CN112280903A - 引物探针组合、脑炎病毒检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种引物探针组合、检测试剂盒及其应用。本发明通过设计第一类Y引物和第二类Y引物，且第一类Y引物可以与乙型脑炎病毒的特异性引物部分互补，第二类Y引物可以与圣路易斯脑炎病毒的特异性引物部分互补，形成“Y”型结构，用于阻止非特异性延伸反应的启动，以避免因乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒基因组序列相似性较高而导致的检测特异性不足的问题，从而提高乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒检测过程中的特异性和准确性，具有良好的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种引物探针组合，一种脑炎病毒检测试剂盒及其应用。
背景技术
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属黄病毒科黄病毒属，为单正链RNA病毒，圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis Virus，SLEV)属黄病毒科黄病毒属，有包膜，基因组为单股正链RNA。
目前，国内外对乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒的检测方法主要是血清学试验、病毒培养和PCR。其中，血清学试验、病毒培养具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点；常规的多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的技术，可以在同一个PCR反应管中对多个病毒同时进行快速扩增，大大提高了检测效率。虽然该方法具有快速、灵敏、自动化程度高等特点，但是对于属间相似性高的病原体，如乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒，也存在特异性不足的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种引物探针组合，一种脑炎病毒检测试剂盒及其应用，旨在解决现有乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒检测过程中存在的特异性和准确性较低的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明一方面，提供了一种引物探针组合，其包括乙型脑炎病毒引物探针组和圣路易斯脑炎病毒引物探针组，所述乙型脑炎病毒引物探针组包括乙型脑炎病毒特异性引物、第一类Y引物和第一类荧光探针，所述第一类Y引物包括第一类第一Y引物、第一类第二Y引物中的至少一种；所述圣路易斯脑炎病毒引物探针组包括圣路易斯脑炎病毒特异性引物、第二类Y引物和第二类荧光探针，所述第二类Y引物包括第二类第一Y引物、第二类第二Y引物中的至少一种；
其中，所述乙型脑炎病毒特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第一类第一Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第一类第二Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第一类荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述圣路易斯脑炎病毒特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:6-7所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:6-7所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第二类第一Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第二类第二Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第二类荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第一类荧光探针上的荧光基团与所述第二类荧光探针上的荧光基团不同。
本发明提供的引物探针组合，通过设计第一类Y引物和第二类Y引物，其中，第一类Y引物可以与乙型脑炎病毒的特异性引物部分互补，第二类Y引物可以与圣路易斯脑炎病毒的特异性引物部分互补，形成“Y”型结构。当乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒的特异性引物的3’端与靶序列识别杂交时，其5’端与第一类Y引物和/或第二类Y引物分开，启动延伸反应；当没有靶序列存在，或待检测样本的序列与5’端序列不完全匹配时，则第一类Y引物与乙型脑炎病毒的特异性引物，以及第二类Y引物与圣路易斯脑炎病毒的特异性引物继续保持“Y”型结构，不会启动延伸反应。通过本发明提供的该引物探针组合可以避免因乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒基因组序列相似性较高而导致的检测特异性不足的问题，避免非特异性扩增，从而提高乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒检测过程中的特异性和准确性。
本发明另一方面，提供了一种脑炎病毒检测试剂盒，其包括本发明提供的所述引物探针组合。
本发明提供的脑炎病毒检测试剂盒，由于包括本发明提供的引物探针组合，因此在检测中对乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒具有较高的特异性、准确性和灵敏度，检测结果可用于乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒的常规监测等领域研究。同时，本发明提供的脑炎病毒检测试剂盒只需对一份待检测样本进行一次检测，即可鉴别该待检测样本对乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒的感染情况，其检测过程仅需1.5小时，可节约检测时间、减少取材数量，显著提高了检测效率。
