CN113388691A - 一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a的核酸检测方法及应用。本方法通过在PCR上游引物的5’端或者下游引物的3’端修饰前间区序列邻近基序(PAM)序列，以实现可以用基于CRISPR‑Cas12a的方法检测任意核酸片段，即使目的片段中不含PAM序列。所述核酸检测平台可用于鉴定鼻疽诺卡菌，具有检测简单、方便、特异性高的特点。

Description

一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法及应用

技术领域

本发明公开了一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

由规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas蛋白)组成的CRISPR-Cas系统被认为是古菌和细菌的适应性免疫系统。CRISPR-Cas系统不仅应用于基因编辑，而且成为核酸检测的一种有吸引力的工具，显示了下一代分子诊断方法的巨大潜力。2018年，Chen等人报道了他们的发现，当Cas12a蛋白以序列特异的方式切割双链DNA(dsDNA)时，诱导了强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割。研究人员利用Cas12a蛋白的反式切割活性建立了DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans–Reporter)检测方法，该方法能够检测临床标本中与癌症相关的HPV 16型和18型。然而，Cas12a蛋白反式切割活性的释放依赖于靶标序列上的前间区序列邻近基序(PAM)序列(TTTN)，即只有当其识别到PAM序列时，才能发挥反式切割活性。由于要检测的靶标序列不一定含有合适的PAM序列，这因此限制了CRISPR-Cas12a在核酸检测中的应用。

诺卡菌病是由诺卡菌属细菌引起的一种疾病，通常包括急性或慢性肺部感染。诺卡菌病通常是由吸入或皮肤黏膜损伤感染诺卡菌而造成的，是一种罕见的感染，严重者可能危及生命。诺卡菌病的症状与肺结核相似，如发烧、咳嗽和胸痛。鼻疽诺卡菌(Nocardiafarcinica,N.farcinica)是引起诺卡菌病最常见的病原之一，其与分枝杆菌在形态学上极为相似，容易混淆，从而导致误诊。对于许多诺卡菌病患者来说，误诊或可导致疾病的延误和错误治疗，从而提高了病死率。此外，诺卡菌暂无合适的选择性培养基，因此分离培养所需时间长(2～14天)，易造成延误治疗。基于现有技术存在的问题，本技术领域迫切需要一种充分应用CRISPR-Cas12a技术，能够简便、快速、准确地检测核酸标本的方法，进而需要一种应用该方法原理检测鼻疽诺卡菌核酸的方法。

发明内容

基于现有技术存在的问题，本发明的目的就是建立一种新的基于CRISPR-Cas12a的核酸检测方法，命名为CRISPR-Pa(CRISPR/Cas12a combined PCR amplification)。该方法将聚合酶链扩增反应(PCR)与CRISPR-Cas12a检测相结合，通过在聚合酶链扩增反应的上游扩增引物5’端或者下游引物的3’端修饰PAM序列(TTTA)，并在其上添加一个A碱基对PAM序列进行保护，以实现可以检测任意序列的目的。CRISPR-Pa作为一种新的核酸检测方法，将能够广泛应用于生物相关领域，实现核酸的快速扩增和检测。

基于上述目的，本发明首先提供了一种基于非诊断目的应用CRISPR-Cas12a技术检测核酸的方法，所述方法包括以下步骤

(1)以样本中的核酸作为模板进行聚合酶链扩增反应，其中，所述聚合酶链扩增反应使用的上游引物的5’端或者下游引物的3’端加入了PAM位点的修饰；

(2)使用步骤(1)获取的聚合酶链扩增反应产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

在一个优选的技术方案中，步骤(1)所述的PAM位点的修饰序列如SEQ ID NO.1所示。

其次，在本发明中，鼻疽诺卡菌被用作一种模型菌，用于证明CRISPR-Pa方法的可行性。本发明建立针对鼻疽诺卡菌的CRISPR-Pa检测技术，并提供了一种检测鼻疽诺卡菌gyrA基因的核酸分子组合。

