CN104404168A - 克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法 - Google Patents

克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，通过序列的合成、克隆载体、目的片段和载体的连接、质粒转化以及重组质粒的提取、冻干保存等步骤制得克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品，本发明制备出一种包含病毒特征序列信息、适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品；本发明提供的标准样品均匀性好、稳定性强、可长期保存、纯度好，并且制备方法过程简单，可以为克里米亚-刚果出血热病毒检测研究、医用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果比对，从而保证实验室的质量控制；同时也为检验检疫机构、进出口贸易等企业实现对克里米亚-刚果出血热病毒的快速准确检测提供了标准样品。

Description

克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法，属于分子生物学领域。 
背景技术
克里米亚-刚果出血热 是欧、亚、非三大洲都有分布的蜱媒自然疫源性病毒疾病。人群普遍易感，感染发病以青壮年为多，但也有2.5～3 岁婴幼儿被感染。临床表现与其他型出血热相似，惟肾脏的损伤较为轻微。患者入院时多呈重症，病死率高达50%。本病因在克里米亚和刚果相继发现而得名。在国内首先发现于新疆巴楚，故我国又称新疆出血热。 
目前，克里米亚-刚果出血热病毒的诊断方法主要由病毒分离、琼脂糖免疫扩散技术、分子生物学等诊断技术。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术以其快速、敏感、特异性好的优点占很大优势，引起了众多研究者的关注，但现有分子生物学检测试剂盒多为公司根据文献设计阳性对照，没有统一的标准。随着进出口贸易的增大，检验流程时限缩短，难以保证实验室的质量控制。 
发明内容
针对上述问题，本发明研制一种克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品，可用于特征序列检测时的阳性对照，以保证检测结果的可溯源性。具体技术方案如下。 
本发明所述克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，主要包括如下步骤： 
1）          合成病毒序列，其序列如Sequence NO.1所述：并在每段序列前增加一个T7启动子；
2）          将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化；
3）          目的片段和载体的连接反应；
4）          通过感受态细菌转化质粒；
5）          重组质粒提取；
6）          采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测；
7）          选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度，然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于-80℃冰箱保存。
上述克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括重组质粒的鉴定：即从步骤4）得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄的LB培养基中培养，提取质粒，然后进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆。 
上述克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括核酸序列测定及序列对比分析：即将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行同源性分析。 
本发明所获得的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品，即为含有Sequence NO.1的核苷酸序列的重组载体。而且所述重组载体为质粒。 
进一步地，上述步骤2）所述克隆和胶纯化的具体步骤为：将序列平端克隆入pUC19质粒中；酶切鉴定选择EcoR I和XbaI作为质粒载体的克隆位点进行酶切，37℃，反应1-2h，反应体系为DNA 16μL，10X buffer 2μL，EcoRI 1μL，XbaI 1μL；酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。 
进一步地，上述步骤3）所述目的片段和载体的连接反应具体步骤为：条件为16℃，反应16h，反应体系为：步骤2）得到的纯化产物1 μL，合成序列X μL：其与载体的摩尔比为3~20：1，T4 Ligase 1μL，10X Ligase solution 1μL，加去离子水补齐至10μL。 
进一步地，上述步骤4）所述感受态细菌转化质粒的具体步骤为：将感受态细菌加到预冷无菌的Eppendorf管内，取步骤3）得到的连接反应液，加到含DH5α感受态细菌的管中，轻混匀，冰上静置30min，42℃热激90s，不要摇晃管，冰上静置5min，加不含氨苄的LB培养基，37℃，225rpm，培养1h得转化液；取转化液涂布于含氨苄的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h。 
本发明是基于病毒的RNA序列与cDNA序列互补的原理基础之上，利用DNA合成技术合成病毒的特征核酸序列，将其克隆入质粒载体中，制备出一种包含病毒特征序列信息、适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品；本发明提供的标准样品均匀性好、稳定性强、可长期保存、纯度好，并且制备方法过程简单，可以为克里米亚-刚果出血热病毒检测研究、医用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果比对，从而保证实验室的质量控制；同时也为检验检疫机构、进出口贸易等企业实现对克里米亚-刚果出血热病毒的快速准确检测提供了标准样品。 
附图说明
图1质粒酶切电泳图，图2重组质粒测序图，图3序列比对报告。 
具体实施方式