本发明再一方面，提供了上述脑炎病毒检测试剂盒在检测乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒中的应用。
本发明提供的脑炎病毒检测试剂盒由于包括本发明提供的引物探针组合，因此在检测时，既可以用于单独快速检测乙型脑炎病毒或圣路易斯脑炎病毒，还可以在乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒同时存在的情况下进行快速检测，同时避免因乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒基因组序列相似性较高而导致的检测特异性不足的问题，具有特异性强、准确性好、灵敏度高的优点。本发明提供的检测试剂盒的检测过程仅需1.5小时，可显著缩短检测时间，提高检测效率，具有良好的应用前景和市场价值。
附图说明
图1为本发明提供的第一类第一Y引物和乙型脑炎病毒特异性引物与靶序列的序列进行匹配扩增的过程示意图；
图2为本发明提供的第一类第一Y引物和乙型脑炎病毒特异性引物与待检测样本(非靶序列)无法进行匹配扩增的过程示意图；
图3为本发明实施例2对阳性质控品进行检测所得的扩增曲线；
图4为本发明实施例3对阴性质控品进行检测所得的扩增曲线。
图5为本发明实施例4对乙型脑炎病毒样本进行检测所得的扩增曲线；
图6为本发明实施例5对圣路易斯脑炎病毒样本进行检测所得的扩增曲线；
图7为本发明实施例6对乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒混合样本进行检测所得的扩增曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
需要理解的是，本发明实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
另外，除非上下文另外明确地使用，否则词的单数形式的表达应被理解为包含该词的复数形式。术语“包括”或“具有”旨在指定特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合的存在，但不用于排除存在或可能添加一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合。
需要说明的是，本发明实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；相关试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明实施例提供了一种引物探针组合，其包括乙型脑炎病毒引物探针组和圣路易斯脑炎病毒引物探针组，乙型脑炎病毒引物探针组包括乙型脑炎病毒特异性引物、第一类Y引物和第一类荧光探针，第一类Y引物包括第一类第一Y引物、第一类第二Y引物中的至少一种；圣路易斯脑炎病毒引物探针组包括圣路易斯脑炎病毒特异性引物、第二类Y引物和第二类荧光探针，第二类Y引物包括第二类第一Y引物、第二类第二Y引物中的至少一种；
其中，乙型脑炎病毒特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
第一类第一Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或由SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
第一类第二Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或由SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
第一类荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或由SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
圣路易斯脑炎病毒特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:6-7所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO:6-7所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
第二类第一Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，或由SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
第二类第二Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或由SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
第二类荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，或由SEQ IDNO:10所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
第一类荧光探针上的荧光基团与第二类荧光探针上的荧光基团不同。
乙型脑炎病毒特异性引物(JEV-FP和JEVRP)的核苷酸序列(SEQ ID NO:1-2)：
JEV-FP：ccaagcctcgtctargatgc
JEV-RP：gtccttccaccycctctacagc
第一类第一Y引物JEV-FP2的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：
JEV-FP2：agtgtgtgagcgaggcttgg-P(“P”表示以磷酸盐封闭其3’端)
