CN109628637B - 基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测虫媒病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒的方法，属于出入境卫生检验检疫范畴，包括以下步骤：(1)设计各病毒的锁式探针与通用引物；(2)优化超分支滚环扩增条件，建立特异、准确的日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒超分支滚环扩增检测技术体系；(3)将3种虫媒病毒的检测探针交联于硝酸纤维素膜，实现对病毒超分支滚环扩增产物的特异性检出，成功研发了检测几种虫媒病毒的超分支滚环扩增试纸条，不仅确保检测的特异性和灵敏度，而且缩短检测时间、提高通关速度，对于提高入境卫生疫情截获、保护我国人民生命安全、加快口岸通关速度、降低检测成本都具有重要意义。

Description

基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测虫媒病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种虫媒携带传染病检测技术领域，特别是涉及一种基于超分支滚环扩增试纸条检测多种虫媒病毒的方法，属于卫生检疫范畴。
背景技术
目前，在我国口岸检测的重要传染病中，由蚊类为传播媒介的病毒病主要包括流行性乙型脑炎(又称日本脑炎)、登革热、基孔肯亚热、西尼罗热、黄热病等。其中日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、登革病毒(Dengue virus，DENV)、西尼罗河病毒(Westnile virus，WNV)、黄热病病毒(Yellow fever virus，YFV)属于黄病毒科黄热病毒属，基孔肯亚病毒是披膜病毒科甲病毒属成员，这五种病毒均是RNA病毒，基因结构非常相似。同时这五种病毒共享媒介载体，日本脑炎病毒和西尼罗病毒的传播媒介主要是库蚊，登革病毒和黄热病病毒的传播媒介主要是伊蚊，库蚊和伊蚊均可传播基孔肯亚病毒，导致这几种病毒具有高度重叠的地理分布。对于感染者来说，这几种病毒病表现出相似的临床特征(高热，皮疹，关节疼，神经症状等)和流行病学特点，常常需要实验室同时对这几种病毒进行检测以完成鉴别诊断。因此，建立针对同一份样品几种病原的快速，准确检测方法对于口岸传染病监测和防控十分必要。
当前，对媒介携带虫媒病毒或者出入境疑似病人虫媒病毒病的筛查主要依靠酶联免疫学方法和实时荧光RT-PCR方法。由于黄病毒科病毒抗体存在严重的交叉反应，酶联免疫学方法在检测这些病毒病时的准确性不够，需要进行多病毒感染排除；实时荧光RT-PCR虽然特异性和敏感性高，但样品前处理繁琐费时，实验周期长；需要特殊的仪器(实时定量PCR仪)，检测成本高；在一个反应体系中只能对一种病原进行鉴定，检测效率低；且需要专门的分析技术人员，检测场所也局限于有条件的实验室中，不能满足现场快速检测的需要。建立快速、灵敏、操作简便、无需仪器的检测方法对于口岸检验检疫人员现场检疫工作具有高度的意义。
超分支滚环扩增技术(hyper-branched rolling circle amplification，HRCA)，是一种借鉴自然界中环状病原生物体DNA分子滚环式的复制方式建立的核酸扩增技术，可在室温下进行，使用两个引物就可实现指数扩增，具有与环介导等温扩增(LAMP)技术相同的快速、灵敏、特异等特点。并且可以通过特异性的检测探针，构建基于目视判别颜色变化的可视化快速检测试纸条对超分支滚环扩增产物进行直观、快速判断。该技术即可以通过核酸扩增保证检测的特异性和敏感性，又通过固相化的检测探针，实现直观性和简便性，非常适合用于基层和现场检测目的。目前该技术在虫媒病原体检测领域中的应用还处于空白，有很大的应用前景。
发明内容
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测几种虫媒病毒的方法，所述的几种虫媒病毒包括日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒。
本发明根据三种虫媒病毒的保守基因片段，依据锁式探针的设计原则设计三种虫媒病毒的锁式探针，锁式探针和靶标序列杂交后其两端的检测序列在空间位置上彼此相邻，在连接酶的作用下，形成一个环状的DNA分子；生物素标记的通用引物GF1和GR1可与这个环状单链DNA分子上的pNAK1序列区域的3’端和5’端结合，生成的延伸产物就是这个环状DNA模板分子的互补配对产物的多个连接，并在两端标记上生物素；扩增产物可特异的与固定在硝酸纤维素膜上的检测探针结合，最后与HRP-标记的亲和素反应，TMB显色，有肉眼可见的颜色反应表明有靶片段存在。
一种基于超分支滚环扩增的核酸试纸条检测三种虫媒病毒的方法，具体包括以下步骤
(1)获取病毒DNA模板
日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸由山东出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心实验室提供；以日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸序列为模板，分别设计三种病毒的扩增引物，分别为：
Figure GDA0003785965210000021
配制逆转录反应(RT-PCR)体系：对各自的基因进行RT-PCR扩增，采用onestep RT-PCR试剂盒(TAKARA)，反应体系如下：上/下游引物(10μmol/L)各1μL，模板2μL，PrimeScript 1Step Enzymemixl μL，2×1step buffer 12.5μL，添加dH2O至终体积25μL；
