CN108950080A - 一种基于双重荧光pcr法联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双重荧光PCR法联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组，包括针对辛德毕斯病毒的特异性引物及探针、针对盖塔病毒的探针及引物，所述针对辛德毕斯病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对辛德毕斯病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对辛德毕斯病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述针对盖塔病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对盖塔病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对盖塔病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明的引物探针组及使用引物探针组的试剂盒可以对辛德毕斯病毒及盖塔病毒进行有效检测，检测灵敏度均可达1×10³copies/ml，有效克服了现有技术中对辛德毕斯病毒、盖塔病毒检测的缺失，具高度产业利用价值。

Description

一种基于双重荧光PCR法联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒 的引物探针组及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组及试剂盒，特别是涉及一种基于双重荧光PCR法联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组、试剂盒及其使用方法。

背景技术

辛德毕斯病毒(Sindbisvirus，SINV)隶属于披膜病毒科(Tongaviridae)甲病毒属(Alphavirus)，可通过蚊虫叮咬传播引起人畜共患辛德毕斯病毒病，该病毒1952年在埃及的尼罗河三角洲辛德毕斯地区从库蚊体内分离到。此后，相继在印度、南非、澳大利亚、中东地区、俄罗斯、瑞典等地的蚊虫标本中再次分离到该病毒。人受到辛德毕斯病毒感染，除能引起发热、皮疹和关节痛等临床症状外，还能发展成为慢性疾患，对健康危害大。我国自1987年从云南省西双版纳发热患者血清中分离到一株辛德毕斯病毒以来，迄今为止，不仅从发热患者血清和蚊虫(中华按蚊、三带喙库蚊)体内分离到辛德毕斯病毒，而且血清流行病学调查提示我国人群中普遍存在辛德毕斯病毒感染。

盖塔病毒(GETAhvirus，GETV)虽然也属于披膜病毒科(Tongaviridae)甲病毒属(Alphavirus)，但与辛德毕斯病毒不属于同一个血清群。GETV最早于1955年马来西亚橡胶林中生存的白雪库蚊(Culexgelidus)中分离到，由于在马来语中橡胶即为盖塔(GETAh)，因而命名为盖塔病毒。该病毒能在各种脊椎动物和节肢动物体内增殖，可引起家畜的疾病，人群中也存在该病毒感染。根据血清动物流行病学研究，GETV在欧亚大陆至东南亚，远到东亚，太平洋岛屿和澳大利亚等地区都有分布。近年来在我国部分省区蚊虫中分离到GETV，表明该病毒在我国分布较为广泛。

辛德毕斯病毒和盖塔病毒虽然属于不同的血清群，但由于流行范围广泛，自然宿主广泛，尤其是在我国多地的人群血清中均检测到相应的中和抗体，因而这两个病毒已在我国流行传播，具有潜在的暴发威胁。然而，目前我国尚未建立针对这些病毒的应急检测机制以应对潜在的风险，因而，我们有必要开发新型的、可快速执行的实验室检测方法，应对应急检测需求。

发明内容

本发明提供了一种基于双重荧光PCR法联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组、试剂盒及其使用方法，以解决缺少对辛德毕斯病毒及盖塔病毒进行有效检测方法的问题。

本发明公开了一种双重荧光PCR法联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组，包括针对辛德毕斯病毒的特异性引物及探针、针对盖塔病毒的探针及引物，所述针对辛德毕斯病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对辛德毕斯病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对辛德毕斯病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述针对盖塔病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对盖塔病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对盖塔病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地，所述辛德毕斯病毒探针的探针序列如SEQ ID No.5所示，所述针对盖塔病毒的探针序列如SEQ ID No.6所示。

进一步地，所述辛德毕斯病毒探针、盖塔病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，具体可选用的荧光报告基团包括但不限于FAM、HEX、CY5等中的一种或多种的组合。在本发明一实施例中，所述荧光报告基团为FAM荧光基团，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

更进一步地，所述辛德毕斯病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述盖塔病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团、

更进一步地，所述辛德毕斯病毒探针上标记的荧光报告基团、所述盖塔病毒探针上标记的荧光报告基团不相同且荧光波长不相同，优选情况下，辛德毕斯病毒探针上和盖塔病毒探针上荧光报告基团的荧光波长相差较大、信号强度相近，保证了检测结果的准确性，避免了信号之间的相互干扰。

本发明还公开了一种双重荧光定量PCR检测辛德毕斯病毒、盖塔病毒的试剂盒，包括上述引物探针组。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR试剂和阳性对照中的一种或多种的组合。

本发明所提供的试剂盒用于辛德毕斯病毒及盖塔病毒的荧光PCR检测，所以试剂盒中还可以包括其他荧光PCR检测中的相关试剂，具体包括但不限于：PCR试剂、阴性对照品和阳性对照品等。

所述PCR试剂可采用本领域各种PCR试剂，具体可包括PCR预混液、PCR酶(包括反转录酶和Taq酶)、工艺用水等，所述工艺用水包括但不限于ddH2O，这些试剂均可通过市售途径获得。

