CN100557027C - 用于检测包括日本脑炎病毒血清群成员在内的某些黄病毒的组合物和方法 - Google Patents

用于检测包括日本脑炎病毒血清群成员在内的某些黄病毒的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检出样品中的某些黄病毒的快速和准确方法、引物、探针和试剂盒。可检测的黄病毒包括日本脑炎病毒血清群成员、登革热病毒、圣路易斯脑炎病毒、蒙太拿鼠耳蝠脑白质炎病毒、Modoc病毒和黄热病病毒。本发明的引物和探针可与待检病毒基因组3’非翻译区内的区域杂交。

Description

用于检测包括日本脑炎病毒血清群成员在内的某些黄病毒的组合物和方法
发明背景
黄病毒科家族和黄病毒属包括许多是潜在致死人病原体的病毒.这些病毒包括登革热病毒、黄热病病毒、Modoc病毒，以及日本脑炎病毒血清群中的病毒.日本脑炎病毒血清群包括若干种密切相关的病毒，诸如日本脑炎病毒(JEV)、西尼罗病毒(WNV)、圣路易斯脑炎病毒、Murray河谷脑炎病毒和Kunjin病毒.Kunjin病毒通常被认为是WNV变体的原因是这两种病毒之间的序列保守程度.根据序列分析结果，可将已表征的WNV菌株划分为两组，即I谱系和II谱系。
美国第一宗人类WNV感染是于1999年被报导的。从此开始每年爆发流行。2002年8月，当4个器官受体被单器官供体传染时，证实了WNV可通过除了蚊子叮咬以外的其它途径进行传播.该病毒由此被发现可通过输用血液制品(21宗已证实案例)和母乳喂养传播.
检测活性WNV感染是困难的，因为其症状是非特异性的，且病毒特异性抗体通常仅在病毒血症期之后才可被检出.此外，WNV-特异性IgM可持续1年以上，使人们难以区分活性感染和既往接触.因此，需要更多的灵敏检测方法，诸如直接检测病毒核酸的方法。对WNV及其它黄病毒感染的早期检测而言，检测病毒核酸的方法比目前应用的血清学方法更灵敏.
包括日本脑炎病毒血清群成员在内的其它黄病毒也是人类病原体。这些病原体包括日本脑炎血清群成员，诸如日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)和Murray河谷脑炎病毒，以及其它黄病毒，诸如登革热病毒、黄热病病毒和Modoc病毒。日本脑炎病毒血清群中除WNV以外的其它成员通过血液制品的传播尚未有记录.不过，这种传播是可能的，并且越来越有可能发生，因为这些病毒的分布更加广泛了。因此，高度需要能够检测上述是人类病原体的黄病毒的新型、灵敏并具有特异性的方法。此外，还非常需要能够检测若干日本脑炎血清群成员的单一试验方法。
发明简述
本发明提供了用于检测包括若干日本脑炎病毒血清群成员在内的某些黄病毒的核酸是否存在的组合物、方法和试剂盒.本发明的组合物和方法部分地基于特定寡核苷酸的发现，该寡核苷酸可作为，例如引物和探针，被用于检测日本脑炎病毒血清群成员.例如，可用本发明寡核苷酸检测西尼罗病毒、Kunjin病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)和Murray河谷脑炎病毒.本发明寡核苷酸可被进一步用于检测日本脑炎病毒血清群范围外的黄病毒，包括例如，登革热病毒、蒙太拿鼠耳蝠脑白质炎病毒、Modoc病毒和黄热病病毒.根据本文所述方法，本发明寡核苷酸可作为引物和探针，被用于检测上述黄病毒。
在某些方面，本发明提供了用于检测若干日本脑炎病毒血清群成员的核酸的方法.该方法是以下文详述的本发明的可检测标记寡核苷酸作为探针，用于检测若干日本脑炎病毒血清群成员的核酸.该探针可与SEQ ID NO.：16所示核酸或其互补序列杂交，这是黄病毒核酸3’非翻译区内的一个保守序列区域，可根据本发明检测.在本发明的某些实施方案中，具有5’-3’外切核酸酶活性的模板依赖型核酸聚合酶可使上述探针断裂，其中该可检测标记探针的断裂说明存在日本脑炎血清群成员的核酸.
在某些实施方案中，所述方法包括在可检测标记核酸探针的存在条件下扩增日本脑炎病毒血清群成员的核酸，其中的可检测标记核酸探针包括SEQ ID NO.：17所示序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述方法包括在可检测标记寡核苷酸的存在条件下扩增日本脑炎病毒血清群成员的核酸，其中的可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO.：18所示序列或其互补序列.SEQ ID NO.：18是可与目前已知的黄病毒核酸的保守区杂交的寡核苷酸序列，可根据本发明检测.在另一些实施方案中，所述方法包括在可检测标记核酸探针的存在条件下扩增日本脑炎病毒血清群成员的核酸，其中的可检测标记探针包括SEQ ID NO.：28所示序列或其互补序列。SEQ IDNO.：28是可根据本发明被用于检测黄病毒的特异性探针核酸序列.
在某些实施方案中，所述探针包括可检测部分.不加限制的话，该可检测部分可以是本领域技术人员已知的任意可检测部分.例如，该可检测部分可以是荧光部分.在某些实施方案中，所述荧光部分可选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料和
Figure C20048001479000061
家族染料.在一种优选实施方案中，所述荧光部分是6-羧基荧光素.
在某些实施方案中，所述探针包括猝灭剂部分.不加限制的话，该猝灭剂部分可以是本领域技术人员已知的任意猝灭剂部分。在某些实施方案中，所述猝灭剂部分可选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料、
Figure C20048001479000062
家族染料和非荧光猝灭剂部分.在某些实施方案中，所述非荧光猝灭剂部分可以是BHQTM-家族染料、IowaBlackTM或Dabcyl.在一种优选实施方案中，所述猝灭剂部分为Cy5TM.
在某些方面中，可用本发明寡核苷酸检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.在某些实施方案中，可与SEQ ID NO.：1所示核酸杂交的第一种寡核苷酸可作为引物，被用于扩增日本脑炎病毒血清群成员的核酸.SEQ ID NO.：1基于了特定序列的发现，该序列是日本脑炎病毒血清群成员的保守序列，可根据本发明检测。在某些实施方案中，所述第一种引物包括SEQ ID NO.：2所示序列中的至少16个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述第一种引物包括SEQ ID NO.：3所示序列.SEQ I D NO.：3是以特定保守区的发现为基础的引物序列，该保守区是目前所有已知来源于日本脑炎病毒血清群成员的序列的保守区，可根据本发明检测.在另一些实施方案中，所述第一种引物包括SEQ ID NO.：8所示序列.SEQ ID NO.：8是可根据本发明被用于扩增日本脑炎血清群成员核酸的特异性引物序列.
在某些实施方案中，可与SEQ ID NO.：9所示核酸杂交的第二种寡核苷酸可作为引物，被用于扩增日本脑炎病毒血清群成员的核酸.SEQID NO.：9是以特定序列的发现为基础的共有序列，该特定序列是日本脑炎病毒血清群成员的保守序列，可根据本发明检测.在某些实施方案中，所述第二种引物包括SEQ ID NO.：10所示序列中的至少16个连续核苷酸.SEQ ID NO.：10是SEQ ID NO.：9的互补序列。在另一些实施方案中，所述第二种引物包括SEQ ID NO.：11所示序列。SEQID NO.：11是以特定保守区的发现为基础的引物序列，该特定保守区是目前所有已知来源于日本脑炎病毒血清群成员的序列的的保守区，可根据本发明检测.在另一些实施方案中，所述第二种引物包括SEQ IDNO.：15或SEQ ID NO：74所示序列。SEQ ID NO.：15和SEQ ID NO：74是可根据本发明被用于扩增日本脑炎病毒血清群成员核酸的特异性引物序列.在某些实施方案中，所述第一和第二种引物可被一起应用在检测日本脑炎血清群成员核酸的方法中.
在某些实施方案中，所述方法包括在特定的可检测标记核酸探针的存在条件下扩增日本脑炎病毒血清群成员的核酸，该可检测标记探针包括荧光部分和猝灭剂部分.在某些实施方案中，具有5’-3’核酸酶活性的模板依赖型核酸聚合酶使所述可检测标记探针断裂，从而将荧光部分和猝灭剂部分分离.在某些实施方案中，可通过监测荧光的发射，检测所述探针的断裂并进而确定日本脑炎病毒血清群成员核酸的存在.
在某些实施方案中，可通过使日本脑炎血清群成员的核酸与共价连接在固相支持体上的本发明引物或探针杂交，以检测该核酸.在某些实施方案中，可通过使上述核酸与可检测标记引物或探针杂交，以检测该核酸.在另一些实施方案中，可通过将可检测部分掺入上述核酸中，以直接检测该核酸.
在另一些实施方案中，可利用共价连接有2个或多个本发明引物或探针的毫微粒子检测日本脑炎血清群成员的核酸.在另一些实施方案中，可通过利用本发明引物和/或探针进行的滚环扩增试验检测日本脑炎血清群成员的核酸.在另一些实施方案中，则可通过利用两种本发明引物进行的链置换扩增试验检测日本脑炎血清群成员的核酸。在另一些实施方案中，可通过利用本发明引物和/或探针进行的转录介导扩增试验检测日本脑炎血清群成员的核酸.在另一种实施方案中，可通过利用本发明引物和/或探针进行的以核酸序列为基础的扩增(NASBA)试验检测日本脑炎血清群成员的核酸.在另一种实施方案中，则可通过利用本发明引物和/或探针进行的诊断PCR检测日本脑炎血清群成员的核酸.
在某些实施方案中，本发明的第一种和第二种引物和探针可被一起应用在检测日本脑炎血清群成员的方法中。在某些实施方案中，可利用包括分子信标的本发明探针检测日本脑炎血清群成员的核酸.在另一些实施方案中，可通过利用本发明引物和/或探针进行的以核酸序列为基础的扩增试验检测日本脑炎血清群成员的核酸.在另一些实施方案中，则可通过利用本发明的两种引物扩增日本脑炎血清群成员的核酸，并接着用本发明的可检测标记探针检测该核酸，以检出该核酸.在某些实施方案中，可通过利用本发明引物和/或探针进行的斑点印迹试验检测日本脑炎血清群成员的核酸.在另一些实施方案中，可通过利用本发明引物和/或探针进行的反向斑点印迹试验检测日本脑炎血清群成员的核酸。在另一些实施方案中，则可利用诸如树突状聚合物的多价探针检测日本脑炎血清群成员的核酸.
除了上述方法外，本发明进一步提供了用于检测日本脑炎血清群成员核酸的核酸引物和探针.在某些方面中，本发明提供了用于检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸引物.在某些实施方案中，所述引物包括可与SEQ ID NO.：1所示核酸杂交的核酸.在某些实施方案中，所述核酸引物包括SEQ ID NO.：2所示序列中的至少16个连续核苷酸。在另一些实施方案中，所述核酸引物包括SEQ ID NO.：3所示序列.在另一些实施方案中，所述核酸引物则包括SEQ ID NO.：8所示序列.
在某些实施方案中，所述核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列23号位的N6-烷基-脱氧腺苷.在一种特定实施方案中，所述核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列23号位的N6-甲基-脱氧腺苷。在某些实施方案中，所述核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列24号位的N6-烷基-脱氧腺苷.在一种特定实施方案中，所述核酸引物包括SEQ IDNO.：8所示序列24号位的N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷.在某些实施方案中，所述核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列23和24号位的N6-烷基-脱氧腺苷。在另一种特定实施方案中，所述核酸引物包括SEQ IDNO.：8所示序列23号位的N6-甲基-脱氧腺苷和SEQ ID NO.：8所示序列24号位的N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷.
在某些实施方案中，本发明提供了用于检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸引物.在某些实施方案中，所述引物包括可与SEQ ID NO.：9所示核酸杂交的核酸.在另一些实施方案中，所述核酸引物包括SEQ IDNO.：10所示序列中的至少16个连续核苷酸。在另一些实施方案中，所述核酸引物包括SEQ ID NO.：11所示序列.在另一些实施方案中，所述核酸引物则包括SEQ ID NO.：15或SEQ ID NO.：74所示序列。在某些实施方案中，所述核酸引物包括SEQ ID NO.：15或SEQ ID NO.：74所示序列中24号位的N6-烷基-脱氧腺苷。在一种特定实施方案中，所述核酸引物包括SEQ ID NO.：15或SEQ ID NO.：74所示序列中24号位的N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷.
在另一些方面中，本发明提供了用于检测黄病毒核酸的核酸探针.可用该探针检测的黄病毒核酸包括，例如，日本脑炎病毒血清群成员、登革热病毒、黄热病病毒、蒙太拿鼠耳蝠脑白质炎病毒和Modoc病毒.在某些实施方案中，所述探针包括可与SEQ ID NO.：16所示核酸或其互补序列杂交的核酸.在某些实施方案中，所述核酸探针包括SEQ IDNO.：17所示序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述核酸探针包括SEQ ID NO.：18所示序列或其互补序列.在另一些实施方案中，所述核酸探针则包括SEQ ID NO.：28所示序列或其互补序列。
在某些实施方案中，本发明提供了包括荧光部分和猝灭剂部分的核酸探针。在某些实施方案中，当所述探针完整时，所述荧光部分与猝灭剂部分的相对定位可使该荧光部分发射的光子被猝灭剂部分吸收。具有5’核酸酶活性的酶对该探针的断裂可使其荧光部分与猝灭剂部分分离，从而使荧光部分发射的光子可以被检出.
在另一些方面中，本发明提供了用于检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸的试剂盒.在某些实施方案中，所述试剂盒包括本发明的寡核苷酸.在进一步的实施方案中，所述试剂盒包括本发明一种或多种引物与探针的组合.例如，在一种实施方案中，所述试剂盒包括可与SEQID NO.：1所示核酸杂交的第一种核酸引物；可与SEQ ID NO.：9所示核酸杂交的第二种核酸引物；以及可与SEQ ID NO.：16所示核酸或其互补序列杂交的核酸探针.
在某些实施方案中，本发明试剂盒的第一种核酸引物包括SEQ IDNO.：2所示序列中的至少16个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：3所示序列.在另一些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列.在某些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列23号位的N6-烷基-脱氧腺苷.在一种特定实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列23号位的N6-甲基-脱氧腺苷.在某些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列24号位的N6-烷基-脱氧腺苷.在一种特定实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列24号位的N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷.在某些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列23和24号位的N6-烷基-脱氧腺苷.在另一种特定实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列23号位的N6-甲基-脱氧腺苷和SEQ ID NO.：8所示序列24号位的N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷。
在某些实施方案中，本发明试剂盒的第二种核酸引物包括SEQ IDNO.：10所示序列中的至少16个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：11所示序列.在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：15所示序列.在某些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：15所示序列24号位的N6-烷基-脱氧腺苷.在一种特定实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：15所示序列24号位的N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷.
在某些实施方案中，本发明试剂盒的核酸探针包括SEQ ID NO.：17所示序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述核酸探针包括SEQ ID NO.：18所示序列或其互补序列.在另一些实施方案中，所述核酸探针则包括SEQ ID NO.：28所示序列或其互补序列.
在某些实施方案中，本发明试剂盒包括可作为核酸探针应用的寡核苷酸，其中该核酸探针连有一个或多个可检测部分。在某些实施方案中，所述的一个或多个可检测部分是荧光部分.在某些实施方案中，所述荧光部分可选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料和家族染料。在一种优选实施方案中，所述荧光部分是6-羧基荧光素.
在某些实施方案中，本发明试剂盒包括可作为核酸探针应用的寡核苷酸，其中该核酸探针连有至少一个猝灭剂部分。在某些实施方案中，所述猝灭剂可选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料、
Figure C20048001479000111
家族染料和非荧光猝灭剂部分。在某些实施方案中，所述非荧光猝灭剂部分可以是BHQTM-家族染料、Iowa BlackTM或Dabcyl。在一种优选实施方案中，所述猝灭剂部分为Cy5TM。在另一些实施方案中，所述探针包括至少一个可检测部分，例如荧光部分，和至少一个猝灭剂部分.
在某些实施方案中，本发明试剂盒包括热稳定DNA聚合酶.在某些实施方案中，所述热稳定DNA聚合酶具有逆转录活性.在某些实施方案中，本发明试剂盒还包括与根据本发明方法检测日本脑炎病毒血清群家族成员核酸有关的说明书。
本发明还提供了分离的多核苷酸，包括SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQID NO：39或SEQ ID NO：40.
本发明还提供了含有特定多核苷酸的载体，该多核苷酸包括SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40。
本发明还提供了含有特定序列的寡核苷酸，该序列含有至少10个相邻核苷酸，可与SEQ ID NO：29或其互补序列、SEQ ID NO：30或其互补序列、SEQ ID NO：31或其互补序列、SEQ ID NO：32或其互补序列、SEQ ID NO：33或其互补序列、SEQ ID NO：34或其互补序列、SEQID NO：35或其互补序列、SEQ ID NO：36或其互补序列、SEQ ID NO：37或其互补序列、SEQ ID NO：38或其互补序列、SEQ ID NO：39或其互补序列、SEQ ID NO：40或其互补序列杂交.在某些实施方案中，所述寡核苷酸与SEQ ID NO：68杂交，或与SEQ ID NO：69的互补序列杂交。在某些实施方案中，所述寡核苷酸包括选自SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的序列。在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67.在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有少于100个的核苷酸。
本发明还提供了含有特定寡核苷酸的反应混合物，该寡核苷酸包括可与SEQ ID NO：29或其互补序列、SEQ ID NO：30或其互补序列、SEQID NO：31或其互补序列、SEQ ID NO：32或其互补序列、SEQ ID NO：33或其互补序列、SEQ ID NO：34或其互补序列、SEQ ID NO：35或其互补序列、SEQ ID NO：36或其互补序列、SEQ ID NO：37或其互补序列、SEQ ID NO：38或其互补序列、SEQ ID NO：39或其互补序列、SEQ ID NO：40或其互补序列杂交的核苷酸序列.
在某些实施方案中，所述寡核苷酸与SEQ ID NO：68杂交，或与SEQ ID NO：69的互补序列杂交.在某些实施方案中，所述寡核苷酸包括选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的序列。在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67。
在某些实施方案中，所述反应混合物包括选自SEQ ID NO：64和SEQID NO：65的寡核苷酸；和选自SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的寡核苷酸.在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有少于100个的核苷酸.在某些实施方案中，所述反应混合物进一步包括可与SEQ ID NO：16或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸。
在某些实施方案中，所述反应混合物包括DNA聚合酶.
在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO.：17所示序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸.在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO.：28所示序列或其互补序列。在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括荧光部分.在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸进一步包括猝灭剂部分。
本发明还提供了检测圣路易斯脑炎病毒的方法.在某些实施方案中，所述方法包括在特定条件下，用至少一种包括可与SEQ ID NO：29或其互补序列、SEQ ID NO：30或其互补序列、SEQ ID NO：31或其互补序列、SEQ ID NO：32或其互补序列、SEQ ID NO：33或其互补序列、SEQ ID NO：34或其互补序列、SEQ ID NO：35或其互补序列、SEQ ID NO：36或其互补序列、SEQ ID NO：37或其互补序列、SEQ ID NO：38或其互补序列、SEQ ID NO：39或其互补序列或SEQ ID NO：40或其互补序列杂交的核苷酸序列的寡核苷酸扩增圣路易斯脑炎病毒的核酸，所述特定条件即允许从该寡核苷酸开始扩增上述核苷酸序列的至少一部分；并检测扩增核酸，以检测圣路易斯脑炎病毒.
在某些实施方案中，所述寡核苷酸包括选自SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的序列。在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67。在某些实施方案中，所述寡核苷酸与SEQ ID NO：68杂交，或与SEQ ID NO：69的互补序列杂交.在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有少于100个的核苷酸.
在某些实施方案中，圣路易斯脑炎病毒的核酸是用选自SEQ IDNO：64和SEQ ID NO：65的引物，以及选自SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的引物扩增的.
在某些实施方案中，所述检测步骤包括使可与SEQ ID NO：16杂交的可检测标记寡核苷酸与圣路易斯脑炎病毒核酸的扩增核酸杂交；并检测该探针与扩增核酸的杂交。
在某些实施方案中，可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO.：17所示序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸.在某些实施方案中，可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO.：28所示序列或其互补序列。在某些实施方案中，可检测标记寡核苷酸包括荧光部分.在某些实施方案中，可检测标记寡核苷酸进一步包括猝灭剂部分。
在某些实施方案中，扩增核酸的量是在扩增期间测定的，由此便可定量样品中的病毒.
在某些实施方案中，扩增步骤是在特定条件下，在包括具有5’-3’外切核酸酶活性的模板依赖型核酸聚合酶的扩增反应混合物中进行的，所述特定条件即允许该模板依赖型核酸聚合酶断裂所述可检测标记寡核苷酸的条件；该方法进一步包括检测所述可检测标记核酸寡核苷酸的断裂.