在一个优选的技术方案中，步骤(2)所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.5所示。

在另一个优选的技术方案中，所述聚合酶链扩增反应的上游引物的序列含有SEQID NO.2所示的序列，所述聚合酶链扩增反应的下游引物的序列含有SEQ ID NO.3所示的序列，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.4所示。

更为优选地，所述聚合酶链扩增反应的上游引物的序列由SEQ ID NO.2所示，所述聚合酶链扩增反应的下游引物的序列由SEQ ID NO.3所示。

在一个优选的技术方案中，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为61-73℃。

在一个更为优选的技术方案中，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为69℃。

最后，本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术的核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括crRNA分子、Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及用于聚合酶链扩增反应的上游引物和下游引物，其中，在所述上游引物的5’端或者下游引物的3’端加入了PAM位点的修饰。

在一个优选的技术方案中，所述试剂盒用于检测鼻疽诺卡菌gyrA基因，其中，聚合酶链扩增反应的上游引物的序列由SEQ ID NO.2所示，所述聚合酶链扩增反应的下游引物的序列由SEQ ID NO.3所示，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.4所示。

在一个优选的技术方案中，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供的CRISPR-Pa方法通过在聚合酶链扩增反应上游引物的5’端修饰前间区序列邻近基序(PAM)序列，以实现可以用基于CRISPR-Cas12a的方法检测任意核酸片段，即使目的片段中不含PAM序列。所述核酸检测平台可用于鉴定鼻疽诺卡菌，具有检测简单、方便、特异性高的特点。在应用于鼻疽诺卡菌gyrA基因的CRISPR-Pa检测体系时，对于纯培养细菌的检测下限为1pg的模板DNA。在应用于模拟痰标本检测时，鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测方法和传统的细菌培养方法对于鼻疽诺卡菌的检测下限均为10⁵CFU/ml，但CRISPR-Pa法可在90分钟内完成检测，而培养法则需要至少6天时间。在对45株鼻疽诺卡菌(包括12株标准菌株和33株临床分离株)和14株常见的其他种属细菌的检测中，未出现假阴性和假阳性，显示出100％的特异性。

附图说明

图1为CRISPR-Pa系统工作流程图，整个CRISPR-Pa检测过程可以在90分钟内完成。

图2为CRISPR-Pa的检测原理示意图。第I部分中，PCR扩增后目标扩增子呈指数级增加。然后构建修饰引物引入的CRISPR-Cas12a识别位点(PAM)。在第II部分中，Cas12a蛋白与crRNA形成CRISPR-Cas12a/crRNA复合物。目标扩增子引导CRISPR-Cas12a/crRNA复合物非特异性地切割5’端由6-FAM修饰的单链报告分子。随后，通过剪切ssDNA释放荧光信号，用实时荧光定量PCR仪捕获荧光信号。

图3为鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测的引物和crRNA设计示意图。图中显示了部分gyrA基因正义链的核苷酸序列。引物设计位点以箭头线段标出，gRNA被框出。修饰的ATTTA位点以灰度背景框突出显示。

图4为鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测方法的可行性验证结果图。其中，(A)用2％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物，M代表DL 2000DNA标记，1和2分别代表鼻疽诺卡菌IFM 10152和去离子水；(B)CRISPR-Cas12a介导检测的荧光信号读出，鼻疽诺卡菌IFM 10152呈阳性，PCR阴性产物(以去离子水作为PCR模板)和空白对照(以去离子水代替PCR产物)均为阴性。

图5为鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测的敏感性结果图。1～9分别为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg模板DNA每反应和空白对照。

图6为2％琼脂糖凝胶电泳法测定鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa PCR扩增的最佳退火温度结果图。M代表DL 2000DNA标记。1-7代表分别在61℃、63℃、65℃、67℃、69℃、71℃、73℃退火的PCR产物。8-14代表1-7对应的阴性对照。

