CN113637730B - 一种等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法 - Google Patents

一种等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法，利用等温扩增技术扩增待检测核酸，Exo III剪切扩增子3’末端序列暴露单链DNA靶标，茎环探针结合靶标，Exo III能够剪切探针3’末端并释放荧光基团，通过裸眼或横向流动试纸条可快速、灵敏地检测病毒核酸。该方法无需特殊检测装置，检测速度快、灵敏性高、成本低，且在室温条件下均可完成检测，裸眼和试纸条可视化过程在25~30 min内完成，检测灵敏度可达到2个拷贝。

Description

一种等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法。
背景技术
核酸分子的快速检测对于疾病诊断、临床检验等都具有十分重要的作用。其广泛的应用领域也对核酸检测技术的发展不断提出新的需求，尤其是对现场化、快速化、简便化和准确性等方面的需求不断提升。传统的核酸检测方式主要包括通过RT-qPCR，但是这种方法需要借助荧光定量PCR仪。RPA-exo和Nfo-exo方法虽然能用于快速检测病毒核酸，但是该方法需要利用荧光读取仪器实时监控荧光强度来判别，且探针序列较长，需要修饰四个荧光基团，不仅增加成本，降低灵敏性，还限制了该方法在现场化的应用。Exo III结合茎环探针的方法虽然已经被广泛利用于核酸检测，但是该系统常常用来检测合成的靶标序列，或需要借助电化学材料或结合纳米材料来增强荧光信号，且尚未开发可视化检测方法。以上这些方法都不利于实时快速诊断和现场化检测的应用。因此，开发一种检测低成本、速度快、准确性高、灵敏度高、最小设备需求且能够应用于现场化检测的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明目的在于提供一种简单、快速、准确、灵敏、设备最少、可应用于现场的核酸可视化检测方法。该方法是将RPA技术与核酸外切酶III结合，加之茎环探针完成的核酸检测技术，具体地，茎环探针结合在RPA扩增产物5’端后，Exo III切割茎环探针上的淬灭基团来释放荧光基团，通过裸眼和试纸条可视化方式进行病毒核酸的检测。本发明优化了检测体系和可视化方法，并快速、准确地鉴定到非洲猪瘟临床样本。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
基于等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法，包括以下步骤：
(1)等温扩增引物扩增待检核酸；
(2)核酸外切酶III剪切扩增子的3’平末端碱基，暴露茎环探针结合的单链DNA；
(3)标记荧光基团的探针与靶标结合，核酸外切酶III剪切探针的3’端，释放荧光基团用于裸眼检测和横向流动试纸条检测。
用于裸眼检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物，特异性结合p72基因的茎环探针，核酸外切酶III；所述茎环探针的核苷酸序列为5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’，茎环探针含有5’端标记的荧光基团和中间标记的淬灭基团。
进一步地，所述非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物的序列为：P72-F:5’-TAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGG-3’；P72-R:5’-AACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACC-3’。
进一步地，茎环探针最佳用量为10～20μM；核酸外切酶III反应最佳时间：37℃反应条件时，反应时间为5～20min；25℃反应条件时，反应时间为20～40min。
用于检测非洲猪瘟病毒的横向流动试纸条，包括非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物，特异性结合p72基因的茎环探针，核酸外切酶III，单链结合蛋白，横向流动试纸条；所述茎环探针的核苷酸序列为5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’，茎环探针有两种标记方式，一种是茎环上标记FAM荧光基团，3’端标记生物素，另一种是茎环上标记生物素，3’端标记荧光基团。
进一步地，处于茎环上的第12位碱基T标记荧光基团或者生物素。
进一步地，茎环探针最佳用量为25～400nM；单链结合蛋白最佳用量为2.5～50ng。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)与TwistDx公司的RPA-exo或RPA-nfo试剂盒比较
a.RPA-exo或RPA-nfo所用探针需要进行四个碱基的修饰，本方法所用探针只需修饰两个碱基，降低成本；