实验材料：pUC19质粒、琼脂糖、限制性内切酶EcoR I和XbaI、T4 Ligase试剂盒、胶纯化试剂盒、DH5α菌株、LB培养基购于大连宝生物工程有限公司，Wizard PlusSV Minipreps DNA Purification System购自promega公司。 
实施例1：标准样品的制备 
1．合成序列：利用软件Clone Manager 7.0从GenBank上下载公开发布的序列，进行同源性分析和引物匹配，分析确定拟合成的病毒序列：CC TAT ATA CGA GTG TGC TTG GGC TAG CTC CAC TGG CAT TGT TAA GAA GGG GCT GGA GTG GTT CGA AAA AAA TGC AGG AAC CAT TAA ATC TTG GGA TGA GAG TTA CAC TGA GCT GAA AGT TGA AGT TCC CAA AAT AGA ACA ACT TTC CAA CTA CCA ACA GGC TGC TCT CAA GTG GAG GAA AGA CAT AGG CTT CCG TGT CAA TGC AAA CAC GGC AGC TTT AAG TAA CAA GGT CCT TGC AGA ATA CAA AGT TCC TGG CGA AAT TGT GAT GTC TGT CAA AGA GAT GTT GTC AGA TAT GAT TAG AAG GAG GAA CCT GAT TCT CAA CAG AGG TGG TGA TGA AAA CCC ACG CGG CCC AGT CAG CCG TGA GCA TGT GGA GTG GTG TAG GGA ATT TAT CAA AGG CAA GTA CAT AAT GGC TTT TAA CCC ACC TTG GGG GGA CAT CAA CAA GTC AGG CCG TTC AGG AAT AGC ACT CGT TGC AAC AGG CCT TGC CAA GCT TGC AGA GAC TGA，序列合成委托公司完成；为便于将病毒核酸序列体外转录成RNA，在每段序列前增加一个T7启动子，序列20bp：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；
2．将合成序列平端克隆入pUC19质粒并通过酶切鉴定及胶纯化：将序列克隆入pUC19质粒中，经序列酶切位点分析，选择EcoR I和XbaI作为质粒载体的克隆位点进行酶切，如图1所示，37℃，反应1-2h，反应体系如下：
酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，按照Takara公司胶纯化试剂盒说明书进行胶回收纯化；
3. 目的片段和载体的连接反应
胶纯化后进行连接反应，16℃，反应16h，体系如下：
4．感受态细菌的制备
挑取冻存的DH5α菌接种于LB培养基平板，37℃倒置培养过夜，挑单个菌落接种在5mL LB培养基中于37℃ 250rpm振荡培养过夜，转接1mL过夜培养物入100mL LB液体培养基中于37℃培养2-3h，使之进入对数生长期OD600约为0.3，4℃，4,000g离心10min，回收细菌，去尽培养基，加入10mL预冷的1×TSS Buffer，重悬细菌，分装成200μL/管，置于-70℃备用；
5．通过感受态细菌转化质粒：DH5α感受态细胞从-70℃冰箱取出，置于冰上融化，取100μL加到预冷无菌的1.5mL Eppendorf管内。取10μL上述连接反应液，加到含DH5α感受态细菌的管中，轻混匀，冰上静置30min。42℃热激90s，不要摇晃管。冰上静置5min，加0.9mL不含氨苄的LB培养基，37℃，225rpm，培养1h。取100-300μL转化液涂布于含氨苄（100μ/mL）的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；
6. 重组质粒的鉴定
取1-3个菌落，接种于5mL含氨苄的LB培养基中，37℃，225rpm，培养12h，提取质粒，并以之为模板，用通用引物M13进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆；
7．核酸序列测定及序列比对分析
经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌送Takara公司测序，如图2所示；测序结果用Clone Manager 7.0软件进行序列同源性分析鉴定，如图3所示，一致性为100%；
8．重组质粒的提取
采用Wizard PlusSV Minipreps DNA Purification System，取1-10mL过夜培养的菌液移至10mL离心管中，3,000g离心15min，弃上清，倒置于滤纸上使残液流净，收集的菌体沉淀中加入250μL细胞重悬溶液轻混匀，完全重悬细菌，将重悬液移至1.5mL Eppendorf管，再在该管中加入250μL细胞裂解液，上下颠倒混匀4-6次；加入10μL碱性磷酸酶溶液，上下颠倒混匀4-6次，室温静置5min；加入350μL中和液，上下颠倒混匀4-6次，室温12,000g离心10min；离心柱放入收集管中，将离心的上清转移至离心柱中，室温12,000g离心1min，弃去离心后液体，将离心柱重新放入收集管中，将750μL已加入乙醇的洗液加入离心柱，室温12,000g离心1min，弃去离心后液体，加入250μL洗液重复上述步骤，室温12,000g离心2min，将离心柱转移至一无菌1.5ml的Eppendorf管中，加入20-30μL灭菌的无核酶去离子水，放置2-3min，室温12,000g离心1min；弃去离心柱，回收纯化的质粒DNA， -20℃保存；
9．质量检测
采用分光光度计法测试DNA在260 nm和280 nm下的吸光度，以评价DNA的质量。结果见表1，DNA重组质粒的含量为2.032μg，样本标准差<10%，纯度符合要求；
表  重组质粒含量及纯度测定结果（质量单位：μg）
10．样品分装
选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，再一次测定浓度和纯度，调整溶液浓度值10.000 μg/mL，按2 μg/管进行分装冻干(条件：样品放置于-20℃冰箱中预冻24h，保证样品彻底冷冻，预冻结束后，快速将样品放置在冻干机（SIM公司FD5508 型）的样品托盘中，保持真空度在30～40 mtorr 间，真空干燥24h，制备成冻干粉末样品。)，将制备好的标准样品置于-80℃冰箱保存。
实施例2：标准样品的均匀性检验 
按照随机抽样法随机抽取样品进行均匀性分析：
1．瓶内均匀性
随机抽取1瓶，加200 μL去离子水后，取三份，每份50 μL，编号为101-103，每份测三次，结果见表2；将三组质量数据做方差分析，方差齐，P=0.332>0.05，质量无显著差异，符合均匀性要求，标准差为0.001。纯度均在1.80左右，符合纯度要求。
表 2 瓶内均匀性实验结果（质量单位：μg） 
 