图7为鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测PCR扩增的最佳退火温度结果图。7条荧光曲线分别代表退火温度为61-73℃，以2℃为增量。阴性反应和空白对照均未检出。

图8为鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测的特异性结果图。1-45为45株鼻疽诺卡菌(包括12株标准株和33株临床株)。46-59代表14个非鼻疽诺卡菌。阳性对照为鼻疽诺卡菌标准菌株IFM 10152。阴性对照为PCR阴性产物(无菌去离子水作为PCR模板)。在CRISPR检测中，PCR产物以无菌去离子水代替作为空白对照。

图9为鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa方法在模拟痰标本中的应用。1-7分别代表模拟痰标本中鼻疽诺卡菌IFM 10152浓度为10⁶～1CFU/ml，稀释10倍为梯度。8为阴性痰标本。阴性对照和空白对照同上。

图10为含不同浓度鼻疽诺卡菌的模拟痰标本接种于血平板后的培养观察图。8块平板分别为：模拟痰标本中含鼻疽诺卡菌10⁶～1CFU/ml以及阴性痰标本对照。典型的鼻疽诺卡菌菌落被箭头指出并圈出。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实施例1.CRISPR-Pa方法的构建

本发明所公开的CRISPR-Pa的工作流程：

如图1所示，CRISPR-Pa平台包括以下三个步骤：1.样本前处理和DNA提取，约20分钟；2.PCR扩增，60分钟；3.基于CRISPR的荧光检测，10分钟。整个CRISPR-Pa的检测流程可在90分钟内完成。

本发明所公开的CRISPR-Pa的检测原理：

如图2所示，DNA提取后的检测过程分为两个步骤：1.采用PCR对目标序列进行指数级扩增。在PCR的退火阶段，修饰了PAM位点：ATTTA(SEQ ID NO:1)的上游引物和下游引物与模板DNA链结合，并在扩增阶段与模板DNA链一同复制。PCR扩增结束后，目标扩增子上游携带了ATTTA序列。2.在基于CRISPR的检测阶段，Cas12a蛋白首先与crRNA形成复合物(CRISPR-Cas12a/crRNA)，后将复合物加入到含有扩增子和修饰了荧光基团的单链DNA探针(5’-6-FAM-TATTAT-BHQ1-3’)的缓冲液中，在37℃环境下，CRISPR-Cas12a/crRNA复合物特异性识别目标扩增子的PAM序列，Cas12a蛋白的反式切割活性被激活，单链DNA探针被裂解，释放出荧光被荧光定量仪捕获。

本发明中所使用和涉及的试剂：

PCR反应体系混合物2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)购于宝生物工程(北京)有限公司。DNA提取试剂盒

Genomic DNA Purification Kit购于美国Promega公司。6×Loading Buffer和DL 2000DNA Marker购于宝生物工程(北京)有限公司。CRISPR反应缓冲液10×NEBuffer 2.1和Cas12a蛋白

Lba Cas12a(Cpf1)购于美国New EnglandBiolabs公司。其余试剂均为市售分析纯级产品。

本发明实验中所使用和涉及的主要仪器：

实时荧光定量仪QuantStudio 6Flex、PCR仪Veriti 96和分光光度计NanoDropND-1000为美国赛默飞公司产品。电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品。凝胶成像系统Bio-Rad Gel Dox XR为美国Bio-Rad公司产品。恒温金属加热器为北京金银杏生命科学有限公司产品。

本发明实验中所使用的菌株和临床标本：

本发明实验中所用标准菌株均购于国际各大菌种保藏中心。表1中其他菌株为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所生物安全实验室收集及保藏。

表1：本发明实验中所用菌株信息

序列设计：

根据鼻疽诺卡菌标准菌株IFM 10152gyrA基因的DNA序列设计引物和crRNA。利用引物设计软件Primer Premier 6.0设计PCR扩增引物，并将获得的特异性引物利用BLAST序列分析以确证引物的特异性，利用IDT工具分析以确保不形成发夹结构，最终获得优化后的一对PCR扩增引物。然后根据PCR扩增引物的结合位点设计引导RNA(crRNA)。引物设计的位置和方向见图3，序列见表2。