本发明还提供了用于检测圣路易斯脑炎病毒的试剂盒.在某些实施方案中，所述试剂盒包括含有特定核苷酸序列的寡核苷酸，该特定核苷酸序列可与SEQ ID NO：29或其互补序列、SEQ ID NO：30或其互补序列、SEQ ID NO：31或其互补序列、SEQ ID NO：32或其互补序列、SEQ ID NO：33或其互补序列、SEQ ID NO：34或其互补序列、SEQ ID NO：35或其互补序列、SEQ ID NO：36或其互补序列、SEQ ID NO：37或其互补序列、SEQ ID NO：38或其互补序列、SEQ ID NO：39或其互补序列、或SEQ ID NO：40或其互补序列杂交。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸与SEQ ID NO：68杂交，或与SEQID NO：69的互补序列杂交.在某些实施方案中，所述寡核苷酸包括选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的序列.在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67.
在某些实施方案中，所述试剂盒包括选自SEQ ID NO：64和SEQ IDNO：65的寡核苷酸，以及选自SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的寡核苷酸。在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有少于100个的核苷酸.在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括可与SEQ ID NO：16所示序列或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸.
本发明还提供了含有选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：62和SEQ ID NO：63的序列的寡核苷酸.在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63.
本发明还提供了含有特定寡核苷酸的反应混合物，该寡核苷酸包括选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63的序列.在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：56、SEQID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63.
在某些实施方案中，所述反应混合物进一步包括可与SEQ ID NO：25或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸。在某些实施方案中，所述反应混合物进一步包括具有FGGTCTAGAIGGTTAGAGGAGACCCTCCAG序列的可检测标记寡核苷酸，其中F为CY5、I为FAM、P为PO4、U为丙炔基dU、E为5-甲基-dC.在某些实施方案中，所述反应混合物进一步包括可与SEQ ID NO：16或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸。
在某些实施方案中，所述反应混合物包括DNA聚合酶.在某些实施方案中，所述反应混合物包括至少一种上游引物和至少一种下游引物。
本发明还提供了检测黄热病病毒的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在特定条件下，用至少一种含有选自SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63的序列的寡核苷酸扩增黄热病病毒的核酸，所述特定条件即允许从该寡核苷酸开始扩增上述核苷酸序列的至少一部分；并检测扩增核酸，以检测黄热病病毒。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63.在某些实施方案中，检测步骤包括使可与SEQ ID NO：25所示序列或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸与黄热病病毒核酸的扩增核酸杂交；并检测该可检测标记寡核苷酸与扩增核酸的杂交。
在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括FGGTCTAGAIGGTTAG AGGAGACCCTCCAG，其中F为CY5、I为FAM、P为PO4、U为丙炔基dU、E为5-甲基-dC。在某些实施方案中，检测步骤包括使可与SEQ ID NO：16或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸与黄热病病毒核酸的扩增核酸杂交；并检测该可检测标记寡核苷酸与扩增核酸的杂交.
在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO.：17所示序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸.在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO.：28所示序列或其互补序列.在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括荧光部分.在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸进一步包括猝灭剂部分.
在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有少于100个的核苷酸.在某些实施方案中，扩增核酸的量是在扩增期间测定的，由此便可定量样品中的病毒.
在某些实施方案中，扩增步骤是在特定条件下，在包括具有5’-3’外切核酸酶活性的模板依赖型核酸聚合酶的扩增反应混合物中进行的，所述特定条件即允许该模板依赖型核酸聚合酶断裂上述可检测标记寡核苷酸；该方法进一步包括检测该可检测标记寡核苷酸的断裂。
本发明还提供了用于检测黄热病病毒的试剂盒.该试剂盒包括含有选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63的序列的寡核苷酸。在某些实施方案中，该寡核苷酸选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ I D NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63。
在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括可与SEQ ID NO：16或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸.在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括可与SEQ ID NO：25或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸.在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括具有FGGTCTAGAIGGTTAGAGGAGACCCTCCAG的可检测标记寡核苷酸，其中F为CY5、I为FAM、P为PO4、U为丙炔基dU、E为5-甲基-dC。
在某些实施方案中，所述反应混合物包括DNA聚合酶.在某些实施方案中，所述反应混合物包括至少一种上游引物和至少一种下游引物。
本发明还提供了含有选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55的序列的寡核苷酸.在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQID NO：54和SEQ ID NO：55.
本发明还提供了包括特定寡核苷酸的反应混合物，该寡核苷酸含有选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55的序列.在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55.
在某些实施方案中，所述反应混合物进一步包括可与SEQ ID NO：16或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸.在某些实施方案中，所述反应混合物包括DNA聚合酶.在某些实施方案中，所述反应混合物包括至少一种上游引物和至少一种下游引物.
本发明还提供了检测登革热病毒的方法.在某些实施方案中，所述方法包括在特定条件下，用至少一种含有选自SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQID NO：55的序列的寡核苷酸扩增登革热病毒的核酸，所述特定条件即允许从该寡核苷酸开始扩增上述核苷酸序列的至少一部分；并检测扩增核酸，以检测登革热病毒.
在某些实施方案中，所述方法进一步包括使可与SEQ ID NO：16杂交的可检测标记寡核苷酸与扩增的登革热病毒核酸杂交；并检测该寡核苷酸与扩增核酸的杂交.在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55.
在某些实施方案中，所述核酸是用至少一种上游引物和至少一种下游引物扩增的.在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括SEQID NO.：17所示序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸.在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO.：18所示序列或其互补序列.在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸包括荧光部分.在某些实施方案中，所述可检测标记寡核苷酸进一步包括猝灭剂部分.
在某些实施方案中，所述寡核苷酸具有少于100个的核苷酸.在某些实施方案中，扩增核酸的量是在扩增期间测定的，由此便可定量样品中的病毒.在某些实施方案中，扩增步骤是在特定条件下，在包括具有5’-3’外切核酸酶活性的模板依赖型核酸聚合酶的扩增反应混合物中进行的，所述特定条件即允许该模板依赖型核酸聚合酶断裂上述可检测标记寡核苷酸；该方法进一步包括检测该可检测标记核酸寡核苷酸的断裂.
本发明还提供了用于检测登革热病毒的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包括含有选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55的序列的寡核苷酸.在某些实施方案中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQID NO：54和SEQ ID NO：55。
在某些实施方案中，所述试制盒进一步包括可与SEQ ID NO：16所示序列或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸。在某些实施方案中，所述反应混合物包括DNA聚合酶.
在某些实施方案中，定量步骤是利用内部或外部对照核酸进行的.参见被完整引入作为参考的美国专利Nos.5,476,774和5,219,727。
附图简述
图1所示为黄病毒基因组3’非翻译区内的一个保守序列区域，被确定为SEQ ID NO.：1，可利用本发明的组合物和方法检测，并可与本发明引物结合.SEQ ID NO.：2表示SEQ ID NO.：1的互补序列.
图2所示为黄病毒基因组3’非翻译区内的一个保守序列区域，被确定为SEQ ID NO.：9，可利用本发明的组合物和方法检测，并可与本发明引物结合.SEQ ID NO.：10表示SEQ ID NO.：9的互补序列.
图3所示为黄病毒基因组3’非翻译区内的一个保守序列区域，被确定为SEQ ID NO.：16，可利用本发明的组合物和方法检测，并可与本发明探针结合.SEQ ID NO.：17表示SEQ ID NO.：16的互补序列.在SEQ ID NO：16中，N为缺失、A或C.在SEQ ID NO：17中，N为缺失、T或G。
图4所示为本发明寡核苷酸的核酸序列与日本脑炎病毒血清群成员的核酸序列的对比.
图5所示为本发明寡核苷酸的核酸序列与非日本脑炎病毒血清群成员的可检测黄病毒的核酸序列的对比。
图6所示为归一化荧光与扩增循环数的关系图，显示了利用本发明寡核苷酸对系列稀释的提取WNV RNA的检测结果.
图7所示为许多SLEV分离物的基因组中的3’非翻译区序列，可用本发明的组合物和方法检测，并可与本发明引物结合。所列分离物的序列如下所示：BFS1750(SEQ ID NO：29)、1750-Std(SEQ ID NO：30)、TD6-4G(SEQ ID NO：31)、CoaV750(SEQ ID NO：32)、L695121.05(SEQID NO：33)、TNM771K(SEQ ID NO：34)、MSI-7(SEQ ID NO：35)、Kern217(SEQ ID NO：36)、CoaV608(SEQ ID NO：37)、TBH-28(SEQ ID NO：38)、VR1265(SEQ ID NO：39)和CoaV353(SEQ ID NO：40).
发明详述
1.缩写词
在本说明书的通篇内容中，被用于指含有特定核苷酸序列的核酸的缩写词是常规的单字母缩写.因此，当被包括在核酸中时，天然存在的编码核苷酸的缩写如下：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U).同样，如无另外指明，被表示为一组单字母缩写的核酸序列是以5′-＞3′方向表示的.
2.定义
“扩增反应”指任何可导致模板核酸序列的拷贝增加或使表明存在该模板的信号增强的反应(例如化学、酶促或其它类型的反应).扩增反应包括例如，聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)(参见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications(Innis et al.，eds，1990))、链置换扩增(SDA)(Walker，et al.Nucleic Acids Res.20(7)：1691-6(1992)；Walker PCR Methods Appl 3(1)：1-6(1993))、转录介导的扩增(Phyffer，et al.，J.Clin.Microbiol.34：834-841(1996)；Vuorinen，et al.，J.Clin.Microbiol.33：1856-1859(1995))、以核酸序列为基础的扩增(NASBA)(Compton，Nature350(6313)：91-2(1991))、滚环扩增(RCA)(Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)：75-99(1999))；Hatch et al.，Genet.Anal.15(2)：35-40(1999))、分支DNA信号扩增(bDNA)(Iqbal et al.，Mol.Cell Probes13(4)：315-320(1999))和Q-β复制酶(Lizardi et al.，Bio/Technology 6：1197(1988))。
本文所用“样品”指任何含有或被推测含有核酸的物质.该样品可以是天然或合成来源，并可通过本领域技术人员已知的任何方法获得。该样品可以是从一个或多个个体分离获得的组织或液体样品，包括但不限于，例如皮肤、血浆、血清、全血、脊髓液、精子、精液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、器官、肿瘤、支气管肺泡灌洗液，也可以是体外细胞培养组分的样品(包括但不限于由细胞在细胞培养基中生长而获得的条件培养基、重组细胞和细胞组成)。核酸可通过本领域已知的任意方法从生物学样品中获得.
本文所用术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指引物、探针、待检寡聚体片段、寡聚体对照物和未标记的封闭寡聚体，通常指多脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)的线型多聚体，以及嘌呤或嘧啶碱基，或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的其它任何N-糖苷.
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可含有磷酸二酯键或经过修饰的键，包括，但不限于磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硅氧烷键、碳酸酯键、羧甲基酯键、乙酰胺酯键、氨基甲酸酯键、硫醚键、桥联氨基磷酸酯键、桥联亚甲基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、桥联硫代磷酸酯键或砜键，以及这些键的组合.
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括5个在生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或除了这5个碱基以外的其它碱基.这些碱基可能具有多种用途，例如，使杂交稳定或不稳定；促进或抑制探针降解；或者充当连接可检测部分或猝灭剂部分的连接点.例如，本发明的多核苷酸可含有一个或多个修饰的、非标准或衍生的碱基部分，包括但不限于N6-甲基-腺嘌呤、N6-叔丁基-苄基-腺嘌呤、咪唑、取代咪唑、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-Dmannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine，2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w，2，6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶。修饰的、非标准或衍生的碱基部分的其它实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利Nos.6,001,611、5,955,589、5,844,106、5,789,562、5,750,343、5,728,525和5,679,785。
此外，核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括一个或多个经过修饰的糖部分，包括但不限于阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖和己糖.
本发明不希望受限于核酸、多核苷酸或寡核苷酸的来源。核酸、多核苷酸或寡核苷酸可来源于人类或非人类的哺乳动物，或其它任意生物体，或者来源于任意重组体、体外合成或通过化学方法合成.核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、杂合体或它们的任意混合物，并可能以双链、单链或部分双链形式存在.核酸还可以是被完整引入本文作为参考的美国专利5,696,248所描述的衍生核酸.本发明的核酸包括纯化或未纯化形式的核酸及其片段，包括诸如微生物，例如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉、真菌和植物、动物、人类等的生物学材料的基因、染色体、质粒，基因组.
术语核酸、多核苷酸和寡核苷酸的长度无特定的差别，且这些术语均可互换使用.这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA.
本文所用术语“残基”指上文所定义核酸内的核苷酸或碱基.不加限制的话，残基可以是本领域技术人员已知的任意核苷酸，包括上述所有通过生物学方法生成的核苷酸和通过非生物学方法生成的核苷酸.
术语“引物”指能够在特定条件下，沿模板核酸链充当多核苷酸合成起始点的寡核苷酸，所述特定条件即允许合成与所述模板链互补的引物延伸产物.该引物可从重组体来源中获得，形式为纯化的限制片段，或者通过合成方法制备而得。引物延伸条件典型地包括在合适的温度下，在合适的缓冲液(“缓冲液”可以包括本身是辅因子或影响pH、离子强度等的取代物)中含有四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和具有聚合活性的试剂，诸如DNA聚合酶或逆转录酶.该引物优选在扩增中效率最高的单链。本发明的引物可能含有，例如5-500个核苷酸，在某些实施方案中，将含有至少10、20、30、25、30、40、50、75或100个核苷酸和/或含有少于500、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、25或20个的核苷酸.
术语“杂交”指单链核酸或双链核酸的局部单链区域与具有互补序列的另一个单链核酸或双链核酸的局部单链区域的结合.就本领域技术人员所知，两条核酸链并不需要完全互补便可彼此杂交。根据杂交条件，核酸可与其互补序列杂交，即使两条链或其中的一条链中存在较少、若干或许多错配、缺失或添加的情况也可杂交.在某些实施方案中，正如下文所定义的，本发明的引物和探针可以选择性地与至少部分互补的核酸杂交.在某些实施方案中，本发明的引物和探针可在下文定义的严格条件下与至少部分互补的序列杂交.
本文所用术语“严格”或“严格条件”正如本领域所熟知的，指低离子强度和高温度的杂交条件；参见被引入本文作为参考的，例如Maniatis等人于1989年出版的第2版分子克隆：实验室手册；J.Wiley&Sons publ.，New York 1988年出版的Ausubel等人编辑的CurrentProtocols in Molecular Biology和Tijssen在1993的生物化学和分子生物学方面的技术-与核酸探针的杂交中的“杂交原理综述和核酸试验方案”.通常，所选严格条件比特定序列在定义的离子强度和pH条件下的热解链温度(Tm)低大约5-30℃.可选地，所选严格条件比特定序列在定义的离子强度和pH条件下的热解链温度(Tm)低大约5-15℃.Tm指在与靶互补的探针中，有50％的探针与靶序列杂交并处于平衡状态时的温度(在定义的离子强度、pH和核酸浓度条件下)(即当靶序列过量存在时，在Tm条件下，50％的探针被占用了，并处于平衡状态)。例如，严格杂交条件可以如下，其中在大约pH7.0到大约pH8.3的条件下，盐浓度小于大约1.0M钠(或其它盐)离子，典型地为大约0.01到大约1M钠离子浓度，且对短探针(例如具有10-50个核苷酸)而言，温度至少为大约25℃，对长探针(例如具有多于50个的核苷酸)而言，温度至少为大约55℃。严格条件还可通过加入诸如甲酰胺的杂交去稳定剂而得以改变。
本文所用术语“选择性”或“选择性条件”指适用于本发明引物和/或探针的杂交条件，可实现对特定样品中的可检测黄病毒核酸进行的扩增、检测和/或定量，所述特定样品可能含有并非来源于可检测黄病毒的其它核酸，或来源于黄病毒基因组中无关区域的其它核酸.可检测黄病毒如下所述.
本文所用的核酸序列的“互补序列”指处于反平行结合状态的寡核苷酸，即当其与所述核酸序列进行对比时，一个序列的5’末端可与另一个序列的3’末端配对.核酸序列的互补序列无需与该序列的每一个核苷酸都准确配对；稳定的双链体可能含有错配碱基对或未配对碱基.核酸技术领域的技术人员可根据经验考虑许多变量，包括例如所述寡核苷酸的长度、该寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度、错配碱基对的发生率的影响，确定双链体的稳定性.
核酸双链体的稳定性是通过解链温度或“T.”的测定而得以确定的.特定核酸双链体在特定条件下的T.是一半的潜在碱基对解离的温度。
本文所用术语“探针”指可与核酸的一个区域形成双链结构的寡核苷酸，而形成双链结构的原因是该探针的至少一个序列与上述区域中的序列具有互补性.优选的探针不包括与引物序列互补的序列.如下所述，该探针可以是标记或未标记的.该探针的3’末端可以被“加帽”，以阻止该探针掺入引物延伸产物中.“加帽”可通过利用非互补碱基或通过将诸如生物素或磷酸盐基团的化学部分加入最后一个核苷酸的3’羟基中而得以实现，根据所选部分的不同，加帽可能具有双重用途，即还充当标记，可用于后续检测或捕获与该标记相连的核酸.加帽还可通过除去上述3’羟基或通过利用无3’羟基的核苷酸，诸如双脱氧核苷酸而得以实现.
本文所用术语“可检测部分”指可被用于提供可检测(任选地可量化的)信号，和可与核酸或蛋白质相连的任何原子或分子.可检测部分可能提供通过荧光性、放射性、比色法、重量分析法、X线衍射或吸收法、磁性、酶促活性等方法可检测的信号.适用于本发明的合适的可检测部分包括那些用于检测寡核苷酸片段大小的可检测部分.
本文所用术语“荧光部分”指可在特定条件下发射光的化学部分，该条件即适用于该特定部分的条件。典型地，特定的荧光部分可在吸收较短波长的光之后发射特定波长的光.由特定荧光部分发射的光的波长是该部分的特征.因此，可在利用较短波长的光激发特定荧光部分之后，通过检测合适波长的光，以检出该荧光部分.可应用于本发明方法和组合物的荧光部分的实例包括，但不限于荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料和家族染料.
本文所用术语“猝灭剂部分”指可在特定条件下吸收荧光部分所发射能量的化学部分，所述特定条件即当该猝灭剂部分充分接近荧光部分，例如当该猝灭剂和荧光部分与同一多核苷酸相连时.该现象在本领域通常被称为荧光共振能量转移(“FRET”)。猝灭剂部分可再次发射从荧光部分吸收的能量，形成该猝灭剂部分的特有信号，因此猝灭剂也可以是“荧光部分”。可选地，猝灭剂部分可能在加热时将从荧光部分吸收的能量散失.
本文所定义的“5’-3’核酸酶活性”或“5’核酸酶活性”指可以序贯方式将寡核苷酸5’末端的核苷酸除去的酶活性。该5’核酸酶活性可以是5’-3’外切核酸酶活性或5’-3’内切核酸酶活性.例如，许多模板特异性核酸聚合酶表现的是通常与某些DNA聚合酶相关的5’-3’外切核酸酶活性，(即大肠杆菌DNA聚合酶I具有该活性，而大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段则无该活性).5’-3’外切核酸酶活性还可从底物核酸的5’末端开始裂解多于一个的磷酸二酯键(核苷酸)。虽然无意受限于任何特定的探作理论，对导致探针释放裂解的寡核苷酸片段这一方面而言，与DNA聚合酶相关的5’-3’外切核酸酶活性仍然被认为取决于所述探针的特定核苷酸组成.例如，在所述寡核苷酸与模板核酸二者的核苷酸之间，尤其是出现在所述寡核苷酸5’末端处的匹配或错配数目可影响该5’-3’外切核酸酶活性，正如例如，被完整引入此处作为参考的Holland et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：7276-80所描述的.
本文所用术语“对照5’核酸酶反应”指如下所述基于已知量的，例如已知拷贝数的可检测黄病毒核酸进行的5’核酸酶反应。由这种反应发射的荧光量可与基于含未知量日本脑炎病毒血清群核酸的样品所进行的反应比较，以评估该样品中存在的这种核酸的量.
