CN106755565A - 一种基于荧光pcr法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及荧光PCR检测试剂盒领域，特别是涉及一种基于荧光PCR法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒。本发明提供一种联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒，所述试剂盒包括针对登革热病毒的特异性引物、登革热病毒探针、针对基孔肯亚病毒的特异性引物以及基孔肯亚病毒探针，所述针对登革热病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述针对基孔肯亚病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物。本发明所提供的试剂盒具体涉及两对特异性PCR引物和探针，分别特异性扩增登革热病毒和基孔肯亚病毒，两对特异性PCR引物能在同一PCR反应体系中同时进行扩增，实现了多重PCR检测，不仅操作简便，还大大缩短了检测时间。

Description

一种基于荧光PCR法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒

技术领域

本发明涉及荧光PCR检测试剂盒领域，特别是涉及一种基于荧光PCR法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒。

背景技术

登革热病毒是小型黄病毒，属于黄热病毒属，能引起一系列临床症状，包括有生命危险的失血性休克综合征和较少见的伴有肝衰与脑病的急性肝炎。以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，广泛流行于全球热带和亚热带的60多个国家和地区，每年大约超过一亿人受到感染，死亡率高达50％，25亿以上的人受到威胁，该病毒的传播已成为热带、亚热带地区严重的公共卫生问题。在大多数国家登革热的死亡率大约为5％，大多发生在儿童和青壮年中。

基孔肯亚病毒属于披膜病毒科的甲病毒属，在疾病流行地区，这种病毒可存在于绿猴、狒狒、黑猩猩、牛、马、猪、兔等多种动物体内，受感染的动物宿主和病人都是传染源。该病毒由受感染蚊子叮咬传播，能引起一种少见的病毒性传染病——基孔肯亚热。基孔肯亚热一般持续五到七天，常会引起严重的关节痛使人失去能力，这种状况最终可以恢复，但剧烈疼痛和恢复缓慢的特点可明显影响人的正常生活和工作。2006年在印度和南亚的一次流行中，不止125万人感染基孔肯亚热病毒。2007年9月，意大利北部通报了由一例输入病例引起的一次基孔肯亚热暴发。基孔肯亚热近年来急剧复苏并扩大了地域范围，突出表明了我们对昆虫传播的新传染病的脆弱性，并强调了作为卫生安全基本要素的持续控制规划的重要性。

基孔肯亚热与登革热的传播媒介相同，流行区域基本相同，临床表现亦类似，与登革热较难鉴别，两者鉴别有赖于实验室特异性检测。

荧光RT-PCR技术是上世纪九十年代末才发展起来的新技术，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。目前已开发出利用荧光定量PCR技术分别针对上述两种病毒进行的快速检测试剂盒，但是由于是单一检测，两种病毒检测下来，既麻烦又浪费成本。因此在荧光RT-PCR技术的基础上，建立单管联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的方法具有非常重要的意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于荧光PCR法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒，所述试剂盒包括针对登革热病毒的特异性引物、登革热病毒探针、针对基孔肯亚病毒的特异性引物以及基孔肯亚病毒探针，所述针对登革热病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对登革热病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对登革热病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述针对基孔肯亚病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对基孔肯亚病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对基孔肯亚病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述登革热病毒探针的探针序列如SEQ ID No.5所示。

更优选的，所述登革热病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

进一步优选的，所述登革热病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，具体可选用的荧光报告基团包括但不限于FAM、VIC/HEX、RED610、HEX等中的一种或多种的组合。在本发明一实施例中，所述荧光报告基团为FAM荧光基团，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

优选的，所述基孔肯亚病毒探针的探针序列如SEQ ID No.6所示。

更优选的，所述基孔肯亚病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

进一步优选的，所述基孔肯亚病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，具体可选用的荧光报告基团包括但不限于FAM、VIC/HEX，RED610、HEX等中的一种或多种的组合。在本发明一实施例中，所述荧光报告基团为HEX荧光基团，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

