CN116574841B - 一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法 - Google Patents

一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多重病原菌检测技术领域，尤其涉及一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法。包括如下步骤：选择能够特异性扩增单一病原菌的特异性LAMP引物组；用LAMP引物标记序列分别标记每一种病原菌的LAMP引物组中的FIP引物，得到每一种病原菌的LAMP标记引物组；将每一种病原菌的LAMP标记引物组混合用于LAMP多重扩增；对LAMP多重扩增的产物非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割，释放荧光报告信号；(5)通过检测释放的荧光报告信息判定是否存在病原菌。本发明摆脱了CRISPR/Cas12a系统对CrRNA的高度依赖，实现了多重可视化检测。

Description

一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的 检测方法
技术领域
本发明涉及病原菌多重检测技术领域，尤其涉及一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法。
背景技术
近年来，CRISPR/Cas系统的兴起给新一代快速核酸检测带来了新思路，如SHERLOCK(cas13a)、DETECTR(cas12 or cas14)以及HOLMES(cas12)等。Cpf1-LAMP系统是一种基于CRISPR/Cas12a和环介导等温扩增技术(LAMP)的病原菌检测体系。Cpf1-LAMP系统是一种基于CRISPR/Cas12a和环介导等温扩增技术(LAMP)的病原菌检测体系。由于CrRNA的高度特异识别，CRISPR/Cas12a系统会对等温扩增产物进一步进行确认，并通过反式切割活性的激活将识别结果释放。便携式荧光阅读器或者侧向流动试纸条便可以实现不依赖昂贵仪器下完成对CRISPR/Cas12a系统释放信号的完美捕捉。也正因为LAMP和CRISPR/Cas12a系统的双重特异识别，Cpf1-LAMP具有很好的特异性，但这也让它很难实现高通量的多重检测。此外，传统的Cpf1-LAMP检测理念是根据不同的靶标基因序列来设计不同的CrRNA，因此要想采用传统的Cpf1-LAMP检测方法实现对多种病原菌的检测，就需要在检测不同的病原菌时重复设计CrRNA。
田间病害致病菌复杂多样，单一的靶标基因的精准识别无法反应田间病害的复杂情况。例如，甘蔗病害不仅种类繁多，致病菌更是复杂多样，常规检测针对单一的靶标很难对甘蔗病害做出准确的判断，多重靶标识别在甘蔗病害高通量检测中愈加重要。
因此，有必要提供一种病原菌多重、快速可视化检测技术。
发明内容
本发明提供了一种甘蔗病原菌多重、快速可视化检测技术(Cas-mCfLAMP)用于准确检测甘蔗梢腐病。Cas-mCfLAMP摆脱了CRISPR/Cas12a系统对高度特异的CrRNA的依赖，实现了多重可视化检测。此外，因其高灵敏度、高特异性和简易的操作流程降低了CRISPR/Cas12a系统在田间检测中的运行时间和成本，提高了甘蔗病原菌检测效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法，包括如下步骤：
(1)选择能够特异性扩增单一病原菌的特异性LAMP引物组；
(2)用LAMP引物标记序列分别标记每一种病原菌的LAMP引物组中的FIP引物，得到每一种病原菌的LAMP标记引物组；
(3)将每一种病原菌的LAMP标记引物组混合，用于LAMP多重扩增；
(4)对LAMP多重扩增的产物进行非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割，释放荧光报告信号；
(5)通过检测释放的荧光报告信息判定是否存在病原菌。
优选的，所述LAMP引物标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述LAMP引物标记序列标记于所述FIP引物的F1c区域和F2区域之间。
优选的，在步骤(4)释放的荧光报告信号体系中加入单链报告探针，借助交免疫胶体金试纸条实现可视化检测。
本发明还提供了一种基于所述检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括核酸提取试剂盒、LAMP标记引物组预混液、Lbcas12a-CrRNA预混液、保温装置、移液器、Hybri Detect缓冲液和免疫胶体金试纸条。
本发明还提供了一种利用所述试剂盒的多重病原菌的检测方法，包括如下步骤：
(1)用核酸提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA；
(2)将所述基因组DNA与LAMP标记引物组预混液混合进行LAMP扩增；