本文所用术语“相邻”指所述引物相对于所述探针在模板核酸的相同或互补链上的定位.所述引物和探针可能被多于大约150个的核苷酸、多于大约125个的核苷酸、多于大约100个的核苷酸、多于大约80个的核苷酸、多于大约60个的核苷酸、多于大约50个的核苷酸、多于大约40个的核苷酸、多于大约30个的核苷酸、多于大约20个的核苷酸、大约1到大约20个核苷酸、大约1到大约10个核苷酸分隔开，或者可能直接地彼此相邻.如果需要采用不依赖于聚合作用的方法检测黄病毒核酸，则所述探针与探针优选地被大约1到大约10个核苷酸分隔开.在依赖于聚合作用的方法中，例如，本文所述的PCR扩增和检测方法中，探针可能与待扩增序列任意位置，即引物下游的可检测核酸杂交，从而使引物延伸可以确定聚合酶的位置，进而得以断裂该探针。
术语“热稳定核酸聚合酶”指与例如大肠杆菌来源的核苷酸聚合酶相比，对热相对稳定并可催化核苷三磷酸的聚合作用的酶.通常，这种酶是从被本领域技术人员认为嗜热的生物体中获得.该酶通常会在已退火至引物结合序列的引物的3’末端处开始合成，并将继续向模板的5’末端合成新链.如果该聚合酶具有5’-3’核酸酶活性，它可以水解已退火至模板的间插探针，以释放已标记和未标记的探针片段，直到聚合作用终止或所有探针片段与待检核酸解离为止。美国专利4,889,818描述了分离自栖热水生菌(Taq)的代表性热稳定酶，Saikiet al.，1988，Science 239：487-91描述了将其应用于常规PCR的方法.另一种代表性的热稳定酶包括栖热菌种Z05 DNA聚合酶。参见例如美国专利5,674,738.
Taq DNA聚合酶具有DNA合成依赖型链置换5’-3’外切核酸酶活性(参见Gelfand在Stockton Press，N.Y.(1989)出版和Erlich编辑的“PCR技术原理及其在DNA扩增方面的应用“第2章中的“Taq DNA聚合酶”。因此，当探针未与模板DNA结合时，Taq DNA聚合酶不会降解该探针。
术语核酸引物或探针的“5’核酸酶反应”正如上文所定义和下文将详细描述的，指当利用具有5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶延伸引物时，与所述核酸杂交的探针的降解.这种反应是基于被完整引入本文作为参考的美国专利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015所描述的方法.
为确定两个核酸序列的“互补性百分率”或“同一性百分率”，对这两个序列进行对比，以获得最适比较结果(例如，可将缺口导入第一个核酸序列中，用于与第二个核酸序列进行最适对比)。接着比较相应核苷酸位置上的核苷酸.当第一个序列中的一个位置被与第二个序列中相应位置上的核苷酸互补的核苷酸占据时，这两个分子在该位置上是互补的。同样，当第一个序列中的一个位置被与第二个序列中相应位置上的相同核苷酸占据时，则这两个分子在该位置上是一致的。这两个序列的互补性百分率(或同一性百分率)是被比较的总位置数目除这两个序列所共有的互补位置(或一致位置)数目后所获结果的函数(即％互补性＝互补重叠位置数目/较短核苷酸的总位置数目x100％；和％同一性＝一致重叠位置数目/较短核苷酸的总位置数目x100％)。
对两个序列之间的同一性百分率的测定还可利用数学算法实现.被用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin和Altschul于1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2264-2268公开的算法，以及Karlin和Altschul于1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5877公开的改良算法.这种算法被合并进Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403所公开的NBLAST程序中.
如无另外指明，本发明的实践将应用到属于本领域技术范畴的常规分子生物学、微生物学技术和重组DNA技术.这些技术在文献中得到了完整阐释.参见例如Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York 2001年出版的Sambrook等人编辑的第三版Molecular Cloning：A Laboratory Manual；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait于1984年编辑的)；Nucleic AcidHybridizat ion(核酸杂交)((B.D.Hames&S.J.Higgins于1984年编辑的)；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal于1984年编辑的)；以及一系列的Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)。
3.用于检测日本脑炎血清群成员和其它某些黄病毒的核酸的核酸引物和探针
本发明提供了可作为引物和探针被用于检测日本脑炎病毒血清群成员和其它某些黄病毒属成员的核酸是否存在的寡核苷酸及它们的应用方法.下文详述了这些引物和探针.应当指出的是，虽然本文论述的引物可能被指出尤其用于扩增特定病毒类型(例如西尼罗病毒、SLEV、登革热病毒、黄热病病毒等)，这些引物也可以用于扩增其它病毒.
可对应用于本发明方法的寡核苷酸进行设计，使其包括被不同菌株的黄病毒或被日本脑炎病毒血清群的两个或多个成员或黄病毒属的其它成员保守的核苷酸序列或其互补序列.包括被不同菌株或血清群成员或属成员保守的序列的寡核苷酸可能被用作例如，引物或探针，被用于检测不同菌株或成员，从而减少检测不同菌株或成员所必需的引物或探针数量.保守序列可包括，例如在两个或多个菌株或日本脑炎病毒血清群的两个或多个成员或黄病毒属其它成员之间，完全(即100％)或基本上一致的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50个或更多的相邻核苷酸.基本上一致的序列包括那些例如，在包括上述相邻核苷酸的两个或多个菌株之间具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列
3.1.核酸引物
基于SEQ ID NO：1的引物
在一个方面中，本发明提供了可被应用在检测日本脑炎病毒血清群成员的方法中的核酸引物.在某些实施方案中，可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员的第一种核酸引物包括可与SEQ ID NO.：1所示核酸或其互补序列杂交的核酸.如图1所示的SEQ ID NO.：1显示了黄病毒基因组3’非翻译区内的一个保守序列区域，可利用本发明的组合物和方法检测.SEQ ID NO.：2显示了SEQ ID NO.：1的互补序列.
在本发明的上述实施方案中，所述第一种核酸引物具有可使其在特定条件下与SEQ ID NO.：1所示核酸杂交的核苷酸组成，即化学结构。在某些情况中，与核酸杂交的引物的各核苷酸将与该核酸的核苷酸形成碱基配对互补序列.例如，包括可与SEQ ID NO.：1所示核酸中的C残基杂交的标准核苷酸的引物应在该相应位置具有G残基.因此，与SEQ ID NO.：1所示核酸的杂交确定了引物的核苷酸序列，并进而确定了该引物的准确化学结构.此外，根据上文对寡核苷酸和引物的定义，所述第一种核酸引物还可包括非标准核苷酸.某些这样的非标准核苷酸还可与其它标准或非标准核苷酸结合并形成碱基对.例如，非标准核苷酸肌苷可与尿嘧啶、胞嘧啶和腺嘌呤配对.假定杂交与化学结构之间的相关性已知，本领域技术人员可容易地识别本发明引物的标准特征.下文具体描述了典型实施方案.
在某些实施方案中，与SEQ ID NO.：1所示核酸杂交的第一种核酸引物可以短至大约6个核苷酸.在另一些实施方案中，所述第一种核酸引物可以长至大约80个核苷酸。在某些实施方案中，所述第一种核酸引物具有大约10个、大约12个、大约14个、大约15个、大约16个、大约17个、大约18个、大约19个、大约20个、大约21个、大约22个、大约23个、大约24个、大约25个、大约26个、大约27个、大约28个、大约29个、大约30个、大约35个或大约40个核苷酸.在某些实施方案中，所述第一种核酸引物具有少于100、80、70、60、50、40、30、25、21或20个的核苷酸。
可对引物的长度和组成进行选择，以提供充分的热动力学稳定性，进而确保该引物与黄病毒核酸在合适反应条件下的杂交，该反应条件取决于待实施的检测方法.例如，具有修饰的、非标准或衍生核苷酸的引物可能比具有常规核苷酸的引物长或短，却仍具有类似的热动力学杂交特性。这种非标准碱基的实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,320,005、6,174,998、6,001,611和5,990,303。另一个实例是，与具有富含A/T序列且长度相似的引物相比，具有富含G/C序列的引物可能在较高温度条件下退火至靶序列。因此，在某些实施方案中，所述第一种核酸引物包括上文定义的修饰的、非标准或衍生碱基.
在某些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：2所示序列中的至少大约16个连续核苷酸.如图1所示的SEQ ID NO.：2是SEQ ID NO.：1的互补序列.在另一些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：2所示序列中的至少大约18个连续核苷酸。在另一些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：2所示序列中的至少大约20个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述第一种核酸引物则包括SEQ ID NO.：2所示序列中的至少大约22个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：2所示序列中的至少大约24个连续核苷酸.
在某些实施方案中，本发明提供了可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸引物.通过参考核酸序列，可在结构上定义这些引物，如表1所示.
  表1
  SEQ ID NO.：3  GN<sup>2</sup>AAN<sup>5</sup>CCN<sup>8</sup>N<sup>9</sup>N<sup>10</sup>CN<sup>12</sup>N<sup>13</sup>AN<sup>15</sup>CN<sup>17</sup>N<sup>18</sup>N<sup>19</sup>N<sup>20</sup>TCGGN<sup>25</sup>N<sup>26</sup>日本脑炎病毒血 其中N<sup>2</sup>为T或A；N<sup>5</sup>为G或C；N<sup>8</sup>为T或缺失；9清群引物1      号位的N为C或G；N<sup>10</sup>为T或C；N<sup>12</sup>为A或G；N<sup>13</sup>为G或A；N<sup>15</sup>为A或C；N<sup>17</sup>为C或T；N<sup>18</sup>为G或C；N<sup>19</sup>为T或C；N<sup>20</sup>为C或T；N<sup>25</sup>为A或G；和N<sup>26</sup>为A或T.
  SEQ ID NO.：4  GTAAGCCN<sup>8</sup>CN<sup>10</sup>CAGAACCGN<sup>19</sup>N<sup>20</sup>TCGGAA西尼罗病毒引物其中N<sup>8</sup>为缺失或T；N<sup>10</sup>为T或C；N<sup>19</sup>为T或C；1和N<sup>20</sup>为C或T.
  SEQ ID NO.：5  GAAAN<sup>5</sup>CCN<sup>8</sup>CTCN<sup>12</sup>N<sup>13</sup>AACN<sup>17</sup>GTN<sup>20</sup>TCGGAA日本脑炎病毒引其中N<sup>5</sup>为G或C；N<sup>8</sup>为缺失；N<sup>12</sup>为A或G；N<sup>13</sup>物1            为G或A；N<sup>17</sup>为C或T；和N<sup>20</sup>为C或T.
  SEQ ID NO.：6  GAAAGCCTCCCAGAN<sup>15</sup>CCGTN<sup>20</sup>TCGGAAMurray河谷脑   其中N<sup>15</sup>为A或C；和N<sup>20</sup>为C或T.炎病毒引物1
  SEQ ID NO.：7  GTAAGCCCTCAGAACCGTCTCGGAAKoutango病毒引物1
  SEQ ID NO.：8  GTAAGCCCTCAGAACCGTCTCGGAA实例引物1
  SEQ ID NO.：11 N<sup>1</sup>CCN<sup>4</sup>AN<sup>6</sup>TN<sup>8</sup>TN<sup>10</sup>N<sup>11</sup>N<sup>12</sup>N<sup>13</sup>CCAGGTN<sup>20</sup>TCAA日本脑炎病毒   其中N<sup>1</sup>为T或C；N<sup>4</sup>为C或T；N<sup>6</sup>为G或C；N<sup>8</sup>血清群引物2    为C或A；N<sup>10</sup>为A或T；N<sup>11</sup>为缺失或T；N<sup>12</sup>为T或C；N<sup>13</sup>为C或T；和N<sup>20</sup>为G或A.
  SEQ ID NO.：12 N<sup>1</sup>CCTAGTCTATCCCAGGTN<sup>19</sup>TCAA西尼罗病毒引   其中N<sup>1</sup>为T或C和N<sup>19</sup>为G或A.物2
  表1
  SEQ ID NO.：13  CCCN<sup>4</sup>AN<sup>6</sup>TN<sup>8</sup>TATN<sup>12</sup>N<sup>13</sup>CCAGGTGTCAA日本脑炎病毒引  其中N<sup>4</sup>为C或T；N<sup>6</sup>为G或C；N<sup>8</sup>为C或A；N<sup>12</sup>物2             为T或C；和N<sup>13</sup>为C或T.
  SEQ ID NO.：14  TCCTAGTCTTTTCCCAGGTGTCAAMurray河谷脑炎病毒引物2
  SEQ ID NO.：15  TCCTAGTCTATCCCAGGTGTCAA实例引物2
  SEQ ID NO.：74  TCTCCTAGTCTATCCCAGGTGTCAA实例引物2
在某些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NOS.：3-8所示的任意序列.在本发明的某些实施方案中，为了提高引物特异性，所述引物可在其3’末端或附近包括一个或多个烷基化核苷酸。例如，在某些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列，其中23号位残基为N6-烷基-脱氧腺苷.在一种特定实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列，其中23号位残基为N6-甲基-脱氧腺苷.在某些实施方案中，所述第一种核酸包括SEQID NO.：8所示序列，其中24号位残基为N6-烷基-脱氧腺苷.在一种特定实施方案中，所述第一种核酸包括SEQ ID NO.：8所示序列，其中24号位残基为N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷.在某些实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列，其中23号位残基为N6-烷基-脱氧腺苷，24号位残基为N6-烷基-脱氧腺苷.在另一种特定实施方案中，所述第一种核酸引物包括SEQ ID NO.：8所示序列，23号位残基为N6-甲基-脱氧腺苷，24号位残基则为N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷。被上文引入作为参考的美国专利6,001,611描述了N6-烷基-脱氧腺苷，以及可与这种非标准核苷酸一起应用的烷基部分的同一性.例如，在某些实施方案中，所述烷基部分包括C1到大约C10具有支链或无支链的烷基。在另一些实施方案中，所述烷基部分包括C1到大约C20具有支链或无支链的烷基.
在另一个方面中，本发明提供了用于检测日本脑炎病毒血清群成员的第二种核酸引物，包括可与SEQ ID NO.：9所示核酸或其互补序列杂交的核酸.如图2所示的SEQ ID NO.：9显示了黄病毒基因组3’非翻译区内的一个保守序列区域，可利用本发明的组合物和方法检测。图2还显示了SEQ ID NO.：9的互补序列，即SEQ ID NO.：10。
在本发明的上述实施方案中，所述第二种核酸引物具有可使其与SEQ ID NO.：9所示核酸杂交的核苷酸组成，即化学结构。例如，包括可与SEQ ID NO.：9所示核酸中的C残基杂交的标准核苷酸的引物应在相应位置具有G残基.因此，与SEQ ID NO.：9所示核酸的杂交确定了引物的核苷酸序列，并进而确定了该引物的准确化学结构.此外，根据上文对寡核苷酸和引物的定义，所述第二种核酸引物还可包括非标准核苷酸.某些这样的非标准核苷酸还可与其它标准或非标准核苷酸结合并形成碱基对.例如，非标准核苷酸肌苷可与尿嘧啶、胞嘧啶和腺嘌呤配对。假定杂交与化学结构之间的相关性已知，本领域技术人员可容易地识别本发明引物的标准特征。下文具体描述了典型实施方案.
在某些实施方案中，与SEQ ID NO.：9所示核酸杂交的第二种核酸引物可以短至大约6个核苷酸.在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物可以长至大约80个核苷酸.在某些实施方案中，所述第二种核酸引物具有大约10个、大约12个、大约14个、大约15个、大约16个、大约17个、大约18个、大约19个、大约20个、大约21个、大约22个、大约23个、大约24个、大约25个、大约26个、大约27个、大约28个、大约29个、大约30个、大约35个或大约40个核苷酸.
可对第二种引物的长度和组成进行选择，以提供充分的热动力学稳定性，进而确保该引物与黄病毒核酸在合适反应条件下的杂交，该反应条件取决于待实施的检测方法.例如，具有修饰的、非标准或衍生核苷酸的引物可能比具有常规核苷酸的引物长或短，却仍具有类似的热动力学杂交特性.这种非标准碱基的实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,320,005、6,174,998、6,001,611和5,990,303.另一个实例是，与具有富含A/T序列且长度相似的引物相比，具有富含G/C序列的引物可能在较高温度条件下退火至靶序列.因此，在某些实施方案中，所述第二种核酸引物包括上文定义的修饰的、非标准或衍生碱基。
在某些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：10所示序列中的至少16个连续核苷酸.如图2所示的SEQ ID NO.：10表示SEQ ID NO.：9的互补序列。在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：10所示序列中的至少大约18个连续核苷酸。在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：10所示序列中的至少大约20个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物则包括SEQ ID NO.：10所示序列中的至少大约22个连续核苷酸。在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：10所示序列中的至少大约24个连续核苷酸。
在某些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：11所示序列.在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：12所示序列。在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ IDNO.：13所示序列.在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：14所示序列.另一些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：15或SEQ ID NO：74所示序列.在某些实施方案中，所述第二种核酸引物包括非标准或衍生的核苷酸.在另一些实施方案中，所述第二种核酸引物可在其3’末端具有一个或多个烷基化核苷酸.在某些实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：15或SEQ ID NO：74所示序列，其中24号位残基为N6-烷基-脱氧腺苷。在某些实施方案中，所述烷基部分包括C1到大约C10具有支链或无支链的烷基。在另一些实施方案中，所述烷基部分包括C1到大约C20具有支链或无支链的烷基。在一种特定实施方案中，所述第二种核酸引物包括SEQ ID NO.：15或SEQ ID NO：74所示序列，其中24号位残基为N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷.
本发明的核酸引物还可包括与日本脑炎病毒血清群成员不互补和/或不杂交的核酸序列.这些附加序列可以是本领域技术人员选定的，例如，以辅助检测日本脑炎病毒血清群成员.下文4.2和4.3节详尽描述了检测包括日本脑炎病毒血清群成员核酸在内的核酸的方法.这些方法描述了可存在于本发明核酸引物中的附加核酸序列以及利用这些附加序列检测日本脑炎病毒血清群成员的方法.
不加限制的话，可通过本领域技术人员已知的任意合适方法制备上述核酸引物.制备特定序列的寡核苷酸的方法是本领域熟知的，包括例如，对合适序列的克隆和限制以及直接化学合成.化学合成方法可包括例如，Narang et al.，1979，Methods in Enzymology 68：90描述的磷酸三酯法、Brown et al.，1979，Methods in Enzymology68：109描述的磷酸二酯法、Beaucage et al.，1981，TetrahedronLetters 22：1859公开的二乙基氨基磷酸酯法，以及美国专利4,458,066公开的固相支持体法.此外，对上述合成方法的改动可被理想地用于影响与被合成的寡核苷酸有关的酶行为.例如，将经过修饰的磷酸二酯键(例如硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酰胺酯或boranophosphate)或不同于亚磷酸衍生物的键掺入寡核苷酸中可能被用于阻止在特定位点的裂解.此外，当所述寡核苷酸与还作为合成新核酸链的模板的核酸杂交时，随着该寡核苷酸的水解，2’-氨基修饰的糖的应用将促成置换的进行.
登革热病毒引物
本发明的另一些引物与登革热病毒3′UTR杂交.用于扩增和/或检测登革热病毒核酸的典型引物包括表2所示的引物(5′→3′).
表2
序列                         注释             SEQ ID NO：
GAGCCCCGTCCAAGGACGTAAAAAGAA  登革热病毒共有   41
                             上游引物.
GAGCCCCGTCCAAGGACGTAAAAAGAJ  登革热病毒共有   42
                             上游引物.
GAGCCCCGTCCAAGGACGTAAAAAGEJ  登革热病毒共有   43
                             上游引物。
GAGCCCCGTCCAAGGACGTAAAATGAA  I型登革热病毒    44
                             上游引物。
GAGCCCCGTCCAAGGACGTAAAATGAJ  I型登革热病毒    45
                             上游引物.
GAGCCCCGTCCAAGGACGTAAAATGEJ  I型登革热病毒    46
                             上游引物.
GAGCCCCGTCCAAGGACGTTAAAAGAA  II&III型登革      47
                             热病毒上游引物
GAGCCCCGTCCAAGGACGTTAAAAGAJ  II&III型登革      48
                             热病毒上游引物
GAGCCCCGTCCAAGGACGTTAAAAGEJ  II&III型登革      49
                             热病毒上游引物
ATTGAAGTCAGGCCACTTGTGCCA     IV型登革热病毒    50
                             上游引物
ATTGAAGTCAGGCCACTTGTGCCJ     IV型登革热病毒    51
                             上游引物
ATTGAAGTCAGGCCACTTGTGCUJ     IV型登革热病毒    52
                             上游引物
GATCTCTGGTCTTTCCCAGCGTCAA    登革热病毒下游    53
                             引物
GATCTCTGGTCTTTCCCAGCGTCAJ    登革热病毒下游    54
                             引物
GATCTCTGGTCTTTCCCAGCGTCEJ    登革热病毒下游    55
                             引物
引物后缀的定义：J＝t-丁基-苄基-dA，E＝甲基-dA；U＝基-dC
在某些实施方案中，组合应用了一种“上游”引物与“下游”引物扩增登革热病毒核酸。在某些实施方案中，组合应用了多于一种的上游引物与至少一种下游引物检测一种或多种登革热病毒核酸.在单一扩增反应中应用多种上游引物可实现对不同登革热病毒核酸变体的扩增和/或检测.例如，在某些实施方案中，第一种上游引物(选自SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43)和第二种上游引物(选自SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52)是与登革热病毒下游引物(例如选自包括SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55所示序列的引物)组合应用的.这些实施方案有助于例如，检测1、2、3或4型登革热病毒中的任意一种.