本领域技术人员可根据实际需要确定阴性对照品和阳性对照品，在本发明一实施例中，所述阴性对照品为DEPC-H2O，所述阳性对照品为含有辛德毕斯病毒及盖塔病毒扩增序列的质粒。

本发明所提供的双重检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的试剂盒采用Taqman荧光定量PCR原理，分别针对辛德毕斯病毒及盖塔病毒设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时分别设计 Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，位于上下游引物之间。探针其5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量PCR技术具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。

本发明还公开了上述试剂盒进行辛德毕斯病毒及盖塔病毒的双重检测的方法，具体包括如下步骤：

1)标本的核酸提取：使用病毒RNA抽提试剂盒提取标本RNA；

2)标本RNA逆转录：使用RT-PCR试剂，将标本RNA进行逆转录PCR，获得标本的逆转录产物；

3)核酸荧光PCR检测混合液的配制：将针对辛德毕斯病毒的特异性引物、辛德毕斯病毒探针、针对盖塔病毒的特异性引物、盖塔病毒探针、PCR预混液、工艺用水组成核酸荧光PCR检测混合液体系；

4)试剂配制：将核酸荧光PCR检测混合液混匀、离心；

5)加样：将步骤3所得混合液置于PCR管中，然后将步骤1所得标本、阳性对照品、DEPC-H2O分别加入PCR管中，离心后立即进行PCR扩增反应；

6)通过定量荧光PCR仪器对样品进行PCR反应，并通过荧光信号的强度判断辛德毕斯病毒及盖塔病毒的阳性和阴性。

所述步骤3中，本领域技术人员可根据实际反应情况或现有试剂盒的使用说明，确定核酸荧光PCR检测混合液体系的配比。所述步骤4中，本领域技术人员可根据实际反应情况或现有试剂盒的使用说明，确定核酸荧光PCR检测混合液体系、RT-PCR酶的使用比例。

所述步骤5中，具体指步骤2所得标本、阳性对照品、DEPC-H2O(阴性对照)的平行实验，分别将试样加入到对应的PCR管中，离心后进行PCR扩增反应。

所述步骤4和步骤5中，离心的时间为数秒，本领域技术人员可根据实验需求确定实际所需要的离心时间。

本发明发明人通过长期研究和大量的筛选实验，通过特定引物的设计，从而提供了一种能够同时检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的试剂盒。所述试剂盒具体涉及两对特异性PCR引物和探针，分别特异性扩增辛德毕斯病毒及盖塔病毒，两对特异性PCR引物能在同一PCR反应体系中同时进行扩增，实现了多重PCR检测，不仅操作简便，还大大缩短了检测时间。此外，所述两对特异性引物和探针均具有高度的保守性和特异性，两对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的情况，且对于两种病毒的检测灵敏度均可达到1×10³copies/ml以上，保证了检测结果灵敏度和准确性的同时，避免了信号之间的相互干扰。

附图说明

图1为本发明实施例辛德毕斯病毒灵敏度检测曲线图示意图；

图2为本发明实施例盖塔病毒灵敏度检测曲线图示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

辛德毕斯病毒及盖塔病毒的双重检测试剂盒(荧光PCR法)检测引物探针的设计和合成：

按SEQ ID No.1-6合成辛德毕斯病毒的特异性引物、辛德毕斯病毒探针、针对盖塔病毒的特异性引物以及盖塔病毒探针，并在辛德毕斯病毒探针的5’标记FAM荧光基团，盖塔病毒探针的 5’标记HEX荧光基团，二者的3’端均标记BHQ1，合成辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针，引物和探针序列具体如下：

辛德毕斯病毒：

上游引物：CTAAAGGTACATTTCAATCA(SEQ ID No.1)

下游引物：ATATCGATTTCAATGTTCTT(SEQ ID No.2)

探针：5’荧光报告基团-CCAAGACATTCTACAAGTATATCTC-BHQ13’(SEQ ID No.5)

盖塔病毒：

上游引物:GTAAAGAAGATCACCATAAG(SEQ ID No.3)

下游引物:TATCAGTGATCTTACACATC(SEQ ID No.4)

探针:5’荧光报告基团-AACAGTCGATTACGCAGTTAC-BHQ13’(SEQ ID No.6)

实施例2

辛德毕斯病毒及盖塔病毒双重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)检测混合液的配制：

按照辛德毕斯病毒上游引物0.5μl/test；下游引物0.5μl/test；探针0.25μl/test；盖塔病毒上游引物0.5μl/test；下游引物0.5μl/test；探针0.25μl/test；引物浓度均为10μM，探针浓度均为10μM； PCR MIX 12.5μl/test；工艺用水(ddH₂O)5μl/test进行混匀即为核酸荧光PCR检测混合液。