逆转录反应(RT-PCR)条件：50℃逆转录反应30min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应10min，循环反应35次；72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物经1.5％(m/V)琼脂糖凝胶电泳检测，大小与目的条带一致即为日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒DNA核酸模板；
(2)锁式探针的设计
锁式探针为两端为特异性识别序列、中间为连接序列的单链DNA，分别根据三种虫媒病毒的保守基因的片段序列设计锁式探针的特异性识别序列，两端特异性识别序列中间的连接部分为进行适当修改的pNAK1质粒中的一段核酸序列，锁式探针5’端磷酸化；
当虫媒病毒为登革病毒时，其保守序列为3’UTR的部分序列，序列为：CGAAAGCCACGGTTTGAGCAAGCCGTGCTGCCTGTAGCTCCATCGTGGGGATGTAAAAACCTGGGAGGCTGCAAACCATGGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTGGTTAGAGGAGACCCCTCCCAAAACACAACGCAGCAGCGGGGCCCAACACCTGGGAAAGCTGTACCCTGGTGGTAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCCGCATAACAATAAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAGAACGCCAGAAAATGGA；锁式探针为：
Figure GDA0003785965210000031
Figure GDA0003785965210000032
Figure GDA0003785965210000033
单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；
当虫媒病毒为乙脑病毒时，其保守序列为3’UTR的部分序列，序列为：catttgcatcaaacagcatattgacacctgggaatagactgggagatcttctgctctatctcaacatcagctactaggcacagagcgccgaagtatgtagctggtggagaggaagaacacaggatct；锁式探针为：5’
Figure GDA0003785965210000034
Figure GDA0003785965210000035
Figure GDA0003785965210000036
单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；
当虫媒病毒为基孔肯亚病毒时，其保守序列为NSP1的部分序列，序列为：tagagcaggaaattgatcccgactcaaccatcctggatataggtagtgcgccagcaaggaggatgatgtcggacaggaagtaccactgcgtttgcccgatgcgcagcgcagaagatcccgagagactcgctaattatgcgagaaagctcgcatctgccgcaggaaaagtcctggacagaaacatttctggaaagatcggggacttacaagaggtgatggccgtgccagacacggagacaccaacattttgcttacacacagatgtctcatgtagacagagagcagacgtcgcgatataccaagacgtctatgctgtacatgcacccacgtcgctatatcaccaggcgattaaag；锁式探针为：
Figure GDA0003785965210000037
Figure GDA0003785965210000038
Figure GDA0003785965210000039
单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；
(3)通用引物的设计
根据锁式探针两端特异性识别序列中间的连接部分的序列，设计两条扩增方向相反的通用引物GF1和GR1，引物GF1和GR1的5’端修饰有生物素(biotin)，通用引物序列为：
Figure GDA0003785965210000041
(4)检测探针的设计
设计检测探针序列，检测探针序列为锁式探针两特异性末端与模板相结合的衔接区域，检测探针序列5’端含有多聚核苷酸T；
当虫媒病毒为登革病毒时检测探针为：5’-TTTTTTAGATCCTGCTGTCTCTACA-3’；
当虫媒病毒为乙脑病毒时检测探针为：5’-TTTTTTCTGCTCTATCTCAACATC-3’；
当虫媒病毒为基孔肯亚病毒时检测探针为：5’-TTTTTTGGAAAAGTCCTGGACAGA-3’；
(5)锁式探针连接反应
锁式探针连接反应体系：浓度为1nmol/L～10μ mol/L的锁式探针1μL，T4 DNA连接酶1U/μL，其商品配套的10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，样品模板2μL，加去离子水至反应总体积为10μL；
锁式探针连接反应条件：94℃反应5min后迅速置于冰上，2min后加T4 DNA连接酶，37℃条件下连接反应20～60min，最后65℃10min终止连接反应；
(6)超分支滚环扩增(HRCA)反应
HRCA反应体系：dNTPs 0.4mmol/L，GF1 0.4μ mol/L，GR1 0.4μ mol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgS046.5mmol/L，(NH4)2S04 10mmol/L，0.1％Triton X-100，2μL连接产物与8U Bst DNA聚合酶大片段，加dH2O使反应体系总体积为25μL；