黄热病病毒引物
本发明的另一些引物与黄热病病毒3′UTR杂交.用于扩增和/或检测黄热病病毒核酸的典型引物包括下表3所示的引物(5′→3′)。
表3
序列                          注释            SEQ ID NO：
AACCGGGATAAAAACTACGGGTGGAGAA  黄热病病毒上    56
                              游引物
AACCGGGATAAAAACTACGGGTGGAGAJ  黄热病病毒上    57
                              游引物
AACCGGGATAAAAACTACGGGTGGAGEJ  黄热病病毒上    58
                              游引物
ATAAAAACTACGGGTGGAGAACCGGA    黄热病病毒上    59
                              游引物
ATAAAAACTACGGGTGGAGAACCGGJ    黄热病病毒上    60
                              游引物
ACTCCGGTCTTTCCCTGGCGTCAA      黄热病病毒下    61
                              游引物
ACTCCGGTCTTTCCCTGGCGTCAJ      黄热病病毒下    62
                              游引物
ACTCCGGTCTTTCCCTGGCGTCEJ      黄热病病毒下    63
                              游引物
后缀参见表2.
在某些实施方案中，组合应用了一种“上游”引物和“下游”引物扩增黄热病病毒核酸.在某些实施方案中，组合应用了多于一种的上游引物与至少一种下游引物检测一种或多种黄热病病毒核酸。在单一扩增反应中可能应用到多种上游引物.例如，在某些实施方案中，第一种上游引物(例如，选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57和SEQ IDNO：58)和第二种上游引物(例如，选自SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：521)是与黄热病病毒下游引物(例如，选自包括SEQ IDNO：62和SEQ ID NO：63所示序列的引物)组合应用的.
基于图7所示序列的引物
本发明的另一些引物可在特定条件下与图7所示任意序列(例如，SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40)或它们的互补序列杂交，所述特定条件即允许引发扩增反应的条件.在某些情况中，这些引物用于扩增和/或检测SLEV来源的核酸。
与上述可与SEQ ID NO：1所示序列杂交的引物一样，根据上文对寡核苷酸和引物的定义，可与图7所示任意序列杂交的引物还可包括非标准核苷酸.
可对与图7所示任意序列杂交的引物的长度和组成进行选择，以提供充分的热动力学稳定性，进而确保该引物与黄病毒核酸在合适反应条件下的杂交，该反应条件取决于待实施的检测方法.例如，具有修饰的、非标准或衍生核苷酸的引物可能比具有常规核苷酸的引物长或短，却仍具有类似的热动力学杂交特性.因此，在某些实施方案中，所述第二种核酸引物包括上文定义的修饰的、非标准或衍生碱基。可与图7所示任意序列杂交的引物可以包括图7所示任意序列或它们的互补序列中的至少例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50个或更多相邻核苷酸.
本领域的技术人员应理解的是，可利用SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQID NO：39、SEQ ID NO：40所示序列设计引物对，以从SLEV的3’UTR区扩增预期序列.在某些实施方案中，在允许引发扩增反应的条件下，本发明的第一种引物与TTGACACCTGGAAA GACAGGAGA(SEQ ID NO：68)杂交，第二种引物则与CAAAGCCCCTCATTC CGACTCGGG(SEQ ID NO：69)的互补序列杂交.
用于检测和/或扩增SLEV的典型引物包括表4所示的引物.
表4
序列                       注释                  SEQ ID NO：
CAAAGCCCCTCATTCCGACTCGGGA  圣路易斯脑炎病毒上    64
                           游引物
CAAAGCCCCTCATTCCGACTCGGGJ  圣路易斯脑炎病毒上    65
                           游引物
TCTCCTGTCTTTCCAGGTGTCAA    圣路易斯脑炎病毒下    66
                           游引物
TCTCCTGTCTTTCCAGGTGTCAJ    圣路易斯脑炎病毒下    67
                           游引物
后缀参见表2.
3.2.核酸探针
在另一个方面中，本发明提供了用于检测某些黄病毒核酸的探针。可利用本发明探针检测的黄病毒核酸如下文3.3和3.4节所述.不加限制的话，该探针可以是任何可被用于鉴定本领域技术人员已知的可检测黄病毒核酸是否存在的核酸探针.该探针典型地包括可与待检黄病毒核酸中的一个区域杂交的核苷酸序列.
所述探针的核苷酸序列可具有任意长度，该长度足以特异性结合待检黄病毒的核酸.在某些实施方案中，所述探针具有至少大约6个核苷酸.在某些实施方案中，所述探针具有少于大约140个的核苷酸.在某些实施方案中，所述探针的长度可以是大约18到大约25个、大约25到大约35个或大约35到大约45个核苷酸.可对该探针的长度和组成进行选择，以提供充分的热动力学稳定性，进而确保该探针与黄病毒核酸在合适反应条件下的杂交，该反应条件则取决于待实施的检测方法。例如，具有修饰的、非标准或衍生核苷酸的探针可能比具有常规核苷酸的探针长或短，却仍具有类似的热动力学杂交特性.这种非标准碱基的实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,320,005、6,174,998、6,001,611和5,990,303.另一个实例是，与具有富含A/T序列且长度相似的探针相比，具有富含G/C序列的探针可能在较高温度下退火至靶序列.
在所述探针的核苷酸序列中，与可检测核酸杂交的部分典型地与该可检测核酸中被所述探针杂交的区域一致或互补。不过，探针的该部分与可检测病毒核酸中被该探针杂交的区域的序列同一性或互补性可小于100％。在本发明的某些实施方案中，所述探针中与可检测病毒核酸杂交的部分的核苷酸序列可以与可检测病毒核酸中被该探针杂交的区域具有大约99％、大约98％、大约97％、大约96％、大约95％、大约90％、大约85％或大约80％的互补性或同一性.
在某些实施方案中，本发明提供了用于检测日本脑炎病毒血清群成员的探针，该探针包括可与SEQ ID NO.：16所示核酸杂交的核酸.如图3所示的SEQ ID NO.：16显示了黄病毒基因组3’非翻译区内的一个保守序列区域，可利用本发明的组合物和方法检测.图3还显示了SEQ ID NO.：17，表示SEQ ID NO.：16的互补序列.
在本发明的这些实施方案中，所述探针具有可使其在特定条件下与SEQ ID NO.：16所示核酸杂交的核苷酸组成，即化学结构.例如，包括标准核苷酸并可与SEQ ID NO.：16所示核酸中的C残基杂交的探针必须在相应位置具有G残基.因此，与SEQ ID NO.：16所示核酸的杂交确定了所述探针的核苷酸序列，并进而确定了其准确的化学结构.此外，根据上文对寡核苷酸和引物的定义，所述探针还可包括非标准核苷酸.某些这样的非标准核苷酸还可与其它标准或非标准核苷酸结合并形成碱基对.例如，非标准核苷酸肌苷可与尿嘧啶、胞嘧啶和腺嘌呤配对.假定杂交与化学结构之间的相关性已知，本领域技术人员可容易地识别本发明探针的标准特征.下文具体描述了若干典型实施方案。
在某些实施方案中，可与SEQ ID NO.：16所示序列杂交的探针具有大约10个、大约12个、大约14个、大约15个、大约16个、大约17个、大约18个、大约19个、大约20个、大约21个、大约22个、大约23个、大约24个、大约25个、大约26个、大约27个、大约28个、大约29个、大约30、大约32、大约34、大约36个、大约38个、大约40个、大约42个、大约44个、大约46个、大约48个、大约50个、大约55个、大约60个、大约65个、大约70个、大约75个或大约80个核苷酸.在某些实施方案中，所述探针包括上文定义的修饰的、非标准或衍生碱基。
在某些实施方案中，所述探针包括SEQ ID NO.：17所示序列中的至少大约20个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述探针包括SEQ IDNO.：17所示序列中的至少大约22个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述探针包括SEQ ID NO.：17所示序列中的至少大约24个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述探针包括SEQ ID NO.：17所示序列中的至少大约28个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述探针包括SEQ ID NO.：17所示序列中的至少大约30个连续核苷酸。在另一些实施方案中，所述探针包括SEQ ID NO.：17所示序列中的至少大约32个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述探针包括SEQ ID NO.：17所示序列中的至少大约36个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述探针则包括SEQ ID NO.：17所示序列中的至少大约38个连续核苷酸.在另一些实施方案中，所述探针包括SEQ ID NO.：17所示序列中的至少大约40个连续核苷酸。
在某些实施方案中，本发明提供了可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员和其它某些黄病毒的特定核酸探针.如表5所示，通过参考核酸序列，可在结构上定义这些探针。
  表5
  SEQ ID NO.：18       GGN<sup>3</sup>CTAGN<sup>8</sup>GGTTAGAGGAGACCCN<sup>24</sup>N<sup>25</sup>N<sup>26</sup>N<sup>27</sup>N<sup>28</sup>用于检测黄病毒的探针                   其中N<sup>3</sup>为A或T；N<sup>8</sup>为A或T；N<sup>24</sup>为C或T；N<sup>25</sup>为G，C，T，A或缺失；N<sup>26</sup>为C，T，G或缺失；N<sup>27</sup>为G，C，A，T或缺失；和N<sup>28</sup>为G，C，A，T或缺失.
  SEQ ID NO.：19       GGACTAGN<sup>8</sup>GGTTAGAGGAGACCCCN<sup>25</sup>N<sup>26</sup>N<sup>27</sup>N<sup>28</sup>用于检测日本脑炎病毒 其中N<sup>8</sup>为A或T；N<sup>25</sup>为G或A；N<sup>26</sup>为C血清群成员的探针     或T；N<sup>27</sup>为G或T；和N<sup>28</sup>为G或T.
  SEQ ID NO.：20       GGACTAGN<sup>8</sup>GGTTAGAGGAGACCCCN<sup>25</sup>CGN<sup>28</sup>用于检测西尼罗病毒的 其中N<sup>8</sup>为A或T；N<sup>25</sup>为G或A；和N<sup>28</sup>为探针                 G或T.
  SEQ ID NO.：21       GGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCGN<sup>26</sup>GG用于检测日本脑炎病毒 其中N<sup>26</sup>为C或T.的探针
表5
SEQ ID NO.：22       GGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCACTC用于检测Murray河谷脑炎病毒的探针
SEQ ID NO.：23       AATAN<sup>5</sup>GTGGATTACATGAN<sup>19</sup>TTCAN<sup>24</sup>TGAAG用于检测Kunjin病毒   其中N<sup>5</sup>为T或C；N<sup>19</sup>为G或C；和N<sup>24</sup>为T的探针               或C.
SEQ ID NO.：24       GGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCN<sup>25</sup>N<sup>26</sup>N<sup>27</sup>N<sup>28</sup>用于检测登革热病毒的 其中N<sup>25</sup>为C或T；N<sup>26</sup>为C或G；N<sup>27</sup>为C探针                 或G；和N<sup>28</sup>为G，C或A.
SEQ ID NO.：25       GGTCTAGAGGTTAGAGGAGACCCTCCAG用于检测黄热病病毒的探针
SEQ ID NO.：26       GGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCTTCC用于检测蒙太拿鼠耳蝠脑白质炎病毒的探针
SEQ ID NO.：27       GGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCGGC用于检测Modoc病毒的探针
SEQ ID NO.：28       GGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCGCGG实例探针1
SEQ ID NO.：70       GGGTCTCCTCTAACCTCTAGTCCTTCCCCC黄病毒反义探针
在本发明的某些实施方案中，所述探针包括SEQ ID NOS.：18-28或70所示序列中的任意一个序列或其互补序列。
本发明的核酸探针还可包括并非来源于日本脑炎病毒血清群成员或可用该公开探针检测的其它黄病毒并且/或者不与它们的核酸杂交的其它核酸序列.本领域的技术人员可对这些附加核酸序列进行选择，使所述探针具有预期的功能性。例如，所述核酸探针可包括能使检测方法改进的附加序列.可包括附加核酸序列或可通过其它方法被调整用于本发明探针、方法和试剂盒的探针实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,323,337、6,248,526、6,150,097、6,117,635、6,090,552、5,866,336和5,723,591.此外，下文的4.2和4.3节详尽描述了检测包括日本脑炎病毒血清群成员或其它可检测黄病毒的核酸在内的核酸的方法。这些方法中的某些方法还采用了可存在于本发明所述核酸引物中的附加核酸序列；下文描述了这些附加核酸序列和利用这些附加序列检测日本脑炎病毒血清群成员的方法.
不加限制的话，本发明的核酸探针可通过本领域技术人员已知的任意方法制备。具体而言，被用于制备本发明核酸引物的方法还可被用于制备本发明的核酸探针。
除了上述探针核苷酸序列，所述探针还可包括不抑制本发明方法的附加核苷酸序列或其它部分。在本发明的简便实施方案中，所述探针可包括有助于实施本发明方法的附加核苷酸序列或其它部分。例如，所述探针的3’末端可被加帽，以阻止该探针引发的不需要的核酸聚合作用.同样，所述探针内可存在特定部分，以使该探针或探针片段与所述核苷酸序列的杂交稳定或不稳定.本发明的探针还可包括上文定义的修饰的、非标准或衍生核苷酸.
在本发明的某些实施方案中，所述探针可包括可检测部分。不加限制的话，该可检测部分可以是本领域技术人员已知的任意可检测部分.此外，不加限制的话，可通过本领域技术人员已知的任意方法检测该可检测部分.例如，可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测该可检测部分.
多种可被用于检测本发明探针的可检测部分以及使它们与所述探针桥接的方法是本领域已知的，包括但不限于，酶(例如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)和酶底物、放射性部分、荧光部分、发色团、化学发光标记、诸如OriginTM(Igen)的电化学发光标记，具有特异性结合配偶体的配体或其它任何可能彼此相互作用从而增强、改变或减弱信号的标记.当然，温度提高时，应利用热稳定DNA聚合酶进行5’核酸酶反应，所述可检测部分不应被该升高的温度降解或变得不可检测.
在某些实施方案中，所述可检测部分可以是荧光部分.不加限制的话，该荧光部分可以是本领域技术人员已知的任意荧光部分。通常优选具有宽斯托克斯频移的荧光部分，从而可以应用优于单比色计的具有滤波器的荧光计，并提高检测效率.在某些实施方案中，所述荧光部分可选自荧光素家族染料(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA)、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Or)、罗丹明家族染料(Integrated DNA Technologies，Inc.)、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料和家族染料(Molecular Probes，Inc.)。在一种优选实施方案中，所述荧光部分为6-羧基荧光素(FAMTM)(IntegratedDNA Technologies，Inc.).可应用于本发明探针、方法和试剂盒的其它荧光部分实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,406,297、6,221,604、5,994,063、5,808,044、5,880,287、5,556,959和5,135,717.
在另一些实施方案中，所述可检测部分可以是与荧光部分不同的可检测部分。在放射性部分当中，优选32P-标记的化合物.不加限制的话，本领域技术人员已知的任意方法均可被用于将32P导入探针中.例如，可通过利用激酶进行5’标记或随机插入切口平移，使探针标记有32P。本身是酶的可检测部分典型地可通过它们的活性而得以检测.例如，可通过测定由碱性磷酸酶对合适的底物化合物作用所产生的荧光检测该酶。以特异性结合配偶体的组成部分作为可检测部分时，可通过检测分子与该特异性结合配偶体的组成部分的特异性结合，检测所述探针的存在.例如，抗原可与所述探针连接，则可采用对该抗原具有特异性的单克隆抗体检测该抗原的存在，进而确定所述探针的存在.可被用作可检测部分的其它特异性结合配偶体包括生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、IgG和A蛋白，以及本领域熟知的诸多其它的受体-配体对。非荧光部分的其它可检测部分实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利5,525,465、5,464,746、5,424,414和4,948,882.
上文对可检测部分的描述并不意味着将多种标记划分为了不同种类，因为相同标记可能以若干种不同模式发挥作用。例如，125I可充当放射性部分或密电子试剂.辣根过氧化物酶可充当酶或单克隆抗体的抗原.此外，可将多种可检测部分组合应用，以发挥预期作用。例如，可用生物素标记探针，并用标记有125I的抗生物素蛋白或标记有辣根过氧化物酶的抗生物素单克隆抗体检测该探针的存在.其它变换和可能性应是本领域普通技术人员易于理解的，并且被认为是属于本发明范畴的等同物。
使上述可检测部分与探针连接或结合的方法当然取决于被采用的可检测部分的类型和该可检测部分在探针上的位置.
可通过多种技术使所述可检测部分与探针直接或间接相连。根据被采用的可检测部分的准确类型，该可检测部分可位于探针的5’或3’末端、位于探针核苷酸序列内部，或与不同大小的间隔臂和组合物相连，以利于信号的相互作用.利用通过商业渠道获得的亚磷酰胺试剂，可借助于经过适当保护的亚磷酰胺制备在任一末端具有官能团(例如巯基或伯胺)的寡核苷酸，并可采用例如Academic Press出版的由Innis等人编辑的PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications中描述的方法使其连有可检测部分.
美国专利4,914,210描述了导入寡核苷酸功能化试剂的方法，可将一个或多个巯基、氨基或羟基部分导入所述寡核苷酸探针序列中，典型地导入在该序列的5’末端.通过利用多核苷酸激酶和[γ-32P]ATP，可将5’磷酸盐基团作为放射性同位素导入，以提供报道基团。通过使合成期间导入的氨基胸苷残基或烷氨基接头与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，可将生物素加入5’末端.使包括荧光部分在内的可检测部分与探针相连的其它方法可参见被完整引入本文作为参考的美国专利5,118,802.
也有可能通过应用例如多核苷酸末端转移酶，以添加诸如，例如蛹虫草菌素35S-dATP和生物素化dUTP的预期部分，从而将可检测部分连接在所述探针的3’末端.
寡核苷酸衍生物也是可被应用在本发明探针、方法和试剂盒中的可检测部分。例如，乙烯-dA和乙烯-A均是已知可被掺入寡核苷酸探针中的荧光腺嘌呤核苷酸.同样，乙烯-dC是另一种可应用于探针合成的类似物。包括这种核苷酸衍生物的探针可以被例如，具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶降解，释放出荧光性远强于完整探针的单核苷酸.
在本发明的某些实施方案中，探针可被标记多于一个的可检测部分。在某些这样的实施方案中，各检测部分均可单独地与所述探针的不同碱基相连.在另一些实施方案中，多于一个的可检测部分可与所述探针的相同碱基相连.
在某些实施方案中，所述可检测部分可与探针的5’末端相连。在另一些实施方案中，所述可检测部分可在距探针5’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大约35或大约40个残基范围内的残基位置上与探针相连.在某些实施方案中，可检测部分可与探针的3’末端相连。在另一些实施方案中，所述可检测部分可在距探针3’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大约35或大约40个残基范围内的残基位置上与探针相连。该可检测部分可与探针残基的任意部分相连.例如，可检测部分可与探针核苷酸的糖、磷酸或碱基部分相连.在另一些实施方案中，所述可检测部分可连接在探针的两个残基之间。
在本发明的某些实施方案中，所述探针可包括荧光部分和猝灭剂部分。在这些实施方案中，荧光部分可以是如上所述本领域技术人员已知的任意荧光部分.此外，不加限制的话，猝灭剂部分可以是本领域技术人员已知的任意猝灭剂部分。在某些实施方案中，猝灭剂部分可选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料和
Figure C20048001479000441
家族染料和非荧光猝灭剂部分.在某些实施方案中，非荧光猝灭剂部分可以是BHQTM家族染料(包括WO 01/86001所述的猝灭剂)、IowaBlackTM或Dabcyl(Integrated DNA Technologies，Inc.)。其它特异性猝灭剂部分实例包括但不限于，例如TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明)(Molecular Probes，Inc.)、DABCYL(4-(4’-二甲基氨苯基偶氮)苯甲酸)、Iowa BlackTM(Integrated DNATechnologies，Inc.)、Cy3TM(Integrated DNA Technologies，Inc.)或Cy5TM(Integrated DNA Technologies，Inc.)。在一种优选实施方案中，猝灭剂部分为Cy5TM.可应用于本发明探针、方法和试剂盒的其它猝灭剂部分实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,399,392、6,348,596、6,080,068和5,707,813.
在某些实施方案中，猝灭剂部分可与探针的5′末端(相连。在另一些实施方案中，猝灭剂部分可连接在距探针5’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大约35或大约40个残基处的残基上.在某些实施方案中，猝灭剂部分可与探针的3′末端相连.在另一些实施方案中，猝灭剂部分可在距探针3’末端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大约35或大约40个残基范围内的残基处与探针相连.在一种优选实施方案中，荧光部分连接在探针的5′末端，猝灭剂部分则连接在距探针5’末端大约9个残基范围内的残基上。猝灭剂部分可与探针残基的任意部分相连.例如，猝灭剂部分可与探针核苷酸的糖、磷酸盐或碱基部分相连.在另一些实施方案中，猝灭剂部分可连接在探针的两个残基之间.