本发明所提供的试剂盒中，登革热病毒探针上标记的荧光报告基团和基孔肯亚病毒探针上标记的荧光报告基团不相同且荧光波长不相同，优选情况下，两种荧光报告基团的荧光波长相差较大、信号强度相近，保证了检测结果的准确性，避免了信号之间的相互干扰。

优选的，所述试剂盒还包括RNA抽提试剂、RT-PCR试剂、内部对照体系和阳性对照中的一种或多种的组合。

本发明所提供的试剂盒用于登革热病毒及基孔肯亚病毒的荧光PCR联合检测，所以试剂盒中还可以包括其他荧光PCR检测中的相关试剂，具体包括但不限于：RNA抽提试剂、RT-PCR试剂、内部对照体系、阴性对照品和阳性对照品等。

所述RNA抽提试剂可使用本领域各种病毒RNA抽提试剂，这些试剂均可通过市售途径获得。

所述RT-PCR试剂可采用本领域各种RT-PCR试剂，具体可包括RT-PCR预混液、RT-PCR酶(包括反转录酶和Taq酶)、工艺用水等，所述工艺用水包括但不限于ddH₂O，这些试剂均可通过市售途径获得。

所述内部对照体系是指包含与登革热和基孔肯亚无关序列的质粒以及其对应的探针的对照体系。本领域技术人员可根据具体序列设计和选用合适的内部对照体系。在本发明一实施例中，所述内部对照体系由内部对照品探针和内部对照品组成，所述内部对照品为与登革热和基孔肯亚无关序列的质粒，内部对照品探针即为针对该质粒其中一段设计获得的探针。

本领域技术人员可根据实际需要确定阴性对照品和阳性对照品，在本发明一实施例中，所述阴性对照品为DEPC-H₂O，所述阳性对照品为含有登革热病毒扩增序列和基孔肯亚病毒扩增序列的质粒。

本发明所提供的联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒采用Taqman荧光定量PCR原理，分别针对登革热病毒及基孔肯亚病毒设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时分别设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，位于上下游引物之间。探针其5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量PCR技术具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。

本发明第二方面提供一种登革热病毒和基孔肯亚病毒的联合检测方法，使用所述试剂盒，具体包括如下步骤：

1)标本的核酸提取：使用病毒RNA抽提试剂盒提取标本RNA；

2)核酸荧光PCR检测混合液的配制：将针对登革热病毒的特异性引物、登革热病毒探针、针对基孔肯亚病毒的特异性引物、基孔肯亚病毒探针、内部对照品探针、RT-PCR预混液、工艺用水组成核酸荧光PCR检测混合液体系；

3)试剂配制：将核酸荧光PCR检测混合液体系、内部对照品、RT-PCR酶振荡混匀、离心；

4)加样：将步骤3所得混合液置于PCR管中，然后将步骤1所得标本、阳性对照品、DEPC-H₂O分别加入PCR管中，离心后立即进行PCR扩增反应；

5)通过定量荧光PCR仪器对样品进行PCR反应，并通过荧光信号的强度判断登革热病毒和基孔肯亚病毒的阳性和阴性。

所述步骤2中，本领域技术人员可根据实际反应情况或现有试剂盒的使用说明，确定核酸荧光PCR检测混合液体系的配比。所述步骤3中，本领域技术人员可根据实际反应情况或现有试剂盒的使用说明，确定核酸荧光PCR检测混合液体系、内部对照品、RT-PCR酶的使用比例。

所述步骤4中，具体指步骤1所得标本、阳性对照品、DEPC-H₂O(阴性对照)的平行实验，分别将试样加入到对应的PCR管中，离心后进行PCR扩增反应。

所述步骤3和步骤4中，离心的时间为数秒，本领域技术人员可根据实验需求确定实际所需要的离心时间。

本发明发明人通过长期研究和大量的筛选实验，通过特定引物的设计，从而提供了一种能够联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒。所述试剂盒具体涉及两对特异性PCR引物和探针，分别特异性扩增登革热病毒和基孔肯亚病毒，两对特异性PCR引物能在同一PCR反应体系中同时进行扩增，实现了多重PCR检测，不仅操作简便，还大大缩短了检测时间。此外，所述两对特异性引物和探针均具有高度的保守性和特异性，两对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的情况，且对于两种病毒的检测灵敏度均可达到1×10³copies/ml以上，保证了检测结果灵敏度和准确性的同时，避免了信号之间的相互干扰。

