KR101954860B1 - 인간 파필로마바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 - Google Patents

Abstract

비정상적인 세포 증식 및 암을 유발하는 것으로 알려진, 고위험 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68을 검출하는 방법 및 키트를 개시한다. 개시된 방법 및 키트는 단일 PCR 반응으로 HPV의 모든 고위험 균주의 신속하고 정량적인 실시간 PCR 검출을 가능하게 한다. 이 방법은 비용 효율적이고 믿을 수 있는 방식으로 HPV의 고위험 균주의 고속 대량 검출을 촉진할 것이다.

Description

인간 파필로마바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트{Oligonucleotide sets for detection of human papillomavirus}

본 개시는 인간 파필로마바이러스(Human Papillomavirus, HPV)의 고 위험 균주의 실시간 PCR 검출을 위한 방법 및 이를 위한 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다.

인간 파필로마바이러스(HPV)는 미국에서 가장 만연한 성 매개 감염(sexually transmitted infection, STI)이 원인이 되는 매개체이고 자궁 경부암의 발병과 관련된 주요 인자이다. HPV는 약 8000개의 염기 쌍으로 이루어진 이중 가닥 환형 DNA를 함유하는 게놈을 둘러싼 72개의 캡소미어로 이루어진 정20면체 대칭의 외피가 없는(non-enveloped) 바이러스이다. 고도로 종-특이적이어서, 인간이 HPV에 대해 유일하게 알려진 병원소(reservoir)이다. 150종 이상의 HPV 혈청형(serotype)이 확인되었고, 80종 이상의 게놈이 완전히 서열분석되었다.

대부분의 HPV 감염은 사마귀(wart) 또는 유두종(papilloma)과 같은 양성 조직 성장을 일으키는 반면에, 약 40종의 성 매개 HPV 혈청형의 군은 항문, 질, 음문, 음경, 구강 인두, 및 상피 세포 피부암 뿐만 아니라 자궁 경부암의 병인론에서 근본적인 역할을 하기 때문에 '고-위험'이라고 칭해진다.

HPV 질병에 걸린 것으로 확인된 환자의 수는 지난 20년 동안 현저히 증가했다. 예를 들면, HPV 감염의 일반적인 징후인, 항문성기의 사마귀, 즉 첨형 콘디로마(condylomata acuminata)의 발생은 1966년 내지 1986년에 5배 증가하였고 이는 매년 500,000 내지 일백만 건의 새로운 케이스가 발생하는 것에 해당한다.

미국에서만, 250만 명의 여성이 매년 저-등급(low-grade) 자궁 경부암 전조의 세포학적 진단을 받는 것으로 추산된다. 그러나 외현적 자궁 경부암의 발생은 부분적으로 질병에 대한 더 커진 인식과 스크리닝 도구로서 파파니콜로(Papanicolaou) 검사(Pap 검사, 또는 Pap 도말)의 광범위한 시행 때문에 현저하게 감소하였다. 그럼에도 불구하고, 부분적으로 PAP 도말과 같은, 현행 스크리닝 분석은 오진에 기여하는 위음성 결과가 되기 쉽기 때문에, 1990년 내지 2001년에, 신규한 침습성 자궁 경부암으로 추산되는 수가 매년 약 13,500건으로 비교적 일정하게 유지되었다.

따라서, 고위험 HPV 감염을 보다 신뢰할 수 있는 검출을 위한 사용자-친화적이고, 정확한 키트에 대한 지속적인 요구가 있다.

요약

고위험 HPV는 비정상적인 세포 증식 및 암을 유발하는 것으로 알려진, 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68을 포함한다. 상이한 고위험 HPV 유전자형의 게놈들 간에 발견된 상당량의 서열 이질성(heterogeneity)이 모든 고위험 HPV 유전자형의 존재를 검사하는 편리하고 민감한 PCR 분석의 개발을 방해했다. 본 명세서에 개시된 방법 및 키트는 단일 PCR 반응으로 HPV의 모든 고위험 균주의 신속하고 정량적인 실시간 PCR 검출을 가능하게 한다. 이 방법은 비용 효율적이고 믿을 수 있는 방식으로 HPV의 고속 대량(rapid high throughput) 검출을 촉진할 것이다.

일 구체예에서, 각각 서열 번호 31 내지 55의 HPV 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 정렬(align)되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 인간 파필로마바이러스(HPV)-특이적 올리고뉴클레오티드의 집단으로서, 상기 집단 내의 각 올리고뉴클레오티드는 GGTAGATACTACHMGYAGYAC (서열 번호 56)의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, H는 A 또는 C 또는 T/U이고, Y는 C 또는 T/U이고 M은 A 또는 C이며, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 35개 미만의 뉴클레오티드로 이루어진 것인 HPV-특이적 올리고뉴클레오티드의 집단이 개시된다.

다른 구체예에서, 각각 서열 번호 31 내지 55의 HPV 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 정렬되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 인간 파필로마바이러스(HPV)-특이적 올리고뉴클레오티드의 집단으로서, 상기 집단 내의 각 올리고뉴클레오티드는 ATACTACHMGYAGYAC (서열 번호 70)의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 5개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, H는 A 또는 C 또는 T/U이고, Y는 C 또는 T/U이고 M은 A 또는 C이며, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 35개 미만의 뉴클레오티드로 이루어진 것인 HPV-특이적 올리고뉴클레오티드의 집단이 개시된다.

집단 내의 각 올리고뉴클레오티드는 서열 TACHMGYAGYAC (서열 번호 57)을 포함할 수 있고, H는 A 또는 C 또는 T/U이고, Y는 C 또는 T/U이고 M은 A 또는 C이다.

다른 구체예에서, 각각 서열 번호 31 내지 55의 HPV 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 상보적인 뉴클레오티드 서열과 정렬되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 인간 파필로마바이러스(HPV)-특이적 올리고뉴클레오티드의 집단으로서, 상기 집단 내의 각 올리고뉴클레오티드는 TGTAAATCATAYT (서열 번호 58)의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, Y는 C 또는 T/U이며, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 35개 미만의 뉴클레오티드로 이루어진 것인 HPV-특이적 올리고뉴클레오티드의 집단이 개시된다.

다른 구체예에서, 각각 서열 번호 31 내지 55의 HPV 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 상보적인 뉴클레오티드 서열과 정렬되는 뉴클레오티드 서열을 각각 갖는 인간 파필로마바이러스(HPV)-특이적 올리고뉴클레오티드의 집단으로서, 상기 집단 내의 각 올리고뉴클레오티드는 ATCATAYT의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 5개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, Y는 C 또는 T/U이며, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 35개 미만의 뉴클레오티드로 이루어진 것인 HPV-특이적 올리고뉴클레오티드의 집단이 개시된다.

상기 집단 내의 각 올리고뉴클레오티드는 서열 AATCAATCATAYT (서열 번호 59)를 포함할 수 있고, H는 A 또는 C 또는 T/U이고, Y는 C 또는 T/U이며 M는 A 또는 C이다.

일 구체예에서, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 증폭 프라이머를 포함하는 고위험 인간 파필로마바이러스(HPV) 유전자형의 동시 실시간 PCR 검출을 위한 키트가 개시된다.

일 구체예에서, 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 증폭 프라이머를 포함하는 고위험 인간 파필로마바이러스(HPV) 유전자형의 실시간 PCR 검출을 위한 키트가 개시된다.

상기 키트는 DNA 및/또는 RNA 의존적 DNA 폴리머라제 활성을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 시료 중 고위험 인간 파필로마바이러스(HPV) 유전자형을 실시간 검출하는 방법으로서:

고위험 HPV 유전자형 DNA의 존재를 검사할 시료를 제공하는 단계;

서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 증폭 프라이머 및 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 증폭 프라이머를 제공하는 단계로서, 정방향 및 역방향 프라이머는 표적 HPV DNA 서열에 동시에 어닐링하는 것인 단계;

증폭 폴리머라제 활성 및 형광 염료를 포함하는 증폭 버퍼의 존재하에 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 사이의 PCR 단편을 증폭하는 단계, 및

형광 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계를 포함하고,

형광 신호의 증가는 시료 중 하나 이상의 고위험 HPV 유전자형의 존재를 나타내는 것인 방법이 개시된다.

다른 구체예에서, 시료 중 고위험 HPV를 실시간 PCR검출하는 방법으로서:

고위험 HPV 유전자형 RNA의 존재를 검사할 시료를 제공하는 단계;

서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 증폭 프라이머 및 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 증폭 프라이머를 제공하는 단계로서, 정방향 및 역방향 프라이머는 표적 HPV 핵산 서열에 동시에 어닐링하는 것인 단계;

역전사 효소 활성 및 역방향 증폭 프라이머를 포함하는 역전사 효소 버퍼의 존재하에 고위험 HPV RNA을 역전사하여 표적 고위험 HPV cDNA 서열을 생성하는 단계;

표적 HPV cDNA 서열과 증폭 폴리머라제 활성 및 형광 염료를 포함하는 증폭 버퍼의 존재하에 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 사이의 PCR 단편을 증폭하는 단계, 및

형광 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계를 포함하고,

형광 신호의 증가는 시료 중 하나 이상의 고위험 HPV 유전자형의 존재를 나타내는 것인 방법이 개시된다.

고위험 HPV 유전자형은 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68을 포함할 수 있다. HPV 표적 DNA 서열은 서열 번호 31 내지 55의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

형광 신호의 증가는 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 66 및 68 유래의 HPV DNA 약 100 카피 및 유전자형 51 유래의 HPV DNA 약 1,000 카피의 존재를 검출할 수 있다.

증폭 폴리머라제 활성은 열안정성 DNA 폴리머라제의 활성일 수 있다. 형광 염료는 SYBR™ 그린 I일 수 있다. PCR 단편은 고체 지지체에 연결될 수 있고 시료 중 핵산은 우라실-N-글리코실라제로 전-처리될 수 있다.

전술된 구체예는 실시간으로 HPV 핵산 서열을 검출하는 능력을 포함하여, 많은 이점을 갖는다. 검출 방법은 빠르고, 정확하며 고속 대량 실험에 적당하다. 또한 고위험 HPV 균주의 신속하고 믿을 수 있는 검출을 위한 편리하고 사용자-친화적인 진단 키트가 기재된다.

당업자는 하기에 설명된, 도면이 단지 예시 목적을 위한 것이라는 것을 이해할 것이다. 도면은 어떤 방식으로도 교시의 범위를 한정하도록 의도되지 않는다.
도 1은 고위험 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68의 L1 개방 해독 프레임(open reading frame) 중 140 bp의 보존된 영역(conserved region)의 서열 정렬(alignment)을 도시한다.
도 2는 카타클리브(CataCleave)™ 프로브 기술의 개략도이다.
도 3은 PCR 증폭 산물의 실시간 카타클리브(CataCleave)™ 프로브 검출의 개략도이다.
도 4는 고위험 HPV 유전자형의 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 얻어진 증폭 커브를 도시한다(도 4a: HPV 유전자형 16, 도 4b: HPV 유전자형 18, 도 4c: HPV 유전자형 31, 도 4d: HPV 유전자형 33, 도 4e: HPV 유전자형 35, 도 4f: HPV 유전자형 39, 도 4g: HPV 유전자형 45, 도 4h: HPV 유전자형 51, 도 4i: HPV 유전자형 52, 도 4j: HPV 유전자형 56, 도 4k: HPV 유전자형 58, 도 4l: HPV 유전자형 59, 도 4m: HPV 유전자형 66 및 도 4n: HPV 유전자형 68).
도 5는 고위험 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68의 PCR 증폭의 겔 전기영동을 도시한다.
도 6은 피로코커스 푸리오시스(Pyrococcus furiosis), 피로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshi), 써모코커스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis), 알케오글로부스 프로펀두스(Archeoglobus profundus), 알케오글로부스 풀기디스(Archeoglobus fulgidis), 써모코커스 세레르(Thermococcus celer) 및 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) RNase HII 폴리펩티드 서열 간의 정렬을 도시한다.
도 7은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 써머스 써모필리스, 써머스 아쿠아티쿠스, 살모넬라 엔테리카 및 아그로박테리움 투메파시엔스 RNase HI 폴리펩티드 서열의 서열 정렬을 도시한다.

본 발명의 실시는, 달리 표시되어 있지 않으면, 당업계에서 통상적인 분자 생물학적 기법들을 사용한다. 이러한 기법들은 당업자에게 잘 알려져 있고, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, 모든 부록을 포함한, Ausubel 등, 편집, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)를 참조한다.

달리 정의되어 있지 않다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당업자가 흔히 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 또한 본 명세서는 본 출원의 개시 및 청구항의 해석을 돕기 위해 용어의 정의를 제공한다. 정의가 다른 정의와 일치하지 않는 경우에는, 본 명세서에 설명되어 있는 정의가 우선할 것이다.

본 명세서에 사용된, 용어 "염기(base)"는 상보적인 염기 또는 염기 유사체의 쌍 형성에서 왓슨-크릭 유형 수소 결합을 형성할 수 있는 질소-함유 헤테로고리 부분을 말한다. 다수의 천연 및 합성(비-천연, 또는 천연이 아닌) 염기, 염기 유사체 및 염기 유도체가 알려져 있다. 염기의 예는 퓨린, 피리미딘, 및 그의 변형된 형태를 포함한다. 천연 염기는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 우라실(uracil, U) 및 티민(thymine, T)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 발명에서 용도를 갖는 다수의 천연이 아닌(비-천연) 염기 및 그의 각각의 천연이 아닌 뉴클레오티드가 당업자에게 알려져 있기 때문에, 본 발명은 천연적으로 존재하는 염기에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.