虽然不想受限于任何特定的理论或作用机制，当探针完整时，荧光部分发射的光子仍被认为可以被猝灭剂部分吸收并猝灭.该猝灭剂部分接着以不同波长光子的形式或热形式释放光子能量.因此，猝灭剂部分也可以是荧光部分.如上所述，该现象被称为荧光共振能量转移(“FRET”).探针在荧光部分与猝灭剂部分之间的裂解导致猝灭剂部分对荧光部分所发射荧光的猝灭的减少.
通常，荧光部分与猝灭剂部分之间的能量转移取决于该荧光部分与猝灭剂部分之间的距离和特定的荧光部分-猝灭剂部分对的临界转移距离。该临界转移距离是与已知猝灭剂部分配对的已知荧光部分的特征和常数.此外，当荧光部分-猝灭剂部分对的临界转移距离接近该荧光部分与猝灭剂部分之间的距离时，便可更灵敏地确定荧光部分与猝灭剂部分的空间关系.相应地，熟练医师可以选择荧光部分和猝灭剂部分，以具有特定的临界转移距离，该距离与探针上荧光部分和猝灭剂部分的分隔距离相近。特定的荧光部分-猝灭剂部分对的临界转移距离是本领域熟知的，可参见例如，被完整引入本文作为参考的Wu和Brand在1994，Anal.Biochem.218：1-13中的论文。
对特定荧光部分-猝灭剂部分对而言的其它标准包括例如，荧光部分发射的荧光的量子产额；荧光部分发射的荧光的波长；猝灭剂部分的消光系数；猝灭剂部分发射的荧光的波长，如果有的话；以及猝灭剂部分发射的荧光的量子产额，如果有的话.此外，如果猝灭剂部分也是荧光部分，可优选地对该猝灭剂部分和荧光部分进行选择，以易于将其中一个部分发射的荧光与另一个部分发射的荧光区分开。与选择特定荧光部分-猝灭剂部分对有关的进一步指导可参见被完整引入本文作为参考的Klostermeier和Millar在2002，Biopolymers61：159-179中的综述论文.
可应用于本发明该方面的荧光部分和猝灭剂部分的典型组合包括，但不限于，荧光部分罗丹明590和猝灭剂部分结晶紫.荧光和猝灭剂部分的一种优选组合是荧光部分6-羧基荧光素和猝灭剂部分Cy5TM.可被应用于本发明探针、方法和试剂盒中的其它荧光部分-猝灭剂部分对实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,245,514。
可作为荧光和猝灭剂部分应用于FRET的分子实例包括荧光素、6-羧基荧光素、2’7’-二甲氧基-4’5′-二氯-6-羧基荧光素、罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基-X-罗丹明和5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光部分究竟是供体还是受体是根据其激发和发射光谱以及与其配对的荧光部分确定的。例如，FAMTM由波长为488nm的光最为有效地激发的，并发射光谱为500-650nm的光，且最大发射波长为525nm.相应地，FAMTM是适合与作为猝灭剂部分且最大激发波长为514nm的TAMRA一起应用的荧光部分.
在某些实施方案中，采用了下列探针变体：FGGACTAGAIGGTTAGAGGAGACCCCGCGGP(SEQ ID NO：28所示序列的变体)；FGGAEUAGAIGGUUAGAGGAGAEEEEGEGGP(SEQ ID NO：28所示序列的变体)；FGGGTCTCCITCTAACCTCTAGTCCTTCCCCCP(SEQ ID NO：70所示序列的变体)；FGGGUEUEEIUEUAACCTCTAGTCCTTCCCCCP(SEQ IDNO：70所示序列的变体)以及FGGTCTAGAIGGTTAGAGGAGACCCTCCAGP(SEQ ID NO：25所示序列的变体)。在所有这些探针中，F＝CY5、I＝FAM、P＝PO4、U＝丙炔基dU、E＝5-甲基-dC).
3.3.可检测的日本脑炎病毒血清群成员的核酸
本发明的引物、探针、方法和试剂盒用于检测黄病毒属的某些成员。具体而言，这些引物、探针、方法和试剂盒用于检测日本脑炎病毒血清群的成员。例如，可根据本发明检测的日本脑炎病毒血清群成员包括，但不限于日本脑炎病毒、西尼罗病毒、Murray河谷脑炎病毒、SLEV和Kunjin病毒.在某些情况中，上述某些病毒的至少一个菌株的完整序列已被确定.通过参考图4所示的GenBank编号便可发现这些序列，图4所示为日本脑炎病毒血清群成员的核酸序列与本发明寡核苷酸的对比.根据图4所示编号识别的各黄病毒基因组的核酸序列被完整引入本文作为参考.
其它日本脑炎病毒血清群成员，例如Cacipacore病毒、圣路易斯脑炎病毒、Usutu病毒和Youende病毒的基因组的完整核酸序列尚未得到确定。但本发明的引物和探针仍然被认为可与所有日本脑炎病毒血清群成员中具有高保守程度的序列杂交.此外，本领域技术人员在确定了上述病毒基因组的核酸序列后，便可容易地识别出可与来源自尚未测序成员的核酸杂交的引物和探针。
在某些实施方案中，可检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.在另一些实施方案中，可检测日本脑炎病毒的核酸.在另一些实施方案中，可检测西尼罗病毒的核酸.在另一些实施方案中，则可检测Kunjin病毒的核酸.在另一些实施方案中，可检测Murray河谷脑炎病毒的核酸.在另一些实施方案中，可检测SLEV的核酸.在另一些实施方案中，则可检测日本脑炎病毒、西尼罗病毒、SLEV或Murray河谷脑炎病毒的核酸.
待检核酸可以是来源于本文所述可检测黄病毒的任意核酸。该核酸典型地为单链RNA，因为待检黄病毒具有正链单链RNA基因组.不过，待检核酸也可以是在序列上与可检测黄病毒的RNA基因组对应的DNA.这种DNA可通过例如，如下文4.1节所述逆转录病毒RNA的方法而得以制备.
不加限制的话，在本领域技术人员已知的任意来源的样品中均可以检测是否存在可检测黄病毒的核酸。例如，可在上文定义的生物学样品中检测所述病毒核酸.在任意天然来源，包括诸如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟或哺乳动物的脊椎动物和诸如昆虫、甲壳动物、节肢动物等的无脊椎动物来源的样品中，均可检测所述病毒核酸的存在.此外，待检样品可来源于无生命的物质，诸如水或土壤样品或swipe样品，诸如由表面检验所获得的样品。
在本发明的某些实施方案中，可根据本领域技术人员已知的方法扩增待检核酸.该扩增可在根据本文所述方法检测之前进行，或者与本文所述的检测同时进行。扩增核酸的方法如下所述，并可参见例如被完整引入本文作为参考的Saiki et al.，1988，Science 239：487-91.
3.4.其它可检测黄病毒的核酸
本发明的探针、方法和试剂盒还可被用于检测来源于其它黄病毒，包括但不限于登革热病毒、蒙太拿鼠耳蝠脑白质炎病毒、Modoc病毒和黄热病病毒的核酸.与日本脑炎病毒血清群成员一样，上述某些病毒的至少一个菌株的核酸序列已被确定.通过参考图5所示编号便可发现这些序列，图5所示为上述可检测黄病毒的核酸序列与SEQ ID NO：16所示序列的对比.根据图5所示GenBank编号识别的各黄病毒基因组的核酸序列均被完整引入本文作为参考.
正如本文所述，引物SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55均用于扩增和/或检测登革热病毒，引物SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63用于扩增和/或检测黄热病病毒。
3.5.检测不同病毒变体或不同病毒的多元扩增反应
本发明的引物和探针可在反应中组合应用，以检测多于一种的病毒核酸.例如，在某些情况中，多种上游和/或多种下游引物可被组合在一种反应混合物中，以用于检测不同病毒变体(例如通过单一引物或引物对无法检测或仅可微弱检测到的病毒变体).在某些实施方案中，多种上游和/或多种下游引物可被组合在一种反应混合物中，以用于检测多于一种的病毒.在这些实施方案中，反应混合物中包括了对各待检病毒均具有特异性的引物，因而可以扩增样品中的各病毒核酸。例如，根据需检测病毒的不同，可以包括用于扩增西尼罗病毒、SLEV、登革热病毒和黄热病病毒的引物的任意组合.采用单一反应检测多种病毒在下述情况中是有用的，例如当筛选血液制品或在其它情况中，即任意病毒的污染均需被检测时.
本发明的探针可被应用在上述反应中。根据需要获得的结果，可采用能够检测任意可能存在的病毒核酸产物的单一探针.可选地，可以采用可与各可能存在的病毒核酸产物特异性杂交的不同探针。在这些情况中，与各探针一起应用不同的可检测标记是有助于区分病毒核酸产物的.
在某些实施方案中，可采用多元PCR并利用上述组成检测多种病毒核酸。多元PCR可在相同反应中扩增和/或检测多种多核苷酸片段。参见例如，PCR PRIMER，A LABORATORY MANUAL(Dieffenbach，ed.1995)Cold Spring Harbor Press，pages 157-171.
在某些实施方案中，采用了可用于检测西尼罗病毒和SLEV的引物.在某些实施方案中，采用了可用于检测西尼罗病毒、SLEV和登革热病毒的引物.在某些实施方案中，采用了可用于检测西尼罗病毒、SLEV和黄热病病毒的引物.在某些实施方案中，则采用了可用于检测西尼罗病毒、SLEV、黄热病和登革热病毒的引物.在某些情况中，多元反应进一步包括本文所述的至少一种探针。
4.对日本脑炎血清群成员和其它某些黄病毒的核酸进行检测和/或定量的方法
在某些方面中，本发明提供了利用核酸引物和探针检测某些黄病毒核酸的方法.在另一些方面中，本发明提供了利用核酸引物和探针定量样品中某些黄病毒的核酸的方法。不加限制的话，本领域技术人员已知利用核酸引物和探针检测核酸的任意方法均可被用于检测上述可检测黄病毒的核酸.在某些实施方案中，所述方法利用引物和探针检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.在另一些实施方案中，所述方法利用两种引物和一种探针检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.在另一些实施方案中，所述方法则利用探针检测某些黄病毒，如下所述。
4.1.以5′核酸酶反应为基础检测和/或定量日本脑炎血清群成员核酸的试验
在本发明的某些方面中，所述方法包括用引物和探针检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸。这些方法通常包括使与日本脑炎病毒血清群成员的核酸杂交的引物和具有5’核酸酶活性的酶接触.该具有5′核酸酶活性的酶接着在5’核酸酶反应中使与日本脑炎病毒血清群成员的核酸杂交的探针断裂。可用用于检测探针断裂的可检测部分标记该探针。这种方法是基于被完整引入本文作为参考的美国专利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015所描述的方法.
不加限制的话，在5′核酸酶反应中，所述核酸、引物和探针可与本领域已知具有5′-3′核酸酶活性的任意酶接触.优选条件可使聚合酶裂解该探针并使所述核酸释放探针的多个片段。具有5′核酸酶活性的优选酶包括模板依赖型核酸聚合酶.已知天然和重组形式的这种聚合酶包括例如，大肠杆菌DNA聚合酶I(Fermentas，Inc.，Hanover，MD)、嗜热脂肪芽胞杆菌DNA聚合酶和Thermococcus littoralis DNA聚合酶.
在优选的实施方案中，具有5′核酸酶活性的酶是具有热稳定性和热活性的核酸聚合酶.这种热稳定聚合酶包括但不限于来源于多种真细菌属，即栖热、栖热袍菌和高温套管菌属的天然和重组形式的聚合酶.例如，可应用于本发明方法的栖热菌种聚合酶包括被完整引入本文作为参考的美国专利5,405,774、5,352,600、5,079,352、4,889,818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和5,795,762所述的栖热水生菌(Taq)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、栖热菌种Z05(Z05)DNA聚合酶和栖热菌种sps17(sps17).可应用于本发明方法的栖热袍菌属聚合酶包括例如海栖热袍菌DNA聚合酶和Thermatoganeapolitana DNA聚合酶，而可被采用的一个高温套管菌属聚合酶实例是Thermosipho africanus DNA聚合酶.被完整引入本文作为参考的国际专利申请PCT/US91/07035和出版物WO 92/06200公开了海栖热袍菌和Thermosipho africanus DNA聚合酶的序列.被完整引入本文作为参考的国际专利出版物WO 97/09451则公开了Thermatoganeapolitana的序列.
5′核酸酶反应包括使待检核酸与引物、探针和具有5′-3′核酸酶活性的酶在特定条件下接触，该条件即所述引物和探针可与该核酸杂交的条件.5′核酸酶反应的各组分可以任意次序与待检核酸接触，例如，待检核酸可首先与引物接触，接着与探针和具有5′核酸酶活性的酶接触，或者可选地，待检核酸首先与具有5’核酸酶活性的酶接触，接着与探针和引物接触。在某些实施方案中，可在5’核酸酶反应中加入多于一种的引物或探针.在某些优选实施方案中，5’核酸酶反应中的核酸可与引物对接触.引物可以是能够引发DNA合成反应的任意引物。仅采用一种引物时，该引物应与所述探针的核酸上游杂交，即该引物的3’末端应指向探针的5’末端。所述引物的3′末端可与探针5’末端的相邻位置杂交，或者该引物的3′末端可与探针5’末端的更上游位置杂交。采用多于一种的引物时，如上所述，至少一种引物应与探针上游的待检核酸杂交。
本发明所述5’核酸酶反应的某些实施方案是基于本领域技术人员已知的若干5’核酸酶反应。这些反应的实例在例如，被完整引入本文作为参考的美国专利5,210,015中得到详述。
简言之，在5′核酸酶反应中，靶核酸在特定条件下与引物和探针接触，该条件即引物和探针与所述核酸链杂交的条件.该核酸、引物和探针还与具有5’-3’核酸酶活性的酶，例如核酸聚合酶接触.具有5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶可裂解与所述引物的核酸下游杂交的探针。该引物的3′末端基于核酸聚合酶的模板核酸提供了延伸新核酸的底物.当该聚合酶延伸新核酸时，遇到探针的5’末端并开始裂解该探针的片段。
可对所述引物和探针进行设计，使它们在彼此接近的状态下与靶核酸杂交，而所述核酸聚合酶与引物3’末端的结合则使其可以接触探针的5’末端.在该方法中，并不必须进行核酸延伸以将所述核酸聚合酶带入特定位置，并实现裂解.该过程被称为术语“不依赖聚合作用的裂解”.
可选地，如果所述引物和探针退火至所述核酸中更远距离的区域，则核酸延伸必须在所述核酸聚合酶遇到探针5’末端之前发生。当聚合作用继续时，聚合酶从探针5’末端开始逐渐裂解片段.该裂解持续到探针的剩余部分已不稳定至特定程度为止，该程度即其可与模板分子解离的程度。该过程被称为“依赖聚合作用的裂解”。
不依赖聚合作用的裂解的一个优势在于无须扩增核酸.缺乏引物延伸时，核酸的链基本上是单链.如果所述引物和探针相邻地与所述核酸结合，便可序贯地循环发生寡核苷酸退火和片段裂解。因此，可使足量的探针断裂，以获得可检测信号，进而可以在缺乏聚合作用的情况下实现检测.
在上述任一方法中，被提供的样品均包括所述核酸.如果该核酸为双链，应首先被变性，例如使该核酸的链彼此分离.不加限制的话，本领域技术人员已知的任意合适变性方法，包括物理、化学或酶促方法均可被用于解离所述核酸链.用于解离链的优选物理方法是加热核酸直至其完全(＞99％)变性.典型的热变性包括在大约80℃到大约105℃的温度范围内加热大约10秒到大约10分钟。相对于变性的可选方法是，核酸可以单链形式存在于样品中，诸如例如，单链RNA或DNA病毒.
应当指出的是，可用本发明引物、探针、方法和试剂盒检测的病毒是单链正链RNA病毒.相应地，检测未扩增的病毒基因组时，无需使天然病毒基因组变性.不过，根据本发明下述的某些实施方案，如果天然病毒基因组被逆转录为DNA，则必须在用本发明引物和探针检测之前使扩增的病毒核酸变性.
如果待检核酸为RNA，该RNA可作为RNA模板被用于上述的5’核酸酶反应，或者可作为模板被逆转录为cDNA，或者是同时参与这两个过程.在某些实施方案中，利用本发明方法可检测到所述RNA，而无需将其逆转录为cDNA.上述不依赖聚合作用的裂解方法尤其适用于这种实施方案.在另一些实施方案中，所述RNA可在探针缺乏条件下首先被逆转录为cDNA，接着便可根据本发明方法检测cDNA产物.在另一些实施方案中，所述RNA可在探针存在条件下被逆转录，同时生成可随后被扩增和/或检测的cDNA，通过如本文所述评估探针的断裂，便可确定所述RNA的存在.
所述RNA在探针缺乏条件下被逆转录时，可通过本领域技术人员已知的任意方法将该RNA逆转录进cDNA中.接着便可象任意可检测核酸一样，根据本文所述方法检测这种逆转录的产物.
在探针存在条件下逆转录所述RNA时，可利用具有5′-3′核酸酶活性并可以RNA为模板进行DNA链合成的DNA聚合酶逆转录该RNA.与所有已知的DNA聚合酶合成活性一样，这种合成需要引物的参与，诸如本文所述的那些引物.可以RNA为模板的优选DNA聚合酶具有热稳定性，从而可以在不破坏该聚合酶的条件下进行多个循环的变性和DNA合成.此外，被用于逆转录的DNA聚合酶还可优选地利用DNA模板合成DNA.在例如，被完整引入本文作为参考的美国专利6,468,775(Carboxydothermus hydrogenformans DNA聚合酶)、5,968,799(Thermosipho africanus DNA聚合酶)、5,736,373(Bacilluspallidus DNA聚合酶)、5,674,738(栖热菌种Z05 DNA聚合酶)和5,407,800(栖热水生菌和嗜热栖热菌DNA聚合酶)中描述了这种聚合酶.此外，被完整引入本文作为参考的美国专利5,693,517、5,561,058、5,405,774、5,352,600、5,310,652和5,079,352描述了利用具有逆转录活性的热稳定DNA聚合酶逆转录RNA的方法和组合物.
无论是RNA还是DNA，变性的核酸链均接着在特定杂交条件下与引物和探针接触，该杂交条件可使所述引物和探针与所述核酸链结合。在某些实施方案中，可采用两种引物扩增所述核酸.在这些实施方案中，可对所述两种引物进行选择，使它们沿所述核酸而言的相对位置特定，可由其中一种引物合成延伸产物，该延伸产物与其模板(互补序列)分离后，便可充当另一种引物延伸的模板，以获得确定长度的扩增产物.该产物的长度取决于两种引物之间的序列长度，以及这两种引物自身的长度.
由于互补链典型地比探针或引物长，该链具有更多的接触点，并在任意的已知时间段内获得了更多可以彼此发现并结合的机会。过高摩尔量的探针和引物有助于使平衡移向引物和探针退火，而不是模板退火。
所述引物应足够长，才可在聚合所用试剂存在条件下引发延伸产物的合成。该引物的准确长度和组成可取决于许多因素，包括退火反应的温度、引物来源和组成、探针退火位点与引物退火位点的接近度以及引物：探针浓度比率.例如，根据所述序列的复杂性，寡核苷酸引物典型地具有大约15-30个核苷酸，但也可能具有更少或更多的核苷酸.所述引物必须充分互补，才可选择性地退火至它们的对应链并形成稳定的双链体.
可对各引物进行选择，以使其与所述核酸的链“基本上”互补。该引物无需反映模板的准确序列，但必须充分互补，才可以在合适的反应条件下与其对应链选择性杂交.非互补碱基或较长序列可被分散进引物中，或者位于引物的末端，使该引物保持与其模板链的充分互补性并与之形成稳定的双链体.引物的非互补核苷酸序列可能包括限制酶位点.所有非互补核苷酸序列均优选地不位于引物的3’末端。
所述探针优选地在聚合酶与所述核酸和引物结合并基于可检测核酸的模板从引物延伸新核酸链之后才与待检核酸杂交.聚合酶在探针与可检测核酸接触之前结合引物和待检核酸是可能的；不过，该安排可导致探针断裂减少，除非进行多个循环的引物延伸才可，正如下文所述在优选的以PCR为基础的5’核酸酶反应中的情况.相应地，探针优选地在聚合酶开始引物延伸之前与待检核酸杂交.
本领域技术人员已知的多种技术均可被用于提高下述情况的可能性，即探针在引物延伸聚合作用到达该双链体区域之前，或是在聚合酶在不依赖聚合作用的过程中与上游寡核苷酸相连之前，与可检测核酸杂交.例如，短引物分子通常需要较冷的温度，才可与所述核酸形成充分稳定的杂合复合体。因此，可将探针设计得比引物长，使探针可以在比引物退火所需温度高的温度下优选地退火至所述核酸.
还可根据引物和探针的核苷酸组成利用具有不同热稳定性的引物和探针.例如，可选择具有较高G/C含量并因此具有比引物高的热稳定性的探针.可选地或另外地，可将一个或多个修饰的、非标准或衍生DNA碱基掺入引物或探针中，使其与仅具有常规DNA碱基的引物或探针相比，具有了较高或较低的热稳定性.这种修饰的、非标准或衍生碱基的实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,320,005、6,174,998、6,001,611和5,990,303.