b.RPA-exo或RPA-nfo试剂盒需要通过荧光读取设备完成检测，本方法无需特殊设备读取结果，在37℃或室温条件下，通过裸眼即可完成检测。
(2)与Exo III基于的靶向循环扩增检测技术比较
Exo III基于的靶向循环扩增检测技术常用于检测合成的靶标序列，在对病原体检测时，需要借助纳米材料或电化学材料等增强荧光信号。本方法无需特殊检测装置，在37℃或室温条件下，通过裸眼即可完成检测。
(3)与CRISPR基于的可视化检测技术比较
a.CRISPR基于的检测方法需要预先进行crRNA的体外转录和活性检测，本方法整个检测过程无RNA反应，无需进行体外转录；
b.Cas13基于的检测系统常出现RNase污染，RNase污染会切割RNAreporte导致结果出现错误的阳性或阴性，为了避免RNase污染，反应体系中需要添加RNase抑制剂，增加成本；本方法整个过程无RNA反应，无需考虑RNase污染，操作更简单，成本更低；
c.CRISPR基于的检测技术存在RNA反应，对储存和运输条件要求较高，本方法整个过程无RNA反应，便于储存和运输。
附图说明
图1：Exo III介导的可视化核酸检测方法示意图。
图2：裸眼评估探针活性。a，ASFV基因组示意图；b，茎环探针结构和序列，5’端标记的荧光基团ROX，第22位碱基标记淬灭基团BHQ2；c，裸眼评估探针敏感性；d，评估裸眼检测时探针最佳浓度。
图3：裸眼评估探针与靶标不同位置结合对方法灵敏性的影响。a，探针与靶标不同位置结合示意图；b，裸眼观察Exo III反应后颜色变化；c，图b对应的荧光强度值。
图4：裸眼评估探针与不同长度靶标结合对该方法灵敏性的影响。a，探针与不同长度靶标结合示意图；b，裸眼观察Exo III反应后颜色变化；c，图b对应的荧光强度值。
图5：裸眼评估该方法的特异性。a，利用ASFV临床样本，JEV、PDCoV、TGEV、PRRSV、PEDV、PRV的基因组和水作为扩增模板，裸眼评估特异性；b，图a对应的荧光强度值。
图6：裸眼评估该方法检测核酸的敏感性。a，裸眼观察不同浓度质粒检测后的颜色变化；b，图a对应的荧光强度值。
图7：裸眼评估该方法最佳反应时间。a，裸眼观察Exo III在37℃反应条件下，反应不同时间的颜色变化；b，图a对应的荧光强度值；c，裸眼观察Exo III在25℃反应条件下，反应不同时间的颜色变化；d，图c对应的荧光强度值。
图8：评估该方法通过横向流动试纸条检测(LFA)的探针最佳标记方式。a，茎环探针的不同标记方式；b，LFA检测探针的适用性；c，SSB对反应体系的优化。
图9：优化LFA反应体系。a，优化Exo III的反应时间；b，优化探针浓度；c，优化SSB质量。
图10：评估该方法通过LFA检测核酸的敏感性。NC，阴性对照，水作为扩增模板。
图11：该方法在检测ASFV临床样本中的应用。a，裸眼检测ASFV临床样本；b，图a对应的荧光强度；c，RT-qPCR检测ASFV临床样本；d，LFA检测ASFV临床样本。PC，阳性对照，扩增模板为PMD19-T-p72质粒；NC，阴性对照，扩增模板为水。
具体实施方式
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
序列：
P72-F:5’-TAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGG-3’；
P72-R:5’-AACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACC-3’；
Probe 1：5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’(第1位碱基A：ROX标记，第22位碱基T：BHQ2标记)；
Probe 2：5’-ACGATGAGTAGTTTTTCATCGTGGTGGTT-3’(第25位碱基T：FAM标记，第29位碱基T：Biotin标记)；
Probe 3：5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’(第12位碱基T：FAM标记，第29位碱基G：Biotin标记)；
Probe 4：5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’，(第12位碱基T：Biotin标记，第29位碱基G：FAM标记)；
P72-qPCR-F：5’-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3’；
P72-qPCR-R：5’-GATACCACAAGATCAGCCGTA-3’。
实施例1：Exo III介导的可视化核酸检测方法原理
首先，利用等温扩增技术(RPA)扩增病毒核酸；然后，Exo III剪切扩增子3’末端序列暴露单链DNA靶标，在茎环探针结合靶标后，Exo III能够剪切探针3’末端并释放荧光基团。最后，通过裸眼或横向流动试纸条可快速、灵敏地检测病毒核酸(图1)。
实施例2：裸眼评估靶向ASFV的茎环探针活性
在本实施例中，为了评估用于检测ASFV茎环探针的敏感性，我们任意设计了3个靶向p72基因的茎环探针：p72-1(Probe 1)，p72-2，p72-3。然后通过Exo III直接消化探针，最后通过观察颜色变化评估探针活性。具体过程如下：