第一类第二Y引物JEV-RP2的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：
JEV-RP2：atggcttgaactgtggaaggac-P(“P”表示以磷酸盐封闭其3’端)
第一类荧光探针JEV-PP的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)：
JEV-PP：agaggttagaggagaccccgtggaa
圣路易斯脑炎病毒特异性引物(SLEV-FP和SLEV-RP)的核苷酸序列(SEQ ID NO:6-7)：
SLEV-FP：tggagatgaytgcgttgtgaar
SLEV-RP：ttcctaacttttcccatrtcattcaa
第二类第一Y引物SLEV-FP2的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)：
SLEV-FP2：gccacacccgcartcatctcca-P(“P”表示以磷酸盐封闭其3’端)
第二类第二Y引物SLEV-RP2的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)：
SLEV-RP2：ccacccacyatgggaaaagttaggaa-P(“P”表示以磷酸盐封闭其3’端)
第二类荧光探针SLEV-PP的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)：
SLEV-PP：caatygatgataggtttgcacatgccctc
本发明实施例提供的引物探针组合，通过设计第一类Y引物和第二类Y引物，其中，第一类Y引物可以与乙型脑炎病毒的特异性引物部分互补，第二类Y引物可以与圣路易斯脑炎病毒的特异性引物部分互补，形成“Y”型结构。当乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒的特异性引物的3’端与靶序列识别杂交时，其5’端与第一类Y引物和/或第二类Y引物分开，启动延伸反应；当没有靶序列存在，或待检测样本的序列与5’端序列不完全匹配时，则第一类Y引物与乙型脑炎病毒的特异性引物，以及第二类Y引物与圣路易斯脑炎病毒的特异性引物继续保持“Y”型结构，不会启动延伸反应。通过本发明实施例提供的该引物探针组合可以避免因乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒基因组序列相似性较高而导致的检测特异性不足的问题，避免非特异性扩增，从而提高乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒检测过程中的特异性和准确性。
具体地，乙型脑炎病毒引物探针组中，第一类第一Y引物可以与乙型脑炎病毒特异性引物JEV-FP的5’端部分互补，形成“Y”型结构；第一类第二Y引物可以与乙型脑炎病毒特异性引物JEV-RP的5’端部分互补，形成“Y”型结构。其中，第一类荧光探针可以与乙型脑炎病毒靶序列的正义链或者反义链的其中一条相结合。以第一类第一Y引物为例，以下结合图1和图2对Y引物与特异性引物之间的匹配过程进行具体说明：图1中，第一类第一Y引物与乙型脑炎病毒特异性引物JEV-FP的5’端部分互补，形成“Y”型结构，在检测过程中，当JEV-FP的3’端与靶序列识别杂交时，其5’端即与第一类第一Y引物分开，此时将启动延伸反应，使第一类荧光探针上的荧光基团和淬灭基团发生分离，从而荧光检测系统可接收到荧光基团发出的荧光信号，实现对靶序列的检测，靶序列为乙型脑炎病毒阳性序列；图2中，当没有靶序列存在，或待测样本的序列与JEV-FP不完全匹配时，则JEV-FP的5’端与第一类第一Y引物继续保持“Y”型结构，此时无法启动延伸反应，第一类荧光探针上的荧光基团所发射的荧光信号持续被淬灭基团所吸收，荧光检测系统无法接收到荧光基团发出的荧光信号，待测样本为乙型脑炎病毒阴性。类似地，第一类第二Y引物与乙型脑炎病毒特异性引物JEV-RP的5’端部分互补，形成“Y”型结构，在检测过程中，当JEV-RP的3’端与靶序列识别杂交时，其5’端即与第一类第二Y引物分开，此时将启动延伸反应，使第一类荧光探针上的荧光基团和淬灭基团发生分离，从而荧光检测系统可接收到荧光基团发出的荧光信号，实现对靶序列的检测，靶序列为乙型脑炎病毒阳性序列；当没有靶序列存在，或待测样本的序列与JEV-RP不完全匹配时，则JEV-RP的5’端与第一类第二Y引物继续保持“Y”型结构，此时无法启动延伸反应，第一类荧光探针上的荧光基团所发射的荧光信号持续被淬灭基团所吸收，荧光检测系统无法接收到荧光基团发出的荧光信号，待测样本为乙型脑炎病毒阴性。在一些实施例中，优选将第一类第一Y引物与JEV-FP、第一类第二Y引物与JEV-RP分别形成“Y”型结构，此时的乙型脑炎病毒引物探针组用于检测乙型脑炎病毒时，其检测特异性可进一步得到提高。
相应地，圣路易斯脑炎病毒引物探针组中，第二类第一Y引物可以与圣路易斯脑炎病毒特异性引物SLEV-FP的5’端部分互补，形成“Y”型结构；第二类第二Y引物可以与圣路易斯脑炎病毒特异性引物SLEV-RP的5’端部分互补，形成“Y”型结构。其中，第二类荧光探针可以与圣路易斯脑炎病毒靶序列的正义链或者反义链的其中一条相结合。第二类第一Y引物与圣路易斯脑炎病毒特异性引物SLEV-FP、第二类第二Y引物与圣路易斯脑炎病毒特异性引物SLEV-RP在检测过程中的识别过程，以及第二类荧光探针的荧光响应过程均与乙型脑炎病毒引物探针组的过程类似，此处不再赘述。在一些实施例中，优选将第二类第一Y引物与SLEV-FP、第二类第二Y引物与SLEV-RP分别形成“Y”型结构，此时的圣路易斯脑炎病毒引物探针组用于检测圣路易斯脑炎病毒时，其检测特异性可进一步得到提高。
可以理解的是，为了实现乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒的同时检测，需对第一类荧光探针与第二类荧光探针的荧光形态加以区分，因此第一类荧光探针上的荧光基团与第二类荧光探针上的荧光基团应不同。在一些具体实施例中，第一类荧光探针的5’端设有荧光基团FAM，3’端设有淬灭基团BHQ1，第二类荧光探针的5’端设有荧光基团HEX，3’端设有淬灭基团BHQ2。此时，将第一类荧光探针和第二类荧光探针的序列依次为：