此外，还可改变反应温度，以利用探针和引物的不同热稳定性.例如，在上述高温下变性后，可在允许探针结合而不允许引物结合的中间温度下温育反应，继而进一步降低温度使引物退火并接着延伸.
相对于引物浓度而言，过高摩尔量的探针浓度还可被优选地用于促使探针在引物之前实现结合。这种探针浓度典型地比通常为0.5-5x10-7M的对应引物浓度高大约2-20倍。
所述寡核苷酸引物的模板依赖型延伸是由DNA聚合酶在包括合适的盐、金属阳离子和pH缓冲体系的反应介质中，并在足量的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)或类似物，例如dUTP存在条件下催化的.合适的聚合剂是已知可催化引物和模板依赖型DNA合成并具有5’-3’核酸酶活性的酶.这种酶包括例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、嗜热栖热菌DNA聚合酶、嗜热脂肪芽胞杆菌DNA聚合酶、Thermococcus littoralis DNA聚合酶、栖热水生菌DNA聚合酶和Z05 DNA聚合酶.此外，利用这些DNA聚合酶进行DNA合成的反应条件是本领域所熟知的.为了适用于本发明方法，聚合剂应具有可有效裂解寡核苷酸并释放标记片段的5′核酸酶活性，以直接或间接生成可检测信号.
该合成产物是由模板链和引物延伸链组成的双链分子.该合成的副产物是由单、双和寡核苷酸片段混合物组成的探针片段.在优选实施方案中，可进行重复循环的变性、探针和引物退火、引物延伸和探针裂解，以指数累积由引物确定的扩增区域并指数生成标记片段.这种重复热循环在本领域内通常被称为聚合酶链反应(PCR).可进行充分的循环以断裂足量的探针，以区分阳性反应和阴性反应，前者即待检核酸存在条件下进行的反应，后者则是在待检核酸不存在的条件下进行的反应.
在某些优选实施方案中，PCR反应是以利用热稳定酶的自动化过程的形式进行.在该过程中，反应混合物经过了包括变性步骤、探针和引物退火步骤和合成步骤的循环，从而得以与引物依赖型模板延伸一起同时发生裂解和置换.可应用经过特定设计可利用热稳定酶的热循环仪，诸如ABI 3700(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)。在本发明某些这样的实施方案中，可在缺乏可检测标记探针的条件下扩增待检核酸，接着在分离反应中检测该扩增产物。可选地，可在探针存在条件下扩增待检核酸，以在单一反应中实现扩增和检测.
在该自动化过程中优选的是热稳定聚合酶，因为使双链延伸产物变性的优选方式是通过在PCR循环期间使它们接受高温(大约95℃)。例如，美国专利4,889,818公开了分离自栖热水生菌的代表性热稳定酶.其它代表性热稳定聚合酶包括例如，提取自热稳定细菌黄色栖热菌、红色栖热菌、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽胞杆菌(最适温度稍低于所列其它细菌)、Thermus lacteus、Thermus rubens、海栖热袍菌、Thermococcus littoralis、炽热甲烷嗜热菌和激烈火球菌(Stratagene，La Jolla，CA)的聚合酶。如上所述，上述某些热稳定聚合酶可由RNA模板合成DNA.当根据本发明方法检测RNA分子时，应采用可由RNA模板合成DNA，即具有逆转录活性的DNA聚合酶。
在另一些方面中，本发明方法还可被用于定量样品中日本脑炎病毒血清群成员的核酸.在这些方法中，进行了上述5’核酸酶反应，并确定了所产生的荧光量.不加限制的话，可通过本领域技术人员已知的任意方法确定荧光量.在某些实施方案中，可利用荧光计确定发射的荧光量.该荧光量可与对照反应发射的荧光量进行对比.对照反应优选地采用相同试剂并与采用具有已知量的日本脑炎病毒血清群成员核酸的样品所进行的反应同时进行.可选地，由荧光部分发射的荧光量可与根据荧光和病毒核酸浓度的关系所标绘的标准曲线进行比较.代表性的标准曲线如图6所示.与定量日本脑炎病毒血清群成员核酸有关的进一步指导可参见已出版的美国专利申请出版物2002/0058262和欧洲专利1138780、1138783和1138784.
4.2.利用一种或多种引物和一种探针检测日本脑炎血清群成员核酸的其它方法
除了上述5′核酸酶反应，本发明进一步提供了其它可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的方法，如下所述.
在某些实施方案中，本领域技术人员已知的利用两种核酸引物和一种核酸探针检测核酸的任意方法均可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.不加限制的话，3.1和3.2节所述的核酸引物和探针均可被应用在上述本领域技术人员已知的任意方法中.可被用于检测所述病毒核酸的典型扩增反应包括，例如聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)(参见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis et al.，eds，1990))、链置换扩增(SDA)(Walker，et al.Nucleic Acids Res.20(7)：1691-6(1992)；Walker PCR Methods Appl 3(1)：1-6(1993))、转录介导的扩增(Phyffer，et al.，J.Clin.Microbiol.34：834-841(1996)；Vuorinen，et al.，J.Clin.Microbiol.33：1856-1859(1995))、以核酸序列为基础的扩增(NASBA)(Compton，Nature 350(6313)：91-2(1991))、滚环扩增(RCA)(Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)：75-99(1999))；Hatch et al.，Genet.Anal.15(2)：35-40(1999))、分支DNA信号扩增(bDNA)(参见例如Iqbalet al.，Mol.Cell Probes 13(4)：315-320(1999))和Q-β复制酶(Lizardi et al.，Bio/Technology 6：1197(1988)).
这些方法的一个实例是扩增日本脑炎血清群成员的核酸并利用本身是分子信标的探针检测该核酸的存在.这种探针包括可杂交在两侧具有互补序列的位置上并可形成发夹的靶识别序列.所述分子信标在探针的相对末端具有荧光部分和猝灭剂部分。该分子信标与日本脑炎血清群成员核酸的杂交使荧光部分与猝灭剂部分分离，从而可以检测该荧光部分，并由此表明日本脑炎血清群成员核酸的存在。本发明的任意探针在5’和3’末端加入若干被本领域技术人员认为能够形成发夹结构的残基后，均可被应用在这些方法中.与选择和利用分子信标有关的进一步指导可参见被完整引入本文作为参考的Tyagi和Kramer在1996，Nat.Biotechnol.14：303-308中的论文.
在另一个实例中，可采用本发明的两种引物和一种探针并通过以核酸序列为基础的扩增检测日本脑炎血清群成员的核酸.以核酸序列为基础的扩增(NASBA)是可被用于检测日本脑炎血清群成员核酸的强扩增技术.在NASBA方法中，采用了三种酶，包括逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RNase H。最终的扩增产物是极性与待检核酸相反的单链RNA.通过利用与磁粒子结合的靶特异性捕捉探针，并结合应用钌标记的检测探针和能够测定电化学发光(ECL)的设备(NucliSens Reader；bioMérieux)，便可检测该扩增RNA产物.可选地，如上所述，可通过在扩增反应中包括上述分子信标探针，以特异性地实时检测通过NASBA扩增的RNA.与利用本发明引物和探针有关的进一步指导可参见被完整引入本文作为参考的Compton在1991，Nature 350：91-92和Kievits等人在1991，J.Virol.Methods 35：273-86中的论文.
这种方法的其它实例包括上文详述的5’核酸酶反应.这种方法的另一个实例包括用本发明的两种引物扩增日本脑炎血清群成员的核酸，接着用本发明探针检测该扩增核酸.在这种方法中，可被本领域技术人员利用或调整用于检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的另一些实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,403,339、6,329,152、5,952,202和5,387,510。
在另一些实施方案中，本领域技术人员已知的利用核酸引物和核酸探针检测核酸的任意方法均可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸。不加限制的话，可在上述本领域技术人员已知的任意方法中应用3.1和3.2节所描述的核酸引物和探针.本领域技术人员应认识到，在上述某些方法中，本发明的引物还可被用作探针，而本发明的探针则可被用作引物。
例如，日本脑炎病毒血清群成员的核酸可与结合在固相支持体上的本发明引物杂交.本发明的可检测标记探针可接着与待检核酸杂交，由此指出该核酸的存在。可选地，该探针可被结合在所述固相支持体上并被用于捕捉上述核酸，接着可使引物具有可检测标记并与所述核酸杂交，由此指出该核酸的存在.采用与固相结合的探针的方法被公开在US 5,232,829和EP 420 260中.
利用核酸引物和探针检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的方法的另一个实例包括利用毫微粒子.在这种方法中，可与待检核酸的不同区域杂交的两种寡核苷酸，诸如本发明的引物或探针是共价连接毫微粒子的.该毫微粒子在杂交条件下与日本脑炎病毒血清群成员的核酸接触.如果该核酸存在，则该核酸将与所述毫微粒子所连的寡核苷酸结合，生成可被检测的大分子量复合体.不加限制的话，可通过本领域技术人员已知的任意方法检测该复合体.在某些实施方案中，是通过该复合体的沉淀对其进行检测的。与利用毫微粒子连同本发明引物和探针的方法有关的进一步指导可参见Taton et al.，2000，Science289(5485)：1757-60和美国专利Nos.6,506,564、6,495,324、6,417,340、6,399,303和6,361,944.
在另一个实例中，可采用滚环扩增(“RCA”)作为检测日本脑炎病毒血清群成员核酸方法的一部分.在RCA方法的某些实施方案中，是通过互补引物的聚合酶延伸扩增DNA环的.本发明的任意引物或探针均可被应用在这种方法中.环化DNA的方法是本领域熟知的，包括例如，在有助于分子内连接的条件下使DNA分子的末端连接在一起.不加限制的话，接着可通过本领域技术人员已知的任意核酸检测方法检测单链产物的多联体产物.例如，可利用本发明的可检测标记探针检测该多联体产物.本文详述了检测已知序列的核酸的其它方法实例.在另一些RCA实施方案中，可采用与所述多联体产物互补的第二种引物.该引物可指数扩增存在于环状DNA模板中的序列.还可通过例如，利用本发明的可检测标记探针检测该扩增产物。与在RCA方法中利用本发明引物和探针检测日本脑炎病毒血清群成员核酸有关的进一步指导可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,344,329、6,350,580、6,221,603、6,210,884、5,648,245和5,714,320，以及国际专利出版物WO95/35390.
这种方法的另一个实例是上述不依赖聚合作用的5′核酸酶反应.被完整引入本文作为参考的美国专利6,316,200、6,268,128、6,180,338、5,716,784和5,573,906描述了利用引物和探针并可被本领域技术人员利用或调整用于检测日本脑炎病毒血清群成员的方法的另一些实例.
在某些实施方案中，可采用本领域技术人员已知的利用两种核酸引物、可扩增核酸并检测该核酸的任意试验方法检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.不加限制的话，可在本领域技术人员已知的所有这种方法中采用3.1节所述的核酸引物。此外，本领域技术人员应认识到，在上述某些方法中，本发明的探针还可被用作引物。
在这种方法的一个实例中，可通过下述方法检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸，即采用至少一种包括了特定发夹结构的引物扩增该核酸，所述发夹结构在分子的5’末端包括荧光部分和猝灭剂部分.将该引物掺入扩增产物，可使所述荧光部分与猝灭剂部分分离，从而得以检测该荧光部分.该荧光部分的检出说明存在日本脑炎病毒血清群成员的核酸。本领域的技术人员通过在所述引物或探针中掺入附加残基以形成必需的发夹结构，便易于认识到本发明引物或探针在这种方法中的用途.与设计和选择这种引物和探针有关的进一步指导可参见被完整引入本文作为参考的Nazerenko et al.，1997，Nucleic AcidsRes.25：2516-2521和Thelwell et al.，2000，Nucleic Acids Res.28：3752-3761.
在这种方法的另一个实例中，可采用链置换扩增(“SDA”)检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.在这种方法中，扩增的日本脑炎病毒血清群核酸是通过掺入特定单链引物而得以检测的，该单链引物包括荧光部分、猝灭剂部分和将这两个部分分隔开的改造限制位点。本领域的技术人员可容易地认识到如何对本发明的任意引物或探针进行修饰，以使其适用于SDA.
在应用于SDA的第一种扩增反应中，引物是在例如硫代dCTP存在条件下被用于扩增日本脑炎血清群成员的核酸，从而将该引物掺入了扩增产物中.接着，可采用限制性内切核酸酶，在该引物中形成限制位点切口.该限制性内切核酸酶不能切割扩增产物的两条链，因为扩增产物中掺入了硫代dCTP.最终，可将通过切口形成的引物3′末端用于引发新聚合反应，从而将该链的3’部分置换为模板链来源的切口。对该链的置换使荧光部分与猝灭剂部分分离，从而阻止了对该荧光部分所发射荧光的猝灭.由此便可通过测定荧光的存在和/或荧光量，检测和/或定量日本脑炎血清群成员的核酸.与对引物和探针进行选择和修饰以使其适用于SDA有关的进一步指导可参见被完整引入本文作为参考的Little et al.，1999，Clin.Chem.45-777-784以及美国专利6,528,254和6,528,632.
在另一个实例中，可利用转录介导的扩增(“TMA”)检测日本脑炎血清群成员的核酸.TMA是利用RNA聚合酶和逆转录酶扩增待检核酸的RNA转录扩增系统。在该方法中，采用了本发明中具有用于RNA聚合酶的启动子的引物，以引发日本脑炎病毒血清群成员RNA的逆转录。逆转录酶的RNAse活性接着降解RNA模板，释放cDNA链。第二个链合成是由本发明的第二种引物引发的，并由逆转录酶催化的.RNA聚合酶接着识别在第二条链中合成的启动子并从该第二条链开始催化多个循环的RNA转录.接着便可检测该RNA产物，或将其作为另一轮扩增的模板.
接着可通过本领域技术人员已知的任意方法检测TMA的RNA产物。在某些实施方案中，可采用本发明的探针检测该RNA产物.在另一些实施方案中，可采用已标记有吖啶-酯标记(Gen-Probe，Inc.，SanDiego，CA)的本发明探针检测该RNA产物.可通过化学方法从未杂交探针上移除这种标记，而不干扰已杂交探针上的标记.因此，在这种实施方案中，可通过检测该吖啶-酯标记的存在，确定日本脑炎病毒血清群成员核酸的存在.与在以TMA为基础的方法中应用本发明引物和探针有关的进一步指导可参见被完整引入本文作为参考的Arnoldet al.，1989，Clin.Chem.35：1588-1594、Miller et al.，1994，J.Clin.Microbiol.32-393-397，以及美国专利6,335,166和6,294,338.
在另一个实例中，可利用诊断PCR检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.在这种方法中，待检核酸的存在是通过对PCR产物进行的成功的模板依赖型扩增而得以说明的。通常，可由PCR产物的大小确定该PCR产物的同一性；对待检核酸的成功扩增通常将获得已知大小的PCR产物。确定诸如PCR产物的核酸大小的方法是本领域熟知的，还包括例如，凝胶和毛细管电泳等.
检测PCR产物的成功扩增并由此表明存在日本脑炎血清群成员的其它方法包括利用非特异性DNA结合染料。例如，可在扩增反应中包括
Figure C20048001479000611
绿(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)，以检测和定量PCR期间生成的任意双链DNA。这种方法的实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,323,337和5,863,753。
最后，被完整引入本文作为参考的美国专利6,528,632、6,475,729、6,361,944、6,329,152、6,270,967、6,258,546、6,063,603、6,057,099、6,040,166、5,914,230、5,843,650、5,747,255、5,747,251、5,731,146、5,712,386、5,635,347、5,554,517、5,409,818、5,384,242、4,965,188、4,868,104、4,800,159和4,683,195描述了可被本领域技术人员利用或调整，以利用本发明引物和探针检测日本脑炎病毒血清群成员的其它方法。
在另一些实施方案中，可采用本领域技术人员已知的利用可与核酸杂交的单一核酸引物或探针检测该核酸的任意试验方法，以检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸。不加限制的话，可在上述本领域技术人员已知的任意方法中应用3.1和3.2节描述的核酸引物和探针。此外，本领域技术人员应认识到，在上述某些方法中，本发明引物还可被用作探针，而本发明探针则可被用作引物.
例如，通过利用引物起动引物延伸反应，可检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.核酸聚合酶对该引物的成功延伸说明存在日本脑炎病毒血清群成员的核酸.可说明存在日本脑炎病毒血清群成员的引物延伸产物是通过本领域技术人员已知的任意方法检测的.例如，该引物延伸反应可掺入32P-标记或荧光标记的核苷酸。
描述了可如本文所述内容应用或被本领域技术人员调整用于检测日本脑炎病毒血清群成员的方法的其它单一引物或探针检测法实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,440,707、6,379,888、6,368,803、6,365,724、6,361,944、6,352,827、6,326,145、6,312,906、6,268,128、6,261,784、6,177,249、6,140,055、6,130,047、6,124,090、6,121,001、6,110,677、6,054,279、6,022,686、5,981,176、5,958,700、5,945,283、5,935,791、5,919,630、5,888,739、5,888,723、5,882,867、5,876,924、5,866,336、5,856,092、5,853,990、5,846,726、5,814,447、5,808,036、5,800,989、5,795,718、5,792,614、5,710,028、5,683,875、5,683,872、5,679,510、5,641,633、5,597,696、5,595,890、5,571,673、5,547,861、5,525,462、5,514,546、5,491,063、5,437,977、5,294,534、5,118,605、5,102,784、4,994,373、4,851,331、4,767,700和4,683,194。
上文参考的某些美国专利公开了可利用一种或两种引物，或利用一种或两种引物和一种探针的方法.上述内容不意味着将这些方法加以类别.利用了例如，在被描述为提供了利用单一引物检测核酸的方法的美国专利中所提供的两种引物检测核酸的方法也被引入本文作为参考，并可与本发明的引物、探针和试剂盒一起应用.
4.3.利用探针检测日本脑炎血清群成员和其它某些黄病毒的核酸的方法
除了上述检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的试验方法外，本发明进一步提供了检测日本脑炎病毒血清群成员和其它某些黄病毒的核酸的方法.上文3.4节描述了可根据这些方法检测的黄病毒。
在某些实施方案中，本领域技术人员已知的利用核酸探针检测核酸的任意方法均可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员和其它某些黄病毒的核酸。上文3.2节描述了可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员和其它某些黄病毒的核酸的核酸探针.
在某些实施方案中，可采用本发明探针并通过确定该探针是否与样品中存在的病毒序列结合，以确定该样品中是否存在日本脑炎病毒血清群成员和其它某些黄病毒的核酸的病毒序列.例如，可采用斑点印迹形式实现该检测.在斑点印迹形式中，未标记的扩增样品与诸如膜的固相支持体结合，接着在合适的杂交条件下用标记探针温育该膜，通过洗涤除去未杂交的探针，并监测滤器以检出已结合探针。当采用单一探针分析多个样品时，该斑点印迹形式相当有用.通过将膜浸入探针溶液中，可使多个样品固定在单张膜上的离散位置处并同时进行杂交。
当采用大量的不同探针时，相当有用的可选方法是“反向”斑点印迹形式，其中的扩增序列具有标记，而所述探针则与固相支持体结合。如果本发明的试验方法是作为一组将针对样品同时进行的方法中的一部分被应用，则该形式是有用的.在该形式中，未标记探针在合适的严格杂交条件下与膜结合并暴露于已标记的样品.接着通过在合适的严格条件下进行洗涤，以除去未杂交的已标记样品，并监测滤器，以检出已结合序列.
在微量滴定板中可方便地进行正向和反向斑点印迹试验；参见被完整引入本文作为参考的1991年5月3日提交的美国专利申请695,072，即1989年9月29日提交的美国专利申请414,542的CIP，以及已被授予权利的美国专利5,232,829.所述探针可与牛血清白蛋白(BSA)相连，例如，通过粘着微量滴定板，从而将该探针固定.
在提供了检测膜结合核酸方法并被完整引入本文作为参考的美国专利6,383,756中，描述了另一种利用本发明探针检测日本脑炎病毒血清群成员和其它某些黄病毒的核酸的方法实例。
在另一个实例中，可采用以分支DNA为基础的方法检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸.在这些方法中，树突状聚合物单体由两条DNA链构成，这两条链的中心部分共享一个序列互补区域.当这两条链退火形成上述单体时，所获结构具有与四个单链末端相连的双链中心.通过使所述单体的单链末端彼此杂交，可由单体装配获得树突状聚合物，同时仍保留许多空置的单链末端.这些空置的单链末端可具有本发明所述任意引物或探针的序列.不加限制的话，可用本领域技术人员已知的任意可检测部分，如上文所述与本发明探针有关的任意可检测部分，可检测地标记树突状聚合物.