(3)在步骤(2)扩增结束后的产物加入Lbcas12a-CrRNA预混液进行CRISPR/Cas12a体外切割反应，释放荧光报告信号，然后加入Hybri Detect缓冲液，插入免疫胶体金试纸条进行可视化检测。
优选的，所述保温装置为可变温加热保温杯；所述移液器是在注射器的前端固定安装一个微量吸头得到的。
本发明还提供了一种所述的检测方法中用到的LAMP引物标记序列或LAMP标记引物组，所述LAMP引物标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述LAMP引物标记序列标记于所述FIP引物的F1c区域和F2区域之间。
本发明还提供了一种利用所述的LAMP引物标记序列或LAMP标记引物组进行病原菌多重检测的应用。
本发明还提供了一种所述的检测方法，或所述的试剂盒，或利用所述试剂盒的多重病原菌的检测方法，或所述的LAMP引物标记序列或LAMP标记引物组用于检测甘蔗病原菌的应用。
优选的，所述甘蔗病原菌包括甘蔗梢腐病原菌、甘蔗黑穗病原菌、甘蔗白条病原菌、甘蔗赤腐病原菌中一种或几种。
本发明建立了一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法，将其命名为Cas-mCfLAMP系统。本发明提供的Cas-mCfLAMP系统解除了传统Cpf1-LAMP技术对CrRNA的高度依赖，实现了非特异CrRNA的的多重可视化检测。其检测原理源自LAMP的茎环结构。具体如下：
LAMP常规的茎环形成过程中，4条基础引物(FIP、F3、BIP、B3)分别识别靶标序列中的6个特异区域(F3c、F2c、F1c、B1c、B2c、B3c)(图1b)。在65℃的反应体系中，模板DNA处在动态平衡的状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离变为单链。FIP引物的F2区段最先与模板DNA互补序列配对，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸合成互补链(图1c)。接下来F3引物与F3c序列互补，在Bst DNA聚合酶的作用下，一边置换之前FIP引物合成的DNA链，一边延伸合成与模板链完全互补的DNA。由FIP引物合成且被置换下来的单链DNA由于其5端存在互补的F1c和F1区段，于是发生自我碱基配对，形成茎环结构(图1d)。LAMP内引物(FIP、BIP)的构造是茎环形成的关键，常规的内引物FIP由两个引物区段决定(F1c和F2)(图1a)，本发明在F1c和F2中间添加一段标记序列(图1e)，该标记序列与CrRNA识别的序列一致(标记序列和CrRNA序列设计原则:一、标记序列和CrRNA序列保持一致。二、此序列不能在靶标序列中找到匹配序列，即对于靶标序列而言，标记序列必须是外源的、自己不含有的。)。当被标记的LAMP引物组完成LAMP反应扩增时，得到的LAMP产物茎环中将携带标记序列(图1h)，这意味着可以通过改变FIP引物实现对不同靶标基因的共同标记。
因此，本发明提供Cas-mCfLAMP系统在单一病害检测中，通过一次反应便可以检测多重致病菌，在多种病害检测中，无需重新制备特异的CrRNA，仅需更换LAMP引物便可以实现多种病害的检测。本发明提供的Cas-mCfLAMP系统的最低检测浓度低至30copies/μL。本发明CrRNA的设计标准并没有严格的标准，只要这个序列在靶标中不存在即可。
本发明还以甘蔗病害为例验证了其实用性。结果表明，其高度的特异性分别在甘蔗黑穗病、甘蔗白条病、甘蔗赤腐病的检测中得到了验证。
此外，本发明还构建了田间检测体系，无需专业的技术人员和昂贵的设备器械，便可以实现甘蔗病原菌的田间可视化检测。因其高灵敏度、高特异性和简易的操作流程降低了传统CRISPR/Cas12a系统在田间检测中的运行时间和成本，提高了原菌检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为LAMP扩增过程中茎环结构的形成原理及插入标记序列后形成的茎环结构。(a)常规FIP引物结构。(b)常规引物结合阶段。(c)常规LAMP第一条链形成。(d)LAMP常规茎环结构。(e)标记FIP引物结构。(f)标记引物结合阶段。(g)标记LAMP第一条链形成。(h)LAMP标记茎环结构。
图2为实施例1中标记LAMP可行性分析结果。(a)CNO-1的LAMP常规引物组和标记引物组琼脂糖凝胶电泳结果，YN41为阴性对照，ddH2O为空白对照。(b)CNO-1的LAMP常规引物组和标记引物组反应40min实时荧光检测曲线，NTC1为常规引物组的空白对照，NTC2为标记引物组的空白对照，空白对照组，模板为无酶水，横坐标为反应时间，纵坐标为荧光强度，任意单位(ArbitraryUnit，AU)，数据为平均值±标准差，三次重复。(c)CNO-1常规LAMP产物和标记LAMP产物钙黄绿素显色(上图)和SYBR Green I显色(下图)。(d)CNO-1常规LAMP产物和标记LAMP产物在CRISPR/Cas12a中体外反应60min荧光检测，横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度，任意单位(ArbitraryUnit，AU)，数据为平均值±标准差，三次重复。
