CN1955308A

CN1955308A - 滚环复制技术(rca)检测rna病毒基因

Info

Publication number: CN1955308A
Application number: CN 200510114349
Authority: CN
Inventors: 马学军; 李启明; 侯云德
Original assignee: BEIJING JINDIKE BIOLOGICAL TECHNOLOGY INST
Current assignee: BEIJING JINDIKE BIOLOGICAL TECHNOLOGY INST
Priority date: 2005-10-24
Filing date: 2005-10-24
Publication date: 2007-05-02

Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及人类医学及兽医，包括RNA病毒在各种生物制品、献血员、病人血液标本等的监测。具体应用滚环复制技术(RCA方法)及其衍生的酶联滚环复制技术，通过生物学计算分析设计病毒保守和病毒特异性基因序列探针，分子杂交反应。连接和扩增反应，用电泳或酶标抗体进行颜色反应来检测，与传统的RT－PCR方法比较，它具有更安全、特异、灵敏、便捷的优势。

Description

滚环复制技术(RCA)检测RNA病毒基因

发明领域

本发明是滚环复制技术(RCA方法)及其衍生的酶联滚环复制技术用于RNA病毒检测。用于RNA病毒在各种生物制品、、献血者、病人血液标本等的监测。应用范围包括人用，兽用及其它生物防御用。

发明背景

滚环复制原理即滚环放大(Rolling Circle Amplification，RCA)是基于这种复制方式可在同温下对环状单链DNA序列进行相对无限单链扩增的特点，所以被成功运用于单核苷酸多态性(SNP)、病毒基因的分型、基因表达图谱、芯片技术以及基因测序等一系列研究中。普通的RCA技术的原理是首先设计一种探针，这种探针的每个末端包含15-20个可与靶序列互补的核苷酸。当这些序列与靶序列结合后，再通过连接酶将之连接为环状，像一把挂锁“锁”在检测基因的靶位上。所以有些研究者也将可环化探针形象地称为挂锁探针或环形探针^[6]。这个环化后的探针就可通过引物进行滚环复制和支链扩增(RamificationRolling Circle Amplification)。反之，若靶序列上存在变异或没有所要检测的目的基因，探针无法被连接成环状，复制也就无法进行。

从RCA的原理和特点不难看出，该方法在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方法无法比拟的优势，与一些常规的检测手段相比，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，RCA检测方法中所扩增的基因并不是病毒的原基因序列而是探针序列，病毒基因只是提供了一个探针环化的互补支架，保证了扩增的安全性和特异性；第二，该方法省去了RNA向cDNA反转录的过程，提高了检测的敏感性。第三，所有的扩增过程都可在同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间。

酶联滚环复制技术是一种结合滚环复制原理和酶联免疫吸附技术用于检测各种病源基因的新型检测技术平台。在此项技术中原理是探针与靶序列杂交后便可在T₄DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子，该分子在同温下可被特异性引物滚动复制和支链扩增，形成最终的双链核酸产物。该双链可通过一条引物上预先用生物素标记的生物素与酶标板上包被的链酶亲和素结合，而在另一条引物上预先标记了地高辛，因此当呈现阳性反应时地高辛就间接的被固化到酶标板上，再通过抗地高辛的酶标抗体进行颜色反应。酶联RCA技术通过在核酸上的标记物与该标记物的酶联抗体有效地将阳性结果以颜色反应的形式呈现出来，并可用酶标仪将这种结果进行量化。从而省略了滚环复制技术中核酸电泳的步骤，减小了污染和结果判断的难度。

发明内容：

1.本发明是对目前对RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，RCA检测方法中所扩增的基因并不是病毒的原基因序列而是探针序列，病毒基因只是提供了一个探针环化的互补支架，保证了扩增的安全性和特异性；第二，该方法省去了RNA向cDNA反转录的过程，提高了检测的敏感性。第三，所有的扩增过程都可在同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间。

2.通过Blast程序选择了SARS病毒、丙型肝炎病毒和禽流感病毒基因的相对保守区，按照探针设计的普通原则借助Oligo程序，分别设计了对应于保守区序列的捕获探针、环形探针和相应的引物。所有探针、引物和模式DNA分子的具体序列见表1。