附图说明

图1显示为本发明登革热病毒灵敏度检测曲线图示意图。

图2显示为本发明基孔肯亚病毒灵敏度检测曲线图示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

登革热病毒及基孔肯亚病毒核酸联合检测试剂盒(荧光PCR法)检测引物探针的设计和合成：

按SEQ ID No.1-6合成登革热病毒的特异性引物、登革热病毒探针、针对基孔肯亚病毒的特异性引物以及基孔肯亚病毒探针，并在登革热病毒探针的5’标记FAM荧光基团，基孔肯亚病毒探针的5’标记HEX荧光基团，两者的3’端均标记BHQ1，合成登革热、基孔肯亚的引物探针，引物和探针序列具体如下：

登革热病毒：

上游引物：AGGACTAGAGGTTAGWGG(SEQ ID No.1)

下游引物：CAGCACCATTCCATTTTC(SEQ ID No.2)

探针：5’荧光报告基团-tccCagCgtCaaTatg-BHQ13’(SEQ ID No.5)

基孔肯亚病毒：

上游引物:ACTCAACCATCCTGGAYA(SEQ ID No.3)

下游引物:GAGTCTCTCGGGATCTTC(SEQ ID No.4)

探针:5’荧光报告基团-ccgAcaTcaTccTcctt-BHQ13’(SEQ ID No.6)

内部对照品探针：5’荧光报告基团-cccGacCgaTttCaaca-BHQ13’(SEQ ID No.7)

内部对照品探针的荧光报告基团为RED610。

实施例2

登革热病毒及基孔肯亚病毒核酸联合检测试剂盒(荧光PCR法)检测混合液的配制：

将登革热病毒上游引物0.5μl/test；下游引物0.5μl/test；探针0.1μl/test；基孔肯亚病毒上游引物0.5μl/test；下游引物0.5μl/test；探针0.1μl/test；内部对照品探针0.1μl/test；引物浓度均为20μM，探针浓度均为10μM；RT-PCR MIX 12.5μl/test(OneStep RT-PCR Kit,QIAGEN)；工艺用水(ddH₂O)3.2μl/test混匀即为D&C核酸荧光PCR检测混合液。

实施例3

登革热病毒及基孔肯亚病毒核酸联合检测试剂盒(荧光PCR法)的灵敏度分析：

3.1样品的准备：

取1×10⁷copies/ml的登革热病毒质粒(DFV-S1)(将目标扩增序列通过TA克隆至pMD8-T载体上，获得的DFV-S1质粒。目标扩增序列：AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAGAACGCCA)(SEQ ID No.8)，按1：10、1：100、1：1000、1：10000稀释，获得DFV-S2(1×10⁶copies/ml)、DFV-S3(1×10⁵copies/ml)、DFV-S4(1×10⁴copies/ml)、DFV-S5(1×10³copies/ml)共5份作为检测样品。

取1×10⁷copies/ml的基孔肯亚病毒质粒(CHIKV-S1)(将目标扩增序列通过TA克隆至pMD8-T载体上，获得的CHIKV-S1质粒。目标扩增序列：GAATGACCATGCTAATGCTAGAGCGTTCTCGCATCTAGCTATAAAACTAATAGAGCAGGAAATTGACCCCGACTCAACCATCCTGGATATCGGCAGTGCGCCAGCAAGGAGGATGATGTCGG)(SEQ ID No.9)，按1：10、1：100、1：1000、1：10000稀释，获得CHIKV-S2(1×10⁶copies/ml)、CHIKV-S3(1×10⁵copies/ml)、CHIKV-S4(1×10⁴copies/ml)、CHIKV-S5(1×10³copies/ml)共5份作为检测样品。