图3为实施例1中标记LAMP的灵敏度评估结果(T1-T10分别表示模板浓度为3×109,3×108,3×107,3×106,3×105,3×104,3×103,3×102,3×101,3×100copies/μL)。(a)标记LAMP 10倍逐级稀释模板琼脂糖凝胶电泳。(b)PCR 10倍逐级稀释模板琼脂糖凝胶电泳。(c)qPCR 10倍逐级稀释模板琼脂糖凝胶电泳，横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度，任意单位(Arbitrary Unit，AU)。(d)qPCR标准曲线，横坐标表示逐级梯度稀释后的浓度模板(取对数表示)，纵坐标表示ct值。
图4为实施例1中标记LAMP特异性评估。(abc)分别为raxB1、OPE-01和Ss-ITS的常规引物和标记引物LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，NTC1为常规引物阴性对照。NTC2为标记引物阴性对照。(def)分别为raxB1、OPE-01和Ss-ITS的常规引物和标记引物LAMP扩增产物的钙黄绿素(上图)和SYBR Green I(下图)显色结果，NTC1为常规引物阴性对照。NTC2为标记引物阴性对照。(ghi)分别以raxB1、OPE-01和Ss-ITS LAMP扩增产物在CRISPR/Cas12a中体外反应60min荧光检测，NTC1为常规引物阴性对照，NTC2为标记引物阴性对照，横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度，任意单位(ArbitraryUnit，AU)，数据为平均值±标准差，三次重复。
图5为实施例1中多重LAMP体系构建。(a)多重LAMP产物琼脂糖凝胶电泳结果。(b)多重LAMP产物钙黄绿素和SYBR Green I显色结果。(c)多重LAMP产物在CRISPR/Cas12a中体外反应60min荧光检测，横坐标为不同的LAMP产物模板，纵坐标为最终荧光强度，任意单位(Arbitrary Unit，AU)，数据为平均值±标准差，三次重复。
图6为实施例1中Cas-mCfLAMP的检测原理及实验室条件下的检测结果。(a)CNO-1和YN41的基因组DNA示意图。(b)CNO-1和YN41的标记引物分别结合识别位点示意图。(c)标记LAMP合成携带标记的茎环产物。(d)CrRNA-Cas12a复合体识别靶标序列并行使其切割活性的示意图。(e)通过荧光检测判断CrRNA-Cas12a复合体识别的结果。(f)免疫胶体金试纸条条带产生原理。(g)实验室条件下Cas-mCfLAMP检测，S1模板为CNO-1的标记LAMP扩增产物，S2模板为YN41的标记LAMP扩增产物，S3模板为无酶水的空白对照。
图7为实施例2构建的田间可视化检测平台及其检测流程。(a)田间可视化检测平台的检测流程。(b)试纸条田间可视化结果。(c)自制的简易移液器。(d)田间可视化检测平台，包括所需用的器材及预混液。
图8为实施例2中梢腐病田间样品检测结构。(a)15个待检测样品，其中S1为组培脱毒苗作为阴性对照，其余14个样品均为疑似感染梢腐病样品。(b)免疫胶体金试纸条检测结果。(c)Cas-mCfLAMP对15个样品检测结果。(d)病原菌CNO-1检测结果，阳性对照(PC)模板为CNO-1基因组DNA，空白对照(NTC)模板为无酶水。(e)病原菌YN41检测结果，阳性对照(PC)模板为YN41基因组DNA，空白对照(NTC)模板为无酶水。(f)PCR对15个样品检测结果汇总。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以甘蔗梢腐病为例对本发明提供的Cas-mCfLAMP系统进行验证。
1菌株及核酸提取
甘蔗梢腐病(Pokkah Boeng disease)的病原菌CNO-1和YN41均由广西大学提供。
将菌株CNO-1和YN41分别在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上活化，在真菌培养箱中28℃黑暗培养7天，将菌丝挑入2.0mL无菌离心管中，液氮预冷后在匀浆仪中研磨60秒，再利用真菌DNA提取试剂盒(索莱宝，北京)提取CNO-1和YN41的基因组DNA，将提取好的DNA在分光光度计NanoDrop Lite当中检测其浓度和质量，并保存与-20℃冰箱以备后用。
2相关引物、CrRNA和探针制备
通过比对CNO-1和YN41的蛋白质序列，分别得到38个YN41的特异性基因和40个CNO-1的特异性基因(表1)，选取YN41的特异性基因YN41|FPRO_06925(核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示)，CNO-1特异性基因CNO1|FSAC_13368(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)作为分别检测YN41和CNO-1的靶标基因。针对两个靶标序列设计其LAMP引物(见表2)。同时委托广州博徕斯生物科技有限公司合成CrRNA。在表2所提供的LAMP引物中，内引物FIP由两个引物区域(F1c、F2)串联形成的，将合成的标记序列插入到常规FIP引物的F1c区域与F2区域之间，得到标记FIP引物(表2中的CNO-1-FIP-L和YN41-FIP-L)。所有引物送至北京擎科生物有限公司合成(PAGE纯化)。