2．瓶间均匀性
按简单随机抽样法抽取20瓶，编号201-220，每瓶测3次。测量顺序：第一次，201→220；第二次，220→201；第三次，单数201→219→偶数202→220，结果见表3；将20组质量和纯度数据做方差分析，方差齐，P=0.219>0.05，含量无显著差异，符合均匀性要求，其标准差为0.001。纯度均在1.80左右，符合纯度要求。
表 3瓶间均匀性实验结果（质量单位：μg） 
 
实施例3：标准样品的稳定性检验
按照随机抽样法随机抽取样品进行稳定性分析：
1．短期稳定性
随机抽取冻干样本分别在-20℃，0℃，4℃，25℃，37℃条件下，放置2周。每个温度下放置8瓶，共40瓶，共40瓶，编号从301-350，每瓶测3次质量。参照GB/T 15000.3-2008对样品稳定性的统计分析要求，采用SPSS 20.0 软件对数据进行方差分析，检验水准P<0.05为有明显差异；
将5组数据（表4）作方差分析，组间有明显统计学差异，进一步将各组之间进行比较，-20℃、0℃与4℃组之间无统计学差异，25℃与37℃之间无统计学差异，而-20℃、0℃与4℃三组与25℃、37℃两组相互有统计学差异。
表 4 短期稳定性检测结果（质量单位：μg） 
2．长期稳定性
随机抽取一批45瓶先放在-80℃下，按照时间间隔取出在-20℃条件下放置12，9，6，3，1个月。每个时间点下放置9瓶。采用同步法测定浓度。参照GB/T 15000.3-2008对样品稳定性的统计分析要求，采用SPSS 20.0 软件进行方差分析，检验水准P<0.05为有明显差异。
将5组数据（表5）作方差分析，组间无显著差异，符合长期稳定性要求。-20℃下放置1年样本质量估算标准偏差（STDEV）=0.028。 
表 5 长期稳定性实验结果（质量单位：ug） 
续表5
 