HRCA反应条件：60℃扩增20～80min后，95℃10min终止反应；扩增产物经1.5％(m/V)琼脂糖凝胶电泳检测，若条带呈阶梯状，则表示该样品为目的病毒阳性，反之为阴性；
(7)检测探针结合试纸条的制备
将17μL变性液与3μL检测探针于室温下混匀5min，取5μL混合液点于硝酸纤维素膜上，室温晾干，每个点样点可重复点样3次；UV光源下(波长254nm，强度60～120mJ/cm2)照射使检测探针固定在膜上；37℃条件下，用脱脂奶粉(5g/100mL)封闭1.5h，备用；
(8)样品检测
在滚环扩增产物中加入5mL预热的杂交缓冲液，将试纸置于混合液中，60℃温浴2h；取出试纸，转至50mL预热洗液中，60℃震荡冲洗15min；取出试纸，转至缓冲液A中，确保缓冲液A中已经加入1：2000稀释的HRP-标记亲和素，反应10min；取出试纸，转至缓冲液B中，室温下浸泡5min；取出试纸，转至缓冲液C中，室温下浸泡5min；加入TMB显色1～20min，终止反应；肉眼观察着色斑颜色变化，也可采用Gelpro图像分析软件进行斑点值分析。
进一步的，步骤(4)所述虫媒病毒为登革病毒时，与登革病毒锁式探针结合的登革病毒靶片段序列为：
Figure GDA0003785965210000051
下划线表示与检测探针结合的区域，竖线表示隔开锁式探针的5’和3’端。
进一步的，步骤(4)所述虫媒病毒为乙脑病毒时，与乙脑病毒锁式探针结合的乙脑病毒靶片段序列为：
Figure GDA0003785965210000052
下划线表示与检测探针结合的区域，竖线表示隔开锁式探针的5’和3’端。
进一步的，步骤(4)所述虫媒病毒为基孔肯亚病毒时，与基孔肯亚病毒锁式探针结合的基孔肯亚病毒片段序列为：
Figure GDA0003785965210000053
下划线表示与检测探针结合的区域，竖线表示隔开锁式探针的5’和3’端。
进一步的，步骤(7)所述变性液为25mmol/L EDTA溶液，0.4mol/L NaOH溶液；
进一步的，步骤(8)所述杂交缓冲液配方为：0.1％SDS，1×SSC缓冲液；步骤(8)所述洗液配方为：0.1％SDS，0.5×SSC缓冲液；步骤(8)所述缓冲液A配方为：PBS、4.3mmo1/LNa2HP04、137mmol/L NaCl、1.4mmol/L KH2PO4、2.7mmol/L KCl、0.3％Triton X-100，调节pH为7.4；步骤(8)所述缓冲液B配方为：1g/100mL硫酸葡聚糖溶液、1mol/L尿素溶液、PBS、4.3mmol/L Na2HPO4、137mmol/L NaCl、1.4mmol/L KH2PO4、2.7mmol/L KCl、0.3％Triton X-100，调节pH为7.4；步骤(8)所述缓冲液C配方为：100mmol/L柠檬酸钠，调节pH为5.0。
如上所述，本发明的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测几种虫媒病毒的方法，具有以下有益效果：(1)出入境口岸对捕获的媒介检测携带虫媒病毒或疑似感染虫媒病毒的病人的筛查，依靠酶联免疫学方法和实时荧光RT-PCR方法，速度慢、前处理复杂且有严重的交叉反应，本发明提供了一种快速检测的方法；(2)本发明特异性和灵敏度较高，对同属别的病毒也能分辨出，对虫媒病及时检测、及时治疗、保护我国人民生命安全具有重要意义；(3)不需要特殊的仪器(实时定量PCR仪)，检测成本低，能在口岸现场进行快速检测，对加快口岸通关速度、降低检测成本都具有重要意义。
附图说明
图1显示为本发明的原理示意图；
图2显示为不同浓度登革病毒锁式探针连接产物的凝胶电泳图；M为DNA Ladder；锁式探针浓度为10μmol/L，100nmol/L，1nmol/L，10pmol/L；样本模板为2×105copies，连接反应时间为60min；
图3显示为不同浓度乙脑病毒锁式探针连接产物的凝胶电泳图；M为DNA Ladder；锁式探针浓度为10μ mol/L，100nmol/L，1nmol/L，10pmol/L；样本模板为2×105copies，连接反应时间为60min；
图4显示为不同浓度基孔肯亚病毒锁式探针连接产物的凝胶电泳图；M为DNALadder；锁式探针浓度为1μmol/L，100nmol/L，10nmol/L，1nmol/L；样本模板为2×105copies，连接反应时间为60min；
图5显示为不同连接反应时间下的登革病毒锁式探针连接产物的凝胶电泳图；M为DNA Ladder；连接时间分别为：10，20，30，40，50，60min；样本模板为2×105copies，登革病毒锁式探针浓度为100nmol/L；
图6显示为不同连接反应时间下的乙脑病毒锁式探针连接产物的凝胶电泳图；M为DNA Ladder；连接时间分别为：10，20，30，40，50，60min；样本模板为2×105copies，乙脑病毒锁式探针浓度为100nmol/L；
图7显示为不同连接反应时间下的基孔肯亚病毒锁式探针连接产物的凝胶电泳图；M为DNA Ladder；连接时间分别为：10，20，30，40，50，60min；样本模板为2×105copies，基孔肯亚病毒锁式探针浓度为100nmol/L；
图8显示为不同反应时间下的登革病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；M为DNALadder；反应时间分别为：10，20，30，40，50，60，70，80min；连接样本为2μL(连接反应样本浓度为2×105copies)；