용어 "뉴클레오시드(nucleoside)"는 당, 예를 들면 리보스 또는 데옥시리보스의 C-1' 탄소에 연결된 염기로 구성된 화합물을 말한다.

용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 단량체 단위로서 또는 폴리뉴클레오티드 중, 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르를 말한다. 본 명세서에 사용된 용어, "뉴클레오티드(nucleotide)"는 리보스, 아라비노스, 자일로스, 및 피라노스와 같은 당, 및 그의 당 유사체의 C-1' 탄소에 연결된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 화합물을 말한다. 또한 용어 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체를 포괄한다. 당은 치환되거나 또는 치환되지 않을 수 있다. 치환된 리보스 당은 하나 이상의 탄소 원자, 예를 들면, 2'-탄소 원자가 하나 이상의 동일하거나 또는 상이한 Cl, F, -R, -OR, -NR₂ 또는 할로겐기에 의해 치환되고, 각 R은 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 C5-C14 아릴인 것인 리보스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 리보스는 2'-(C1-C6)알콕시리보스, 2'-(C5-C14)아릴옥시리보스, 2',3'-디데히드로리보스, 2'-데옥시-3'-할로리보스, 2'-데옥시-3'-플루오로리보스, 2'-데옥시-3'-클로로리보스, 2'-데옥시-3'-아미노리보스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알킬리보스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알콕시리보스 및 2'-데옥시-3'-(C5-C14)아릴옥시리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2',3'-디데옥시리보스, 2'-할로리보스, 2'-플루오로리보스, 2'-클로로리보스, 및 2'-알킬리보스, 예를 들면, 2'-O-메틸, 4'-α-아노머(anomeric) 뉴클레오티드, 1'-α-아노머 뉴클레오티드, 2'-4'- 및 3'-4'-연결된 및 기타 "잠긴(locked)" 또는 "LNA", 이중고리 당 변형(bicyclic sugar modification)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예를 들면, PCT 공개 WO 98/22489, WO 98/39352, 및 WO 99/14226; 및 미국 특허 제6,268,490호 및 제6,794,499호 참조). 변형된 염기 부분 및/또는 변형된 당 부분을 갖는 추가적인 합성 뉴클레오티드는 예를 들면, Scheit: Nucleotide Analogs (John Wiley New York, 1980); Uhlman 및 Peyman, 1990, Chemical Reviews 90:543-584에 기재된 것과 같다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "핵산(nucleic acid)", "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)", "올리고머(oligomer)", "올리고(oligo)", 프라이머 또는 균등한 용어들은 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA), 및, 적절한 경우, 포스포티오에이트 함유 핵산, LNA(locked nucleic acid), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 또는 기타 유도체 핵산 분자 및 그의 조합과 같은, 뉴클레오티드 염기의 서열에 상응될 수 있는 단량체의 중합체 배열을 말한다.

핵산은 고위험 HPV 합성 DNA, 플라스미드 DNA, 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 HPV 핵산 서열을 포함하는 전체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

폴리뉴클레오티드는 둘 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드들의 중합체이다. 폴리뉴클레오티드는 제2 가닥이 제1 올리고뉴클레오티드의 역 상보적인 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드인 것인 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 핵산, 데옥시티미딘, 단일-가닥 RNA, 이중 가닥 RNA 또는 RNA/DNA 헤테로듀플렉스를 포함하는 단일-가닥 핵산 중합체 또는 이중 가닥 영역 예를 들면, DNA 헤어핀 루프 및/또는 RNA 헤어핀 루프 및/또는 DNA/RNA 헤어핀 루프를 포함하는 단일-가닥 핵산 중합체일 수 있다.

본 명세서에서 사용된, "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 짧은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 10개, 약 20개, 약 30개, 약 40개, 약 50개 또는 60개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 500개 미만, 약 250개 미만, 약 200개 미만, 약 150개 미만 또는 100개 미만의 뉴클레오티드이다.

올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있거나 변형된 염기 또는 변형되거나 비-천연적으로 존재하는 당 잔기를 포함할 수 있다. 컨쥬게이트를 포함한, 변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 일부 보고가 발표되었다; 예를 들면, Verma 및 Eckstein Annu. Rev. Biochem. (1998) 67:99-134, Uhlmann 및 Peyman, Chemical Reviews, Vol. 90, pgs. 543-584 (1990), 및 Goodchild, Bioconjugate Chemistry, Vol. 1, pgs 165-187 (1990), Cobb Org Biomol Chem. (2007) 5(20):3260-75, Lyer 등. Curr Opin Mol Ther. (1999) 1(3):344-58), 미국 특허 제6,172,208호, 제5,872,244호 및 미국 특허 출원 공개 제 2007/0281308호를 참조한다.

특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개 또는 그 이상의 축퇴성(degenerate) 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 축퇴성 뉴클레오티드는 상보적, 비-상보적, 또는 부분적으로 비-상보적일 수 있다. 뉴클레오티드들간의 상보성(Complementarity)은 특이적인 수소 결합을 통해 왓슨-크릭 염기쌍(예를 들면, 2개의 수소 결합을 통한 A와 T 염기쌍; 3개의 수소 결합을 통한 C와 G 염기쌍)을 형성하는 능력을 말한다.

기호	기호의 유래	의미*	상보성
K	케토(keto)	G 또는 T/U	비-상보적
R	퓨린(purine)	A 또는 G	비-상보적
Y	피리미딘(pyrimidine)	C 또는 T/U	비-상보적
S	강한 상호작용 (Strong interaction)	C 또는 G	상보적
W	약한 상호작용 (Weak interaction)	A 또는 T/U	상보적
B	A가 아님(not A)	C 또는 G 또는 T/U	부분적으로 비-상보적
D	C가 아님(not C)	A 또는 G 또는 T/U	부분적으로 비-상보적
H	G가 아님(not G)	A 또는 C 또는 T/U	부분적으로 비-상보적
V	T/U가 아님(not T/U)	A 또는 C 또는 G	부분적으로 비-상보적
N	어느 것이나 가능함(any)	A 또는 C 또는 G 또는 T/U	상보적

* A=아데노신, C=시티딘, G=구아노신, T=티미딘, U=우리딘

"프라이머 이량체(primer dimer)"는 프라이머 중 일련의 상보적인 염기 때문에 서로 부분적으로 혼성화하는 프라이머 분자로 구성되는, PCR의 잠재적인 부산물이다. 결과적으로, DNA 폴리머라아제는 프라이머 이량체를 증폭시켜, PCR 시약에 대한 경쟁을 초래하고, 따라서 PCR 증폭을 위해 표적이 된 DNA 서열의 증폭을 잠재적으로 저해한다.

용어 "주형 핵산(template nucleic acid)"은 PCR 반응 또는 역전사 효소-PCR 반응에서 증폭을 위한 출발 물질 또는 주형으로 사용된 복수의 핵산 분자를 말한다. 주형 핵산 서열은 천연 분자 및 합성 분자 모두를 포함할 수 있다. 예시적인 주형 핵산은 게놈 HPV DNA 또는 HPV RNA 서열을 포함하는 총 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"표적 DNA(target DNA)" 또는 "표적 RNA(target RNA)" 또는 "표적 핵산(target nucleic acid)" 또는 "표적 핵산 서열(target nucleic acid sequence)"은 분석되는 주형 핵산의 영역을 말한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "증폭 프라이머(amplification primer)" 또는 "PCR 프라이머(PCR primer)" 또는 "프라이머(primer)"는 표적 핵산 서열의 상보적, 프라이머 특이적 부분과 역평행 방식으로 혼성화되도록 디자인된 정의된 서열을 포함하는 효소에 의해 신장가능한 올리고뉴클레오티드를 말한다. 따라서, 일반적으로 그의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 비교해 몰 과량으로 존재하는, 프라이머는 주형-의존적 효소에 의한 DNA 합성 및 표적 서열의 증폭을 준비(prime)한다. 프라이머 핵산은 프라이머 신장이 일어나도록 하기 위해, 주형 하부 서열(subsequence)과 100% 상동성을 가질 필요가 없다. 상보성이 혼성화 및 폴리머라제 신장이 일어나기에 충분하고 프라이머의 3' 말단에 있는 끝에서 두번째 염기가 주형 핵산과 염기 쌍을 형성할 수 있다면 프라이머는 표적 주형 핵산 서열에 대해 "실질적으로 상보적(substantially complementary)"일 수 있다. PCR 프라이머는 합성인 것이 바람직하지만, 필수적인 것은 아니고, 길이가 일반적으로 거의 약 10개 내지 약 100개 뉴클레오티드일 것이다.

올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진, 적절한 방법(예를 들면, 화학적 합성)으로 합성되고 제조될 수 있다. 다수의 컴퓨터 프로그램(예를 들면, primer-express)이 최적 프라이머 세트의 디자인에 용이하게 이용가능하다. 그러므로 당업자는 목적 표적 핵산 서열에 인접한(flanking) 프라이머를 용이하게 최적화하고 확인할 것이다. 예를 들면, 합성된 프라이머는 약 55도 융점(melting point, T_m)을 갖는, 20개 내지 26개 염기쌍으로 이루어진 길이일 수 있다. 그러므로, 제공된(또는 접속 번호로 공개적으로 이용가능한) 핵산 정보에 기초한 프라이머 및 프로브가 그에 따라 제조될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

용어 "어닐링(annealing)" 및 "혼성화(hybridization)"은 호환적으로 사용되고 듀플렉스, 트리플렉스, 또는 다른 고차원 구조의 형성을 야기하는, 하나의 핵산의 다른 핵산과의 염기쌍 형성(base-pairing) 상호작용을 의미한다. 특정 구체예에서, 일차적인 상호작용은 왓슨/크릭 및 후그스틴(Hoogsteen)-유형 수소 결합에 의하여, 염기 특이적이고, 예를 들면 A/T 및 G/C이다. 특정 구체예에서, 염기-스태킹(base-stacking) 및 소수성 상호작용은 또한 듀플렉스 안정성에 기여할 수 있다. "실질적으로 상보적인(Substantially complimentary)"은 서열에서 충분히 상보적인 두 핵산 가닥이 어닐링하고 안정한 듀플렉스를 형성하는 것을 의미한다.

고위험 HPV 유전자형의 검출을 위한 프라이머 서열의 디자인

실시간 PCR 검출을 위한 고위험 HPV 표적 핵산 서열의 선택하기 위해, 상이한 HPV 바이러스 계통의 완전한 게놈 서열을 우선 정렬하고 상동성 영역을 조사한다. 서열분석된 HPV 유형 la, 6b, 16 및 18의 매트릭스 비교는 가장 보존된 영역이 El 및 Ll ORF 내에 위치한다는 것이 이전에 확인되었다(Giri & Danos (1986). Papillomavirus genomes. From sequence data to biological properties. Trends in Genetics 2, 227-232). 그 결과, 이러한 상동성 영역들은 모든 고위험 HPV 서열의 검출을 위해 사용될 수 있는 잠재적인 프라이머 쌍으로 스크리닝되었다.

도 1은 고위험 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68의 L1 개방 해독 프레임 중 140 bp의 보존된 영역의 서열 정렬을 도시한다.

정방향 프라이머 영역의 서열 정렬이 하기에 표시된다:

역방향 프라이머 영역의 서열 정렬이 하기에 표시된다:

이러한 서열 정렬로부터, H는 A 또는 C 또는 T/U이고, Y는 C 또는 T/U이며 M은 A 또는 C인 정방향 프라이머인, HPV_HR_F10D, 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATACTACHMGYAGYAC-3'(서열 번호 1), 및 역방향 프라이머, HPV_HR_R4, 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCATAYT-3'(서열 번호 16)가 상이한 유전자형 간의 서열 이질성의 위치에 축퇴성 뉴클레오티드를 포함시키고, 높은 엄격성(high stringency) 프라이머 어닐링 온도에 대해 선택하는 것에 의해 검출 민감도를 최적화하도록 디자인되었다.

특정 구체예에서, 서열 번호 1-30의 올리고뉴클레오티드는 또한 HPV 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다.

핵산 주형 제조 - DNA 주형

고위험 HPV 핵산 주형은 플라스미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 HPV 재조합 핵산을 포함하는 인간 자궁 경부 조직 생검 시료 또는 미생물로부터 유래될 수 있다.

시료로부터의 핵산 추출 및 정제의 과정은 당업계에 잘 알려져 있다(Sambrook J 등, Molecular Cloning, Cold Spring harbor Laboratory Press (1989), Ausubel 등, Short Protocols in Molecular Biology, 5판 (2002) John Wiley & Sons, Inc. New York에 기재된 바와 같음).