实施例4：标准样品的定值
  1．协作定值
  标准样品定值工作由7家实验室共同参与完成。采用紫外分光光度法进行协作定值。每家发放1瓶样品，分三天测量，每天测量1次，共计3次。定值数据见表6，实验室平均测量数据见表7。
表 6 实验室测量数据一览表（质量单位：ug） 
表 7 实验室平均测量结果
2．不确定度合成
不确定度的分量包括瓶间不均匀性误差u1+ 稳定性误差（-20℃/1年）u2+重复测量误差u3，协作定值误差u4。总不确定度等于各不确定度分量平方和的开方。
标准样品的不确定度分量来源见表8。合成不确定度见表9。 
经计算，扩展不确定度U=0.058μg，k=2。 
表 8 不确定分量值 
表 9 合成不确定度
重复测量误差 协作定值误差 合成不确定度
0.001 0.008 0.029
定值：2.01μg，扩展不确定度U=0.058μg，k=2。
定值结果表明：1、制备采用的试剂满足配制要求；2、配制工艺合理；3、测试方法满足要求。 
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 
                                               SEQUENCE LISTING
 
<110>  薛芳
 
<120>  克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法
 
<130>  2014
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  500
<212>  DNA
<213>  Sequence NO.1
 
<400>  1
cctatatacg agtgtgcttg ggctagctcc actggcattg ttaagaaggg gctggagtgg     60
 
ttcgaaaaaa atgcaggaac cattaaatct tgggatgaga gttacactga gctgaaagtt    120
 
gaagttccca aaatagaaca actttccaac taccaacagg ctgctctcaa gtggaggaaa    180
 
gacataggct tccgtgtcaa tgcaaacacg gcagctttaa gtaacaaggt ccttgcagaa    240
 
tacaaagttc ctggcgaaat tgtgatgtct gtcaaagaga tgttgtcaga tatgattaga    300
 
aggaggaacc tgattctcaa cagaggtggt gatgaaaacc cacgcggccc agtcagccgt    360
 
gagcatgtgg agtggtgtag ggaatttatc aaaggcaagt acataatggc ttttaaccca    420
 
ccttgggggg acatcaacaa gtcaggccgt tcaggaatag cactcgttgc aacaggcctt    480
 
gccaagcttg cagagactga                                                500
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  T7
 
<400>  2
taatacgact cactataggg                                                 20

Claims (8)

1.克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）合成病毒序列，其序列如Sequence NO.1所述：并在每段序列前增加一个T7启动子；
2）将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化；
3）目的片段和载体的连接反应；
4）通过感受态细菌转化质粒；
5）重组质粒提取；
6）采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测；
7）选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度，然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于-80℃冰箱保存。
2.根据权利要求1所述的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤还包括重组质粒的鉴定：从步骤4）得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄的LB培养基中培养，提取质粒，进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆。
3.根据权利要求2所述的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤还包括核酸序列测定及序列对比分析：将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行同源性分析。
4.由权利要求1所述方法制备的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品，即含有Sequence NO.1的核苷酸序列的重组载体。
5.根据权利要求4所述的克里米亚-刚果出血热病毒核酸分子特征标准样品，其特征在于，所述重组载体为质粒。
6.根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤2）所述克隆和纯化的具体步骤为：将序列平端克隆入pUC19质粒中；酶切鉴定选择EcoR I和XbaI作为质粒载体的克隆位点进行酶切，37℃，反应1-2h，反应体系为DNA 16μL，10X buffer 2μL，EcoR I 1μL，XbaI 1μL；酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。
7.根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤3）所述目的片段和载体的连接反应具体步骤为：条件为16℃，反应16h，反应体系为：步骤2）得到的纯化产物1 μL，合成序列X μL：其与载体的摩尔比为3~20：1，T4 Ligase 1μL，10X Ligase solution 1μL，加去离子水补齐至10μL。
8.根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤4）所述感受态细菌转化质粒的具体步骤为：将感受态细菌加到预冷无菌的Eppendorf管内，取步骤3）得到的连接反应液，加到含DH5α感受态细菌的管中，轻混匀，冰上静置30min，42℃热激90s，不要摇晃管，冰上静置5min，加不含氨苄的LB培养基，37℃，225rpm，培养1h得转化液；取转化液涂布于含氨苄的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h。
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