图9显示为不同反应时间下的乙脑病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；M为DNALadder；反应时间分别为：10，20，30，40，50，60，70，80min；连接样本为2μL(连接反应样本浓度为2×105copies)；
图10显示为不同反应时间下的基孔肯亚病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；M为DNALadder；反应时间分别为：10，20，30，40，50，60，70，80min；连接样本为2μL(连接反应样本浓度为2×105copies)；
图11显示为不同浓度的登革病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；M为DNA Ladder；登革病毒浓度分别为100，101，102，103，104，105，106copies/μL；反应时间为50min；
图12显示为不同浓度的乙脑病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；M为DNA Ladder；乙脑病毒浓度分别为100，101，102，103，104，105，106copies/μL；反应时间为50min；
图13显示为本发明的不同浓度的基孔肯亚病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；M为DNA Ladder；基孔肯亚病毒浓度分别为100，101，102，103，104，105，106copies/μL；反应时间为30min；
图14显示为多种病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；图14A显示为DFV病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；图14A显示为DFV病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；图14B显示为JEV病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；图14C显示为CHIKV病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；图14D显示为YF病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；图14E显示为WNV病毒HRCA反应产物的凝胶电泳图；图14F显示无菌水的HRCA反应产物的凝胶电泳图；M为DNA Ladder；1：登革病毒(DFV)，2：乙脑病毒(JEV)，3：基孔肯亚病毒(CHIKV)，4：黄热病毒(YF)，5：西尼罗病毒(WNV)，6：无菌水；
图15显示为不同浓度的登革病毒的HRCA试纸条检测结果图；登革病毒浓度分别为100，101，102，103，104，105，106copies/μL；
图16显示为不同浓度的乙脑病毒的HRCA试纸条检测结果图；登革病毒浓度分别为100，101，102，103，104，105，106copies/μL；
图17显示为不同浓度的基孔肯亚病毒的HRCA试纸条检测结果图；登革病毒浓度分别为100，101，102，103，104，105，106copies/μL；
图18显示为多种病毒HRCA试纸条检测结果图；1：登革病毒(DFV)，2：乙脑病毒(JEV)，3：基孔肯亚病毒(CHIKV)，4：黄热病毒(YF)，5：西尼罗病毒(WNV)，6：无菌水。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施实例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1
1.制备日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒的DNA样品模板
1.1设计日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒逆转录PCR的引物
日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸由山东出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心实验室提供；以日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸序列为模板，分别设计三种病毒的扩增引物，引物序列见表1：
表1引物序列
Figure GDA0003785965210000071
Figure GDA0003785965210000081
1.2配制逆转录反应(RT-PCR)体系
对各自的基因进行RT-PCR扩增，采用onestep RT-PCR试剂盒(TAKARA)，反应体系如下：上/下游引物(10μmol/L)各1μL，模板2μL，PrimeScript 1Step Enzymemix1 μL，2×1step buffer 12.5μL，添加dH2O至终体积25μL；
1.3逆转录扩增获得日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒模板
反应条件中反应温度与反应时间参见表2：
表2 RT-PCR扩增反应条件
Figure GDA0003785965210000082
逆转录后，按照表中的变性、退火、延伸反应条件进行35个循环，而后72℃延伸10min，4℃保存，RT-PCR产物即为日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒的DNA模板，产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小。