게다가, 핵산의 분리를 위한 여러 상업적 키트가 이용가능하다. 예시적인 키트는 퓨어젠 DNA 분리 키트(Puregene DNA isolation kit, PG) (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, Minn.), 제너레이션 캡쳐 컬럼 키트(Generation Capture Column, GCC) (Gentra Systems, Inc.), 마스터퓨어 DNA 정제 키트 (MasterPure, MP) (Epicentre Technologies, Madison, Wis.), 이소퀵 핵산 추출 키트(IsoQuick, IQ) (Epoch Pharmaceuticals, Bothell, Wash.), 뉴클리센스 분리 키트(NucliSens, NS) (Organon Teknika Corp., Durham, N.C.), QIAamp DNA 혈액 미니 키트(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(Qiagen; Cat. No. 51104), MagNA 퓨어 컴팩트 핵산 분리 키트(MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit)(Roche Applied Sciences; Cat. No. 03730964001), qPCR을 위한 안정화된 Blood-to-CT™ 핵산 제조 키트(Stabilized Blood-to-CT. Nucleic Acid Preparation Kit for qPCR)(Invitrogen, Cat. No. 4449080) 및 GF-1 바이러스 핵산 추출 키트(GF-1 Viral Nucleic Acid Extraction Kit)(GeneOn, Cat. No. RD05)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

핵산 주형 제조 - RNA 주형

일부 구체예에서, 시료는 정제된 RNA 주형(예를 들면, HPV 바이러스 mRNA, 총 RNA, 및 그의 혼합물)이다. 다른 구체예에서, 시료는 PAP 도말로부터 수집된 세포 또는 배양된 세포의 용해물을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 세포는 RNA 분리 전 드라이 아이스에서 동결시켜 -70℃에 보관할 수 있다.

시료로부터의 RNA의 추출 및 정제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 총 RNA는 TRIzol™ 시약(Invitrogen) 분리 방법을 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 그 후 RNA 양 및 품질은 예를 들면, 나노드롭(Nanodrop)™ 분광 광도계 및 애질런트 2100 바이오어낼라이저(Agilent 2100 bioanalyzer)를 사용하여 결정한다(또한 Peirson SN, Butler JN (2007). "RNA extraction from mammalian tissues" Methods Mol. Biol. 362: 315-27, Bird IM (2005) "Extraction of RNA from cells and tissue" Methods Mol. Med. 108: 139-48 참조). 또한, RNA의 분리를 위한 여러 상업적 키트가 이용가능하다. 예시적인 키트는 RNeasy 및 QIAamp 바이러스 RNA 키트(Qiagen, Valencia, Calif.) 및 MagMAX™ 바이러스 RNA 분리 키트(Ambion)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다른 구체예에서, HPV RNA 서열은 HPV L1 유전자 서열(서열 번호 31 내지 55)의 T7 RNA 전사에 의해 수득될 수 있다. T7 인 비트로 전사를 위한 예시적인 상업적 키트는 Ambion의 MEGAscript® 키트(카타로그 번호 1330)이다.

표적 핵산 서열의 PCR 증폭

HPV 핵산 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR), 핵산 서열 기초 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA) 반응, 전사 매개 증폭(transcription mediated amplification, TMA) 반응 및 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응이 특이적 표적 DNA 서열을 증폭하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법이다.

"폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은 일반적으로 원하는 뉴클레오티드 서열의 인 비트로 증폭 방법을 말한다. 일반적으로, PCR 방법은 원하는 표적 서열(들)을 갖는 시료를 포함하는 반응 혼합물에 몰 과량의 2 이상의 신장가능한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입하는 단계로 구성되고, 이때 프라이머들은 이중 가닥 표적 서열의 반대 가닥에 실질적으로 상보적인 것이다. 반응 혼합물에 증폭 핵산 폴리머라제의 존재하에 열 순환 프로그램을 적용하여, 서열-특이적 프라이머에 인접한 원하는 표적 서열의 증폭을 야기한다.

본 명세서에서 사용된, "증폭 폴리머라제 활성(amplifying polymerase activity)"은 데옥시뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 효소적 활성을 말한다. 일반적으로, 증폭 폴리머라제는 표적 핵산 주형 서열에 어닐링된 프라이머의 3' 말단에서 합성을 시작하고, 주형 가닥의 5' 말단을 향해 진행할 것이다.

증폭 핵산 폴리머라제는 DNA-의존적 DNA 폴리머라제, DNA-의존적 RNA 폴리머라제, RNA-의존적 DNA 폴리머라제 또는 RNA 의존적 RNA 폴리머라제 중 하나 이상의 활성을 가질 수 있다.

"DNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성(DNA-dependent DNA polymerase activity)"은 상보적인 역평행 DNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA)을 사용하는 DNA 폴리머라제 효소의 활성을 말한다.

"DNA-의존적 RNA 폴리머라제 활성(DNA-dependent RNA polymerase activity)"은 "전사(transcription)"로 불리는 과정에서 RNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA)을 사용하는 RNA 폴리머라제 효소의 활성을 말한다(예를 들면, Toyobo Life Science Department로부터 상업적으로 이용가능한, 써모(Thermo) T7 RNA 폴리머라제, 카타로그 번호 TRL-201).

"RNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성(RNA-dependent DNA polymerase activity)"은 "역전사(reverse transcription)"로 불리는 과정에서 상보적인 역평행 DNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)을 사용하는 DNA 폴리머라제 효소의 활성을 말한다.

"RNA-의존적 RNA 폴리머라제 활성(RNA-dependent RNA polymerase activity)"은 상보적인 RNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)을 사용하는 RNA 폴리머라제 효소의 활성을 말한다(예를 들면, Cambio로부터 상업적으로 이용가능한, 써머스 써모필러스 RNA 폴리머라제, 카타로그 번호 T90250).

DNA 폴리머라제 PCR 증폭

특정 구체예에서, 핵산 폴리머라제는 전숙된 촉매적 활성 중 둘 이상을 가질 수 있는 열안정성 폴리머라제이다.

본 명세서에서 사용된, 효소에 적용된 용어 "열안정성(thermostable)"은 상승된 온도(예를 들면, 55℃ 이상)에서 그의 생물학적 활성을 보유하거나, 가열 및 냉각의 반복된 사이클 후에 그의 생물학적 활성을 보유하는 효소를 말한다.

"DNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성(DNA dependent DNA polymerase activity)"을 갖는 열안정성 증폭 폴리머라제의 비-한정적 예는 호열성 박테리아 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq 폴리머라제), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus)(Tth 폴리머라제), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)(Tli 또는 VENT™ 폴리머라제), 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus)(Pfu 또는 DEEPVENT™ 폴리머라제), 피로코커스 우시(Pyrococcus woosii)(Pwo 폴리머라제) 및 기타 피로코커스 종, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)(Bst 폴리머라제), 설포로버스 아시도칼다리어스(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac 폴리머라제), 써모플라스카 아시도필럼(Thermoplasma acidophilum)(Tac 폴리머라제), 써머스 러버(Thermus rubber, Tru 폴리머라제), 써머스 브로키아너스(Thermus brockianus, DYNAZYME™ 폴리머라제) i (Tne 폴리머라제), 서모토가 마리팀(Thermotoga maritime)(Tma) 및 써모토가 속의 기타 종(Tsp 폴리머라제), 및 메타노박테리움 써모오토트로피컴(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth 폴리머라제)으로부터 분리된 폴리머라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. PCR 반응은 표적 서열의 보다 효율적인 증폭을 가져오는 보완적인 특성을 갖는 둘 이상의 열안정성 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 높은 진행성(큰 뉴클레오티드 세그먼트를 카피하는 능력)을 갖는 뉴클레오티드 폴리머라제는 교정 능력(표적 핵산 서열의 신장 동안 오류를 수정하는 능력)을 갖는 다른 뉴클레오티드 폴리머라제로 보완될 수 있고, 따라서 긴 표적 서열을 높은 정확도로 복사할 수 있는 PCR 반응을 생성한다. 열안정성 폴리머라제는 그의 야생형으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 폴리머라제는 효소의 단편을 포함하거나 PCR 반응을 촉진하는 이로운 특성을 제공하는 돌연변이를 포함하도록 변형될 수 있다.

일 구체예에서, 열안정성 폴리머라제는 Taq 폴리머라제일 수 있다. 증진된 특성을 갖는 Taq 폴리머라제의 많은 변이체가 알려져 있고 AmpliTaq™, AmpliTaq ™ Stoffel 단편, SuperTaq™, SuperTaq™ 플러스(plus), LA Taq™, LApro Taq™, 및 EX Taq™을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 열안정성 폴리머라제는 AmpliTaq Stoffel 단편이다.

PCR 기법은 PCR: A Practical Approach, M. J. McPherson 등, IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis 등에 의한, Academic Press (1990), 및 PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich, Stockton Press (1989)을 포함하는, 수많은 문헌에 개시되어 있다. 또한 PCR은 미국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호; 제4,889,818호; 제5,075,216호; 제5,079,352호; 제5,104,792호; 제5,023,171호; 제5,091,310호; 및 제5,066,584호를 포함하는, 많은 미국 특허에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조로서 포함된다.

용어 "시료(sample)"는 핵산 분자를 포함하는 물질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "PCR 단편(PCR fragment)" 또는 "역전사 효소-PCR 단편(reverse transcriptase-PCR fragment)" 또는 "앰플리콘(amplicon)은 특정 표적 핵산의 증폭 후에 생산된 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 총괄적으로 복수의 분자들)를 말한다. PCR 단편은 일반적으로 DNA PCR 단편이지만, 반드시 그런 것은 아니다. PCR 단편은 단일-가닥 또는 이중-가닥, 또는 임의의 농도 비율의 그의 혼합물로 존재할 수 있다. PCR 단편 또는 RT-PCR은 길이가 약 100개 내지 약 500개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.

"버퍼(buffer)"는 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 성분의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형하는 증폭 반응에 첨가된 화합물이다. 본 발명의 완충제는 PCR 증폭 및 부위-특이적 RNase H 절단 활성과 양립가능하다. 일부 완충제가 당업계에 잘 알려져 있고 트리스(Tris), 트리신(Tricine), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), 및 HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, PCR 버퍼는 약 70 mM까지의 KCl 및 약 1.5 mM 이상의 MgCl₂, 약 50 내지 200μM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각을 일반적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 버퍼는 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화하기 위해 첨가제를 포함할 수 있다.

첨가제는 조성물의 하나 이상의 성분의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형하는 조성물에 첨가된 화합물이다. 특정 구체예에서, 조성물은 증폭 반응 조성물이다. 특정 구체예에서, 첨가제는 오염물질인 효소를 불활성화시키고, 단백질 폴딩(folding)을 안정화시키고, 및/또는 응집을 감소시킨다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 예시적인 첨가제는 증폭의 효율을 변화시킬 수 있는, 포름아미드, KCl, CaCl₂, Mg(OAc)₂, MgCl₂, NaCl, NH₄OAc, NaI, Na₂CO₃, LiCl, Mn(OAc)₂, NMP, 트레할로스, 데미에틸술폭시드(demiethylsulfoxide, "DMSO"), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨(dithiothreitol, "DTT"), 피로포스파타제 (써모플라스마 아시도필럼 무기 피로포스파타제(Thermoplasma acidophilum inorganic pyrophosphatase("TAP")를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, "BSA"), 프로필렌 글리콜, 글리신아미드, CHES, 퍼콜™, 아우린트리카르복실산, 트윈 20, 트윈 21, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 85, 브리지(Brij) 30, NP-40, 트리톤 X-100, CHAPS, CHAPSO, 맥커니움(Mackernium), LDAO(N-도데실-N,N-디메틸아민-N-옥시드), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, 엠피겐, NDSB-20, T4G32, 대장균 SSB, RecA, 절단하는 엔도뉴클레아제(nicking endonucleases), 7-데아자G, dUTP, 음이온성 디터전트, 양이온성 디터전트, 비-이온성 디터전트, 양쪽 이온성 디터전트(zwittergent), 스테롤, 삼투조절물질(osmolytes), 양이온, 및 기타 화학물질, 단백질, 또는 보조인자(cofactor)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 2 이상의 첨가제가 증폭 반응에 포함된다. 본 발명에 따라, 첨가제가 PCR 증폭 반응을 불리하게 간섭하지 않는다면 첨가제가 프라이머 어닐링의 선택성을 향상시키기 위해 첨가될 수 있다.

역전사 효소 - PCR 증폭

유전자 발현을 연구하는데 가장 폭넓게 사용되는 기법 중 하나는 PCR에 의한 증폭을 위한 주형으로서 mRNA 서열(들)에 대한 제1-가닥 cDNA를 이용하는 것이다.

용어 "역전사 효소 활성(reverse transcriptase activity)" 및 "역전사(reverse transcription)"는 RNA 가닥을 주형으로 사용하여 DNA 가닥(즉, 상보적인 DNA, cDNA)을 합성할 수 있는 RNA-의존적 DNA 폴리머라제로 규명된 한 종류의 폴리머라제의 효소적 활성을 말한다.

"역전사 효소-PCR(Reverse transcriptase-PCR)" 또는 "RNA PCR"은 DNA-의존적 DNA 폴리머라제 프라이머 신장의 복수 사이클 전에, 먼저 단일 가닥 DNA 분자를 생성하기 위하여, RNA 주형과 역전사 효소, 또는 역전사 효소 활성을 갖는 효소를 사용하는 PCR 반응이다. 멀티플렉스 PCR은 전형적으로 단일 반응에서 3종 이상의 프라이머를 첨가함으로써, 단일 반응에서 2종 이상의 증폭된 산물을 생산하는 PCR 반응을 말한다.