表1CNO-1和YN41特异性序列
表2用于CNO-1和YN41 LAMP扩增反应的常规引物和标记FIP引物
如序列4～17所示。
3标记FIP引物的可行性分析
为了验证标记FIP引物是否可行，对CNO-1菌的常规的FIP引物和标记FIP引物分别进行LAMP反应并设立相应的阴性对照(YN41)和空白对照(ddH2O)以防止非特异扩增导致的假阳性对实验结果的干扰。
LAMP反应体系(25μL)按照New England Biolabs(https://www.neb.cn/protocols/2014/12/29/typical-lamp-protocol-m0538)的建议进行配置。具体如下表3。
表3 LAMP反应体系
Component 25μl Reaction Final Conc
10X Isothermal Amplification Buffer 2.5μl 1X(contains 2mM MgSO4)
MgSO4(100mM) 1.5μl 6mM(8mM total)
dNTP Mix(10mM) 3.5μl 1.4mM each
FIP(或FIP-L)/BIP Primers(25X) 1μl 1.6μM
F3/B3 Primers(25X) 1μl 0.2μM
LoopF/B Primers(25X) 1μl 0.4μM
Bst 2.0 DNA Polymerase(8,000U/ml) 1μl 320U/ml
DNA Sample 2.5μl >30copies ormore
Nuclease-free Water to25μl /
Total Reaction Volume / 25μl
上述反应体系，在65℃条件下反应30min，将反应后的LAMP产物在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳。
此外，选择钙黄绿素(25×)(荣研生物科技有限公司，北京)作为LAMP反应的指示剂时，要与MnCl2合用，上述25μL反应体系中，钙黄绿素和MnCl2的终浓度分别是20μM和0.5μM。结果：反应前混合液是橙色，反应后发生扩增的阳性管在365nm紫外线照射下呈现出绿色荧光，未发生扩增的颜色较暗，为橙黄色。选择SYBR Green I显色时，需将10000×的SYBRGreen I原液(索莱宝)稀释10倍使用。为了避免染料对LAMP反应的抑制作用，将1μLSYBRGreen I稀释液加到反应的管盖上，反应结束后与产物涡旋混匀，发生扩增的阳性管发出强烈的荧光绿，未发生扩增的阴性管则保持染料的橙黄色不变。
上述实时荧光LAMP体系(25μL)在保证原来组分终浓度不变的前提下添加1μL Evagreen(20×)(Biotium，美国)。将预混液置于qPCR仪(LightCycler96，Roche)在65℃的条件下进行荧光信号采集，采集通道为SYBR Green I，每60s采集一次荧光数据，共60min，形成LAMP实时荧光扩增曲线，最后85℃反应10min，使Bst 2.0DNA聚合酶灭活。
结果
LAMP产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示常规的FIP引物组和被标记的FIP引物组都发生了正常的扩增反应(图2a)。常规的LAMP产物和被标记LAMP产物在钙黄绿素染色下都有强绿色荧光，而阴性对照和空白对照都呈浅橘色；SYBR Gree I染色结果与此保持一致(图2c)。实时荧光LAMP结果显示被标记的LAMP产物会比常规的LAMP产物晚一些达到荧光峰值，但是两组引物的LAMP扩增反应都能在30min内达到顶峰，而且被标记的LAMP产物的荧光最大值要大于常规LAMP产物的荧光最大值，推测可能是因为被标记的引物FIP要长于常规的FIP引物，在此基础上被标记的LAMP反应扩增的产物量整体大于常规引物扩增的产物量(图2b)。总的来说，标记LAMP和常规LAMP都能够顺利完成扩增反应。表明本发明的标记FIP引物是可行的。
对上述LAMP常规扩增产物和标记扩增产物进行CRISPR/cas12a体外切割。
Lbcas12a反式切割测定体系(1μL浓度为1μM的Lbcas12a(购于NEB)、1μL浓度为10μM的CrRNA(购于广州博徕斯生物科技股份有限公司)和2μL 10X NEBufferr2.1 ReactionBuffer在37℃反应10分钟。反应完毕后加入1μL ssDNA荧光报告分子、2.5μL LAMP产物，无酶水(12.5μL)补足20μL)将预混液置于qPCR仪(LightCycler96，Roche)进行荧光信号采集，采集通道为FAM，采集程序为两步循环法，37℃10秒，37℃10秒(此阶段采集荧光信号)，90个循环。