3.2试剂配制：

每个反应管中，加入18μl D&C核酸荧光PCR检测混合液与1μl内部对照品(将目标扩增序列通过TA克隆至pMD8-T载体上，获得的内部对照品质粒。目标扩增序列：GAATGACCATGCTAATGCTAGAGCGTTCTCGCATCTAGCTATAAACCCGACCGATTTCAACACCCCGACTCAACCATCCTGGATATCGGCAGTGCGCCAGCAAGGAGGATGATGTCGG)(SEQ ID No.10)，以及1μl RT-PCR酶(OneStep RT-PCR Kit,QIAGEN)，振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒。

3.3加样：

将DFV-S1、DFV-S2、DFV-S3、DFV-S4、DFV-S5、CHIKV-S1、CHIKV-S2、CHIKV-S3、CHIKV-S4、CHIKV-S5、阳性对照品(见3.1)、DEPC-H₂O(阴性对照品)各5μl分别加入薄壁PCR反应管或PCR反应板中，每个反应管中含有18μl D&C核酸荧光PCR检测混合液、1μl内部对照品、以及1μl RT-PCR酶，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，离心数秒后立即进行PCR扩增反应。

3.4PCR扩增：

反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：

45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为25μl。

荧光通道检测选择：选用FAM、HEX(或VIC/JOE)和Cal Red 610/ROX/TEXAS RED通道。

基线和阈值设定：基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H₂O检测荧光曲线的最高点。

质量控制：试剂盒各对照品须达到以下要求(表1)，否则实验视为无效。

表1

检测结果判断标准如表2所示：

表2

3.5各检测样品的检测结果如图1、图2和表3所示：

表3

DFV-S1	DFV-S2	DFV-S3	DFV-S4	DFV-S5
					+	+	+	+	+
CHIKV-S1	CHIKV-S2	CHIKV-S3	CHIKV-S4	CHIKV-S5
					+	+	+	+	+

由图1和表3可知，对于登革热病毒质粒，DFV-S1(1×10⁷copies/ml)——DFV-S5(1×10³copies/ml)均检测为阳性，表明试剂盒检测登革热病毒的检测灵敏度能达到1×10³copies/ml。

由图2和表3可知，对于基孔肯亚病毒质粒，CHIKV-S1(1×10⁷copies/ml)——CHIKV-S5(1×10³copies/ml)均检测为阳性，表明试剂盒检测基孔肯亚病毒的检测灵敏度能达到1×10³copies/ml。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.一种联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒，所述试剂盒包括针对登革热病毒的特异性引物、登革热病毒探针、针对基孔肯亚病毒的特异性引物以及基孔肯亚病毒探针，所述针对登革热病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对登革热病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对登革热病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，所述针对基孔肯亚病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对基孔肯亚病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对基孔肯亚病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述登革热病毒探针的探针序列如SEQ ID No.5所示，所述基孔肯亚病毒探针的探针序列如SEQ ID No.6所示。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述登革热病毒探针和基孔肯亚病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述登革热病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述基孔肯亚病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述登革热病毒探针上标记的荧光报告基团和基孔肯亚病毒探针上标记的荧光报告基团不相同且荧光波长不相同。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA抽提试剂、RT-PCR试剂、内部对照体系和阳性对照中的一种或多种的组合。

7.一种登革热病毒和基孔肯亚病毒的联合检测方法，使用如权利要求1-6任一权利要求所述的试剂盒，具体包括如下步骤：

1)标本的核酸提取：使用病毒RNA抽提试剂盒提取标本RNA；

2)核酸荧光PCR检测混合液的配制：将针对登革热病毒的特异性引物、登革热病毒探针、针对基孔肯亚病毒的特异性引物、基孔肯亚病毒探针、内部对照品探针、RT-PCR预混液、工艺用水组成核酸荧光PCR检测混合液体系；

3)试剂配制：将核酸荧光PCR检测混合液体系、内部对照品、RT-PCR酶振荡混匀、离心；

4)加样：将步骤3所得混合液置于PCR管中，然后将步骤1所得标本、阳性对照品、DEPC-H₂O分别加入PCR管中，离心后立即进行PCR扩增反应；

5)通过定量荧光PCR仪器对样品进行PCR反应，并通过荧光信号的强度判断登革热病毒和基孔肯亚病毒的阳性和阴性。