예시적인 역전사 효소는 미국 특허 제4,943,531호에 기재된 M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RT, 미국 특허 제5,405,776호에 기재된 RNase H 활성이 결여된 M-MLV-RT의 돌연변이 형태, 소 백혈병 바이러스,(bovine leukemia virus, BLV) RT, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) RT, 조류 골수아세포종 바이러스(Avian Myeloblastosis virus, AMV) RT 및 미국 특허 제7,883,871호에 개시된 역전사 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

종점 또는 실시간 분석 중 어느 하나로 수행되는, 역전사 효소-PCR 방법은 2개의 분리된 분자 합성을 포함한다: (i) RNA 주형으로부터 cDNA의 합성; 및 (ii) PCR 증폭을 통해 새로 합성된 cDNA의 복제. 역전사 효소-PCR과 흔히 관련된 기술적 문제들을 해결하려고 시도하기 위해, 이 방법의 3개의 기본 단계를 고려하면서 다수의 프로토콜들이 개발되어 왔다: (a) RNA의 변성과 역방향 프라이머의 혼성화; (b) cDNA의 합성; 및 (c) PCR 증폭. 소위 "연결되지 않은(uncoupled)" 역전사 효소-PCR 방법 (예를 들면, 2 단계 역전사 효소-PCR)에서, 역전사는 역전사 효소 활성을 위한 최적 버퍼 조건을 사용하는 독립적인 단계로 수행된다. cDNA 합성 후에, 반응액을 희석하여 MgCl₂, 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(deoxyribonucleoside triphosphate, dNTP) 농도를 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위한 최적 조건까지 감소시키고, 표준 조건에 따라 PCR을 수행한다(U.S. 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호 참조). 대조적으로, "연결된(coupled)" 역전사 효소 PCR 방법은 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위해 최적화된 공통의 버퍼를 사용한다. 하나의 버전에서, 역방향 프라이머의 어닐닝은 효소를 첨가하기 이전의 분리된 단계이고, 그 후 효소는 단일 반응 용기에 첨가된다. 다른 버전에서, 역전사 효소 활성은 열안정성 Tth DNA 폴리머라제의 일 성분이다. 어닐링 및 cDNA 합성은 Mn^{2 +}의 존재하에 수행되고 그 후 PCR은 킬레이트제로 Mn^{2 +}를 제거한 후에 Mg^{2 +}의 존재하에 실시된다. 마지막으로, "연속적인(continuous)" 방법 (예를 들면, 일 단계 역전사 효소-PCR)은 3개의 역전사 효소-PCR 단계들을 요소 또는 효소를 첨가하려고 반응 튜브를 여는 것을 피하는 단일 연속적인 반응으로 통합시킨다. 연속적인 역전사 효소-PCR은 초기 65℃ RNA 변성 단계가 생략될 수 있는 열안정성 Taq DNA 폴리머라제 Tth 활성을 사용하는 단일 효소 시스템과 AMV 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제를 사용한 이 효소 시스템(two enzyme system)으로 기재되어 왔다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 프라이머가 표지될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "표지(label)", "검출가능한 표지(detectable label)", 또는 "마커(marker)" 또는 "검출가능한 마커(detectable marker)"는 본 명세서에서 호환가능하게 사용되고, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체, 또는 핵산 결합 인자에 부착된 화학적 부분(chemical moiety)을 말하고, 부착은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 바람직하게는, 표지는 검출 가능하고 클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체가 본 발명의 실시자에게 검출될 수 있게 한다. 검출가능한 표지는 발광 분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 소광제(quenching agents), 유색 분자, 방사성 동위원소 또는 신틸런트(scintillant)를 포함한다. 또한 검출가능한 표지는 (비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, HRP, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni^{2 +}, FLAG 태그, myc 태그와 같은) 유용한 링커 분자, 중금속, 효소(예를 들면 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 및 루시퍼라제를 포함함), 전자 공여체/수용체, 아크리디늄 에스테르, 염료 및 열량 측정 기질(calorimetric substance)을 포함한다. 또한 표면 플라스몬 공명 검출의 경우와 같이, 질량의 변화가 검출가능한 표지로 간주될 수 있다는 것이 고려된다. 당업자는 전술되지 않은 유용한 검출가능한 표지를 용이하게 인식할 수 있을 것이고, 그들은 본 발명의 실시에 이용될 수 있을 것이다.

일 단계 역전사 효소-PCR은 연결되지 않은 역전사 효소-PCR에 비해 몇가지 장점을 제공한다. 일 단계 역전사 효소-PCR은 연결되지 않은 역전사 효소-PCR보다 반응 혼합물 시약 및 핵산 산물의 조작(예를 들면, 두 개의 반응 단계 사이에서 요소 또는 효소의 첨가를 위해 반응 튜브를 여는 것)을 덜 요구하고, 그러므로 덜 노동집약적이고, 요구되는 인시(person hours)의 수를 감소시킨다. 또한 일 단계 역전사 효소-PCR는 시료를 덜 요구하여, 오염의 위험을 감소시킨다. 일-단계 역전사 효소-PCR의 민감도 및 특이성은 주어진 시료 중 하나 내지 수개의 유전자의 발현 수준 또는 병원균 RNA의 검출을 연구하는데 적합한 것으로 증명되었다. 일반적으로, 이 방법은 cDNA 합성을 개시하기 위한 유전자-특이적 프라이머의 사용에 한정된다.

이러한 역전사 효소-PCR 기법과 조합된 온-라인 검출에 의한 PCR 반응의 반응 속도를 측정하는 능력은 높은 민감도를 갖는 RNA 카피수의 정확하고 정밀한 정량을 가능하게 했다. 이것은 하기에서 논의된, 5' 형광성 뉴클레아제 분석("TaqMan™") 또는 엔도뉴클레아제 분석("CataCleave™")과 같은, 형광 이중-표지 혼성화 프로브 기법에 의한 증폭 과정 동안 형광 모니터링을 통한 역전사 효소-PCR 산물의 검출 및 PCR 산물의 측정에 의해 가능하게 된다.

카타클리브 ( CataCleave )™ 프로브를 사용한 실시간 PCR

다른 구체예에서, HPV 서열은 카타클리브 PCR을 사용하여 검출된다. 이 PCR 검출 방법은 새로 합성된 DNA에 결합하는 형광 표지된 프로브나 이중 가닥 DNA로 끼어들어가면 형광 방출이 증가하는 염료를 이용한다. 실시간 검출 방법론은 게놈 DNA 또는 게놈 RNA에서 표적 핵산 서열의 PCR 검출에 적용가능하다.

프로브는 일반적으로 표적이 없으면 두 개의 발색단 사이의 형광 공명 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer: FRET)에 의하여 공여체 방출이 소광(quench)되도록 디자인된다. 공여체 발색단은 여기 상태(excited state)에서, 그 쌍이 가까운 거리에 있으면 수용체 발색단으로 에너지를 전달할 수 있다. 이러한 전달은 항상 비-방사성이고 쌍극자-쌍극자 결합을 통하여 일어난다. 발색단들간의 거리를 충분히 증가시키는 과정은 FRET 효율을 감소시켜서 공여체 발색단 방출이 방사성으로 검출될 수 있다. 일반적인 수용체 발색단은 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, 및 텍사스 레드를 포함한다. 수용체 발색단은 그의 여기 스펙트럼이 공여체의 방출 스펙트럼과 겹치도록 선택된다. 이러한 쌍의 예는 FAM-TAMRA이다. 또한 광범위한 공여체를 소광시킬 비 형광 수용체가 있다. 적절한 공여체-수용체 FRET 쌍의 다른 예는 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다.

PCR의 실시간 검출에 사용될 수 있는 FRET 프로브들의 일반적인 예는 분자 비콘(molecular beacon)(예를 들면, 미국 특허 제5,925,517호), TaqMan™ 프로브(예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호), 및 카타클리브™ 프로브(예를 들면, 미국 특허 제5,763,181호)를 포함한다. 분자 비콘은 결합하지 않은 상태에서는 프로브가 공여체와 수용체 발색단이 가까이 위치하여 공여체 방출이 감소되는 이차 구조를 형성하도록 디자인된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 적절한 반응 온도에서 비콘은 언폴딩(unfolding)되고 앰플리콘에 특이적으로 결합한다. 언폴딩되면 공여체와 수용체 발색단 사이의 거리가 증가하여 FRET이 역전되고 공여체 방출이 특화된 기기를 사용하여 모니터링될 수 있다. TaqMan™과 카타클리브™ 기술은 이용된 FRET 프로브가 절단되어 공여체와 수용체 발색단이 충분히 떨어져 FRET을 역전시킨다는 점에서 분자 비콘과 다르다.

TaqMan™ 기술은 5' 말단이 공여체 발색단으로 표지되고 3' 말단이 수용체 발색단으로 표지된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 증폭에 사용된 DNA 폴리머라제는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 포함해야 한다. TaqMan™ 프로브는 프라이머가 결합하는 것과 동시에 앰플리콘의 한 가닥에 결합한다. DNA 폴리머라제가 프라이머를 신장시키면 폴리머라제는 결국에는 결합된 TaqMan™ 프로브와 마주치게 될 것이다. 이때 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성은 TaqMan™ 프로브를 5' 말단에서 시작하여 순차적으로 분해할 것이다. 프로브가 분해되면 상기 프로브를 구성하는 모노뉴클레오티드들은 반응 버퍼로 방출된다. 공여체가 수용체로부터 멀리 확산되고 FRET은 역전된다. 공여체로부터의 방출은 프로브 절단을 확인하기 위해 모니터링된다. TaqMan™이 작용하는 방식 때문에 특정 앰플리콘이 PCR의 매 사이클 마다 오직 한번씩 검출될 수 있다. TaqMan™ 표적 부위까지 통한 프라이머의 신장은 앰플리콘이 다음 PCR 사이클에서 변성될 때까지 TaqMan™ 프로브의 추가 결합을 막는 이중 가닥 산물을 생성한다.

그 내용이 본 명세서에서 참조로서 포함된, 미국 특허 제5,763,181호는 다른 실시간 검출 방법(본 명세서에서 "카타클리브(CataCleave)™"로 표시됨)을 기재한다. 카타클리브™ 기술은 프로브의 절단이 폴리머라제 활성을 갖지 않는 제2 효소에 의해 수행된다는 점에서 TaqMan™과 다르다. 카타클리브™ 프로브는 예를 들면 제한 효소나 RNase와 같은, 엔도뉴클레아제의 표적인 분자 내에 서열을 갖는다. 일 예에서, 카타클리브™ 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단이 DNA로 구성되고 절단 부위가 RNA를 포함하는 것인 키메라 구조를 갖는다. 프로브의 DNA 서열 부분은 양 말단이나 또는 내부에서 FRET 쌍으로 표지된다. PCR 반응은 RNA-DNA 듀플렉스의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 열안정성 RNase H 효소를 포함한다. 절단 후, 프로브의 두 개의 반쪽은 반응 온도에서 표적 앰플리콘으로부터 분리되고 반응 버퍼로 확산된다. 공여체 및 수용체가 분리되면 FRET은 TaqMan™ 프로브와 같은 방식으로 역전되고 공여체 방출이 모니터링될 수 있다. 절단과 분리는 추가적인 카타클리브™ 결합을 위한 부위를 재생한다. 이러한 방식으로 프라이머가 카타클리브™ 프로브 결합 부위까지 신장될 때까지 단일 앰플리콘이 복수회의 프로브 절단의 표적으로 작용하는 것이 가능하다.

카타클리브 ™ 프로브의 표지화

용어 "프로브(probe)"는 특이적 핵산 서열 예를 들면, 표적 핵산 서열의 상보적인 영역과 서열-특이적인 방식으로 혼성화하도록 디자인된 특이적 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 15 내지 60개 뉴클레오티드의 범위이다. 보다 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 18개 내지 30개 뉴클레오티드의 범위이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브의 정확한 서열과 길이는 프로브가 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드의 속성에 부분적으로 의존한다. 특정한 구체예에서 적절한 어닐링 및 융해 특성을 달성하기 위해 결합 위치와 길이가 달라질 수 있다. 이러한 디자인 선택을 하기 위한 지침은 미국 특허 제5,763,181호, 제6,787,304호, 및 제7,112,422호에 기재된, Taqman™ 분석 또는 카타클리브™를 기재하는 다수의 참조문헌에서 확인될 수 있고, 그 내용은 전체로서 본 명세서에 참조로 포함된다.

특정 구체예에서, 프로브는 표적 핵산 서열에 "실질적으로 상보적(substantially complementary)"이다.