2.超分支滚环扩增检测日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒的方法的建立
2.1锁式探针的设计
当虫媒病毒为登革病毒时，其保守序列为3’UTR的部分序列，序列为：CGAAAGCCACGGTTTGAGCAAGCCGTGCTGCCTGTAGCTCCATCGTGGGGATGTAAAAACCTGGGAGGCTGCAAACCATGGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTGGTTAGAGGAGACCCCTCCCAAAACACAACGCAGCAGCGGGGCCCAACACCTGGGAAAGCTGTACCCTGGTGGTAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCCGCATAACAATAAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAGAACGCCAGAAAATGGA；锁式探针为：
Figure GDA0003785965210000083
Figure GDA0003785965210000084
Figure GDA0003785965210000085
单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；
当虫媒病毒为乙脑病毒时，其保守序列为3’UTR的部分序列，序列为：catttgcatcaaacagcatattgacacctgggaatagactgggagatcttctgctctatctcaacatcagctactaggcacagagcgccgaagtatgtagctggtggagaggaagaacacaggatct；锁式探针为：
Figure GDA0003785965210000091
Figure GDA0003785965210000092
Figure GDA0003785965210000093
单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；
当虫媒病毒为基孔肯亚病毒时，其保守序列为NSP1的部分序列，序列为：tagagcaggaaattgatcccgactcaaccatcctggatataggtagtgcgccagcaaggaggatgatgtcggacaggaagtaccactgcgtttgcccgatgcgcagcgcagaagatcccgagagactcgctaattatgcgagaaagctcgcatctgccgcaggaaaagtcctggacagaaacatttctggaaagatcggggacttacaagaggtgatggccgtgccagacacggagacaccaacattttgcttacacacagatgtctcatgtagacagagagcagacgtcgcgatataccaagacgtctatgctgtacatgcacccacgtcgctatatcaccaggcgattaaag；锁式探针为：
Figure GDA0003785965210000094
Figure GDA0003785965210000095
Figure GDA0003785965210000096
单下划线表示与通用引物GR1结合的区域，双下划线表示与通用引物GF1结合的区域；
2.2通用引物的设计
根据锁式探针两端特异性识别序列中间的连接部分的序列，设计两条扩增方向相反的通用引物GF1和GR1，引物GF1和GRl的5’端修饰有生物素(biotin)，通用引物序列为：
Figure GDA0003785965210000097
2.3检测探针的设计
设计检测探针序列，检测探针序列为锁式探针两特异性末端与模板相结合的衔接区域，检测探针序列5’端含有多聚核苷酸T；
当虫媒病毒为登革病毒时检测探针为：5’-TTTTTTAGATCCTGCTGTCTCTACA-3’；
当虫媒病毒为乙脑病毒时检测探针为：5’-TTTTTTCTGCTCTATCTCAACATC-3’；
当虫媒病毒为基孔肯亚病毒时检测探针为：5’-TTTTTTGGAAAAGTCCTGGACAGA-3’；
2.4锁式探针连接反应的优化
2.4.1锁式探针最佳浓度的确定
锁式探针连接反应体系：T4 DNA连接酶1U/μL，其商品配套的10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，样品模板2μL，加去离子水至反应总体积为10μL；每种病毒的锁式探针按照表3浓度梯度进行稀释后反应(不同浓度的锁式探针对连接反应产物的影像图如图2、图3、图4所示)，结果显示三种病毒的锁式探针连接反应的最佳探针浓度均为≥100nmol/L。
锁式探针连接反应条件：94℃反应5min后迅速置于冰上，2min后加T4 DNA连接酶，37℃条件下连接反应60min，最后65℃10min终止连接反应；
表3锁式探针浓度梯度
Figure GDA0003785965210000101
2.4.2锁式探针连接反应时间的优化
为确定最佳锁式探针连接时间，参照上述反应体系和反应条件，在最佳探针浓度条件下，每种病原锁式探针的连接时间分别为10，20，30，40，50，60min以确定最佳的连接反应时间(锁式探针连接时间对探针连接反应产物的影响图如图5、图6、图7所示)，结果显示三种病毒的锁式探针连接反应的最佳反应时间均为30min。
2.5超分支滚环扩增(HRCA)反应条件的优化
HRCA反应体系：dNTPs 0.4mmol/L，GF1 0.4μmol/L，GR1 0.4μmol/L，Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L，KC1 10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，0.1％Triton X-100，2μL连接产物与8U Bst DNA聚合酶大片段，加dH2O使反应体系总体积为25μL；