表2：鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa引物及crRNA序列

表2中，所述上游引物F和下游引物R扩增的目的基因为鼻疽诺卡菌的gyrA，所扩增目的基因的扩增产物片段为174bp。

基因组提取：

提取鼻疽诺卡菌标准菌株IFM 10152的基因组DNA，使用提取的DNA作为模板进行鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa方法的建立。细菌基因组和模拟痰标本DNA的提取使用Promega公司的DNA纯化试剂盒(

Genomic DNA Purification Kit)，按照说明书进行操作。利用NanoDrop ND-1000分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，用无菌去离子水进行倍比稀释(10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL)。倍比稀释的DNA用于鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa方法灵敏度的确定。

PCR扩增：

PCR扩增体系总体积20μL，包含各0.4μM的扩增引物F和R，10μL 2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)，1μL的DNA模板(阴性对照以1μL的无菌去离子水代替DNA)，无菌去离子水补至20μL。使用PCR仪Veriti 96进行扩增，退火温度为61-73℃。PCR产物使用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳进行确认。

CRISPR检测反应体系：

反应体系按如下方法配制首先，100nM crRNA与75nM Cas12a蛋白在2×NEBuffer2.1中使用恒温金属加热器在37℃下预孵育10分钟，以形成CRISPR-Cas12a/crRNA复合物。然后，构建98μL的CRISPR-Cas12a/crRNA反应预混合液，包含50μL2×NEBuffer 2.1,2μL单链DNA报告分子(5’-6-FAM-TATTAT-BHQ1-3’,10μM)，36μL CRISPR-Cas12a/crRNA复合物，10μL去离子水。最后，将2μL PCR产物/去离子水(空白对照)加入98μLCRISPR反应预混合液中，形成100μL反应混合液。

CRISPR检测结果判读：

使用荧光定量仪进行CRISPR检测及荧光信号读取。反应液在37℃环境下反应10分钟，荧光信号被实时采集。若为阳性反应，则荧光信号显著增强，超过阈值线；若为阴性反应，则荧光信号无显著增强，低于阈值线。

检测结果的判读与对照：

证明设计的鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa扩增引物及crRNA的可用性

如图4A所示，通过琼脂糖凝胶电泳，PCR阳性扩增产物在174bp处显示出单一而明亮的条带，阴性对照无任何条带，说明设计的PCR扩增产物可用。如图4B所示，在CRISPR检测阶段，阳性反应出现了显著的荧光信号增强，超出阈值线，阴性反应和空白对照未出现显著的荧光信号增强，低于阈值线，说明设计的crRNA可用。

实施例2.鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测体系的灵敏度评价

运用连续稀释的鼻疽诺卡菌标准菌株IFM 10152的基因组DNA进行CRISPR-Pa，检测后结果如图5显示，图5中，1～9分别为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg模板DNA每反应和空白对照。鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测体系对于纯培养细菌的检测下限为1pg的模板DNA。

实施例3.鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测体系反应条件的优化

在标准反应体系条件下，PCR扩增退火温度在61～73℃(增量为2℃)进行。PCR扩增结束后，采用2％琼脂糖凝胶电泳检测和评价不同退火温度下PCR扩增产物量，并用CRISPR检测进一步对检测结果进行评价。如图6所示，标准反应体系在61～73℃退火时均可发生阳性扩增，其中以69～73℃最佳。在CRISPR检测中，如图7所示，所有的阳性结果都在实时荧光信号检测开始10分钟内出现，其中69℃退火的PCR产物的荧光值最高。因此，我们认为在37℃下进行鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测的最佳反应时间为10分钟，PCR扩增的最佳退火温度为69℃。

实施例4.鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测体系的特异性

以45株鼻疽诺卡菌(包括12株标准菌株和33株临床分离株)和14株常见的其他种属细菌DNA为模板评价鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测体系的特异性。以鼻疽诺卡菌IFM 10152作为阳性对照，以阴性PCR产物作为阴性对照，以无菌去离子水作为空白对照。