FAM-agaggttagaggagaccccgtggaa-BHQ1
HEX-caatygatgataggtttgcacatgccctc-BHQ2
本发明实施例还提供了一种脑炎病毒检测试剂盒，其包括本发明实施例提供的上述引物探针组合。
本发明实施例提供的检测试剂盒，由于包括本发明实施例提供的引物探针组合，因此在检测中对乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒具有较高的特异性、准确性和灵敏度，检测结果可用于乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒的常规监测等领域研究。同时，本发明实施例提供的检测试剂盒只需对一份待检测样本进行一次检测，即可鉴别该待检测样本对乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒的感染情况，其检测过程仅需1.5小时，可节约检测时间、减少取材数量，显著提高了检测效率。
在一些实施例中，乙型脑炎病毒特异性引物(JEV-FP或JEV-RP)的终浓度为0.25μM-0.50μM，第一类Y引物(JEV-FP2或JEV-RP2)的终浓度为0.25μM-0.50μM，第一类探针的终浓度为0.25μM-0.50μM；圣路易斯脑炎病毒特异性引物(SLEV-FP或SLEV-RP)的终浓度为0.80μM，第二类Y引物(SLEV-FP2或SLEV-RP2)的终浓度为0.80μM，第二类探针的终浓度为0.30μM。
在一些实施例中，检测试剂盒还包括反应缓冲液、酶混合液、质控品中的至少一种。在一些具体实施例中，检测试剂盒的反应体系为25μL反应体系，其组分如表1所示。可以理解的是，检测试剂盒的反应体系的总体积数也可根据实际情况进行调整，相应地，其中各组分的浓度也按照比例进行调整。
表1 25μL反应体系的反应液组成
| 反应组分 | 起始浓度 | 终浓度 | 体积(μL) |
| 2×一步定量RT-qPCR缓冲液 | 2× | 1× | 12.5 |
| JEV-FP | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| JEV-FP2 | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| JEV-RP | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| JEV-RP2 | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| JEV-PP | 50.00μM | 0.20μM | 0.10 |
| SLEV-FP | 50.00μM | 0.40μM | 0.20 |
| SLEV-FP2 | 50.00μM | 0.40μM | 0.20 |
| SLEV-RP | 50.00μM | 0.40μM | 0.20 |
| SLEV-RP2 | 50.00μM | 0.40μM | 0.20 |
| SLEV-PP | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| RT-PCR酶混合液 | 25× | 1× | 1 |
| DEPC水 | - | - | 4.85 |
| RNA模板 | - | - | 5.00 |
本发明实施例还提供了上述脑炎病毒检测试剂盒在检测乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒中的应用。
本发明实施例提供的检测试剂盒由于包括本发明实施例提供的引物探针组合，因此在检测时，既可以用于单独快速检测乙型脑炎病毒或圣路易斯脑炎病毒，还可以在乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒同时存在的情况下进行快速检测，同时避免因乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒基因组序列相似性较高而导致的检测特异性不足的问题，具有特异性强、准确性好、灵敏度高的优点。本发明实施例提供的检测试剂盒的检测过程仅需1.5小时，可显著缩短检测时间，提高检测效率，具有良好的应用前景和市场价值。
具体地，将本发明实施例提供的检测试剂盒用于检测乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒时，包括如下步骤：
S1、提供待测样本的总RNA；
S2、以检测试剂盒对总RNA进行RT-qPCR扩增，得到荧光曲线；
S3、当荧光曲线呈S型，且Ct值≤38时为阳性结果；当荧光曲线呈S型，且38＜Ct值＜40时为可疑结果，重新对总RNA进行RT-qPCR扩增；当荧光曲线为非S型，且Ct值＝40或无Ct值时为阴性结果。
具体地，S1中，对待测样本进行总RNA提取的方法可采用本领域的常规方法。
S2中，对待测样本的总RNA进行RT-qPCR扩增的方法可采用本领域的常规方法。在一些实施例中，对25μL反应体系下RT-qPCR扩增的反应程序进行了优化，以提高扩增效率和检测效率，具体包括逆转录、变性和扩增三个步骤，各步骤的反应条件如表2所示。
表2 RT-qPCR的反应程序
S3中，根据所得荧光曲线的不同，结合Ct值的范围，可知待测样本的检测结果。Ct值中，C代表Cycle，t代表threshold，其含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。其中，当荧光曲线呈S型，且Ct值≤38时，该待测样本为阳性，根据其所发荧光来源，即可确定该待测样本为乙型脑炎病毒/圣路易斯脑炎病毒阳性。例如，当第一类荧光探针上的荧光基团为FAM，第二类荧光探针上的荧光基团为HEX时，当检测结果所发荧光信号为FAM，则为乙型脑炎病毒阳性；当检测结果所发荧光信号为HEX，则为圣路易斯脑炎病毒阳性；当检测结果所发荧光信号为FAM和HEX的混合，则提示乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒均为阳性。