본 명세서 사용된, 용어 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 서열이 충분히 상보적이어서 어닐링하고 안정한 듀플렉스를 형성하는 두 개의 핵산 가닥들을 말한다. 상보성이 완벽할 필요는 없다; 예를 들면, 두 핵산들 사이에 많은 수의 염기쌍 미스매치(mismatch)가 있을 수 있다. 그러나, 미스매치의 수가 너무 커서 가장 덜 엄격한 혼성화 조건 하에서조차 혼성화가 일어날 수 없다면, 그 서열은 실질적으로 상보적인 서열이 아니다. 본 명세서에서 두 서열들이 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)" 것으로 언급되는 경우에는, 서열들이 서로 충분히 상보적이어서 선택된 반응 조건 하에서 혼성화한다는 것을 의미한다. 특이성을 이루기에 충분한 핵산 상보성과 혼성화의 엄격성의 관계는 당업계에 잘 알려져 있다. 두 개의 실질적으로 상보적인 가닥들은 예를 들면, 완벽하게 상보적일 수 있거나 혼성화 조건이 예를 들면, 쌍을 형성하는 서열 및 서열을 형성하지 않는 서열 간의 구별을 가능하게 할 정도로 충분하기만 한다면, 한 개 내지 수개의 미스매치까지 포함할 수 있다. 따라서, "실질적으로 상보적인(substantially complementary)" 서열은 이중 가닥 영역에서 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50 퍼센트 또는 그 이하, 또는 그 사이의 수치의 염기쌍 상보성을 갖는 서열이라고 말할 수 있다.

본 명세서에서 사용된, "선택된 영역(selected region)"은 프로브의 RNA 서열과 어닐링하는 표적 DNA 또는 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 일 구체예에서, 표적 DNA 또는 cDNA의 "선택된 영역(selected region)"은 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 부위-특이적 RNase H 절단은 표적 DNA 서열에 완전히 상보적이고 표적화된 DNA 서열과 혼성화하여 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성하는 카타클리브™의 RNA 부분의 절단을 말한다.

본 명세서에서 사용된, 카타클리브™ 프로브의 "표지(label)" 또는 "검출가능한 표지(detectable label)"는 공유 또는 비공유 수단에 의해 프로브에 부착된 형광 색소 화합물을 포함하는 표지를 말한다.

본 명세서에서 사용된, "형광 색소(fluorochrome)"는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의한 여기(excitation)로 빛을 방출하는 형광 화합물을 말한다. 용어 "형광 공여체(fluorescent donor 또는 fluorescence donor)"는 본 발명에 기재된 분석에서 측정되는 빛을 방출하는 형광 색소를 말한다. 더욱 구체적으로, 형광 공여체는 형광 수용체에 의해 흡수되는 빛을 제공한다. 용어 "형광 수용체(fluorescent acceptor 또는 fluorescence acceptor)"는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하는 제2 형광 색소 또는 소광 분자를 말한다. 제2 형광 색소는 형광 공여체로부터 방출된 에너지를 흡수하고 형광 공여체에 의해 방출된 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 소광 분자는 형광 공여체에 의해 방출된 에너지를 흡수한다.

발광 분자, 바람직하게는 형광 색소 및/또는 형광 소광제(quencher)가 본 발명의 실시에 사용될 수 있고, 예를 들면, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)™ 350, 알렉사 플루오르™ 430, 알렉사 플루오르™ 488, 알렉사 플루오르™ 532, 알렉사 플루오르™ 546, 알렉사 플루오르™ 568, 알렉사 플루오르™ 594, 알렉사 플루오르™ 633, 알렉사 플루오르™ 647, 알렉사 플루오르™ 660, 알렉사 플루오르™ 680, 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복실산, 플루오레세인, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 514, 테트라메틸로다민, 로다민 X, 텍사스 레드 염료, QSY 7, QSY33, 댑실(Dabcyl), 보디피(BODIPY) FL, 보디피 630/650, 보디피 650/665, 보디피 TMR-X, 보디피 TR-X, 디알킬아미노쿠마린, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, DTPA(Eu3+)-AMCA 및 TTHA(Eu3+)AMCA를 포함한다.

일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브의 3' 터미날 뉴클레오티드는 블록킹되어 있거나 또는 핵산 폴리머라제에 의해 신장되지 못하도록 되어 있다. 이러한 블록킹은 프로브의 터미날 3' 위치에 리포터 또는 소광제 분자를 부착함으로써 편리하게 실시된다.

일 구체예에서, 리포터 분자는 연결 부분(linking moiety)을 통해 프로브의 터미날 3' 말단 또는 터미날 5' 말단에 부착되도록 유도체화된 형광 유기 염료이다. 바람직하게는, 소광제 분자는 또한 유기 염료이고, 이 유기 염료는 본 발명의 구체예에 따라, 형광일 수 있거나 형광이 아닐 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 소광제 분자는 형광이다. 일반적으로 소광제 분자가 형광이거나 또는 비-방사성 분해에 의하여 리포터로부터 전달된 에너지를 단순히 방출하는지 여부에 관계없이, 소광제의 흡수 밴드가 리포터 분자의 형광 방출 밴드와 실질적으로 중첩되어야 한다. 여기된 리포터 분자로부터 에너지를 흡수하지만, 방사성으로 그 에너지를 방출하지 않는, 비-형광 소광제 분자는 발색성 분자로 본 출원에서 언급된다.

예시적인 리포터-소광제 쌍은 플루오레세인을 포함한 크산텐 염료, 및 로다민 염료들로부터 선택될 수 있다. 이러한 화합물들의 많은 적절한 형태들이 결합 부위로서 또는 올리고뉴클레오티드로의 부착을 위한 결합 관능기(functionality)로 이용될 수 있는 그의 페닐 부분에 치환기를 갖는 것으로 폭넓게 상업적으로 이용가능하다. 형광 화합물의 다른 그룹은 알파 또는 베타 위치에 아미노기를 갖는, 나프틸아민이다. 이러한 나프틸아미노 화합물에 포함되는 것은 1-디메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트 및 2-p-토우이디닐6-나프탈렌 설포네이트이다. 다른 염료는 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘 및 아크리딘 오렌지와 같은 아크리딘, N-(p-(2-벤즈옥사졸릴)페닐)말레이미드, 벤즈옥사디아졸, 스틸벤, 피렌 등을 포함한다.

일 구체예에서, 리포터 및 소광제 분자는 플루오레세인 및 로다민 염료로부터 선택된다.

하기 참조 문헌에 의하여 예시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 터미날에 리포터 또는 소광제 분자를 부착하기 위한 많은 연결 부분(linking moiety) 및 방법론들이 존재한다: Eckstein, 편집자, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman 등, Nucleic Acids Research 15: 5305-5321 (1987) (올리고뉴클레오티드의 3' 티올기); Sharma 등, Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3' 설프히드릴); Giusti 등, PCR Methods and Applications, 2: 223-227 (1993) 및 Fung 등, 미국 특허 제 4,757,141호 (캘리포니아, 포스터 시, Applied Biosystems로부터 이용가능한 Aminolink™. II를 통한 5' 포스포아미노기); Stabinsky, 미국 특허 번호 제4,739,044호 (3' 아미노알킬포스포릴기); Agrawal 등, Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (포스포르아미데이트 결합을 통한 부착); Sproat 등, Nucleic Acids Research, 15: 4837 (1987) (5' 메르캅토기); Nelson 등, Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194 (1989) (3' 아미노 기) 등.

또한 로다민 및 플루오레세인 염료는 예를 들면, Woo 등, 미국 특허 제5,231,191호; 및 Hobbs, Jr., 미국 특허 제4,997,928호에서, 포스포르아미디트 부분에 의해 유도체화된 염료에 의해 고체상 합성의 완료시 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실에 편리하게 부착된다.

카타클리브 ™ 프로브의 RNase H 절단

특정 구체예에서, 카타클리브 PCR 반응은 핫 스타트(hot start) RNase H 활성을 포함할 수 있다.

RNase H는 RNA-DNA 하이브리드에서 RNA를 가수분해한다. 이 효소는 송아지 흉선에서 처음 발견되었지만 그 후 여러 생물에서 기재되었다. 실제로, RNase H 활성은 진핵생물 및 박테리아에서 보편적인 것으로 보인다. RNase H는 다양한 분자량과 핵산 분해 활성을 갖는 단백질의 패밀리를 구성하지만, 기질 요구성은 다양한 아형에 대해 유사한 것으로 보인다. 예를 들면, 현재까지 연구된 대부분의 RNase H는 엔도뉴클레아제로서 기능하고 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 터미날을 갖는 절단 산물을 생성하기 위해 2가 양이온(예를 들면, Mg^{2 +}, Mn^{2 +})을 요구한다.

원핵생물에서, RNase H가 클로닝되고 광범위하게 특징이 연구되었다(Crooke 등, (1995) Biochem J, 312 (Pt 2), 599-608; Lima 등, (1997) J Biol Chem, 272, 27513-27516; Lima 등, (1997) Biochemistry, 36, 390-398; Lima 등, (1997) J Biol Chem, 272, 18191-18199; Lima 등, (2007) Mol Pharmacol, 71, 83-91; Lima 등, (2007) Mol Pharmacol, 71, 73-82; Lima 등, (2003) J Biol Chem, 278, 14906-14912; Lima 등, (2003) J Biol Chem, 278, 49860-49867; Itaya, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8587-8591 참조). 예를 들면, 대장균 RNase HI은 길이가 155개의 아미노산인 반면에 대장균 RNase HII는 213개의 아미노산이다. 대장균 RNase HII는 대장균 RNase HI과 겨우 17%의 상동성을 나타낸다. S. 티피무리움(typhimurium)으로부터 클로닝된 RNase H는 대장균 RNaseHI으로부터 11개의 위치에서만 다르고 길이가 155개의 아미노산이었다(Itaya, M. 및 Kondo K., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4443-4449).

또한 RNase H 활성을 나타내는 단백질들이 수많은 바이러스, 기타 박테리아 및 효모로부터 클로닝되고 정제되었다(Wintersberger, U. Pharmac. Ther., 1990, 48, 259-280). 많은 경우에, RNase H 활성을 갖는 단백질들은 RNase H가 다른 효소, 종종 DNA 또는 RNA 폴리머라제의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합된 것인 융합 단백질인 것으로 보인다. RNase H 도메인은 대장균 RNase HI에 상동성이 높은 것으로 일관되게 발견되었지만, 나머지 도메인들은 상당히 다양하기 때문에, 그 융합 단백질의 분자량 및 다른 특성들이 폭넓게 다양하다.

고등 진핵생물에서 분자량, 이가 양이온의 효과, 설피드릴 작용제에 대한 감수성 및 면역학적 교차-반응성에서의 차이에 근거하여 두가지 종류의 RNase H가 정의되었다(Busen 등, Eur. J. Biochem., 1977, 74, 203-208). RNase HI 효소는 68 내지 90 kDa 범위의 분자량을 가지며, Mn^{2 +} 또는 Mg^{2 +}에 의하여 활성화되며 설피드릴 작용제에 민감하지 않은 것으로 보고되었다. 이와 대조적으로, RNase HII 효소는 31 내지 45 kDa 범위의 분자량을 가지고, Mg^{2 +}을 요구하며 설피드릴 작용제에 상당히 민감하고 Mn^{2 +}에 의하여 저해되는 것으로 보고되었다(Busen, W., 및 Hausen, P., Eur. J. Biochem., 1975, 52, 179-190; Kane, C. M., Biochemistry, 1988, 27, 3187-3196; Busen, W., J. Biol. Chem., 1982, 257, 7106-7108).

또한 RNase HII 특성을 갖는 효소가 인간 태반으로부터와 거의 순수하게(homogeneity)으로 정제되었다 (Frank et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5247-5254). 이 단백질은 약 33 kDa의 분자량을 갖고 pH 6.5 내지 10의 범위에서 활성이 있고 최적 pH가 pH 8.5 내지 9이다. 상기 효소는 Mg^{2 +}를 요구하고 Mn^{2 +} 및 n-에틸 말레이미드에 의하여 저해된다. 절단 반응의 산물은 3' 히드록실과 5' 포스페이트 터미날을 갖는다.

상이한 종으로부터 유래한 RNase의 상세한 비교는 Ohtani N, Haruki M, Morikawa M, Kanaya S. J Biosci Bioeng. 1999;88(1):12-9에 보고되었다.

구체예에서 이용될 수 있는 RNase H 효소의 예는, 또한 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshi), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) 또는 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus)와 같은 호열성 생물로부터 분리된 열안정성 RNase H 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

구체예에서 이용될 수 있는 다른 RNase H 효소는 예를 들면, Uemori의 미국 특허 제7,422,888호 또는 Walder의 미국 출원 공개 제2009/0325169호에 기재되어 있고 그 내용은 전체로서 본 명세서에 참조로 포함된다.

일 구체예에서, RNase H 효소는 하기에 표시된, Pfu RNase HII (서열 번호 60)의 아미노산 서열과 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 열 안정성 RNase H이다.

MKIGGIDEAG RGPAIGPLVV ATVVVDEKNI EKLRNIGVKD SKQLTPHERK NLFSQITSIA 60

DDYKIVIVSP EEIDNRSGTM NELEVEKFAL ALNSLQIKPA LIYADAADVD ANRFASLIER 120

RLNYKAKIIA EHKADAKYPV VSAASILAKV VRDEEIEKLK KQYGDFGSGY PSDPKTKKWL 180

EEYYKKHNSF PPIVRRTWET VRKIEESIKA KKSQLTLDKF FKKP (서열 번호 60)

상동성은 예를 들면, 컴퓨터 프로그램 DNASIS-Mac (Takara Shuzo), 컴퓨터 알고리즘 FASTA (버전 3.0; Pearson, W. R. 등, Pro. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988) 또는 컴퓨터 알고리즘 BLAST (버전 2.0, Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)를 사용하여 결정될 수 있다.