反应结束后实时荧光扩增曲线如图2d所示，对形成的实时荧光扩增曲线进行分析，发现常规FIP引物组和被记FIP引物组虽然在上述检测过程中都能发生扩增反应，但是在CRISPR/cas12a体外切割反应中，只有被标记的LAMP扩增反应得到的产物能够被CRISPR/Cas12a系统检测到并激活其反式切割活性，将体系中的单链荧光报告分子切断从而被qPCR仪捕获到荧光信号。显然这是因为标记LAMP产物茎环中的标记序列被cas12a蛋白所特异性识别，从而行使其无差别的切割活性释放荧光报告信号。
4标记LAMP灵敏度评估
为了评估被标记的LAMP与常规PCR、qPCR的灵敏度，需要构建标准质粒。将CNO-1中的特异基因TEF-1α(genbank：MK829752.1)克隆到18-T载体(pMDTM 18-TVector CloningKit)，然后转化到大肠杆菌DH5α细胞中。使用天根质粒试小提剂盒(中国北京天根生物科技有限公司)提取构建好的质粒。
将提取好的质粒在Nanodrop Lite中进行浓度测定，将其换算为质粒拷贝数(Nc＝(6.02×1023)×(Cp×10-9)/(Ln×660)，Nc为目的基因的拷贝数，单位为copies/μL；Cp为质粒浓度，单位为ng/μL；Ln为插入载体的基因的长度，单位为bp)，并用无酶水进行连续的10倍梯度稀释作为灵敏度检测的模板，质粒DNA的相应浓度为3×109、3×108、3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100(分别用编号T1～T10表示，单位为copies/μL)。(T1到T10浓度依次3×109、3×108、3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100(copies/μL))。将稀释好的梯度模板分别进行PCR反应、qPCR反应和LAMP反应(各反应所用引物见表4)并比较各自的最低检测限度。使用双蒸水作为空白对照组。
表4用于灵敏度检测的引物
结果
标记LAMP反应产物琼脂糖凝胶电泳结果显示(图3a)，T9泳道有淡淡的梯状条带，T10则不见条带，这表明标记LAMP的检测最低限度为30copies/μL(T9)。同样的模板进行PCR反应，产物在琼脂糖凝胶电泳中被分离，结果表明，当模板浓度为3×104copies/μL时，目的条带较微弱，当模板浓度为3×103copies/μL时无条带，显示PCR的最低检测浓度为3×104copies/μL(T6)(图3b)。qPCR仪检测浓度梯度模板时，以添加不同梯度浓度质粒的拷贝数(取对数)为横坐标，Ct值为纵坐标，得到标准曲线(Y＝-3.355*X+41.82，R2＝0.9988)(图3d)。当模板浓度为300copies/μL(T8)时，标准曲线相关性良好，这表明qPCR仪的最低检测限度为300copies/μL(T8)(图3c)。显然，标记LAMP在检测中的灵敏度30copies/μL(T9)远高于普通PCR的3×104copies/μL(T6)和qPCR的300copies/μL(T8)。
5标记LAMP特异性评估
为了探究标记LAMP在其他甘蔗病原菌中的适用性，本发明分别对甘蔗白条病、甘蔗赤腐病、甘蔗黑穗病的病原菌进行了特异性检测。
分别选择甘蔗白条病病原菌Xanthomonas albilineans(Ashby)Dowson的特异基因raxB1，甘蔗赤腐病的病原菌Colletotrichumfalcatum Went的特异基因OPE-01，甘蔗黑穗病病原菌Sporisorium scitamineum的ITS序列，作为检测的靶标基因，并且设计了相应的标记LAMP引物(表5)。甘蔗黑穗病(Sugarcane smut disease)的病原菌Sporisoriumscitamineum、甘蔗白条病(Sugarcane leafscald)的病原菌Xanthomonas albilineans(Ashby)Dowson、甘蔗赤腐病(Sugarcane red rot)的病原菌ColletotrichumfalcatumWent均由广西大学提供。
表5用于特异性检测的常规LAMP引物和标记FIP引物
如序列29～47所示。
分别提取三种病原菌的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，分别采用上述引物进行LAMP反应，反应体系参考表3，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，对产物进行钙黄绿素显色和SYBR Green I显色反应。CRISPR/cas12a体外切割反应中，三份扩增产物均使用同一条CrRNA(如SEQ ID NO：18所示)。
结果
琼脂糖凝胶电泳显示三种病菌的LAMP反应结果都正常，相应引物的阴性对照(非靶标模板)和空白对照(无酶水)都未能完成扩增(图4abc)，钙黄绿素和SYBR Green I显色反应都与琼脂糖凝胶电泳结果一致(图4def)。但在荧光信号检测时，三组实验都只有被标记的FIP引物组扩增出的LAMP产物能够将CRISPR/cas12a系统激活，并且行使其无差别的切割活性使得荧光报告探针被qPCR仪捕获到荧光信号(图4ghi)。对甘蔗白条病、甘蔗赤腐病、甘蔗黑穗病病原菌检测的结果出奇的一致，常规的引物和标记的引物都正常的完成了LAMP反应扩增，但常规的LAMP产物没有携带标记序列，无法通过CrRNA的二次识别，也就无法激活CRISPR/cas12a的切割活性。