HRCA反应条件：60℃分别扩增30、40、50、60、70、80min，以确定最佳扩增时间，95℃10min终止反应；扩增产物经1.5％(m/V)琼脂糖凝胶电泳检测，若条带呈阶梯状，则表示该样品为目的病毒阳性，反之为阴性(HRCA反应时间对扩增产物结果的影响图如图8、图9、图10所示)，结果显示检测病毒为登革病毒时反应条件优化为60℃，50min；检测病毒为乙脑病毒和基孔肯亚病毒时反应条件优化为60℃，60min。
3.检测探针结合试纸条的制备
将17μL变性液与3μL检测探针于室温下混匀5min，取5μL混合液点于硝酸纤维素膜上，室温晾干，每个点样点可重复点样3次；UV光源下(波长254nm，强度60～120mJ/cm2)照射使检测探针固定在膜上；37℃条件下，用脱脂奶粉(5g/100mL)封闭1.5h，备用；
4.样品检测
在滚环扩增产物中加入5mL预热的杂交缓冲液，将试纸置于混合液中，60℃温浴2h；取出试纸，转至50mL预热洗液中，60℃震荡冲洗15min；取出试纸，转至缓冲液A中，确保缓冲液A中已经加入1∶2000稀释的HRP-标记亲和素，反应10min；取出试纸，转至缓冲液B中，室温下浸泡5min；取出试纸，转至缓冲液C中，室温下浸泡5min；加入TMB显色1～20min，终止反应；肉眼观察着色斑颜色变化，也可采用Gelpro图像分析软件进行斑点值分析。
实施例2
本发明HRCA试纸条检测多种虫媒病毒的特异性测定
分别采用登革病毒(Dengue virus，DENV)、日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)、基孔肯亚病毒(Chikungunya fever，CHIKV)、西尼罗河病毒(Westnile virus，WNV)、黄热病病毒(Yellow fever virus，YFV)，即分别以五种病毒的核酸DNA作为模板，用于本发明的特异性验证试验，其中dH2O作为阴性对照；DNA模板获取方法和HRCA反应体系和条件见前，结果显示见图14。将三种检测探针点样于同一张硝酸纤维素膜上，HRCA检测试纸条制备方法见前，扩增产物分别通过预先制备好的HRCA检测试纸条进行检测，结果显示见图18，说明本发明提供的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测几种虫媒病毒的方法能保证对日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、登革病毒(Dengue virus DENV)、基孔肯亚病毒(Chikungunya fever，CHIKV)的特异性检测，并不与其他相关病毒发生交叉反应。
实施例3
本发明HRCA试纸条检测多种虫媒病毒的敏感性测定
分别采用登革病毒(Dengue virus，DENV)、日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)、基孔肯亚病毒(Chikungunya fever，CHIKV)，即三种病毒的核酸DNA按照106～100copies/μL浓度梯度进行稀释，做为HRCA反应的模板，进行HRCA扩增反应；其中dH2O作为阴性对照；DNA模板获取方法和HRCA反应体系和条件见前，结果显示见图11、图12、图13。将三种检测探针点样于同一张硝酸纤维素膜上，HRCA检测试纸条制备方法见前，扩增产物HRCA试纸条检测，肉眼观察着色斑颜色变化，也可采用Gelpro图像分析软件进行斑点值分析，比较斑点值与肉眼观察结果的差异，检测试纸条的灵敏度。结果显示见图15、图16、图17，说明本发明提供的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测几种虫媒病毒的方法，对登革病毒(Dengue virus，DENV)所能检测的最低样品模板浓度为100copies/μL，日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)所能检测的最低样品模板浓度为100copies/μL，对基孔肯亚病毒(Chikungunya fever，CHIKV)所能检测的最低样品模板浓度为100copies/μL。
综上所述，本发明基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测几种虫媒病毒的方法，具有以下有益效果：(1)出入境口岸对捕获的媒介检测携带虫媒病毒或疑似感染虫媒病毒的病人的筛查，依靠酶联免疫学方法和实时荧光RT-PCR方法，速度慢、前处理复杂且有严重的交叉反应，本发明提供了一种快速检测的方法；(2)本发明特异性和灵敏度较高，对同属别的病毒也能分辨出，对虫媒病及时检测、及时治疗、保护我国人民生命安全具有重要意义；(3)不需要特殊的仪器(实时定量PCR仪)，检测成本低，能在口岸现场进行快速检测，对加快口岸通关速度、降低检测成本都具有重要意义。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.一种非诊断目的的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测三种虫媒病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)获取病毒DNA模板：
以日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒RNA核酸序列为模板，分别设计三种病毒的扩增引物，分别为：