3.建立了如下的检测过程，详见如下：

(1)合成探针：使用上海生工生物技术公司合成仪合成。

(2)探针处理：5’端进行磷酸化或生物素或地高辛标记，由上海生工生物技术公司完成。

(3)将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA。

(4)分子杂交反应。

(5)连接和扩增反应

(6)电泳检测

具体实施方式

实施方案1：禽流感病毒HA5基因区的检测

在33μl杂交缓冲液中依次加入5μlRNA样品、1μl环形探针(HA-C-probe，10¹²个分子)、1μl相应的捕获探针(Capture-HA-1、Capture-HA-2，各10¹²个分子^[5，8])，在50℃水浴杂交1小时，缓慢冷却至室温。加入40μl链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20分钟，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃尽洗液，按15μl连接体系分别加入1.5μl 10×连接酶缓冲液、1μl连接酶(400U)、12.5μl水，37℃，1小时。直接加入3μl 10×exo^-Bst DNA扩增缓冲液，1μl exo^-Bst聚合酶，1μl dNTP(2.5mM)，各1μl引物(HA-P1、HA-P2)，8μl水，65℃水浴，扩增90分钟。扩增产物行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，观察结果。同时设立阴性对照，阴性对照组除用水替代RNA外其它反应组份及程序均相同。

实施方案2：禽流感病毒NA1基因区的检测

方法与HA5基因区的检测相同，使用的探针和引物分别为：捕获探针Capture-NA-1和Capture-NA-2，环形探针NA-C-probe，引物NA-P1和NA-P2。

实施方案3：丙型肝炎病毒基因的检测

方法与HA5基因区的检测相同，使用的探针和引物分别为：捕获探针Capture-HCV-1和Capture-HCV-2，环形探针HCV-C-probe，引物HCV-P1和HCV-P2。

实施方案4：SARS病毒基因的检测

方法与HA5基因区的检测相同，使用的探针和引物分别为：捕获探针Capture-SARS-1和Capture-SARS-2，环形探针SARS-C-probe，引物SARS-P1和SARS-P2。

实施方案5：酶联滚环复制技术检测RNA病毒

(1)用链酶亲和素包被酶标板

以5μg/ml的包被浓度在酶标板上包被链酶亲和素，每孔加入100μl，4℃过夜，排干酶标板，待用。

(2)环形探针和捕捉探针与被测RNA的杂交和连接

按照以下反应体系进行杂交和连接反应：

反应组分	加入量(μl)
反应组分	加入量(μl)	连接酶缓冲液生物素标记捕捉探针环形探针T₄DNA连接酶RNA样品水	1.5(10×)1(5pmol)2(10pmol)1(3u)54.5

37℃水浴放置1小时，补加35μl水加入酶标板，37℃继续放置40分钟。取出酶标板，甩尽板中液体，加入扩增反应液。

(3)恒温扩增

按照以下反应体系进行扩增反应：

反应组分	加入量(μl)
反应组分	加入量(μl)	BstDNA聚合酶缓冲液BstDNA聚合酶dNTP生物素标记引物地高辛标记引物水	5(10×)1(8u)5(12.5nmol)3(30pmol)3(30pmol)33

65℃放置1小时进行连接环的扩增。同时，标记了生物素的引物链与酶标板上包被的链酶亲和素结合。取出酶标板，用标准PBST洗液洗板3次，排干酶标板。

(4)扩增产物与酶标抗地高辛抗体的结合

在酶标板中加入100μl过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(工作浓度由预实验确定)，37℃放置40分钟，洗板3次(洗液同上)，拍尽板中液体。

(5)显色，读值

在酶标板中加入过氧化物酶的显色底物，37℃放置3至5分钟，显色完成后加入终止液(1N硫酸)终止反应。在酶标仪中检测颜色信号(波长450nm)，读值。

实施方案6：临床标本的监测结果

对收集于病毒病预防控制所流感室、流行病研究所和武汉协和医院20例病人血清临床标本进行检测，H5N1，HCV和SARS病毒的阳性检测结果与常规RT-PCR方法完全一致，说明检测的结果是满意的。