当荧光曲线呈S型，且38＜Ct值＜40时为可疑结果，应重新对总RNA进行RT-qPCR扩增，如果复核结果显示Ct值＜40、且荧光曲线呈S型，则该待测样本为阳性，然后再根据其所发荧光信号确认具体是乙型脑炎病毒阳性和/或圣路易斯脑炎病毒阳性；如果复核结果显示Ct值≥40，或荧光曲线为非S型，则该待测样本为阴性。
当荧光曲线为非S型，且Ct值＝40或无Ct值时，该待测样本为阴性。
通过上述的检测步骤，不仅可以用于单独检测乙型脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒，还可以实现乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒的双重检测，同时在乙型脑炎病毒引物探针组和圣路易斯脑炎病毒引物探针组的存在下，可避免乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒基因组序列相似性较高而导致的特异性不足的问题。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例引物探针组合、脑炎病毒检测试剂盒及其应用的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
实施例1
本实施例提供了一种检测试剂盒，其包括RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合液、阳性质控品和阴性质控品。
其中，RT-PCR反应液包含2×One-Step RT-qPCR Buffer及乙型脑炎病毒特异性引物(JEV-FP、JEV-RP)、第一类Y引物(JEV-FP2、JEV-RP2)及第一类荧光探针(JEV-PP)、圣路易斯脑炎病毒特异性引物(SLEV-FP、SLEV-RP)、第二类Y引物(SLEV-FP2、SLEV-RP2)和第二类荧光探针(SLEV-PP)，其中，各引物、荧光探针的获取方法是：从NCBI上下载所有已知的乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒全基因组序列，使用Clone Manager软件进行序列比对，寻找各型别序列的特异性保守区、然后使用Primer Express 3.0软件设计乙型脑炎病毒特异性引物(JEV-FP、JEV-RP)、第一类Y引物Y引物(JEV-FP2、JEV-RP2)及第一类荧光探针(JEV-PP)、圣路易斯脑炎病毒特异性引物(SLEV-FP、SLEV-RP)、第二类Y引物(SLEV-FP2、SLEV-RP2)和第二类荧光探针(SLEV-PP)。所有引物、探针在生工生物(上海)股份有限公司合成；2×One-Step RT-qPCR Buffer和RT-PCR酶混合液均来源于Quanti Probe One-Step RT-qPCR Kit(深圳联合医学科技有限公司)。
阳性质控品为含有乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒目的基因片段的合成质粒混合物，阴性质控品为DEPC水。
本实施例提供的检测试剂盒的反应体系为25μL，其组成如表1所示。
表1 25μL反应体系的反应液组成
| 反应组分 | 起始浓度 | 终浓度 | 体积(μL) |
| 2×一步定量RT-qPCR缓冲液 | 2× | 1× | 12.5 |
| JEV-FP | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| JEV-FP2 | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| JEV-RP | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| JEV-RP2 | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| JEV-PP | 50.00μM | 0.20μM | 0.10 |
| SLEV-FP | 50.00μM | 0.40μM | 0.20 |
| SLEV-FP2 | 50.00μM | 0.40μM | 0.20 |
| SLEV-RP | 50.00μM | 0.40μM | 0.20 |
| SLEV-RP2 | 50.00μM | 0.40μM | 0.20 |
| SLEV-PP | 50.00μM | 0.30μM | 0.15 |
| RT-PCR酶混合液 | 25× | 1× | 1 |
| DEPC水 | - | - | 4.85 |
| RNA模板 | - | - | 5.00 |
实施例2
本实施例以实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒，对阳性质控品进行检测，包括如下步骤：
(11)阳性质控品验证：取试剂盒内阳性质控品进行验证；以ABI 7500型全自动荧光定量PCR检测仪进行程序设置，荧光报告基团为：FAM，VIC通道，Passive Reference：NONE，反应程序如表2所示；
(12)扩增结束后，所得荧光曲线如图3所示。
通过图3可以看出，两条荧光曲线均呈S型，Ct值均≤38，且第一类荧光探针和第二类荧光探针均发光，说明实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒可以同时检测出乙型脑炎病毒(JEV)和圣路易斯脑炎病毒(SLEV)。
表2 RT-qPCR的反应程序
实施例3
本实施例以实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒，对阴性质控品进行检测，包括如下步骤：
(21)阴性质控品验证：取DEPC水进行阴性质控品验证；以ABI 7500型全自动荧光定量PCR检测仪进行程序设置，荧光报告基团为：FAM，VIC通道，Passive Reference：NONE，反应程序如表2所示；
(22)扩增结束后，所得荧光曲线如图4所示。
通过图4可以看出，实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒对阴性质控品进行检测时，所得荧光曲线非S型且无Ct值，提示不存在乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒，检测结果准确，不会出现假阳性。