6多重LAMP体系构建及优化
多重LAMP反应体系(25μL)，参见表3。在同一个反应体系中，同时加入了两个靶标基因的LAMP标记引物组(CNO-1和YN41 LAMP扩增反应的引物，参见表2)，为了保证各组引物的终浓度不变且体系保持25μL，使用100μM的FIP/BIP标记引物(终浓度0.2μM)。
构建好的多重LAMP体系进行LAMP来评估扩增结果。LAMP反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳、钙黄绿素显色和SYBR Green I显色来检验是否完成扩增。最后，对多重LAMP扩增产物进行CRISPR/cas12a体外切割反应并检测荧光信号。
结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示单一的CNO-1和YN41标记引物组正常的完成了LAMP扩增，而同时添加CNO-1和YN41的混合标记引物组同样也能完成LAMP扩增(图5a)。钙黄绿素显色和SYBR Green I显色结果与电泳结果保持一致，混合标记引物组除了阴性对照(ddH2O)都能观察到荧光(如图5b)。此外，以多重LAMP产物作为模板进行CRISPR/cas12a体外切割实验，qPCR仪荧光信号检测结果表明多重LAMP扩增的产物携带了标记序列，能够激活CRISPR/cas12a系统(如图5c)。
7实验室条件下的Cas-mCfLAMP检测
为了便于检测结果的可视化，本发明选用了一种商用的免疫胶体金试纸条(HybriDetect)。与荧光检测的荧光报告分子(SEQ ID NO：19)不同，试纸条检测需要在反应体系中添加一种5'端带有FAM修饰，3'端带有Biotin修饰的单链报告探针(序列如SEQ ID NO：48所示)。在试纸条上，生物素(Biotin)会被C线中的链霉亲和素(streptavidine)吸附，使得完整的单链报告探针携带着金共轭化合物(GNP)被固定到试纸条的控制线(C)，C线出现条带，测试线(T)则未有条带(此时结果为阴性)；而单链报告探针的断裂(因为cas12a反式切割活性，cas12a被激活后，会无差别的切割体系中的单链核苷酸，单链探针正是根据这种特性来行使报告的作用。)则会导致C线溢出的金共轭化合物的数量增加，并被T线吸附，此时T线处条带增强，C线的强度降低(图6f)。因此，可以通过观察试纸条对检测样本是否为阳性做出可视化的判断。
报告探针的使用量参照其购买说明书。试纸条的检测在体外切割反应完成后添加80μL HybriDetect缓冲液到反应体系中，然后插入试纸条，被切割的单链报告探针因为其两端的修饰会被分别的结合到试纸条的两条线(C线和T线)上，通过观察试纸条的检测线，即可对检测样本是否为阳性做出判断。
具体检测原理为：本发明的Cas-mCfLAMP检测以多重标记LAMP为基础，CNO-1和YN41的基因组DNA同时存在一个反应体系中时(图6a)，这个反应体系也包含了两个靶标基因所对应的各自的LAMP引物组，不同的引物组中FIP引物都被一段相同的序列所标记(图6b)，在两个靶标基因完成LAMP扩增反应后，不同靶标的LAMP产物都将携带这一段相同的序列，这段序列刚好能被CrRNA(如SEQ ID NO:18所示)特异性识别，这使得体系中只要存在两个靶标基因中的任何一个或两个，扩增反应便会发生，且反应的产物都能够被cas12a蛋白所特异性识别并触发其反式切割活性，使得报告信号被释放(图6cd)。当体系中的单链报告探针为荧光探针时(5'-FAM-TTATTATTATT-BHQ1-3')，可以通过检测荧光信号来判断检测结果，得到荧光扩增曲线(图6e)。为了实现田间检测，本发明在体系中加入生物素标记的单链报告探针(5'-FAM-TTTTTTTTTT-Biotin-3')，通过侧向流动试纸条进行田间可视化检测。
在实验室的条件下对甘蔗梢腐病的两个病原菌CNO-1和YN41进行Cas-mCfLAMP检测，三组实验都使用相同的混合标记引物组预混液，预混液包含“预混液包含：
0.5μL浓度为10μM的CNO-1-F3引物
0.5μL浓度为10μM的CNO-1-B3引物
1μL浓度为10μM的CNO-1-LF引物
1μL浓度为10μM的CNO-1-LB引物
0.4μL浓度为100μM的CNO-1-FIP-L引物
0.4μL浓度为100μM的CNO-1-BIP引物
0.5μL浓度为10μM的YN41-F3引物
0.5μL浓度为10μM的YN41-B3引物
1μL浓度为10μM的YN41-LF引物
1μL浓度为10μM的YN41-LB引物
0.4μL浓度为100μM的YN41-FIP-L引物
0.4μL浓度为100μM的YN41-BIP引物
1.5μL浓度为25mM的dNTPs(上海生工购买)
1.5μL浓度为100mM的MgSO4(购于NEB)
1μL Bst 2.0链置换DNA聚合酶(购于NEB)
2.5μL 10×IsothermalAmplificationBuffer(购于NEB)