日本脑炎病毒JEV-F 5'-GCATCAAACAGCATATTGACACC-3'，
JEV-R 5'-GGCGCTCTGTGCCTAGTAGC-3'，
登革病毒DFV-F 5'-AAGCTTCGAAAGCCACGGTTTGAGCA-3'，
DFV-R 5'-GCGGCCGCTCCATTTTCTGGCGTTCTGT-3',
基孔肯亚病毒CHIKV-F 5'-TAGAGCAGGAAATTGATCCC-3',
CHIKV-R 5’-CTTTAATCGCCTGGTGGTAT-3’,
配制逆转录反应体系：对各自的基因进行逆转录反应扩增，采用onestep逆转录反应试剂盒，反应体系如下：10μmol/L的上下游引物各1μL，模板2μL，PrimeScript 1StepEnzymemix 1μL，2×1step buffer 12.5μL，添加dH2O至终体积25μL；
逆转录反应条件：50℃逆转录反应30min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应10min，循环反应35次；72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增后获得的条带所处的位置与目的产物条带所处的位置一致，即为日本脑炎病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒DNA核酸模板，其中日本脑炎病毒目的产物条带为150bp，登革病毒目的产物条带为300bp，基孔肯亚病毒目的产物条带为354bp；
(2)锁式探针的设计：
当虫媒病毒为登革病毒时，锁式探针为：5’-phosphate-AGACAGCAGGATCTCTGGTCTCTCCtgctgaatccgttagccagcagccgcctcgacgaatttctgccattcatccccttattatcacttattcaggcgtagcaccagTGCCTGGAATGATGCTGTAG-3’；其中gctgaatccgttagccag表示与通用引物GR1结合的区域，tcaggcgtagcaccag表示与通用引物GF1结合的区域；
当虫媒病毒为日本脑炎病毒时，锁式探针为：5’-phosphate-TGAGATGAGCAGAAGATCTCCCAGtgctgaatccgttagccagcagccgcctcgacgaatttctgccattcatccccttattatcacttattcaggcgtagcaccagGCCTAGTAGCTGATGT-3’；其中ctgaatccgttagccag表示与通用引物GR1结合的区域，tcacttattcaggcgtagcaccag表示与通用引物GF1结合的区域；
当虫媒病毒为基孔肯亚病毒时，锁式探针为：5’-phosphate-GGACTTTTCCTGCGGtgctgaatccgttagccagcagccgcctcgacgaatttctgccattcatccccttattatcacttattcaggcgtagcaccagCAGATGCAGAAATGTTTCTGTCCA-3’；其中gctgaatccgttagccagcag表示与通用引物GR1结合的区域，tcacttattcaggcgtagcaccag表示与通用引物GF1结合的区域；
(3)通用引物的设计：
通用引物序列为：
GF1 5'-biotin-CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3’，
GR1 5'-biotin-GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3’，
(4)检测探针的设计：
当虫媒病毒为登革病毒时检测探针为：5’-TTTTTTAGATCCTGCTGTCTCTACA-3’；
当虫媒病毒为日本脑炎病毒时检测探针为：5’-TTTTTTCTGCTCTATCTCAACATC-3’；
当虫媒病毒为基孔肯亚病毒时检测探针为：5’-TTTTTTGGAAAAGTCCTGGACAGA-3’；
(5)锁式探针连接反应：
锁式探针连接反应体系：浓度为1nmol/L～10μmol/L的锁式探针1μL，T4 DNA连接酶1U/μL，10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，样品模板2μL，加去离子水至反应总体积为10μL；
锁式探针连接反应条件：94℃反应5min后迅速置于冰上，2min后加T4 DNA连接酶，37℃条件下连接反应20～60min，最后65℃10min终止连接反应；
(6)超分支滚环扩增反应：
超分支滚环扩增反应体系：dNTPs 0.4mmol/L，GF1 0.4μmol/L，GR1 0.4μmol/L，pH 8.8的Tris-HCl 20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO4 6.5mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，0.1％Triton X-100，2μL连接产物与8U Bst DNA聚合酶大片段，加dH2O使反应体系总体积为25μL；
超分支滚环扩增反应条件：60℃扩增20～80min后，95℃10min终止反应；扩增产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，若条带呈阶梯状，则表示该样品为目的病毒阳性，反之为阴性；
(7)检测探针结合试纸条的制备：
将17μL变性液与3μL检测探针于室温下混匀5min，取5μL混合液点于硝酸纤维素膜上，室温晾干，每个点样点可重复点样3次；UV光源下照射使检测探针固定在膜上，UV条件为波长254nm，强度60～120mJ/cm2；37℃条件下，用5g/100mL的脱脂奶粉封闭1.5h，备用；