实施例4
(31)样本准备：收集乙型脑炎病毒3株；
(32)样本核酸提取：按照病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Kit方法对样本进行核酸提取。阳性质控品和阴性质控品无需提取，可直接使用；
(33)以ABI 7500型全自动荧光定量PCR检测仪进行程序设置，荧光报告基团为：FAM，VIC通道，Passive Reference：NONE，反应程序如表2所示；
(34)扩增结束后，所得荧光曲线如图5所示。
通过图5可以看出，实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒对3株乙型脑炎病毒样本进行检测时，所得荧光曲线均呈S型，Ct值≤38，且只收集到第一类荧光探针JEV-PP发出的荧光信号(FAM)，提示乙型脑炎病毒阳性、圣路易斯脑炎病毒阴性，阳性样本检出率为100％。
实施例5
(41)样本准备：收集圣路易斯脑炎病毒3株；
(42)样本核酸提取：按照病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Kit方法对样本进行核酸提取。阳性质控品和阴性质控品无需提取，可直接使用；
(43)以ABI 7500型全自动荧光定量PCR检测仪进行程序设置，荧光报告基团为：FAM，VIC通道，Passive Reference：NONE，反应程序如表2所示；
(44)扩增结束后，所得荧光曲线如图6所示。
通过图6可以看出，实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒对圣路易斯脑炎病毒样本进行检测时，所得荧光曲线呈S型，Ct值≤38，且只收集到第二类荧光探针SLEV-PP发出的荧光信号(HEX)，提示乙型脑炎病毒阴性、圣路易斯脑炎病毒阳性，阳性样本检出率为100％。
实施例6
(51)样本准备：收集乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒各1株；
(52)样本核酸提取：按照病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Kit方法对样本进行核酸提取。阳性质控品和阴性质控品无需提取，可直接使用；
(53)以ABI 7500型全自动荧光定量PCR检测仪进行程序设置，荧光报告基团为：FAM，VIC通道，Passive Reference：NONE，反应程序如表2所示；
(54)扩增结束后，所得荧光曲线如图7所示。
通过图7可以看出，实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒对乙型脑炎病毒和圣路易斯脑炎病毒混合样本进行检测时，得到两条荧光曲线，均呈S型，Ct值均≤38，且可以同时收集到第一类荧光探针JEV-PP和第二类荧光探针SLEV-PP所发出的荧光信号(FAM和HEX)，提示乙型脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒均为阳性。
实施例7
分别取黄热病毒样本核酸、裂谷热病毒样本核酸、西尼罗病毒样本核酸、基孔肯雅病毒样本核酸、东方马脑炎病毒核酸、西方马脑炎病毒核酸、登革病毒核酸和寨卡病毒核酸，以实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒，使用ABI7500荧光PCR进行检测，荧光报告基团为：FAM，VIC通道，Passive Reference：NONE，反应程序如表2所示。经检测发现，上述8种非目标病原体检测结果均为阴性，说明实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒具有良好的特异性，特异性为100％。
实施例8
使用实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒对乙型脑炎病毒中浓度样本(1×104copies/mL)、乙型脑炎病毒低浓度样本(1×103copies/mL)、圣路易斯脑炎病毒中浓度样本(1×104copies/mL)、圣路易斯脑炎病毒低浓度样本(1×103copies/mL)进行检测，每个样本重复检测10次，计算Ct值的变异系数，阳性样本的批内Ct值变异系数≤5％，结果如表3所示。
表3重复性实验结果
通过表3可以看出，本发明实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒对不同浓度的乙型脑炎病毒样本和圣路易斯脑炎病毒样本进行10次重复检测，阳性样本的批内Ct值变异系数≤5％，说明本发明实施例1所得脑炎病毒检测试剂盒的检测重复性好，准确性高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳国际旅行卫生保健中心(深圳海关口岸门诊部)
<120> 引物探针组合、脑炎病毒检测试剂盒及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaagcctcg tctargatgc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtccttccac cycctctaca gc 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtgtgtgag cgaggcttgg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcttgaa ctgtggaagg ac 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaggttaga ggagaccccg tggaa 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggagatgay tgcgttgtga ar 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcctaactt ttcccatrtc attcaa 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccacacccg cartcatctc ca 22