接着，可在例如，下述“斑点印迹”试验中把树突状聚合物用作探针.此外，可在本领域技术人员已知的任意方法中把树突状聚合物用作探针，其中该探针是被直接检测的.当可以确定存在所述探针时，便可直接检测该探针，而无需任何后续反应或修饰，诸如斑点印迹或DNA杂交.与选择并利用可作为探针检测日本脑炎血清群成员或其它可检测黄病毒的核酸的树突状聚合物s有关的进一步指导可参见被完整引入本文作为参考的美国专利6,261,779和Nilsen et al.，1997，J.Theoretical Biology 187：273-284、Capaldi et al.，2000，Nucleic.Acids Res.，28(7)：21e、Wang et al.，1998，J.Am.Chem.Soc.120：8281-8282以及Wang et al.，1998，Electroanalysis10(8)：553-556.
本领域的技术人员应认识到，本发明探针可与特定的任意引物组合应用，该引物可选择性地与可用本发明探针检测的病毒杂交.相应地，组合应用本发明探针和可选择性地与可检测黄病毒杂交的任意引物检测可检测黄病毒的方法应该也在本发明的范畴内.
上文4.2节所述利用单一引物或探针并可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的任意方法均可与本发明探针一起被用于检测上文3.4节所述的其它黄病毒.
5.试剂盒
在另一个方面中，本发明提供了可被用于检测日本脑炎病毒血清群成员和/或其它某些黄病毒的核酸的试剂盒.上文3.3节描述了可用本发明试剂盒检测的日本脑炎病毒血清群成员，而可用本发明试剂盒检测的其它黄病毒的核酸则如上文3.4节所述.
在某些实施方案中，所述试剂盒包括本发明的探针.在某些实施方案中，所述试剂盒包括本发明的引物.在某些实施方案中，所述试剂盒包括由一种或多种本发明引物和探针构成的组合.
例如，在一种实施方案中，所述试剂盒包括可与SEQ ID NO.：1所示核酸杂交的第一种核酸引物，和可与SEQ ID NO.：9所示核酸杂交的第二种核酸引物.在另一些实施方案中，所述试剂盒包括含有特定多核苷酸的引物(例如至少一种上游和/或一种下游引物)，该多核苷酸可与SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或它们的互补序列杂交.典型的引物可选自，例如SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67.
在某些实施方案中，所述试剂盒包括选自SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54或SEQID NO：55的至少一种上游和/或一种下游引物.
在另一些实施方案中，所述试剂盒包括选自SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63的至少一种上游和/或一种下游引物。
在上述某些实施方案中，所述试剂盒还包括如本文所述可与SEQ IDNO.：16所示核酸或其互补序列杂交的核酸探针.
在某些实施方案中，所述试剂盒包括用于检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的两个核酸引物和一个核酸探针.上文3.1节详述了可作为本发明试剂盒组成部分的核酸引物，而可作为本发明试剂盒组成部分的核酸探针则如上文3.2节所述.如上所述，可任选地标记所述探针.在某些实施方案中，所述试剂盒包括热稳定DNA聚合酶.在某些实施方案中，所述热稳定DNA聚合酶具有逆转录活性.在某些实施方案中，所述试剂盒包括与根据本发明方法检测可检测黄病毒核酸有关的说明书.在另一些实施方案中，所述试剂盒包括与检测日本脑炎病毒血清群成员有关的说明书.在另一些实施方案中，所述试剂盒则包括一个或多个可容纳其组成部分的容器.
在某些实施方案中，所述试剂盒可含有包括本发明引物在内的组合物。该试剂盒还可含有包括本发明探针在内的组合物。该试剂盒可进一步含有包括热稳定DNA聚合酶在内的组合物。所述包括本发明引物或探针或热稳定DNA聚合酶在内的组合物可进一步包括其它试剂。例如，该组合物可以包括可阻止其降解的合适防腐剂、可调节其pH的合适缓冲剂、可改变其粘度的合适稀释剂等.
所述试剂盒还可包括上述其它用于进行5’核酸酶反应的试剂。此外，所述试剂盒可包括用于检测断裂的探针并说明存在日本脑炎病毒血清群成员核酸的试剂.被完整引入本文作为参考的美国专利6,514,736、6,197,563、6,040166和5,641,864描述了可被用于检测确定序列的核酸的试剂盒.本领域技术人员可容易地利用本发明引物和探针对上述美国专利的公开内容进行改动，以设计出仍属于本发明范畴的其它试剂盒.
总之，本发明针对的是用于检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的方法，包括：
a)使样品在特定条件下和可与SEQ ID NO.：16所示核酸或其互补序列杂交的可检测标记核酸探针、可与SEQ ID NO.：1所示核酸或其互补序列杂交的引物，以及具有5′-3′外切核酸酶活性的模板依赖型核酸聚合酶接触，所述特定条件即可使模板依赖型核酸聚合酶断裂所述可检测标记核酸探针的条件；并
b)检测上述可检测标记核酸探针的断裂，其中该可检测标记探针的断裂说明存在日本脑炎血清群成员的核酸.
在优选实施方案中，所述可检测标记探针包括SEQ ID NO.：17、SEQID NO.：18和SEQ ID NO.：28所示任意序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸.优选的可检测标记探针包括荧光部分.优选的荧光部分选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料和
Figure C20048001479000661
家族染料.一种非常优选的荧光部分是6-羧基荧光素.
对试验的优选实施方案而言，所述可检测标记探针进一步包括猝灭剂部分.优选的猝灭剂部分选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料、
Figure C20048001479000663
家族染料和非荧光猝灭剂部分。最优选的猝灭剂部分是Cy5TM。优选的非荧光猝灭剂部分选自BHQTM-家族染料、Iowa BlackTM或Dabcyl。最优选的非荧光猝灭剂部分选自BHQTM-1、BHQTM-2和BHQTM-3，在
Figure C20048001479000664
试验中，具有5′-3′核酸酶活性的模板依赖型核酸聚合酶对可检测标记探针的断裂将所述荧光部分与猝灭剂部分分离。优选地可通过激光诱发的荧光检测所述探针的断裂.更优选的是，当所述探针完整时，荧光部分相对于猝灭剂部分的定位可使荧光部分发射的光子被猝灭剂部分吸收，而具有5′-3′核酸酶活性的酶对该探针的断裂将所述荧光部分与猝灭剂部分分离，从而得以检测荧光部分发射的光子.
在一种方法中，是利用包括了可与SEQ ID NO.：1所示核酸杂交的核酸在内的第一种引物扩增日本脑炎病毒血清群成员的核酸.更优选地是利用包括了SEQ ID NO.：2所示序列中的至少16个连续核苷酸的第一种引物扩增所述核酸。最优选的第一种引物包括SEQ ID NO.：3或SEQ ID NO.：8所示序列.
当采用经过修饰的残基时，优选的是，SEQ ID NO.：8所示序列的23号位残基为N6-烷基-脱氧腺苷，或者SEQ ID NO.：8所示序列的23号位残基为N6-甲基-脱氧腺苷，或者SEQ ID NO.：8所示序列的24号位残基为N6-烷基-脱氧腺苷，最优选的是N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷。更优选的是SEQ ID NO.：8所示序列的23号位残基为N6-甲基-脱氧腺苷，SEQ ID NO.：8所示序列的24号位残基为N6-叔丁基-苄基-脱氧腺苷.
优选的第二种引物包括可与SEQ ID NO.：9所示核酸杂交的核酸，更优选地是包括SRQ ID NO.：10所示序列中的至少16个连续核苷酸，最优选地是包括SEQ ID NO.：11或15所示序列.当采用经过修饰的残基时，优选的第二种引物包括SEQ ID NO.：15所示序列中24号位的N6-烷基脱氧腺苷，最优选的是N6-叔丁基苄基-脱氧腺苷.
根据本发明的寡核苷酸是被用于上述方法的引物和探针.根据它们的定位和序列，可将引物用作探针，或者反之亦然.优选的寡核苷酸包括SEQ ID NOs：2、9和17所示任意序列或其互补序列中的至少16个连续核苷酸.另一些优选的寡核苷酸包括SEQ ID NOs 3、4、5、6、7、8、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28所示任意序列或其互补序列中的至少16个连续核苷酸。
优选试剂盒包括上述的优选寡核苷酸.更优选的试剂盒包括
a)可与SEQ ID NO.：1所示核酸或其互补序列杂交的第一种核酸引物
b)可与SEQ ID NO.：9所示核酸或其互补序列杂交的第二种核酸引物；和
c)可与SEQ ID NO.：16所示核酸或其互补序列杂交的核酸探针.最优选的试剂盒包括上述任选或优选地被标记和修饰过的优选引物和探针。此外，该试剂盒还包括热稳定DNA聚合酶.这种热稳定DNA聚合酶可具有逆转录活性。这种具有逆转录活性的热稳定DNA聚合酶优选地选自Carboxydothermus hydrogenformans DNA聚合酶、Thermosipho africanus DNA聚合酶、Bacillus pallidus DNA聚合酶、栖热菌种Z05DNA聚合酶、栖热水生菌DNA聚合酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶和栖热菌种sps17 DNA聚合酶.
该试剂盒还可包括与检测日本脑炎病毒血清群成员核酸有关的说明书.
本发明的另一个主题是用于检测日本脑炎病毒血清群成员的组合物，该组合物包括可与SEQ ID NO.：1所示核酸或其互补序列杂交的核酸引物和缓冲剂.优选的引物和探针如上所述.
本发明的另一个主题是用于检测样品中的日本脑炎病毒血清群成员或登革热病毒、黄热病病毒、Modoc病毒或蒙太拿鼠耳蝠脑白质炎病毒的核酸的方法，包括：
a)使样品和可与SEQ ID NO.：16所示序列杂交的核酸探针接触；并
b)检测该核酸探针与日本脑炎病毒血清群成员或登革热病毒、黄热病病毒、Modoc病毒或蒙太拿鼠耳蝠脑白质炎病毒的核酸的杂交，以检测日本脑炎病毒血清群成员或登革热病毒、黄热病病毒、Modoc病毒或蒙太拿鼠耳蝠脑白质炎病毒的核酸的存在。
本发明的另一个主题是用于检测样品中的日本脑炎病毒血清群成员核酸的方法，包括：
a)在可与SEQ ID NO.：16所示序列杂交的核酸探针和具有5′-3′外切核酸酶活性的模板依赖型DNA聚合酶的存在条件下扩增日本脑炎病毒血清群成员的核酸；并
b)检测该探针的断裂，以检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的存在。
本发明的另一个主题是用于检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的方法，包括
a)使样品和可与SEQ ID NOs.1、9、16或29所示任意序列杂交的核酸引物或探针接触，其中该核酸引物或探针是在允许日本脑炎病毒血清群成员的核酸与其杂交的条件下与固相支持体共价连接的；
b)使可与SEQ ID NOs.：1、9、16或29所示任意序列杂交的可检测标记引物或探针和上述固相支持体接触，该可检测标记引物或探针不是上述与固相支持体共价连接的相同引物或探针；并
c)通过检测该可检测标记引物或探针与日本脑炎病毒血清群成员核酸的杂交，以检测日本脑炎病毒血清群成员核酸.
本发明的另一个主题是用于定量样品中的日本脑炎病毒血清群成员核酸的方法，包括：
a)使待检测是否存在日本脑炎病毒血清群成员的样品和可与SEQID NO.：16所示核酸或其互补序列杂交的荧光标记核酸探针和具有5′-3′外切核酸酶活性的模板依赖型核酸聚合酶接触；
b)检测该荧光标记核酸探针被具有5′-3′外切核酸酶活性的模板依赖型核酸聚合酶断裂所生成的片段量，其中该荧光标记探针断裂的量与样品中存在的日本脑炎血清群成员的核酸量成比例；并
c)通过比较由上述荧光标记探针发射的荧光量和由对照反应中的荧光标记探针所发射的荧光量，确定该荧光标记探针断裂的量。
本发明的另一个主题是用于检测日本脑炎病毒血清群成员核酸的方法，包括：
a)扩增日本脑炎病毒血清群成员的核酸；
b)使可与SEQ ID NO.：16所示序列杂交的可检测标记探针与日本脑炎血清群成员的扩增核酸杂交；并
c)检测该可检测标记探针，以检测日本脑炎血清群成员核酸。
本发明的另一个主题是包括SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQID NO：40所示序列的分离多核苷酸。
本发明的另一个主题是具有特定多核苷酸的载体，该多核苷酸包括SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40所示序列。
本发明的一个进一步的主题是包括特定序列的寡核苷酸，该特定序列由至少10个相邻核苷酸构成，可与SEQ ID NO：29或其互补序列、SEQ ID NO：30或其互补序列、SEQ ID NO：31或其互补序列、SEQ ID NO：32或其互补序列、SEQ ID NO：33或其互补序列、SEQ ID NO：34或其互补序列、SEQ ID NO：35或其互补序列、SEQ ID NO：36或其互补序列、SEQ ID NO：37或其互补序列、SEQ ID NO：38或其互补序列、SEQ ID NO：39或其互补序列、SEQ ID NO：40或其互补序列杂交.优选的寡核苷酸具有少于100个的核苷酸.更优选的寡核苷酸可与SEQ ID NO：68所示序列杂交，或与SEQ ID NO：69的互补序列杂交或者/并且包括选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的序列。还要更优选的寡核苷酸选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：66和SEQ ID NO：67.最优选的寡核苷酸是选自SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65或选自SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的寡核苷酸。
本发明的另一个主题是包括上述任意寡核苷酸的反应混合物.优选的反应混合物进一步包括可与SEQ ID NO：16所示序列或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸，更优选的是包括上文所述的任意标记探针，优选地用于
Figure C20048001479000701
试验.最优选的反应混合物包括DNA聚合酶.
本发明的另一个主题是检测圣路易斯脑炎病毒的方法，包括：
在特定条件下，用至少一种包括特定核苷酸序列的寡核苷酸扩增圣路易斯脑炎病毒的核酸，所述特定核苷酸序列可与SEQ ID NO：29或其互补序列、SEQ ID NO：30或其互补序列、SEQ ID NO：31或其互补序列、SEQ ID NO：32或其互补序列、SEQ ID NO：33或其互补序列、SEQID NO：34或其互补序列、SEQ ID NO：35或其互补序列、SEQ ID NO：36或其互补序列、SEQ ID NO：37或其互补序列、SEQ ID NO：38或其互补序列、SEQ ID NO：39或其互补序列或SEQ ID NO：40或其互补序列杂交，所述特定条件即允许从所述寡核苷酸开始扩增上述核苷酸序列的至少一部分的条件；并
检测扩增核酸，以检测圣路易斯脑炎病毒.优选的寡核苷酸包括选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的序列，更优选的是选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67.最优选的寡核苷酸可与SEQ ID NO：68所示序列杂交，或与SEQ ID NO：69的互补序列杂交。优选的寡核苷酸具有少于100个的核苷酸.优选方法采用的是选自SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65的引物；和选自SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的引物。
所述方法优选地包括检测步骤，包括使可与SEQ ID NO：16所示序列杂交的可检测标记寡核苷酸与圣路易斯脑炎病毒核酸的扩增核酸杂交；并检测该探针与扩增核酸的杂交.优选的探针如上文所述。扩增核酸的量优选地在扩增期间测定。最优选的是
Figure C20048001479000702
法.
本发明的另一个主题是包括与所述方法有关的上述寡核苷酸的试剂盒。
本发明的另一个主题是包括选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63的序列的寡核苷酸.优选的寡核苷酸选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63。
另一个主题是包括上述寡核苷酸的反应混合物，优选的反应混合物进一步包括可与SEQ ID NO：25所示序列或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸.更优选的可检测标记寡核苷酸可与SEQ ID NO：16所示序列或其互补序列杂交.最优选的可检测标记寡核苷酸包括序列FGGTCTAGAIGGTTAGAGGAGACCCTCCAG，其中F为CY5；I为FAM；P为PO4；U为丙炔基dU；和E为5-甲基-dC.优选的反应混合物包括至少一种上游引物和至少一种下游引物.
本发明的另一个主题是检测黄热病病毒的方法，包括在特定条件下用至少一种包括特定序列的寡核苷酸扩增黄热病病毒的核酸，所述特定序列选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ IDNO：63，所述特定条件即允许从所述寡核苷酸开始扩增上述核苷酸序列的至少一部分的条件；并检测扩增核酸，以检测黄热病病毒.更优选的寡核苷酸选自SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63.优选的检测步骤包括使可与SEQ ID NO：25所示序列或其互补序列杂交的可检测标记寡核苷酸与黄热病病毒核酸的扩增核酸杂交；并检测该可检测标记寡核苷酸与扩增核酸的杂交.优选的可检测标记寡核苷酸包括F-5’-GGTCTAGAIGGTTAGAGGAGACCCTCCAG-3’-P，其中F为CY5；I为FAM和P为PO4；或者可与SEQ ID NO：16所示序列或其互补序列杂交.优选的可检测标记寡核苷酸包括SEQ IDNO.：17所示序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸，包括SEQ IDNO.：18所示序列或其互补序列，包括SEQ ID NO.：28所示序列或其互补序列.对优选的
Figure C20048001479000711
试验而言，优选的可检测标记寡核苷酸包括荧光部分和猝灭剂部分.扩增核酸的量优选地在扩增期间测定，由此便可定量样品中的病毒.
用于检测黄热病病毒的试剂盒包括适用于所述方法的上述寡核苷酸.
本发明的另一个主题是包括特定序列的寡核苷酸，所述特定序列选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55.优选的寡核苷酸选自SEQID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55.
本发明的另一个主题是包括这种寡核苷酸的反应混合物。优选的寡核苷酸包括可检测标记.
本发明的另一个主题是检测登革热病毒的方法，包括在特定条件下用至少一种包括特定序列的寡核苷酸扩增登革热病毒的核酸，所述特定序列选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55，所述特定条件即允许从该寡核苷酸开始扩增上述核苷酸序列的至少一部分的条件；并检测扩增核酸，以检测登革热病毒.该方法优选地进一步包括使可与SEQID NO：16所示序列杂交的可检测标记寡核苷酸与扩增的登革热病毒核酸杂交；并检测该寡核苷酸与扩增核酸的杂交.优选的可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO：24所示序列或其互补序列.更优选的寡核苷酸选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：53、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55.所述核酸是用至少一种上游引物和至少一种下游引物扩增的。优选的可检测标记寡核苷酸包括SEQ ID NO.：17所示序列或其互补序列中的至少20个连续核苷酸，包括SEQ ID NO.：18所示序列或其互补序列，或者包括SEQ ID NO.：28所示序列或其互补序列.上述优选特征适用于
Figure C20048001479000731
和定量试验。
本发明的另一个主题是用于检测登革热病毒的试剂盒，该试剂盒包括适用于所述方法的上述寡核苷酸.
实施例
实施例1：西尼罗病毒RNA的扩增和检测
病毒感染细胞培养物上清液的裂解液获得自疾病控制和预防中心的Dr.R.Lanciotti.核酸是利用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(QiagenInc.，Valencia，CA)中的试剂并根据生产商的说明书由上述裂解液纯化而得.制备纯化核酸的10-倍系列稀释液(10-2-10-7)。利用
Figure C20048001479000732
试剂和方法进行5′核酸酶反应试验，并通过在含有1μM引物(包括SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：15)、55mM Tricine(pH 7.7，Sigma，cat T-5816)、450μM dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP，Pharmacia)、2.7mM乙酸锰(Fluka，cat 63537)、135mM乙酸钾(Fluka，cat 60035)、7％(v/v)DMSO(Sigma，cat D8418)、6％(V/V)甘油(USB，cat 16347)、5单位的尿嘧啶-N-糖基化酶(RocheDiagnostics)、40单位的Z05 DNA聚合酶(Roche Diagnostics)和0.15μM探针(SEQ ID NO：28，标记有FAM和CY5)的100μl反应混合物中进行RT-PCR，以扩增各50微升的上述稀释液。逆转录/PCR是在COBAS TaqManTM设备(Roche Diagnostics，Pleasanton，CA)中利用下述热循环参数进行的：50℃下4分钟→59℃下30分钟→2个循环，每个循环包括95℃下15秒、58℃下50秒→60个循环，每个循环包括91℃下15秒、58℃下50秒→40℃下2分钟.扩增结果的一个实例如图6所示.
本文描述了本发明的多种实施方案.所述内容和实例意在说明本发明，而非对其构成限制.当然，本领域技术人员应明白，可以在不偏离本发明精神或下述附加权利要求范畴的前提下改动本发明所述的多种实施方案.
