CN107630108A - 一种检测寨卡病毒的rca方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术应用领域，具体应用滚环复制技术（RCA方法）检测寨卡病毒方法，按照如下步骤完成：（1）标本RNA的提取；（2）RCA，再用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果。本发明锁式探针结合RCA技术是一种检测寨卡病毒的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号，与传统的RT‑PCR方法比较，该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，更安全的优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种检测寨卡病毒的RCA方法。
背景技术
寨卡病毒属黄病毒科，黄病毒属，是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒，宿主不明确，主要在野生灵长类动物和栖息在树上的蚊子，如非洲伊蚊中循环。虫媒病毒在全球分布范围广泛，主要通过昆虫和蜱叮咬而在脊椎动物间传播，播散能力和范围取决于是否有合适的宿主和载体。感染寨卡病毒后，大多数人表现为隐性感染，没有任何临床症状。少数人出现症状，称为寨卡热，主要表现为轻度发热、头痛、疲乏、关节痛和结膜炎、手掌和足底红肿、口唇干裂、舌红如草莓。
检测寨卡病毒的方法有血清学方法和RT-PCR法。寨卡病毒感染以症状和流行病史为诊断基础，由于寨卡病毒与登革热、西尼罗河病毒和黄热病等其他黄病毒会发生交叉反应，因此通过血清学方法做出诊断可能较为困难；RT-PCR对较短的窗期较难检测出来，有可能出现假阴性。滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是一种恒温线性扩增技术，以其快速简易、灵敏度高和特异性强等优点受到广泛关注。锁式探针由5’端模板结合区、中间连接序列区和3’端模板结合区组成。当5’端和3’端与靶序列完全互补时，探针两段在DNA连接酶的作用下形成磷酸二酯键被连接成环，为RCA扩增提供环形模板，环化后的探针就可通过引物进行滚环复制和支链扩增。反之，若靶序列上存在变异或没有所要检测的目的基因，探针无法被连接成环状，复制也就无法进行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测寨卡病毒的RCA方法，该检测方法操作简单、检测时间周期短、高特异性和灵敏性，通过滚环复制法，能够检测出寨卡病毒。
本发明的技术方案如下：一种检测寨卡病毒的RCA方法，按照如下步骤完成：
(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA；
(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μlRNA样品、1μmol/L的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μl链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液；
(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coli Buffer 2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μlE.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×ExonucleaseⅠBuffer2μl和ExonucleaseⅠ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活ExonucleaseⅠ核酸外切酶；
(4)RCA扩增：取步骤(3)中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer 5μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；
(5)取步骤(4)制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；
所述步骤(2)(4)中所设计用于RCA反应的引物是：
引物5’-GGTGCTGGTAGAGCGTGAGGATTATG-3’SEQ NO1；
探针是：
锁式探针
5’-CCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGAGAGCGUGAGCAGAGCCCUCACUCACGCUCUACCAGCACCGACAACTAATGCTCAAGGTGTGTGAATGCTAGTTCATAATCTGAGGGCTCTGCTCACGCTATCACTTCCT-3’，探针的5’端进行磷酸化修饰SEQ NO2；
捕获探针
Biotin-GTGGAGATGATTGCGTTGTGACTTCTGTGGAAATAAAGGAGCSEQ NO3。
采用上述技术方案，本发明通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号，是一种检测寨卡病毒的新方法。与传统的RT-PCR方法比较，该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，更安全的优势。
RCA扩增反应的最低检测浓度：
用本发明的方法检测终浓度分别为5pM、50pM、500pM和5nM的模板，RCA扩增产物电泳结果如图1所示。结果显示，RCA在模板终浓度5pmol/L以下均未见扩增产物，模板终浓度50pmol/L以上均可见明亮条带，表明RCA的最低检测浓度为50pmol/L。结果提示，循环RCA能较好满足低病毒载量标本的检测。
有益效果：本发明锁式探针结合RCA技术是一种检测寨卡病毒的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号，与传统的RT-PCR方法比较，该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，更安全的优势。
附图说明
图1RCA检测不同浓度的模板电泳结果(第1,2,3,4,5泳道分别代表Marker、终浓度为5nM，500pM，50pM，5pM模板组RCA产物电泳结果)
图2样本进行RCA检测的电泳结果(1泳道为Marker,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14为第1至13号标本RCA产物组电泳结果)
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明：
实施例1
一种检测寨卡病毒的RCA方法，按照如下步骤完成：
(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA；
(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μlRNA样品、1μmol/L的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μl链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液。
(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coli Buffer 2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μlE.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×ExonucleaseⅠBuffer2μl和ExonucleaseⅠ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活ExonucleaseⅠ核酸外切酶；
(4)RCA扩增：取步骤(3)中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer 5μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；
(5)取步骤(4)制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；
所述步骤(2)(4)中所设计用于RCA反应的引物是：
引物5’-GGTGCTGGTAGAGCGTGAGGATTATG-3’SEQ NO1；
探针是：
锁式探针
5’-CCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGAGAGCGUGAGCAGAGCCCUCACUCACGCUCUACCAGCACCGACAACTAATGCTCAAGGTGTGTGAATGCTAGTTCATAATCTGAGGGCTCTGCTCACGCTATCACTTCCT-3’探针的5’端进行磷酸化修饰SEQ NO2；
捕获探针
Biotin-GTGGAGATGATTGCGTTGTGACTTCTGTGGAAATAAAGGAGCSEQ NO3。
通过实施例1的检查方法对13例临床标本进行检测：
RCA产物检测：
通过实施例1的检查方法对13例标本提取RNA，然后将RNA进行RCA检测，结果显示10例为阳性，3例为阴性。
寨卡病毒的阳性检测结果与常规PCR方法完全一致，说明检测的结果是满意的。
Claims (1)
1.一种检测寨卡病毒的RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：
（1）将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA；
（2）捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μlRNA样品、1μmol/L的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μl链霉亲和素包被的磁珠（溶于2×结合缓冲液中），混匀，室温放置20min，磁性分离，用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液；
（3）锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤（2）制得的杂交产物和10×E.coli Buffer 2μl，混匀，95℃ 5min，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μlE.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease ⅠBuffer2μl和Exonuclease Ⅰ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease Ⅰ核酸外切酶；
（4）RCA扩增：取步骤（3）中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/L引物1μl和10×phi29 Buffer 5μl，95℃ 5min，冰浴1min；加入phi29 DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；
（5）取步骤（4）制得的扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果
所述步骤（2）（4）中所设计用于RCA反应的引物是：
引物 5’-GGTGCTGGTAGAGCGTGAGGATTATG-3’ SEQ NO1；
探针是：
锁式探针
5’-CCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGAGAGCGUGAGCAGAGCCCUCACUCACGCUCUACCAGCACCGACAACTAATGCTCAAGGTGTGTGAATGCTAGTTCATAATCTGAGGGCTCTGCTCACGCTATCACTTCCT-3’，探针的5’端进行磷酸化修饰 SEQ NO2；
捕获探针
Biotin-GTGGAGATGATTGCGTTGTGACTTCTGTGGAAATAAAGGAGC SEQ NO3。
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