(8)样品检测：
在滚环扩增产物中加入5mL预热的杂交缓冲液，将试纸置于混合液中，60℃温浴2h；取出试纸，转至50mL预热洗液中，60℃震荡冲洗15min；取出试纸，转至缓冲液A中，确保缓冲液A中已经加入1：2000稀释的HRP-标记亲和素，反应10min；取出试纸，转至缓冲液B中，室温下浸泡5min；取出试纸，转至缓冲液C中，室温下浸泡5min；加入TMB显色1～20min，终止反应；肉眼观察着色斑颜色变化；
所述变性液为25mmol/L EDTA溶液，0.4mol/L NaOH溶液；所述杂交缓冲液配方为：0.1％SDS，1×SSC缓冲液；所述洗液配方为：0.1％SDS，0.5×SSC缓冲液；所述缓冲液A配方为：PBS、4.3mmol/L Na2HPO4、137mmol/L NaCl、1.4mmol/L KH2PO4、2.7mmol/L KCl、0.3％Triton X-100，调节pH为7.4；所述缓冲液B配方为：1g/100mL硫酸葡聚糖溶液、1mol/L尿素溶液、PBS、4.3mmol/L Na2HPO4、137mmol/L NaCl、1.4mmol/L KH2PO4、2.7mmol/L KCl、0.3％Triton X-100，调节pH为7.4；所述缓冲液C配方为：100mmol/L柠檬酸钠，调节pH为5.0。
2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测三种虫媒病毒的方法，其特征在于所述的虫媒病毒为登革病毒时，其保守序列为3’UTR的部分序列，序列为：
CGAAAGCCACGGTTTGAGCAAGCCGTGCTGCCTGTAGCTCCATCGTGGGGATGTAAAAACCTGGGAGGCTGCAAACCATGGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTGGTTAGAGGAGACCCCTCCCAAAACACAACGCAGCAGCGGGGCCCAACACCTGGGAAAGCTGTACCCTGGTGGTAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCCGCATAACAATAAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAGAACGCCAGAAAATGGA。
3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测三种虫媒病毒的方法，其特征在于所述虫媒病毒为乙型脑炎病毒时，其保守序列为3’UTR的部分序列，序列为：
catttgcatcaaacagcatattgacacctgggaatagactgggagatcttctgctctatctcaacatcagctactaggcacagagcgccgaagtatgtagctggtggagaggaagaacacaggatct。
4.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测三种虫媒病毒的方法，其特征在于所述虫媒病毒为基孔肯亚病毒时，其保守序列为NSP1的部分序列，序列为：
tagagcaggaaattgatcccgactcaaccatcctggatataggtagtgcgccagcaaggaggatgatgtcggacaggaagtaccactgcgtttgcccgatgcgcagcgcagaagatcccgagagactcgctaattatgcgagaaagctcgcatctgccgcaggaaaagtcctggacagaaacatttctggaaagatcggggacttacaagaggtgatggccgtgccagacacggagacaccaacattttgcttacacacagatgtctcatgtagacagagagcagacgtcgcgatataccaagacgtctatgctgtacatgcacccacgtcgctatatcaccaggcgattaaag。
5.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测三种虫媒病毒的方法，其特征在于所述虫媒病毒为登革病毒时，与登革病毒锁式探针结合的登革病毒靶片段序列为：5’-GGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCA-3’，AGATCCTGCTGTCTCTACA表示与检测探针结合的区域，AGATCCTGCTGTCT表示锁式探针的5’端的序列,CTACAG表示锁式探针的3’端的序列。
6.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测三种虫媒病毒的方法，其特征在于所述虫媒病毒为日本脑炎病毒时，与日本脑炎病毒锁式探针结合的日本脑炎病毒靶片段序列为：5’-CTGGGAGATCTTCTGCTCTATCTCAACATCAGCTACTAGGC-3’，CTGCTCTATCTCAACATC表示与检测探针结合的区域，CTGCTCTATCTCA表示锁式探针的5’端的序列,ACATC表示锁式探针的3’端的序列。
7.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于超分支滚环扩增核酸试纸条检测三种虫媒病毒的方法，其特征在于所述虫媒病毒为基孔肯亚病毒时，与基孔肯亚病毒锁式探针结合的基孔肯亚病毒片段序列为：5’-CTGCCGCAGGAAAAGTCCTGGACAGAAACATTTCTG-3’，GGAAAAGTCCTGGA表示与检测探针结合的区域，GGAAAAGTCC表示锁式探针的5’端的序列，TGGA表示锁式探针的3’端的序列。
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