10μL反应体系中，探针终浓度为20μM，10×NEbuffer 2为1μL，Exo III为30U(100,000U/mL)，补水到10μL。
混匀后置于37℃反应5min。结果显示，探针p72-1(Probe 1)在Exo III消化前后颜色变化不明显，探针p72-2和p72-3变化明显，故选择探针p72-1(Probe 1)用于后续试验。
为了进一步评估通过裸眼方式判别时，所需的探针浓度。通过利用质粒pMD19-T-p72作为RPA扩增模板，得到p72基因片段后，加入Exo III和探针p72-1(Probe 1)，最后观察颜色变化进行评估。具体过程如下：
(1)RPA反应：使用TwistDx生产的RPA试剂盒扩增p72基因。配置50μL反应液，其中缓冲液V为25μL，p72-PCR-F(10μM)和p72-PCR-R(10μM)引物各2μL，水17.5μL，乙酸镁2.5μL，pMD19-T-p72模板1ng。37℃金属浴反应20min。
(2)Exo III酶切反应：配置10μL反应体系，10×NEbuffer 2为1μL，RPA反应液6.5μL，探针分别加入终浓度为10μM，15μM和20μM，Exo III为30U(100,000U/mL)，补水至10μL，37℃反应10min后观察颜色变化。结果显示，探针终浓度在10～20μM时，均可通过裸眼进行检测(图2)。
实施例3：裸眼评估探针结合靶标不同位置和不同长度对灵敏性的影响
在本实施例中，为了评估探针与靶标不同位置结合对该方法灵敏性的影响，我们分别设计了探针与扩增子的5’端结合，中间结合和3’端结合，然后通过裸眼和荧光强度进行评估。裸眼评估具体操作过程与实施例2中的RPA反应，Exo III酶切体系相同，其中加入探针的终浓度为20μM。荧光强度通过多功能酶标仪进行检测，将Exo III反应液稀释20倍后通过多功能酶标仪(激发光576nm，发射光601nm)进行荧光值测定。结果显示，探针与靶标5’端结合时，颜色变化最明显，且荧光强度最大。与3’端结合时，颜色变化不明显，荧光强度最弱(图3)。这个结果说明，探针与靶标5’端结合时，该方法检测核酸更灵敏。
进一步，为了评估探针与不同长度靶标结合对该方法灵敏性的影响。我们分别扩增了三个不同长度的靶标(106bp，193bp，287bp)，在Exo III消化后，我们发现探针与三种长度的靶标结合不影响灵敏性(图4)。此过程的RPA反应和Exo III酶切体系与实施例2中相同。
实施例4：裸眼评估该方法的特异性
在本实施例中，为了评估该方法的特异性，我们分别从感染的细胞上清液中提取JEV、PDCoV、PRRSV、TGEV、PRV、PEDV病毒基因组作为检测模板，RNA被反转录成cDNA，ASFV临床样本为阳性对照，水为阴性对照。利用靶向ASFV的探针Probe-1进行检测，结果显示，该方法能特异性的区分ASFV，说明该方法的特异性较高(图5)。此过程的RPA反应和Exo III酶切体系与实施例2中相同。
实施例5：裸眼评估该方法检测核酸的敏感性
在本实施例中，为了进一步评估Exo III介导的可视化检测核酸方法的敏感性，我们扩增了ASFV的p72基因的部分片段并克隆到PMD19-T载体上，得到pMD19-T-p72质粒。把该质粒进行梯度稀释(2×108拷贝/微升、2×106拷贝/微升、2×104拷贝/微升、2×102拷贝/微升、2×100拷贝/微升)并分别作为RPA扩增模板，用水作为阴性对照。结果显示，裸眼检测的最低检测限度达到～2cpoies/μL(图6)。此过程的RPA反应和Exo III酶切体系与实施例2中相同。
实施例6：裸眼评估该方法的最佳反应时间
在本实施例中，分别评估Exo III在37℃和25℃条件下反应的最佳时间。设定37℃反应的时间点为5min，10min，20min，40min，25℃反应的时间点为10min，20min，40min，60min。结果显示，Exo III在37℃反应5min，25℃反应20min时即能通过裸眼进行区分。该方法的RPA反应时间为20min，因此，通过裸眼检测的最佳反应时间为37℃，25min；25℃，40min(图7)。此过程的RPA反应和Exo III酶切体系与实施例2中相同。
实施例7：评估该方法通过横向流动试纸条检测(LFA)时，茎环探针的最佳标记方式
在本实施中，为了评估茎环探针的最佳标记方式。我们设计了四种(Probe 1，Probe 2，Probe 3，Probe 4)标记方式(图8a)，然后分别通过LFA(TwistDx，#MILENIA01)检测探针的适用性。结果显示，Probe 3和Probe 4的检测带在阳性和阴性样本中差异明显，但在阴性样本中仍有较强信号的检测带(图8b)。为了能够明显的区分阳性和阴性样本，我们选择了Probe 3进一步优化LFA反应体系。通过加入单链结合蛋白(SSB)预处理探针，并失活SSB后能够显著降低阴性样本中检测带的信号强度(图8c)。此过程的RPA反应和Exo III反应与实施例2中相同。SSB预处理探针和失活体系如下：
10μL反应中，10x NEBuffer 4为1μL，探针(10μM)为0.7μL，SSB为2.5ng，补水至10μL，然后置于37℃反应。