다른 구체예에서, RNase H 효소는 서열 번호 60의 위치 5 내지 20, 33 내지 44, 132 내지 150, 및 158 내지 173에 상응하는 상동성 영역 1 내지 4 중 하나 이상을 포함하는 RNase H이다. 이러한 상동성 영역은 피로코커스 푸리오시스(Pyrococcus furiosis), 피로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshi), 써모코커스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis), 알케오글로부스 프로펀두스(Archeoglobus profundus), 알케오글로부스 풀기디스(Archeoglobus fulgidis), 써모코커스 세레르(Thermococcus celer) 및 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) RNase HII 폴리펩티드 서열의 서열 정렬에 의해 확인되었다(도 6 참조).

상동성 영역 1: GIDEAG RGPAIGPLVV (서열 번호 61; 서열 번호 60의 위치 5 내지 20에 상응함)

상동성 영역 2: LRNIGVKD SKQL (서열 번호 62; 서열 번호 60의 위치 33 내지 44에 상응함)

상동성 영역 3: HKADAKYPV VSAASILAKV (서열 번호 63; 서열 번호 60의 위치 132 내지 150에 상응함)

상동성 영역 4: KLK KQYGDFGSGY PSD (서열 번호 64; 서열 번호 60의 위치 158 내지 173에 상응함)

일 구체예에서, RNase H 효소는 서열 번호 61, 62, 63 또는 64의 폴리펩티드 서열과 50%, 60%. 70%, 80%, 90% 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 상동성 영역을 갖는 열안정성 RNase H이다.

다른 구체예에서, RNase H 효소는 하기에 표시된, 써머스 써모필러스 RNase HI (서열 번호 65)의 아미노산 서열과 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 열안정성 RNase H이다.

MNPSPRKRVA LFTDGACLGN PGPGGWAALL RFHAHEKLLS GGEACTTNNR MELKAAIEGL

KALKEPCEVD LYTDSHYLKK AFTEGWLEGW RKRGWRTAEG KPVKNRDLWE ALLLAMAPHR

VRFHFVKGHT GHPENERVDR EARRQAQSQA KTPCPPRAPT LFHEEA (서열 번호 65)

다른 구체예에서, RNase H 효소는 서열 번호 65의 위치 23 내지 48, 62 내지 69, 117 내지 121, 및 141 내지 152에 상응하는 상동성 영역 5 내지 8 중 하나 이상을 포함하는 열안정성 RNase H이다. 이러한 상동성 영역은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 써머스 써모필리스(Thermus thermophilis), 써머스 아쿠아티커스(Thermus acquaticus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) RNase HI 폴리펩티드 서열의 서열 정렬에 의해 확인되었다(도 7 참조).

상동성 영역 5: K*V*LFTDG*C*GNPG*GG*ALLRY (서열 번호 66; 서열 번호 65의 위치 23 내지 48에 상응함)

상동성 영역 6: TTNNRMEL (서열 번호 67; 서열 번호 65의 위치 62 내지 69에 상응함)

상동성 영역 7: KPVKN (서열 번호 68; 서열 번호 65의 위치 117 내지 121에 상응함)

상동성 영역 8: FVKGH*GH*ENE (서열 번호 69; 서열 번호 65의 위치 141 내지 152에 상응함)

다른 구체예에서, RNase H 효소는 서열 번호 66, 67, 68 또는 69의 폴리펩티드 서열과 50%, 60%. 70%, 80%, 90% 서열 동일성을 갖는 상동성 영역 4 내지 8 중 하나 이상을 갖는 열안정성 RNase H이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "서열 동일성(sequence identity)"은 서열이 비교 범위(window of comparison)에서 아미노산 대 아미노산 기준으로 동일하거나 기능적으로 또는 구조적으로 유사한 정도를 말한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율(percentage of sequence identity)"은 예를 들면, 비교 범위에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 동일한 아미노산이 두 서열 모두에서 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된(matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내 위치의 총 갯수(즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다.

특정 구체예에서, 상기 RNase H는 핫 스타트(hot start) "유도성(inducible)" RNase H를 생성하기 위해 변형될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "변형된 RNase H(modified RNase H)"는 RNase H의 엔도뉴클레아제 활성의 상실을 야기하는 저해 인자에 가역적으로 커플링되거나 또는 가역적으로 결합된 RNase H일 수 있다. RNase H로부터 저해 인자의 방출 또는 분리(decoupling)는 RNase H의 엔도뉴클레아제 활성의 적어도 부분 활성 또는 완전한 활성을 회복하게 한다. 온전한(intact) RNase H의 활성의 약 30 내지 100%가 충분할 수 있다. 저해 인자는 리간드 또는 화학적 변형일 수 있다. 리간드는 항체, 앱타머(aptamer), 수용체, 보조인자, 또는 킬레이트제일 수 있다. 리간드는 RNase H 효소의 활성 부위에 결합할 수 있고 이에 의해 효소 활성을 저해하거나 또는 RNase의 활성 부위로부터 떨어진 부위에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드는 구조적 변화(conformational change)를 유도할 수 있다. 화학적 변형은 가교화(예를 들면, 포름알데히드에 의한 가교화) 또는 아실화일 수 있다. RNase H로부터 저해 인자의 방출 또는 분리는 커플링된 RNase H(불활성)를 포함하는 시료 또는 혼합물을 약 65℃ 내지 약 95℃ 또는 그 이상의 온도로 가열하고, 및/또는 혼합물 또는 시료의 pH를 약 7.0 이하로 낮추는 것에 의해 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 핫 스타트 "유도성(inducible)" RNase H 활성은 리간드와의 결합에 의해 조절될 수 있는 엔도뉴클레아제 촉매 활성을 갖는 본 명세서에 기재된 변형된 RNase H를 말한다. 허용적 조건 하에서, RNase H 엔도뉴클레아제 촉매 활성이 활성화되나, 비-허용적 조건에서, 이 촉매 활성은 저해된다. 일부 구체예에서, 변형된 RNase H의 촉매 활성은 역전사에 적합한 온도, 즉 약 42℃에서 저해되고 PCR 반응에서 발견되는 더욱 상승된 온도, 즉 약 65℃ 내지 95℃에서 활성화된다. 이 특성을 갖는 변형된 RNase H는 "열 유도성(heat inducible)"인 것으로 지칭된다.

다른 구체예에서, 변형된 RNase H의 촉매 활성은 효소를 포함하는 용액의 pH를 변화시키는 것에 의해 조절될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, "핫 스타트(hot start)" 효소 조성물은 비-허용적 온도, 즉, 약 25℃ 내지 약 45℃에서 저해되고 PCR 반응에 적합한 온도, 예를 들면, 약 55℃ 내지 약 95℃에서 활성화되는 효소 활성을 갖는 조성물을 말한다. 특정 구체예에서, "핫 스타트" 효소 조성물은 당업계에 알려진, '핫 스타트' RNase H 및/또는 '핫 스타트' 열안정성 DNA 폴리머라아제를 가질 수 있다.

RNase H 효소의 가교화는 예를 들면, 포름알데히드를 사용하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 열안정성 RNase H가 포름알데히드를 사용한 제어되고 한정된 가교화에 적용된다. 활성 상태의 변형된 RNase H를 포함하는, 증폭 반응 조성물을 약 95℃ 이상의 온도까지 연장된 시간, 예를 들면, 약 15분 동안 가열함으로써, 가교화는 역전되고 RNase H 활성이 회복된다.

일반적으로, 가교화의 정도가 더 낮을수록, 가교화의 역전 후 효소의 엔도뉴클레아제 활성이 더 높다. 가교화의 정도는 포름알데히드의 농도와 가교화 반응의 지속기간을 변화시킴으로써 조절될 수 있다. 예를 들면, 약 0.2% (w/v), 약 0.4% (w/v), 약 0.6% (w/v), 또는 약 0.8% (w/v)의 포름알데히드가 RNase H 효소를 가교화시키는데 이용될 수 있다. 0.6% 포름알데히드를 이용한 약 10분의 가교화 반응은 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래의 RNase HII를 불활성화시키기에 충분할 수 있다.

가교화된 RNase H는 약 37℃에서 측정가능한 엔도뉴클레아제 활성을 보이지 않는다. 일부 경우에, 가교화된 RNase H의 측정가능한 부분적 재활성화가 PCR 변성 온도보다 더 낮은, 약 50℃의 온도에서 일어날 수 있다. 효소의 그와 같은 의도하지 않은 재활성화를 피하기 위해, 변형된 RNase H를 재활성화시킬 때까지 50℃ 미만의 온도로 보관 또는 유지하는 것이 요구될 수 있다.

일반적으로, PCR은 이중 가닥 표적 서열을 변성시키기 위해 각 사이클에서 약 95℃로 증폭 조성물을 가열하는 것을 요구하고 이는 또한 RNase H로부터 불활성화 인자들을 방출시켜, 효소의 활성을 부분적으로 또는 완전히 회복시킬 것이다.

또한 RNase H는 효소에 아실화제, 예를 들면, 디카르복실산을 사용한 리신 잔기의 아실화를 수행하여 변형시킬 수 있다. RNase H의 아실화는 아실화 버퍼 중 RNase H의 용액에 시스-아코니트산 무수물(cis-aconitic anhydride)을 첨가하고 약 1 내지 20℃에서 5 내지 30시간 동안 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 아실화는 약 3 내지 8℃에서 18 내지 24시간 동안 수행될 수 있다. 아실화 버퍼의 유형은 특별히 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 아실화 버퍼는 약 7.5 내지 약 9.0의 pH를 갖는다.

아실화된 RNase H의 활성은 증폭 조성물의 pH를 약 7.0 이하로 낮춤으로써 회복될 수 있다. 예를 들면, Tris 버퍼가 완충제로 사용되는 경우, 조성물을 약 95℃로 가열시켜, 약 8.7(25℃에서)로부터 약 6.5(95℃에서)까지 pH 저하를 야기할 수 있다.

증폭 반응 조성물에서 가열 단계의 지속시간은 변형된 RNase H, PCR에 사용된 버퍼 등에 따라 변할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 약 30초 내지 4분 동안 95℃로 증폭 조성물을 가열하는 것은 RNase H 활성을 회복시키기에 충분하다. 일 구체예에서, 상업적으로 이용가능한 버퍼와 하나 이상의 비-이온성 계면활성제를 사용하여, 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus) RNase HII의 전체 활성이 약 2분의 가열 후에 회복된다.

RNase H 활성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 제1 방법에 따라, 단위 활성(unit activity)은 정의된 분석 조건 하에서 동일 몰의 폴리티미딜산의 존재하에 특정 몰수의 방사성 표지된 폴리아데닐산의 산-용해화(acid-solubilization)에 의해 정의된다 (Epicentre Hybridase thermostable RNase HI 참조). 제2 방법에서, 단위 활성은 정의된 분석 조건 하에서 동일 몰량의 프로브와 상보적인 주형 DNA를 포함하는 반응의 상대적 형광 강도의 특이적 증가의 용어로 정의된다.

카타클리브 ™ 프로브의 고체 지지체로의 부착

일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상이한 프로브들이 고체 지지체에 부착될 수 있고 시료 중 상이한 표적 서열들을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다. 상이한 형광 파장을 갖는 리포터 분자들이 상이한 프로브에 사용되어, 상이한 프로브들로의 혼성화가 별개로 검출될 수 있게 한다.

올리고뉴클레오티드 프로브의 고정을 위한 고체 지지체의 바람직한 유형의 예는 유리 판, 폴리스티렌, 아비딘 코팅된 폴리스티렌 비드, 셀룰로오스, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 제어된 공극 유리(controlled pore glass, CPG), 유리판 및 고 가교된 폴리스티렌(high cross-linked polystyrene)을 포함한다. 이러한 고체 지지체는 그의 화학적 안정성, 관능화(functionalization)의 용이성 및 잘 정의된 표면적(surface area) 때문에 혼성화 및 진단 연구에 바람직하다. 제어된 공극 유리(500 Å, 1000 Å) 및 비-팽창성(non-swelling) 고 가교된 폴리스티렌(1000 Å)과 같은 고체 지지체가 올리고뉴클레오티드 합성과의 적합성(compatibility)을 고려하면 특히 바람직하다.

올리고뉴클레오티드 프로브는 다양한 방식으로 고체 지지체에 부착할 수 있다. 예를 들면, 프로브는 프로브의 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드의 고체 지지체로의 부착에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그러나, 프로브를 상기 고체 지지체로부터 이격시키는 작용을 하는 링커에 의해 프로브가 고체 지지체에 부착될 수 있다. 링커는 가장 바람직하게는 길이가 30개 이상의 원자이고, 보다 바람직하게는 길이가 50개 이상의 원자이다.

고체 지지체에 고정된 프로브의 혼성화는 일반적으로 프로브가 고체 지지체로부터 30개 이상의 원자, 보다 바람직하게는 50개 이상의 원자만큼 분리될 것을 요구한다. 이러한 분리를 이루기 위해, 링커는 일반적으로 링커와 3' 뉴클레오시드 사이에 위치한 스페이서(spacer)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위해, 링커 암(linker arm)은 대개 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 유리시키기 위해 염기성 시약에 의해 절단될 수 있는 에스테르 결합에 의해 3' 뉴클레오시드의 3'-OH에 부착된다.