如图8所示，鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测IFM 10152和其他45株鼻疽诺卡菌时均呈阳性反应，检测14种其他种属细菌以及阴性对照和空白对照时均呈阴性，说明该检测体系的特异性良好。菌株背景信息见表1。

实施例5.鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测体系应用于模拟痰标本检测时与传统培养法的比较

我们采集了一份志愿者的呼吸分泌物样本，将其分为8份，其中7份与不同浓度梯度(10⁶～1CFU/ml)的鼻疽诺卡菌标准菌株IFM 10152的菌悬液进行混合，其中1份将菌悬液改为等体积无菌生理盐水作为阴性痰对照。模拟痰标本经4％氢氧化钠溶液消化后，用DNA纯化试剂盒提取DNA。提取的DNA用于鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测。同时，对模拟痰标本也采用金标准方法，即血琼脂平板细菌培养的方法进行检测。

如图9所示，CRISPR-Pa可检测出模拟痰标本中10⁶～10⁵CFU/ml的鼻疽诺卡菌。因此，在模拟痰标本中应用鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa的检测下限为10⁵CFU/ml。在阴性痰标本中，未检出鼻疽诺卡菌。在使用血琼脂平板进行细菌培养时，将血平板置于37℃培养6天后，在鼻疽诺卡菌浓度为10⁶和10⁵CFU/ml的模拟痰标本接种的血平板上可见到鼻疽诺卡菌菌落的生长，而在浓度为10⁴～1CFU/ml和阴性对照的血平板上则未见鼻疽诺卡菌生长(图10)。

因此，鼻疽诺卡菌CRISPR-Pa检测方法和传统的细菌培养方法对于鼻疽诺卡菌的检测下限均为10⁵CFU/ml，但CRISPR-Pa法可在90分钟内完成检测，而培养法则需要至少6天时间，因而CRISPR-Pa法较培养法显示出了良好的优越性。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attta 5

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atttaaaccg gtcgtcctgc caagccgtgt gcc 33

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcacgcggc gagggtggtc tcctcgtc 28

<210> 4

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uaauuucuac uaaguguaga uaaccggucg uccugccaag c 41

<210> 5

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tattat 6

Claims (11)

1.一种基于非诊断目的应用CRISPR-Cas12a技术检测核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤

(1)以样本中的核酸作为模板进行聚合酶链扩增反应，其中所述聚合酶链扩增反应使用的上游引物的5’端或者下游引物的3’端加入了PAM位点的修饰；

(2)使用步骤(1)获取的聚合酶链扩增产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的聚合酶链扩增反应的上游引物的5’端加入了PAM位点的修饰，步骤(1)所述的PAM位点的修饰序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述单链DNA探针的序列如SEQ IDNO.5所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链扩增反应的上游引物的序列含有SEQ ID NO.2所示的序列，所述聚合酶链扩增反应的下游引物的序列含有SEQ ID NO.3所示的序列，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链扩增反应的上游引物的序列由SEQ ID NO.2所示，所述聚合酶链扩增反应的下游引物的序列由SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为61-73℃。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合酶链扩增反应的退火温度为69℃。

8.一种基于CRISPR-Cas12a技术的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及用于聚合酶链扩增反应的上游引物，用于聚合酶链扩增反应的下游引物，其中，在所述上游引物的5’端或者下游引物的3’端加入了PAM位点的修饰。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，在所述的聚合酶链扩增反应的上游引物的5’端加入了PAM位点的修饰，所述的PAM位点的修饰序列如SEQ ID NO.1所示。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述聚合酶链扩增反应的上游引物的序列由SEQ ID NO.2所示，所述聚合酶链扩增反应的下游引物的序列由SEQ ID NO.3所示，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.4所示。

11.根据权利要求8-10任一所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的序列如SEQ IDNO.5所示。

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