表1探针和引物序列

Table 1 Nucleotide sequences of the probes and primers

Probe and primer		squence
Probe and primer		squence	avianinfluenzavirussubtypeH5N1	HA-P1HA-P2HA-C-probeCapture-HA-1Capture-HA-2NA-P1NA-P2NA-C-probeCapture-NA-1Capture-NA-2Model molecule	5’GAGCCGTCATTGGATTAGGTC3’5’GCGTTCTCGTTGATGCTTCC3’5’TAACGGTCACGATCCCTTGAGCCGTCATTGGATTAGGTCTAGGAAGCATCAACGAGAACGCTAGTACCATCTGTATTTCTATCTGGTCGATGGTAC3’Biotin-5’GGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTATGACTACCCGCAGTAT3’Biotin-5’GGGAACATAATCTCAATATGGGTCAGTCATTCAATTCAGACAAGGA3’5’TCATTTCGTCATTGGATTAG3’5’GTTCTCGTTGATGCTTCCTA3’5’TTCGGTGTCGAAAGAGTCATTTCGTCATTGGATTAGGTCTAGGAAGCATCAACGAGAACGTCATTGTTACTTAACGGGCGATTACAATGAC3’Biotin-5’TGTGTGTGCAGGGATAATTGGCATGGCTCCAATCGGCCAT3’Biotin-5’GGAGGAACAACATACTGAGAACTCAAGAGTCTGAATGTGC3’5’AAATGACTCTTTCGACACCGAAGTCATTGTAATCGCCCGTTAAGTAGCAGGTAGCACATTCAGACTCTTGAGTTCTCAGTATGTTGTTCCTCC3’
HCV	HA-P1HA-P2HCV-C-probeCapture-HCV-1Capture-HCV-2	5’CTATGAGTGACATGACTTGA3’5’AGTACGCCTAGTCTACTGTC3’5’TTCCTCACAGGGGAGTGATCTCAAGTCATGTCACTCATAGTACGCCTAGTCTACTGTCTTTTTCTGCGTGAAGACAGTAG3’Biotin-5’TTTGACGCTTTCTGCGTGAAGACA3’Biotin-5’TTTGCAGTACCACAAGGCCTTTCG3’	avianinfluenzavirussubtypeH5N1
HCV	HA-P1HA-P2HCV-C-probeCapture-HCV-1Capture-HCV-2		SARSvirus	SARS-P1SARS-P2SARS-C-probeCapture-SARS-1Capture-SARS-2	5’TATCTTGACACGAATATCAGCGT3’5’CGTAATGACCTTAGTTACT3’5’GTTGTCTGATATCACACATTGAGTACGCTGATATTCGTGTCAAGATACGCGTAATGACCTTAGTTACTCAACTACGAATAGGA3’Biotin-5’AGCTGATTTATCCAGATTGTTAACGATTACTTGGTTGGCA3’Biotin-5’AGTGTTTTAGTTCAACAGAACTTCCTTCCTTA3’

Claims

1、一种用于RNA病毒检测的滚环复制技术(RCA方法)及其衍生的酶联滚环复制技术，其中包括：H5N1、HCV和SARS病毒检测的寡核苷酸探针和对照探针。

2、权力要求1所述的RNA病毒检测RCA方法及其衍生的酶联滚环复制技术的探针包括图1所列的基因序列及其衍生探针及每种探针的互补探针或变体。

3、权力要求1所述的RNA病毒检测RCA方法及其衍生的酶联滚环复制技术包括如下病毒及其变异株：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)，人免疫缺陷性病毒(Human Immunodeficiency virus，HIV)和禽流感病毒H5N1及其它的流感病毒亚型等。

4、权力要求1所述的RNA病毒检测RCA方法及其衍生的酶联滚环复制技术，其介质为液相或链酶亲和素包被的磁珠固相。

5、权力要求1所述的RNA病毒检测的滚环复制技术(RCA方法)及其衍生的酶联滚环复制技术应用范围包括：H5N1、HCV和SARS病毒和其它RNA病毒。

6、权力要求5所述的本发明的应用范围包括人用，兽用及其它生物防御用。

7、权力要求1所述的RNA病毒检测的滚环复制技术(RCA方法)及其衍生的酶联滚环复制技术的反应程序和检测程序。