올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에 부착시키는데 사용될 수 있는 광범위하게 다양한 링커들이 당업계에 알려져 있다. 링커는 고체 지지체에 부착된 프로브로의 표적 서열의 혼성화를 현저하게 간섭하지 않는 화합물로 형성될 수 있다. 링커는 자동화된 합성에 의해 링커에 용이하게 첨가될 수 있는 단일 중합체(homopolymeric) 올리고뉴클레오티드로 형성될 수 있다. 대안적으로, 관능화된 (functionalized) 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 링커로 사용될 수 있다. 그러한 중합체는 프로브의 표적 올리고뉴클레오티드로의 혼성화를 현저하게 간섭하지 않기 때문에 단일 중합체(homopolymeric) 올리고뉴클레오티드보다 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜은 상업적으로 이용가능하고, 유성 및 수성 매질에서 용해가능하며, 관능화하기 쉬우며, 올리고뉴클레오티드 합성 및 합성 후(post-synthesis) 조건 하에서 완전히 안정하기 때문에 특히 바람직하다.

고체 지지체, 링커 및 프로브 간의 결합은 바람직하게는 고온에서 염기성 조건 하에서 염기 보호기의 제거 동안 절단되지 않는다. 바람직한 결합의 예는 카르바메이트 및 아미드 결합을 포함한다. 프로브의 고정은 당업계에 잘 알려져 있고 당업자는 고정 조건을 결정할 수 있다.

본 방법의 일 구체예에 따라, 카타클리브™ 프로브가 고체 지지체에 고정된다. 카타클리브™ 프로브는 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하고, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 완전히 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적이다. 프로브는 RNase H의 존재 및 프로브 내의 RNA 서열이 PCR 단편의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 핵산의 시료와 접촉된다. RNA:DNA 헤테로듀플렉스 내 RNA 서열의 RNase H 절단은 프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 야기하고, 신호의 증가는 표적 DNA 서열의 존재를 나타낸다.

본 방법의 또 다른 구체예에 따라, 고체 지지체에 고정된, 카타클리브™ 프로브는 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하고, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 완전히 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적이다. 프로브는 RNase H의 존재 및 프로브 중 RNA 서열이 PCR 단편 내 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 핵산의 시료와 접촉된다. RNA:DNA 헤테로듀플렉스 내 RNA 서열의 RNase H 절단은 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가를 야기한다.

프로브의 고체 지지체로의 고정은 프로브에 혼성화된 표적 서열을 시료로부터 용이하게 단리할 수 있게 한다. 이후 단계에서, 단리된 표적 서열은 고체 지지체로부터 분리되고 연구자의 특정한 니즈에 따라 당업계에서 잘 알려진 방법으로 가공(예를 들면, 정제, 증폭)된다.

키트

또한 본 명세서의 개시는 고위험 HPV 표적 핵산 서열의 실시간 PCR 검출을 위한 하나 이상의 시약을 갖는 포장 단위를 포함하는 키트 형태(kit format)를 제공한다. 또한 키트는 하기의 품목 중 하나 이상 포함할 수 있다: 버퍼, 설명서, 및 양성 또는 음성 대조군. 키트는 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위해 적절한 비율로 함께 혼합된 시약들의 용기들을 포함할 수 있다. 시약 용기들은 바람직하게는 본 방법을 수행할 때 측정하는 단계를 제거하는 단위 양의 시약을 포함한다.

또한 키트는 열안정성 폴리머라아제, 핫 스타트 RNase H, 고위험 HPV 표적 핵산 서열을 증폭할 수 있는 것으로 본 명세서에 기재된 프라이머, 형광 염료 및/또는 본 명세서에 기재된 방법론에 따라 실시간 PCR 산물에 어닐링하고 표적 핵산 서열의 정량적 검출을 가능하게 하는 표지된 카타클리브™ 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 실시간 PCR을 위한 시약을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 키트 시약은 생물학적 시료로부터 게놈 DNA 또는 RNA를 추출하기 위한 시약을 추가로 포함한다. 또한 키트 시약은 적용할 수 있는 경우 역전사 효소-PCR 분석을 위한 시약을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 개시한 특허, 특허 출원, 문헌, 또는 그 외 개시 자료는 그 전체로 본 명세서에 참조로서 포함된다. 본 명세서에서 참조로서 포함되나, 본 명세서에 기재된 정의, 진술 또는 기타 개시 자료와 모순되는 자료 또는 그의 일부는, 포함된 자료와 본 명세서의 개시 자료가 모순되지 않는 정도로만 포함된다.

실시예

본 발명은 하기의 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이다. 이러한 실시예들은 예시 목적만을 위한 것이며 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1: 고위험 HPV 의 SYBR 그린 I 실시간 PCR 검출

실시간 반응은 2 ㎕의 DNA 주형 및 23 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 섞었다. PCR 반응 혼합물은 32 mM HEPES ((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)-KOH, pH 7.8, 50 mM 포타슘 아세테이트, 6 mM 마그네슘 아세테이트, 0.11% 소 혈청 알부민, 1% 디메틸술폭시드, 120 nM 정방향 프라이머, 120 nM 역방향 프라이머, dUTP/NTP 혼합물 (80 μM dGTP, dCTP, dATP 및 160 μM dUTP), 2.5 유닛(Unit) 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 폴리머라제, 1 ㎕의 희석된 SYBR 그린 I 염료, 및 1 유닛 우라실-N-글리코실라제를 포함하였다.

각 HPV 유전자형의 플라스미드 주형은 IDT로 합성하였다. 정제된 플라스미드의 희석은 반응 당 10 카피 내지 10⁶ 카피로 검사되었다. 고위험 HPV의 총 14종 유전자형을 검사하였다.

반응을 상온에서 준비(assemble)하고 하기 순환 프로토콜을 사용하여 Roche Lightcycler 480에서 수행했다:

37℃에서 5분;

95℃에서 10분;

그 후 5회 사이클의 제1-단계 증폭,

95℃에서 10초,

48℃에서 60초, 및

72℃에서 30초;

그 후 50회 사이클의 제2-단계 증폭,

95℃에서 10초,

50℃에서 60초, 및

72℃에서 30초.

SYBR 그린 I 염료 형광의 방출을 72℃ 단계 동안 모니터링하였다.

총 14종의 고위험 HPV 유전자형(즉 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68)을 정제된 플라스미드 DNA를 사용하여 검사하였다. 각 유전자형에 대해, 반응 당 플라스미드 DNA의 10 카피 내지 10⁶ 카피의 범위에 걸친 희석을 검사하였다(도 4 참조).

HPV 유전자형들 간의 높은 이질성 때문에, 어닐링 온도를 사이클 당 1분 동안 48 내지 50℃로 낮추었다. 이것은 그러나 프라이머 이량체의 형성을 촉진했다. 도 4에 도시된 증폭 곡선에 표시된 바와 같이, 대부분의 음성 대조군들은 사이클 40 주변에서 프라이머 이량체를 형성하였다. 그러므로, 융해 곡선 분석에 추가하여, 음성 대조군을 포함하는 모든 PCR 반응, 100 카피, 1,000 카피 및 10,000 카피로 희석된 각 HPV 유전자형의 PCR 증폭은 뒤이어 겔 전기영동으로 분석하여(도 5) HPV 표적 핵산 서열의 서열-특이적 증폭을 확인했고, 예상된 앰플리콘 크기는 약 140 bp였다.

실시간 PCR 및 겔 전기영동 결과에 표시된 바와 같이, HPV 분석은 약 100 카피의 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 66, 68과 약 1000 카피의 HPV 유전자형 51을 검출할 수 있었다.