然后，将反应液置于65℃反应20min进行失活。失活后吸取5μL加入Exo III反应体系中，10x NEBuffer 1为1μL，Exo III为30U(100,000U/mL)，RPA反应液为3.5μL，总共10μL反应液，然后置于37℃反应。在Exo III反应结束后，进行LFA反应。
实施例8：优化LFA的反应体系
在本实施例中，通过摸索Exo III反应时间、探针浓度和SSB含量系统优化LFA的反应体系。分别设定Exo III的反应时间为5min，10min，20min，40min，60min(图9a)；探针浓度分别为0nM，25nM，50nM，100nM，200nM，400nM(图9b)；SSB加入量分别为2.5ng，5.0ng，12.5ng，25ng，50ng(图9c)。结果显示，Exo III反应5min，探针浓度为25nM，SSB为2.5ng时通过LFA反应即能完成检测。此过程的RPA反应、Exo III反应和LFA反应与实施例7中相同。
实施例9：评估该方法通过LFA检测核酸的敏感性
在本实施例中，为了进一步评估该方法通过LFA检测核酸方法的敏感性，我们利用实施例5中的梯度稀释质粒进行评估。结果显示，LFA最低检测限度达到～2cpoies/μL(图10)。此过程的RPA反应、Exo III反应和LFA反应与实施例7中相同。
实施例10：该方法在检测ASFV临床样本中的应用
在本实施例中，为了进一步评估该方法在临床样本中的应用。我们收集了18个ASFV感染猪的粪便样本，并粗提取核酸用作扩增模板。并分别通过裸眼和LFA方法进行检测，结果显示裸眼和LFA均检测到3个相同的阳性样本。为了证实该检测方法的准确性，进一步利用RT-qPCR进行确认，结果与裸眼和LFA检测结果一致(图11)。RT-qPCR反应体系如下：20μL反应体系中，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)为10μL，p72-qPCR-F(5’-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3’)，p72-qPCR-R(5’-GATACCACAAGATCAGCCGTA-3’)各8μM，模板(临床样本核酸粗提物)5μL。反应程序：95℃，15min；95℃，10s，60℃，30s，共进行40个循环。使用CFX384 Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad,USA)进行荧光定量PCR检测。此过程的RPA反应、Exo III反应和LFA反应与实施例7中相同。

Claims (2)

1.用于裸眼检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，包括非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物，特异性结合p72基因的茎环探针，核酸外切酶III；所述茎环探针的核苷酸序列为5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’，茎环探针含有5’端标记的荧光基团和中间标记的淬灭基团，茎环探针用量为10~20 μM；所述非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物的序列为P72-F: 5’-TAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGG-3’，P72-R: 5’-AACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACC-3’； 核酸外切酶III反应时间为37℃反应条件时，反应时间为5~20 min，或者25℃反应条件时，反应时间为20~40 min。
2.用于检测非洲猪瘟病毒的横向流动试纸条，其特征在于，包括非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物，特异性结合p72基因的茎环探针，核酸外切酶III，单链结合蛋白，横向流动试纸条；所述非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物的序列为P72-F: 5’-TAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGG-3’ ，P72-R: 5’-AACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACC-3’；所述茎环探针的核苷酸序列为5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’，茎环探针有两种标记方式，一种是处于茎环上的第12位碱基T标记FAM荧光基团，3’端标记生物素，另一种是处于茎环上的第12位碱基T标记生物素，3’端标记FAM荧光基团，茎环探针用量为25~400 nM，单链结合蛋白用量为2.5~50 ng。
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