8.4μL无酶水
总体积：22.5μL(后面加上模板2.5μL，共25μL)”
当模板为CNO-1和YN41的基因组DNA时，试纸条T线出现条带，显示阳性结果。当模板为无酶水时，试纸条C线出现条带，而T线无条带，显示阴性结果(图6g)。显然，不管是CNO-1还是YN41，都能够被同一套预混液所特异性识别，这意味着在甘蔗梢腐病检测时，Cas-mCfLAMP无需对CNO-1和YN41两个菌株单独检测，仅需要一次反应，便可以对甘蔗是否患梢腐病做出准确判断。
实验例2
为了摆脱检测技术对实验室昂贵仪器的依赖，实现田间多重快速检测，本发明提供了一种简易的田间可视化检测平台或反应装置(图7d)。LAMP扩增所需的模板核酸由核酸释放剂提取。
固体核酸释放剂购买于北京天恩泽基因科技有限公司。使用方法为：将待检测甘蔗叶片2mg放入含有100μL的核酸释放剂的1.5mL离心管中，常温裂解5min即可得到可供PCR扩增级别的模板核酸。
LAMP反应的孵育环境由可变加热保温杯提供(苏泊尔)。简易的移液装置是在10mL的注射器(广西大学提供)前端安装一个10μL的吸头(Axygen)，为了保证移液时注射器和吸头之间的密封性，需要提前用火烤装置的接头部位，使其紧密结合(图7c)。
在田间检测中，取下一片甘蔗叶片，将其放入核酸提取液中(1号管为100μL核酸提取剂(购于北京天恩泽基因科技有限公司))裂解5min，用简易的移液装置转移2.5μL(吸头刻度处)到LAMP标记引物预混液(组成同实施例1)中(2号管为22.5μL LAMP反应预混液)，将2号管放入保温杯中65℃反应30min，反应完后转移2.5μL产物到提前螯合好的Lbcas12a-CrRNA预混液(1μL浓度为1μM的Lbcas12a(NEB)、1μL浓度为10μM的CrRNA(购于广州博徕斯生物科技股份有限公司)和2μL 10XNEBuffer r2.1 Reaction Buffer在37℃反应10分钟。反应完毕后加入1μL浓度为10μM的生物素报告探针，再加入12.5μL无酶水，Lbcas12a-CrRNA预混液预混液便制备完成。体积为17.5μL(加上后面2.5μL的LAMP产物共20μL))中(3号管)并置于保温杯中，保温杯温度调至37℃，反应20min。体外切割完后，用移液装置将4号管中的80μL HybriDetect缓冲液全部转移到体外切割反应体系中(3号管为17.5μL的Lbcas12a-CrRNA预混液)(整个流程如图7a所示)。将免疫胶体金试纸条放入3号管中，3min后目视读数(图7b)。根据试纸条T线是否出现条带确定检测样本的感病情况。
为了评估Cas-mCfLAMP在田间检测的适用性，本发明在广西大学标本园采取了14株疑似感染甘蔗梢腐病的甘蔗叶片(S2-S15)进行Cas-PfLAMP检测，以甘蔗组培脱毒苗(广西大学提供)作为阴性对照(S1)。同时提取15个甘蔗样品的核酸(固体核酸释放剂购买于北京天恩泽基因科技有限公司。使用方法为：将待检测甘蔗叶片2mg放入含有100μL的核酸释放剂的1.5mL离心管中，常温裂解5min即可得到可供PCR扩增级别的模板核酸)，以此作为模板进行梢腐病两种致病菌CNO-1和YN41的常规PCR检测(引物见表6)
表6常规PCR扩增的引物
结果
PCR检测结果与Cas-mCfLAMP检测结果进行比较以评估本工作的性能。NTC代表空白对照组，PC代表阳性对照组。
结果：本发明对14个疑似感染梢腐病的样品和1个组培脱毒苗进行梢腐病检测的Cas-mCfLAMP检测结果显示S1为阴性，其余14个样品均为感染梢腐病(图8b)。CNO-1的PCR结果显示S1、S5、S10为阴性，即未检测到CNO-1的存在，其余12个样品均检测到了CNO-1的存在(图8d)。YN41的PCR结果显示S4、S5、S8、S10、S13检测到了YN41的存在，其他10个样品均未检测到YN41的存在(图8e)。
综合CNO-1和YN41的PCR结果(即只要存在两者中的一个或两个菌株即被认为感染梢腐病)，判定15个样品中，S1未感染梢腐病，其余14个样品均感染了梢腐病(图8f)，这个结果与Cas-mCfLAMP检测的结果一致(图8c)。
可见，田间样品的检测显示了Cas-mCfLAMP的优异性能，相比于常规的PCR检测，Cas-mCfLAMP表现出高特异、高灵敏且简易高效。
由以上实施例可知，传统的Cpf1-LAMP检测理念是根据不同的靶标基因序列来设计不同的CrRNA，本发明的Cas-mCfLAMP系统则是通过标记LAMP内引物FIP，将既定的CrRNA识别序列通过LAMP扩增引入到扩增产物的茎环中。以常规LAMP引物组为对照和被标记的LAMP引物组对比分析，发现内引物FIP的标记，会导致LAMP反应的发生推迟5min左右，但在反应30min后，荧光值都能达到最高，且实验组的荧光强度会大于对照组，证明了在LAMP产物的标记并不会影响LAMP反应的发生。