本文所引用的各参考文献均被完整引入本文作为参考。
序列表
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<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄病毒基因组3’非翻译区内的保守序列区
<400>1
gtaagccctc agaaccgtct cggaa                                          25
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>SEQ ID NO：1的互补序列
<400>2
ttccgagacg gttctgaggg cttac                                          25
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>日本脑炎病毒血清群引物1
<220>
<221>综合特征
<222>(8)..(8)
<223>n＝t或缺失
<400>3
gwaasccnsy crramcysyy tcggrw                                          26
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>西尼罗病毒引物1
<220>
<221>综合特征
<222>(8)..(8)
<223>n＝t或缺失
<400>4
gtaagccncy cagaaccgyy tcggaa                                          26
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>日本脑炎病毒引物1
<220>
<221>综合特征
<222>(8)..(8)
<223>n＝缺失
<400>5
gaaasccnct crraacygty tcggaa                                         26
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Murray河谷脑炎病毒引物1
<400>6
gaaagcctcc cagamccgty tcggaa                                         26
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Koutango病毒引物1
<400>7
gtaagccctc agaaccgtct cggaa                                          25
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>实例引物1
<400>8
gtaagccctc agaaccgtct cggaa                                          25
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄病毒基因组3’非翻译区内的保守序列区
<400>9
tctcctagtc tatcccaggt gtcaa                                          25
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>SEQ ID NO：9的互补序列
<400>10
agaggatcag atagggtcca cagtt                                          25
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>日本脑炎病毒血清群引物2
<220>
<221>综合特征
<222>(11)..(11)
<223>n＝t或缺失
<400>11
yccyastmtw nyyccaggtr tcaa                                           24
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>西尼罗病毒引物2
<400>12
ycctagtcta tcccaggtrt caa                                            23
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>日本脑炎病毒引物2
<400>13
cccyastmta tyyccaggtg tcaa                                           24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>Murray河谷脑炎病毒引物2
<400>14
tcctagtctt ttcccaggtg tcaa                                           24
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>实例引物2
<400>15
tcctagtcta tcccaggtgt caa                                            23
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄病毒基因组3’非翻译区内的保守序列区
<400>16
ggactagagg ttagaggaga ccccgcgg                                       28
<210>17
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>SEQ ID NO：16的互补序列
<400>17
ccgcggggtc tcctctaacc tctagtcc                                        28
<210>18
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测黄病毒的探针
<220>
<221>综合特征
<222>(25)..(25)
<223>n＝g、c、t、a或缺失
<220>
<221>综合特征
<222>(26)..(26)
<223>n＝c、t、g或缺失
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>n＝g、c、a、t或缺失
<220>
<221>综合特征
<222>(28)..(28)
<223>n＝g、c、a、t或缺失
<400>18
ggwctagwgg ttagaggaga cccynnnn                                        28
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测日本脑炎病毒血清群成员的探针
<400>19
ggactagwgg ttagaggaga ccccrykk                                       28
<210>20
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测西尼罗病毒的探针
<400>20
ggactagwgg ttagaggaga ccccrcgk                                       28
<210>21
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测日本脑炎病毒的探针
<400>21
ggactagagg ttagaggaga ccccgygg                                       28
<210>22
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测Murray河谷脑炎病毒的探针
<400>22
ggactagagg ttagaggaga ccccactc                                       28
<210>23
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测Kunjin病毒的探针
<400>23
aataygtgga ttacatgast tcaytgaag                                      29
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测登革热病毒的探针
<400>24
ggactagagg ttagaggaga ccccyssv                                       28
<210>25
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测黄热病病毒的探针
<400>25
ggtctagagg ttagaggaga ccctccag                                       28
<210>26
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测蒙太拿鼠耳蝠脑白质炎病毒的探针
<400>26
ggactagagg ttagaggaga ccccttcc                                       28
<210>27
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于检测Modoc病毒的探针
<400>27
ggactagagg ttgagggaga cccccggc                                        28
<210>28
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>实例探针1
<400>28
ggactagagg ttagaggaga ccccgcgg                                        28
<210>29
<211>418
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(418)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物BFS1750的基因组的3’非翻译区
<400>29
ttgccaccgg atgtcaggta aacggtgctg tctgtaacct ggccccaggt gactgggtta   60
tcaaagccaa tctggccgag tgcaaagccc ctcattccga ctcgggaggg tccctagcac  120
gtaggctgga gaggacgcaa aagtcagacc agaaatgcca cctgaaagca tgctaaaggt  180
gctgtctgta catgccccag gaggactggg ttaacaaagc ttaacagccc cagcggccca  240
aaccatggag tgcgtgacca tggcgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgctgcaac  300
ttggcaaggc ccaaacccgc tcgaagctgt agagacgggg gaaggactag aggttagagg  360
agaccccttg ccgttaacgc aaacaacagc atattgacac ctggaaagac aggagatc    418
<210>30
<211>342
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(342)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物1750-Std的基因组的3’非翻译区
<400>30
ttgccaccgg atgtcaggta aacggtgctg tctgtaacct ggccccaggt gactgggtta   60
tcaaagccaa tctggccgag tgcaaagccc ctcattccga ctcgggaggg tccctagcac  120
gtaggctgga gaggacgcaa aagtcagacc agaaatgcca cctgaaagca tgctaaaggt  180
gctgtctgta catgccccag gaggactggg ttaacaaagc ttaacagccc cagcggccca  240
aaccatggag tgcgtgacca tggcgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgcgcaact  300
tggcaaggcc caaacccgct cgaagctgta gagacggggg aa                     342
<210>31
<211>418
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(418)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物TD6-4G的基因组的3’非翻译区
<400>31
ttgccaccgg atgtcaggta aacggtgctg cctgtaacct ggccccaggt gactgggtta   60
tcaaagccaa tctggccgag tgcaaagccc ctcattccga ctcgggaggg tccctggcac  120
gtaggctgga gaggacgcaa aagtcagacc agaaatgcca cctgaaagca tgctaaaggt  180
gctgtctgta catgccccag gaggactggg ttaacaaagc ttaacagccc cagcggccca  240
aaccatggag tgcgtgacca tggcgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgctgcaac  300
tcggcaaggc ccaaacccgc tcgaagctgt agagatgggg gaaggactag aggttagagg  360
agaccccttg ccgttaacgc aaacaacagc atattgacac ctggaaagac aggagatc    418
<210>32
<211>342
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(342)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物CoaV750的基因组的3’非翻译区
<400>32
ttgccaccgg atgtcaggta aacggtgctg cctgtaacct ggccccaggt gactgggtta   60
ccaaagccaa tctggctgag tgcaaagccc ctcgttccga ttcgggaggg tccctggcac  120
gtaggctgga gaggacgcaa aagtcagacc agaaatgcca cctgaaagca tgctaaaggt  180
gctgtctgta catgccccag gaggactggg ttaacaaagc ttaacagccc cagcggccca  240
aaccatggag tgcgtgacca tggcgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgcgcaact  300
tggcaaggcc aaaacccgct cgaagctgta gagatggggg aa                     342
<210>33
<211>418
<212>DNA
<213>圣路易脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(418)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物L695121.05的基因组的3’非翻译区
<400>33
ttgccaccgg atgtcaggta aacggtgctg tctgtaacct ggccccaggt gactgggtta   60
tcaaagccaa tccggctggg tgcaaagccc ctcattccga ctcgggaggg tccctggcat  120
gtaggctgga gaggacgcac aagtcagacc agaaatgcca cctgaaagca tgctaaaggt  180
gctgtctgta catgccccag gaggactggg ttaacaaagc ttaacagccc cagcggccca  240
aaccatggag tgcgtgacca tggcgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgctgtaac  300
ttggcaaggc ccaaacccgc tcgaagctgt agagacgggg gaaggactag aggttagagg  360
agaccccttg ccgttaacgc aaacaacagc atattgacac ctggaaagac aggagatc    418
<210>34
<211>418
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(418)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物TNM771K的基因组的3’非翻译区
<220>
<221>综合特征
<222>(384)..(384)
<223>n＝g、a、c或t
<400>34
ttgccaccgg atgtcaggta aacggtgctg tctgtaacct ggccccaggt gactgggtca   60
tcaaagccaa tctggctggg tgcaaagccc ctcattccga ctcgggaggg tccctggcac  120
gtaggctgga gaggacgcac aagtcagacc agaaatgcca cctgaaagca tgctaaaggt  180
gctgtctgta catgccccag gaggactggg ttaacaaagc ttaacagccc cagcggccca  240
aaccatggag agcgtgacca tggcgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgctgtaac  300
ttggcaaggc ccaaacccgc tcgaagctgt agagacgggg gaaggactag aggttagagg  360
agaccccttg ccgttaacgc aaanaacagc atattgacac ctggaaagac aggagatc    418
<210>35
<211>418
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(418)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物MSI-7的基因组的3’非翻译区
<400>35
ttgccaccgg atgtcaggta aacggtgctg tctgtaacct ggccccaggc gactgggtta   60
tcaaagccaa tccggctggg tgcaaagccc ctcattccga ctcgggaggg tccctggcac  120
gtaggctgga gaggacgcac aagtcagacc agaaatgcca cctgaaagca tgctaaaggt  180
gctgtctgta catgccccag gaggactggg ttaacaaagc ttaacagccc cagcggccca  240
aaccatggag tgcgtgacca tggcgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgctgtaac  300
ttggcaaggc ccaaacccgc tcaaagctgt agagacgggg gaaggactag aggttagagg  360
agaccccttg ccgttaacgc aaacaacagc atattgacac ctggaaagac aggagatc    418
<210>36
<211>405
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(405)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物Kern217的基因组的3’非翻译区
<400>36
ccggatgtca ggtaaacggt gctgtctgta acctggcccc aggtcactgg gttatcaaag   60
ccaacccggc tgggtgcaaa gcccctcatt ccgactcggg agggtccctg gcacgtaggc  120
tggagaggac gcacaagtca gaccagaaat gccacctgaa agcatgctaa aggtgctgtc  180
tgtacatgcc ccaggaggac tgggttaaca aagcttaaca gccccagcgg cccaaaccat  240
ggagtgcgtg accatggcgt aaggactaga ggttagagga gaccccgctg taacttggca  300
aggcccaaac ccgctcaaag ctgtagagac gggggaagga ctagaggtta gaggagaccc  360
cttgccgtta acgcaaacaa cagcatattg acacctggaa agaca                  405
<210>37
<211>375
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(375)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物CoaV608的基因组的3’非翻译区
<400>37
cccaggcgac tgggttatca aagccaatcc ggctgggtgc aaagcccctc attccgactc   60
gggagggtcc ctggcacgta ggctggagag gacgcacaag tcagaccaga aatgccacct  120
gaaagcatgc taaaggtgct gtctgtacat gccccaggag gactgggtta acaaagctta  180
acagccccag cggcccaaac catggagtgc gtgaccatgg cgtaaggact agaggttaga  240
ggagaccccg ctgtaacttg gcaaggccca aacccgctca aagctgtaga gacgggggaa  300
ggactagagg ttagaggaga ccccttgccg ttaacgcaaa caacagcata ttgacacctg  360
gaaagacagg agatc                                                   375
<210>38
<211>411
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(411)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物TBH-28的基因组的3’非翻译区
<400>38
ttgccaccgg atgtcaggta aacggtgctg tctgtaacct ggccccaggt gactgggtta   60
tcaaagccaa cccggctggg tgcaaagccc ctcattccga ctcgggaggg tccctggcac  120
gtaggccgga gaggacgcac aagtcagacc agaaatgcca cctgaaagca tgctaaaggt  180
gctgtctgta catgccccag gaggactggg ttaacaaagc ttaacagccc cagcggccca  240
aaccatggag tgcgtgacca tggcgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgctgtaat  300
ttggcaaggc ccaaacccgc tcgaagctgt agagacgggg gaaggactag aggttagagg  360
agaccccttg ccgttaacgc aaacaacagc atattgacac ctggaaagac a           411
<210>39
<211>402
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(402)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物VR1265的基因组的3’非翻译区
<400>39
ccggaagtca ggtaaacggt gctgtctgta acctggcccc aggtgactgg gttatcaaag   60
ccaatctggc tgggtgcaaa gcccctcatt ccgactcggg agggtccctg gcacgtaggc  120
tggagcggac gcacaagtca gaccagaaat gccacctgaa agcatgctaa aggtgctgtc  180
tgtacatgcc ccaggaggac tgggttaaca aagcttaaca gccccagcgg cccaaaccat  240
ggagtgcgtg accatggcgt aaggactaga ggttagagga gaccccgctg taacttggca  300
aggcccaaac ccgctcgaag ctgtagagac gggggaagga ctagaggtta gaggagaccc  360
cttgccgtca acgcaaacaa cagcatattg acacctggaa ag                     402
<210>40
<211>374
<212>DNA
<213>圣路易斯脑炎病毒
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(374)
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)分离物CoaV353的基因组的3’非翻译区
<400>40
cccaggtgac tgggttatca aagccaatct agctgagtgc aaagcccctc attccgactc   60
gggagggtcc ctggcacgta ggctggagag gacgcaaaag tcagaccaga aatgccacct  120
gaaagcatgc taaaggtgct gtctgtacat gccccaggag gactgggtta acaaagctta  180
acagccccag cggcccaaac catggagtgc gtgaccatgg cgtaaggact agaggttaga  240
ggagaccccg ctgcaacttg gcaaggccca aacccgctcg aagctgtaga gacgggggaa  300
ggactagagg ttagaggaga ccccttgccg ttaacgcaaa caacagcata ttgacacctg  360
gaaagacagg agat                                                    374
<210>41
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>登革热病毒共有上游引物
<400>41
gagccccgtc caaggacgta aaaagaa                                        27
<210>42
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>登革热病毒共有上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>42
gagccccgtc caaggacgta aaaagan                                        27
<210>43
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>登革热病毒共有上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(26)..(26)
<223>n＝甲基-dA
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>43
gagccccgtc caaggacgta aaaagnn                                        27
<210>44
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>I型登革热病毒上游引物
<400>44
gagccccgtc caaggacgta aaatgaa                                        27
<210>45
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>I型登革热病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>45
gagccccgtc caaggacgta aaatgan                                       27
<210>46
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>I型登革热病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(26)..(26)
<223>n＝甲基-dA
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>46
gagccccgtc caaggacgta aaatgnn                                         27
<210>47
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>II和III型登革热病毒上游引物
<400>47
gagccccgtc caaggacgtt aaaagaa                                         27
<210>48
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>II和III型登革热病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>48
gagccccgtc caaggacgtt aaaagan                                        27
<210>49
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>II和III型登革热病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(26)..(26)
<223>n＝甲基-dA
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>49
gagccccgtc caaggacgtt aaaagnn                                        27
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IV型登革热病毒上游引物
<400>50
attgaagtca ggccacttgt gcca                                           24
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IV型登革热病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(24)..(24)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>51
attgaagtca ggccacttgt gccn                                           24
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>IV型登革热病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(23)..(23)
<223>n＝乙基-dC
<220>
<221>综合特征
<222>(24)..(24)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>52
attgaagtca ggccacttgt gcnn                                           24
<210>53
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>登革热病毒下游引物
<400>53
gatctctggt ctttcccagc gtcaa                                          25
<210>54
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>登革热病毒下游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(25)..(25)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>54
gatctctggt ctttcccagc gtcan                                          25
<210>55
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>登革热病毒下游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(24)..(24)
<223>n＝甲基-dA
<220>
<221>综合特征
<222>(25)..(25)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>55
gatctctggt ctttcccagc gtcnn                                          25
<210>56
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄热病病毒上游引物
<400>56
aaccgggata aaaactacgg gtggagaa                                       28
<210>57
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄热病病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(28)..(28)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>57
aaccgggata aaaactacgg gtggagan                                       28
<210>58
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄热病病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>n＝甲基-dA
<220>
<221>综合特征
<222>(28)..(28)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>58
aaccgggata aaaactacgg gtggagnn                                        28
<210>59
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄热病病毒上游引物
<400>59
ataaaaacta cgggtggaga accgga                                         26
<210>60
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄热病病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(26)..(26)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>60
ataaaaacta cgggtggaga accggn                                         26
<210>61
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄热病病毒下游引物
<400>61
actccggtct ttccctggcg tcaa                                           24
<210>62
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄热病病毒下游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(24)..(24)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>62
actccggtct ttccctggcg tcan                                            24
<210>63
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄热病病毒下游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(23)..(23)
<223>n＝甲基-dA
<220>
<221>综合特征
<222>(24)..(24)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>63
actccggtct ttccctggcg tcnn                                           24
<210>64
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>圣路易斯病毒上游引物
<400>64
caaagcccct cattccgact cggga                                          25
<210>65
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>圣路易斯病毒上游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(25)..(25)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>65
caaagcccct cattccgact cgggn                                          25
<210>66
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>圣路易斯病毒下游引物
<400>66
tctcctgtct ttccaggtgt caa                                            23
<210>67
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>圣路易斯病毒下游引物
<220>
<221>综合特征
<222>(23)..(23)
<223>n＝叔丁基-苄基-dA
<400>67
tctcctgtct ttccaggtgt can                                            23
<210>68
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)第一种引物互补序列
<400>68
ttgacacctg gaaagacagg aga                                            23
<210>69
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>圣路易斯脑炎病毒(SLEV)第二种引物
<400>69
caaagcccct cattccgact cggg                                           24
<210>70
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>黄病毒反义探针
<400>70
gggtctcctc taacctctag tccttccccc                                     30
<210>71
<211>98
<212>DNA
<213>黄病毒种
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(98)
<223>黄病毒基因组3’非翻译区内的保守序列区，AF196835
<400>71
caaccccagg aggactgggt gaacaaagcc gcgaagtgat ccatgtaagc cctcagaacc    60
gtctcggaag gaggacccca catgttgtaa cttcaaag                            98
<210>72
<211>105
<212>DNA
<213>黄病毒种
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(105)
<223>黄病毒基因组3’非翻译区内的保守序列区，AF196835
<400>72
tgactgaagc tgtaggtcag gggaaggact agaggttagt ggagaccccg tgccacaaaa    60
caccacaaca aaacagcata ttgacacctg ggatagacta ggaga                   105
<210>73
<211>121
<212>DNA
<213>黄病毒种
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(121)
<223>黄病毒基因组3’非翻译区内的保守序列区，AF196835
<400>73
cagggcgaaa ggactagagg ttagaggaga ccccgcggtt taaagtgcac ggcccagcct   60
gactgaagct gtaggtcagg ggaaggacta gaggttagtg gagaccccgt gccacaaaac  120
a                                                                  121
<210>74
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>实例引物2
<400>74
tctcctagtc tatcccaggt gtcaa                                          25

Claims (17)

1.用于检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸的试剂盒，包括：
a)包括SEQ ID NO.：8的第一种寡核苷酸；
b)与SEQ ID NO.：9的核酸或其互补序列杂交的第二种寡核苷酸；和
c)可检测标记的第三种寡核苷酸，其与SEQ ID NO.：16或其互补序列杂交。
2.权利要求1的试剂盒，其中SEQ ID NO.：8的24号位残基为N6-烷基-脱氧腺苷。
3.权利要求1的试剂盒，其中可检测标记的第三种寡核苷酸包括SEQ ID NO.：28或其互补序列。
4.权利要求3的试剂盒，其中可检测标记的第三种寡核苷酸包括荧光部分。
5.权利要求4的试剂盒，其中可检测标记的第三种寡核苷酸进一步包括猝灭剂部分。
6.权利要求4的试剂盒，其中荧光部分选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料和
Figure C2004800147900002C1
家族染料。
7.权利要求4的试剂盒，其中荧光部分是6-羧基荧光素。
8.权利要求5的试剂盒，其中猝灭剂部分选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合镧系元素家族染料、家族染料和非荧光猝灭剂部分。
9.权利要求8的试剂盒，其中非荧光猝灭剂部分是BHQTM-家族染料、Iowa BlackTM或Dabcyl。
10.权利要求5的试剂盒，其中猝灭剂部分是Cy5TM。
11.权利要求1的试剂盒，还包括热稳定DNA聚合酶。
12.权利要求11的试剂盒，其中热稳定DNA聚合酶选自Carboxydothermus hydrogenformans DNA聚合酶、Thermosiphoafricanus DNA聚合酶、Bacillus pallidus DNA聚合酶、栖热菌种Z05DNA聚合酶、栖热水生菌DNA聚合酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶、海栖热袍菌DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶和栖热菌sps17 DNA聚合酶。
13.权利要求1的试剂盒，还包括用于检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸的说明书。
14.权利要求1的试剂盒，其中第二种寡核苷酸包括SEQ ID NO.：15。
15.权利要求14的试剂盒，其中SEQ ID NO.：15的23号位残基为N6-烷基-脱氧腺苷。
16.权利要求14的试剂盒，其中第二种寡核苷酸包括SEQ ID NO.：74。
17.用于检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸的、非诊断目的的方法，包括：
a)使样品与包括SEQ ID NO.：8的第一种寡核苷酸和与SEQ ID NO.：9的核酸或其互补序列杂交的第二种寡核苷酸接触，其中所述第一种或所述第二种寡核苷酸是共价连接在固相支持体上，接触的条件是允许日本脑炎病毒血清群成员的核酸与所述寡核苷酸杂交的条件；
b)使可检测标记的、与SEQ ID NO.：16的核酸或其互补序列杂交的第三种寡核苷酸与固体支持物接触；和
c)通过检测可检测标记的寡核苷酸与日本脑炎病毒血清群成员的核酸的杂交，检测日本脑炎病毒血清群成员的核酸。
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