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccacccacya tgggaaaagt taggaa 26
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caatygatga taggtttgca catgccctc 29
Claims (10)
1.一种引物探针组合，其特征在于，包括乙型脑炎病毒引物探针组和圣路易斯脑炎病毒引物探针组，所述乙型脑炎病毒引物探针组包括乙型脑炎病毒特异性引物、第一类Y引物和第一类荧光探针，所述第一类Y引物包括第一类第一Y引物、第一类第二Y引物中的至少一种；所述圣路易斯脑炎病毒引物探针组包括圣路易斯脑炎病毒特异性引物、第二类Y引物和第二类荧光探针，所述第二类Y引物包括第二类第一Y引物、第二类第二Y引物中的至少一种；
其中，所述乙型脑炎病毒特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第一类第一Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或由所述SEQID NO:3所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第一类第二Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或由所述SEQID NO:4所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第一类荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或由所述SEQID NO:5所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述圣路易斯脑炎病毒特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:6-7所示的核苷酸序列，或由所述SEQ ID NO:6-7所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第二类第一Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，或由所述SEQID NO:8所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第二类第二Y引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或由所述SEQID NO:9所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第二类荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，或由所述SEQID NO:10所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所得具有相同功能的核苷酸序列；
所述第一类荧光探针上的荧光基团与所述第二类荧光探针上的荧光基团不同。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一类探针的5’端设有荧光基团FAM，3’端设有淬灭基团BHQ1。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第二类探针的5’端设有荧光基团HEX，3’端设有淬灭基团BHQ2。
4.一种脑炎病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的脑炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合中，所述乙型脑炎病毒特异性引物的终浓度为0.25μM-0.50μM，所述第一类Y引物的终浓度为0.25μM-0.50μM，所述第一类探针的终浓度为0.10μM-0.30μM；和/或
所述圣路易斯脑炎病毒特异性引物的终浓度为0.25μM-0.50μM，所述第二类Y引物的终浓度为0.25μM-0.50μM，所述第二类探针的终浓度为0.10μM-0.30μM。
6.根据权利要求4所述的脑炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括反应缓冲液、酶混合液、质控品中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的脑炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括一步定量RT-qPCR缓冲液；和/或
所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品。
8.权利要求4-7任一项所述脑炎病毒检测试剂盒在检测乙型脑炎病毒和/或圣路易斯脑炎病毒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
提供待测样本的总RNA；
以所述脑炎病毒检测试剂盒，对所述总RNA进行RT-qPCR扩增，得到荧光曲线；
当所述荧光曲线呈S型，且Ct值≤38时为阳性结果；
当所述荧光曲线呈S型，且38＜Ct值＜40时为可疑结果，重新对所述总RNA进行RT-qPCR扩增；
当所述荧光曲线为非S型，且Ct值＝40或无Ct值时为阴性结果。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述RT-qPCR扩增程序包括如下步骤：
在50℃下进行逆转录反应10min，循环次数为1次；
在95℃下进行变性反应3min，循环次数为1次；
先在95℃下进行扩增反应10s，然后在60℃下收集荧光1min，循环次数为40次。
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