<110> Samsung Techwin <120> OLIGONUCLEOTIDE SETS FOR DETECTION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS <130> SA-40236-US <150> 13/370,738 <151> 2012-02-10 <160> 82 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> n= A or C or T/U <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n= A or C <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n=C or T/U <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> n= C or T/U <400> 1 tttgttactg tggtagatac tacnngnagn ac 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 tttgttactg ttgttgatac tacacgcagt ac 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 tttgttactg tggtagatac cactcgcagt ac 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 tttgttactg tggtagatac cacacgtagt ac 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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(HPV) <400> 37 tttgttactg tagttgatac aacccgtagt acaaatatgt ctgtgtgttc tgctgtgtct 60 tctagtgaca gtacatataa aaatgacaat tttaaggaat atttaaggca tggtgaagaa 120 tatgatttac agtttatttt tc 142 <210> 38 <211> 142 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus (HPV) <400> 38 tttgttactg tagttgatac aacccgtagt acaaatatgt ctgtgtgttc tgctgtgtct 60 actagtgaca gtacatataa aaatgacaat tttaaggaat atttaaggca tggtgaagaa 120 tatgatttac agtttatttt tc 142 <210> 39 <211> 145 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus (HPV) <400> 39 tttcttactg ttgtggacac tacccgtagt accaacttta cattatctac ctctatagag 60 tcttccatac cttctacata tgatccttct aagtttaagg aatataccag gcacgtggag 120 gagtatgatt tacaatttat atttc 145 <210> 40 <211> 145 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus (HPV) <400> 40 tttcttactg tagtggacac tacccgtagt accaacttta cattatctac ctctatagag 60 tcttccatac cttctacata tgatccttct aagtttaagg aatatatcag gcacgtggag 120 gagtatgatt tacaatttat atttc 145 <210> 41 <211> 145 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus (HPV) <400> 41 tttcttactg 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tgataatttt aaggaatatg tacgtcatgt tgaagagtat 120 gacttacagt ttgtttttc 139 <210> 50 <211> 139 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus (HPV) <400> 50 tttgttaccg tggttgatac cactcgtagc actaatatga cattatgcac tgaagtaact 60 aaggaaggta catataaaaa tgataatttt aaggaatatg tacgtcatgt tgaagaatat 120 gacttacagt ttgtttttc 139 <210> 51 <211> 145 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus (HPV) <400> 51 tttttaacag ttgtagatac tactcgcagc accaatcttt ctgtgtgtgc ttctactact 60 tcttctattc ctaatgtata cacacctacc agttttaaag aatatgccag acatgtggag 120 gaatttgatt tgcagtttat atttc 145 <210> 52 <211> 145 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus (HPV) <400> 52 tttttaacag ttgtagatac tactcgcagc accaatcttt ctgtgtgtgc ttctactact 60 tcttctattc ctaatgtata cacacctacc agttttaaag aatatgccag acatgtggag 120 gaatttgatt tgcagtttat atttc 145 <210> 53 <211> 145 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus (HPV) <400> 53 tttcttactg ttgtggatac cactcgcagt accaatttta ctttgtctac tactactgaa 60 tcagctgtac caaatattta tgatcctaat aaatttaagg aatatattag 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can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 66 Lys Xaa Val Xaa Leu Phe Thr Asp Gly Xaa Cys Xaa Gly Xaa Pro Gly 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Tyr 20 25 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 67 Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu Leu 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 68 Lys Pro Val Lys Asn 1 5 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 69 Phe Val Lys Gly His Xaa Gly His Xaa Glu Asn Glu 1 5 10 <210> 70 <211> 16 <212> DNA <213> Human Papilloma Virus (HPV) <400> 70 atactachmg yagyac 16 <210> 71 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 71 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile Glu Lys 20 25 30 Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro His Glu 35 40 45 Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala Asp Asp Tyr Lys 50 55 60 Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn Arg Ser Gly Thr Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu Ala Leu Asn Ser Leu Gln 85 90 95 Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn 100 105 110 Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr 165 170 175 Lys Lys Trp Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His 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Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Ala Val Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Glu Glu Tyr Gly Glu Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr 165 170 175 Arg Ala Phe Leu Glu Asn Tyr Tyr Arg Glu His Gly Glu Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Lys Gly Trp Lys Thr Leu Lys Lys Ile Ala Glu Lys Val 195 200 205 Glu Ser Glu Lys Lys Ala Glu Glu Arg Gln Ala Thr Leu Asp Arg Tyr 210 215 220 Phe Arg Lys Val 225 <210> 74 <211> 211 <212> PRT <213> Archaeoglobus profundus <400> 74 Met Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Pro Val Ile Gly Pro 1 5 10 15 Leu Val Ile Cys Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Thr Val Glu Tyr Leu 20 25 30 Lys Ser Val Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Asp Arg Arg Lys Arg 35 40 45 Glu Glu Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Ser Leu Cys Lys Val Lys Val Leu 50 55 60 Lys Ile Ser Val Glu Asp Leu Asn Arg Leu Met Glu Tyr Met Ser Ile 65 70 75 80 Asn Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Val Glu Ile Ile Arg Ser Leu Met 85 90 95 Pro Lys Val Val Tyr Ile Asp Cys Pro Asp Ile Asn Val Glu Arg Phe 100 105 110 Lys His Glu Ile Glu Glu Arg Thr Gly Val Glu Val Phe Ala Ser His 115 120 125 Lys Ala Asp Glu Ile Tyr Pro Ile Val Ser Ile Ala Ser Ile Val Ala 130 135 140 Lys Val Glu Arg Asp Phe Glu Ile Asp Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Gly 145 150 155 160 Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Leu Arg Thr Ile Glu Phe Leu 165 170 175 Arg Ser Tyr Leu Arg Glu His Lys Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg Lys 180 185 190 Arg Trp Lys Thr Leu Lys Arg Leu Thr Thr His Thr Leu Ser Asp Phe 195 200 205 Phe Glu Val 210 <210> 75 <211> 205 <212> PRT <213> Archaeoglobus fulgidis <400> 75 Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly Pro 1 5 10 15 Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu Arg Lys 20 25 30 Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg Arg Glu Glu 35 40 45 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu Val Leu Lys Val 50 55 60 Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala Lys Thr Ile Asn Glu 65 70 75 80 Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile Leu Arg Leu Lys Pro Glu 85 90 95 Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg 100 105 110 Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu Arg Val Val Ala Glu His Lys Ala 115 120 125 Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val 130 135 140 Glu Arg Glu Arg Glu Ile Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe 145 150 155 160 Gly Ser Gly Tyr Ala Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu 165 170 175 Trp Ile Ala Ser Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys 180 185 190 Thr Val Ser Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe 195 200 205 <210> 76 <211> 233 <212> PRT <213> Thermococcus celer <400> 76 Leu Lys Leu Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Met Val Ile Ala Ala Val Val Leu Asp Glu Lys Asn Val Pro Lys 20 25 30 Leu Arg Asp Leu Gly Val Arg Asp Ser Lys Lys Leu Thr Pro Lys Arg 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Phe Asn Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asp Asp Tyr Val 50 55 60 Ile Leu Glu Leu Trp Pro Glu Glu Ile Asp Ser Arg Gly Gly Thr Leu 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Val Glu Arg Phe Val Glu Ala Leu Asn Ser Leu Lys 85 90 95 Val Lys Pro Asp Val Val Tyr Ile Asp Ala Ala Asp Val Lys Glu Gly 100 105 110 Arg Phe Gly Glu Glu Ile Lys Glu Arg Leu Asn Phe Glu Ala Lys Ile 115 120 125 Val Ser Glu His Arg Ala Asp Asp Lys Phe Leu Pro Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Ala Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Glu Lys Tyr Gly Glu Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr 165 170 175 Arg Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Tyr Arg Gln His Gly Glu Phe Pro Pro 180 185 190 Val Val Arg Arg Ser Trp Lys Thr Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Leu 195 200 205 Arg Lys Glu Ala Gly Ser Lys Asn Pro Glu Asn Ser Lys Glu Lys Gly 210 215 220 Gln Thr Ser Leu Asp Val Phe Leu Arg 225 230 <210> 77 <211> 224 <212> PRT <213> Thermococcus litoralis <400> 77 Met Lys Leu Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Ile Ala Ala Val Val Val Asp Glu Ser Arg Met Gln Glu 20 25 30 Leu Glu Ala Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Thr Pro Lys Arg 35 40 45 Arg Glu Glu Leu Phe Glu Glu Ile Val Gln Ile Val Asp Asp His Val 50 55 60 Ile Ile Gln Leu Ser Pro Glu Glu Ile Asp Gly Arg Asp Gly Thr Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Ile Glu Asn Phe Ala Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys 85 90 95 Val Lys Pro Asp Val Leu Tyr Ile Asp Ala Ala Asp Val Lys Glu Lys 100 105 110 Arg Phe Gly Asp Ile Ile Gly Glu Arg Leu Ser Phe Ser Pro Lys Ile 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ser Lys Tyr Ile Pro Val Ala Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Ala Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Gly Glu Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Thr 165 170 175 Arg Arg Phe Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Ala His Gly Glu Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Lys Ser Trp Lys Thr Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Leu 195 200 205 Lys Ala Lys Lys Thr Gln Pro Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Lys Pro 210 215 220 <210> 78 <211> 174 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 78 Met Phe Asn Leu Ser Leu Ser Ile Lys Ile Pro Ala Ile Leu His Asn 1 5 10 15 Asn Leu Phe Val Met Gln Lys Gln Ile Glu Ile Phe Thr Asp Gly Ser 20 25 30 Cys Leu Gly Asn Pro Gly Ala Gly Gly Ile Gly Ala Val Leu Arg Tyr 35 40 45 Lys Gln His Glu Lys Met Leu Ser Lys Gly Tyr Phe Lys Thr Thr Asn 50 55 60 Asn Arg Met Glu Leu Arg Ala Val Ile Glu Ala Leu Asn Thr Leu Lys 65 70 75 80 Glu Pro Cys Leu Ile Thr Leu Tyr Ser Asp Ser Gln Tyr Met Lys Asn 85 90 95 Gly Ile Thr Lys Trp Ile Phe Asn Trp Lys Lys Asn Asn Trp Lys Ala 100 105 110 Ser Ser Gly Lys Pro Val Lys Asn Gln Asp Leu Trp Ile Ala Leu Asp 115 120 125 Glu Ser Ile Gln Arg His Lys Ile Asn Trp Gln Trp Val Lys Gly His 130 135 140 Ala Gly His Arg Glu Asn Glu Ile Cys Asp Glu Leu Ala Lys Lys Gly 145 150 155 160 Ala Glu Asn Pro Thr Leu Glu Asp Met Gly Tyr Phe Glu Glu 165 170 <210> 79 <211> 166 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 79 Met Asn Pro Ser Pro Arg Lys Arg Val Ala Leu Phe Thr Asp Gly Ala 1 5 10 15 Cys Leu Gly Asn Pro Gly Pro Gly Gly Trp Ala Ala Leu Leu Arg Phe 20 25 30 His Ala His Glu Lys Leu Leu Ser Gly Gly Glu Ala Cys Thr Thr Asn 35 40 45 Asn Arg Met Glu Leu Lys Ala Ala Ile Glu Gly Leu Lys Ala Leu Lys 50 55 60 Glu Pro Cys Glu Val Asp Leu Tyr Thr Asp Ser His Tyr Leu Lys Lys 65 70 75 80 Ala Phe Thr Glu Gly Trp Leu Glu Gly Trp Arg Lys Arg Gly Trp Arg 85 90 95 Thr Ala Glu Gly Lys Pro Val Lys Asn Arg Asp Leu Trp Glu Ala Leu 100 105 110 Leu Leu Ala Met Ala Pro His Arg Val Arg Phe His Phe Val Lys Gly 115 120 125 His Thr Gly His Pro Glu Asn Glu Arg Val Asp Arg Glu Ala Arg Arg 130 135 140 Gln Ala Gln Ser Gln Ala Lys Thr Pro Cys Pro Pro Arg Ala Pro Thr 145 150 155 160 Leu Phe His Glu Glu Ala 165 <210> 80 <211> 161 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <400> 80 Met Ser Leu Pro Leu Lys Arg Val Asp Leu Phe Thr Asp Gly Ala Cys 1 5 10 15 Leu Gly Asn Pro Gly Pro Gly Gly Trp Ala Ala Leu Leu Arg Tyr Gly 20 25 30 Ser Gln Glu Lys Leu Leu Ser Gly Gly Glu Pro Cys Thr Thr Asn Asn 35 40 45 Arg Met Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Gly Leu Leu Ala Leu Arg Glu 50 55 60 Pro Cys Gln Val His Leu His Thr Asp Ser Gln Tyr Leu Lys Arg Ala 65 70 75 80 Phe Ala Glu Gly Trp Val Glu Arg Trp Gln Arg Asn Gly Trp Arg Thr 85 90 95 Ala Glu Gly Lys Pro Val Lys Asn Gln Asp Leu Trp Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Lys Ala Met Glu Gly His Glu Val Ala Phe His Phe Val Glu Gly His 115 120 125 Ser Gly His Pro Glu Asn Glu Arg Val Asp Arg Glu Ala Arg Arg Gln 130 135 140 Ala Lys Ala Gln Pro Gln Val Pro Cys Pro Pro Lys Glu Ala Thr Leu 145 150 155 160 Phe <210> 81 <211> 146 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 81 Met Leu Lys Gln Val Glu Ile Phe Thr Asp Gly Ser Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Ala Ile Leu Arg Tyr Arg Gly His Glu 20 25 30 Lys Thr Phe Ser Glu Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu 35 40 45 Leu Met Ala Ala Ile Val Ala Leu Glu Ala Leu Lys Glu His Cys Glu 50 55 60 Val Thr Leu Ser Thr Asp Ser Gln Tyr Val Arg Gln Gly Ile Thr Gln 65 70 75 80 Trp Ile His Asn Trp Lys Lys Arg Gly Trp Lys Thr Ala Glu Lys Lys 85 90 95 Pro Val Lys Asn Val Asp Leu Trp Lys Arg Leu Asp Ala Ala Leu Gly 100 105 110 Gln His Gln Ile Lys Trp Val Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro 115 120 125 Glu Asn Glu Arg Cys Asp Glu Leu Ala Arg Ala Ala Ala Met Asn Pro 130 135 140 Thr Gln 145 <210> 82 <211> 146 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 82 Met Lys His Val Asp Ile Phe Thr Asp Gly Ala Cys Ser Gly Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Trp Gly Ala Val Leu Arg Tyr Gly Glu Thr Glu Lys 20 25 30 Glu Leu Ser Gly Gly Glu Ala Asp Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu Leu 35 40 45 Leu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Asn Ala Leu Lys Ser Pro Cys Glu Val 50 55 60 Asp Leu Tyr Thr Asp Ser Ala Tyr Val Lys Asp Gly Ile Thr Lys Trp 65 70 75 80 Ile Phe Gly Trp Lys Lys Lys Gly Trp Lys Thr Ala Asp Asn Lys Pro 85 90 95 Val Lys Asn Val Glu Leu Trp Gln Ala Leu Glu Ala Ala Gln Glu Arg 100 105 110 His Lys Val Thr Leu His Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro Glu 115 120 125 Asn Glu Arg Ala Asp Glu Leu Ala Arg Lys Gly Met Glu Pro Phe Lys 130 135 140 Arg Arg 145

Claims (20)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 증폭 프라이머 및 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 증폭 프라이머를 포함하는 고위험 인간 파필로마바이러스(HPV) 유전자형의 동시 실시간 PCR 검출을 위한 키트로서,
   상기 고위험 HPV 유전자형은 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68을 포함하는 것인 키트.
6. 삭제
7. 청구항 5에 있어서, DNA 의존적 DNA 폴리머라제 또는 RNA 의존적 DNA 폴리머라제를 추가로 포함하는 것인 키트.
8. 시료 중 고위험 인간 파필로마바이러스(HPV) 유전자형을 실시간 검출하는 방법으로서,
   고위험 HPV 유전자형 DNA의 존재를 검사할 시료를 제공하는 단계;
   서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 증폭 프라이머 및 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 증폭 프라이머를 제공하는 단계로서, 상기 정방향 및 역방향 프라이머는 표적 HPV DNA 서열에 동시에 어닐링하는 것인 단계;
   증폭 폴리머라제 활성 및 형광 염료를 포함하는 증폭 버퍼의 존재하에 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 사이의 PCR 단편을 증폭하는 단계, 및
   형광 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계를 포함하고,
   상기 고위험 HPV 유전자형은 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68을 포함하는 것이고,
   형광 신호의 증가는 상기 시료 중 하나 이상의 고위험 HPV 유전자형의 존재를 나타내는 것인 방법.
9. 삭제
10. 청구항 8에 있어서, 상기 HPV 표적 DNA 서열은 서열 번호 31 내지 55의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
11. 청구항 8에 있어서, 상기 형광 신호의 증가는 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 66 및 68 유래의 HPV DNA 100 카피 및 유전자형 51 유래의 HPV DNA 1,000 카피의 존재를 검출할 수 있는 것인 방법.
12. 청구항 8에 있어서, 상기 증폭 폴리머라제 활성은 열안정성 DNA 폴리머라제의 활성인 것인 방법.
13. 삭제
14. 청구항 8에 있어서, 상기 PCR 단편은 고체 지지체에 연결된 것인 방법.
15. 청구항 8에 있어서, 상기 시료 중 핵산은 우라실-N-글리코실라제로 전-처리되는 것인 방법.
16. 시료 중 고위험 HPV를 실시간 PCR 검출하는 방법으로서,
    고위험 HPV 유전자형 RNA의 존재를 검사할 시료를 제공하는 단계;
    서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 정방향 증폭 프라이머 및 서열 번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 증폭 프라이머를 제공하는 단계로서, 상기 정방향 및 역방향 프라이머는 표적 HPV 핵산 서열에 동시에 어닐링하는 것인 단계;
    역전사 효소 활성 및 역방향 증폭 프라이머를 포함하는 역전사 효소 버퍼의 존재 하에 고위험 HPV RNA를 역전사하여 표적 고위험 HPV cDNA 서열을 생성하는 단계;
    상기 표적 HPV cDNA 서열과 증폭 폴리머라제 활성 및 형광 염료를 포함하는 증폭 버퍼의 존재하에 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 사이의 PCR 단편을 증폭하는 단계, 및
    형광 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 고위험 HPV 유전자형은 HPV 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68을 포함하는 것이고,
    형광 신호의 증가는 상기 시료 중 하나 이상의 고위험 HPV 유전자형의 존재를 나타내는 것인 방법.
17. 삭제
18. 청구항 16에 있어서, 상기 HPV 표적 DNA 서열은 서열 번호 31 내지 55의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
19. 청구항 16에 있어서, 상기 형광 신호의 증가는 유전자형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 66 및 68 유래의 HPV DNA 100 카피 및 유전자형 51 유래의 HPV DNA 1,000 카피의 존재를 검출할 수 있는 것인 방법.
20. 삭제

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