在性能评估中，发现本发明的Cas-mCfLAMP系统最低能够检测到至30copies/μL的靶标基因，灵敏度远高于普通PCR(3000copies/μL)、qPCR(300copies/μL)，并分别在甘蔗黑穗病、甘蔗白条病、甘蔗赤腐病中证明了其高度的特异性。为了实现多重靶标基因的一次性检测，本发明构建并优化了多重LAMP反应体系，在LAMP反应体系中，两个引物组(被标记)分别识别靶标基因并完成扩增反应，反应结束的LAMP产物都将携带CrRNA的识别序列，这意味着体系中只要存在任何一个或者两个靶标基因，产物都能被Cas12a-CrRNA复合体精准识别并激活其正式和反式切割活性，从而无差别的切割体系中的报告探针。
为了能实现田间检测，本发明构建了田间检测平台，并选用了一种商用的免疫胶体金侧向流动试纸条，被切割的标记单链报告探针在侧向流动试纸条中分别被T线和C线捕获，从而将结果可视化。在田间样品适用性检测中，没有任何相关技术背景的人员也可以在60min内完成对15个样品的病害准确检测，无需任何样品纯化，这比传统的PCR和qPCR检测病害的时间要短、操作要简易。
本发明提供的Cas-mCfLAMP系统解除了Cpf1-LAMP对CrRNA的高度依赖，这不仅意味着多重检测的实现，更大意义在于仅需更换LAMP引物便可以对各种病害使用同一套CRISPR/Cas12a系统，无需重新制备特异的CrRNA，这对于田间病害高通量检测来说具有重大意义。
总的来说，本发明提供了一种甘蔗病原菌检测的新方法Cas-mCfLAMP，Cas-mCfLAMP突破了传统Cpf1-LAMP检测方法对特异性CrRNA序列的依赖性，实现了多重靶标基因的一次性检测，降低了Cpf1-LAMP在植物病原菌检测领域的检测成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）选择能够特异性扩增单一病原菌的特异性LAMP引物组；
（2）用LAMP引物标记序列分别标记每一种病原菌的LAMP引物组中的FIP引物，得到每一种病原菌的LAMP标记引物组；
（3）将每一种病原菌的LAMP标记引物组混合，用于LAMP多重扩增；
（4）对LAMP多重扩增的产物进行非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割，释放荧光报告信号；
（5）通过检测释放的荧光报告信息判定是否存在病原菌；
步骤（2）所述LAMP引物标记序列标记于所述FIP引物的F1c区域和F2区域之间；
步骤（2）所述LAMP引物标记序列5，端具有PAM位点；
标记序列和CrRNA序列设计原则：
一、标记序列与5，端添加了PAM位点的CrRNA序列的Guide sequence保持一致；
二、此序列不能在靶标序列中找到匹配序列，即对于靶标序列而言，标记序列必须是外源的、自己不含有的；
所述病原菌为甘蔗病原菌。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP引物标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，在步骤（4）释放的荧光报告信号体系中加入单链报告探针，借助免疫胶体金试纸条实现可视化检测。
4.一种基于权利要求1~3任一项所述检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂盒、LAMP标记引物组预混液、Lbcas12a-CrRNA预混液、保温装置、移液器、Hybri Detect缓冲液和免疫胶体金试纸条。
5.一种利用权利要求4所述试剂盒的多重病原菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）用核酸提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA；
（2）将所述基因组DNA与LAMP标记引物组预混液混合进行LAMP扩增；
（3）在步骤（2）扩增结束后的产物加入Lbcas12a-CrRNA预混液进行CRISPR/Cas12a体外切割反应，释放荧光报告信号，然后加入Hybri Detect缓冲液，插入免疫胶体金试纸进行可视化检测；所述病原菌为甘蔗病原菌。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述保温装置为可变温加热保温杯；所述移液器是在注射器的前端固定安装一个微量吸头得到的。
7.一种权利要求1所述的检测方法中用到的LAMP标记引物组，其特征在于，所述LAMP引物标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述LAMP引物标记序列标记于所述FIP引物的F1c区域和F2区域之间。
8.一种利用权利要求7所述的LAMP标记引物组进行病原菌多重检测的应用；所述病原菌为甘蔗病原菌。
9.一种权利要求1~3任一项所述的检测方法，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5或6所述的检测方法，或权利要求7所述的LAMP标记引物组用于检测甘蔗病原菌的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述甘蔗病原菌包括甘蔗梢腐病原菌、甘蔗黑穗病原菌、甘蔗白条病原菌、甘蔗赤腐病原菌中一种或几种。
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