实施例3

辛德毕斯病毒及盖塔病毒双重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)的灵敏度分析：

3.1样品的准备：

取1×10⁹copies/ml的辛德毕斯病毒质粒(SINV-S1)(将目标扩增序列通过TA克隆至PEGM-T 载体上，获得的SINV-S1质粒。目标扩增序列为：

CTAAAGGTACATTTCAATCACCCTGAAAAAGACATATGCACCAAGACATTCTACAAGTATATCTCCCGGCGTTGCACACAGCCAGTTACAGCTATTGTATCGACACTGCATTACGATGGAAAGATGAAAACCACGAACCCGTGCAAGAAGAACATTGAAATCGATAT(SEQ ID No.7))分为5份，其中4份依次按照10倍、100倍、1000倍、10000倍进行稀释，获得SINV-S2(1×10⁸copies/ml)、 SINV-S3(1×10⁷copies/ml)、SINV-S4(1×10⁶copies/ml)、SINV-S5(1×10⁵copies/ml)，得到共5份作为检测样品。

取1×10⁹copies/ml的盖塔病毒质粒(GETA-S1)(将目标扩增序列通过TA克隆至PEGM-T载体上，获得的GETA-S1质粒。目标扩增序列：

GTAAAGAAGATCACCATAAGCCCGGGCATATATGGAAAAACAGTCGATTACGCAGTTACCCATCACGCAGAGGGTTTCCTGATGTGTAAGATCACTGATA(SEQ ID No.8))分为5份，，按照10 倍、100倍、1000倍、10000倍进行稀释，获得GETA-S2(1×10⁸copies/ml)、GETA-S3(1×10⁷copies/ml)、GETA-S4(1×10⁶copies/ml)、GETA-S5(1×10⁵copies/ml)，得到共5份作为检测样品。

3.2试剂配制：

每个反应管中，加入上述20μl核酸荧光PCR检测混合液。

3.3加样：

将SINV-S1～S5、GETA-S1～S5、阳性对照品(见3.1)、DEPC-H₂O(阴性对照品)各5μl分别加入薄壁PCR反应管或PCR反应板中，每个反应管中含有20μl核酸荧光PCR检测混合液，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，离心数秒后立即进行PCR扩增反应。

3.4 PCR扩增：

反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：

反应管置于荧光PCR仪上，反应条件设置为(反应体积设置为25μl)：①95℃2min，②95℃ 15s，③53℃30s，②-③循环40次，单点荧光检测在53℃。

荧光通道检测选择：选用FAM和HEX通道。

基线和阈值设定：基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过 DEPC-H₂O检测荧光曲线的最高点。

质量控制：试剂盒各对照品须达到以下要求(表1)，否则实验视为无效。

表1

检测结果判断标准如表2所示：

表2

3.5各检测样品的检测结果如图1、图2所示：

由图1可知，对于辛德毕斯病毒质粒，SINV-S1(1×10⁹copies/ml)～SINV-S5(1×10⁵copies/ml) 均检测为阳性，表明试剂盒检测辛德毕斯病毒的检测灵敏度能达到1×10⁵copies/ml。(图1中在 20-21Cycles之间的曲线从高至低依次对应SINV-S1～SINV-S5)。

由图2可知，对于盖塔病毒质粒，GETA-S1(1×10⁹copies/ml)～GETA-S5(1×10⁵copies/ml)均检测为阳性，表明试剂盒检测卡地皮诺的检测灵敏度能达到1×10⁵copies/ml。(图2中在18-20Cycles 之间的曲线从高至低依次对应GETA-S1～GETA-S5)。

3.6对于辛德毕斯病毒、盖塔病毒质粒进行极限稀释灵敏度测定：

取1×10⁹copies/ml的辛德毕斯病毒质粒(SINV-S1)分为4份，依次按照10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍进行稀释，获得SINV-S6(1×10⁴copies/ml)、SINV-S7(1×10³copies/ml)、SINV-S8(1×10²copies/ml)、SINV-S9(1×10copies/ml)，得到共4份作为检测样品；盖塔病毒质粒 (GETA-S1)采用相同方式进行稀释，得到GETA-S6(1×10⁴copies/ml)、GETA-S7(1×10³copies/ml)、 GETA-S8(1×10²copies/ml)、GETA-S9(1×10copies/ml)中，重复步骤3.1-3.4，发现SINV-S7、GETA-S7 的检测结构Ct值为38-40之间，结果为阳性，而SINV-S8(1×10²copies/ml)、SINV-S9(1×10copies/ml)、 GETA-S8(1×10²copies/ml)、GETA-S9(1×10copies/ml)的Ct值大于38，结果为阴性。

综上所述，本发明实施例的检测灵敏度均可达1×10³copies/ml，有效克服了现有技术中对辛德毕斯病毒、盖塔病毒检测的缺失，具高度产业利用价值。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省疾病预防控制中心

<120> 一种基于荧光PCR法联合检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组及试剂盒

<130> 1

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctaaaggtac atttcaatca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atatcgattt caatgttctt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtaaagaaga tcaccataag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tatcagtgat cttacacatc 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccaagacatt ctacaagtat atctc 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacagtcgat tacgcagtta c 21

Claims (10)

1.一种基于双重荧光定量PCR检测辛德毕斯病毒及盖塔病毒的引物探针组，所述引物探针组包括针对辛德毕斯病毒的特异性引物、辛德毕斯病毒探针、针对盖塔病毒的特异性引物、盖塔病毒探针，所述针对辛德毕斯病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述针对巴泰的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述针对巴泰的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述针对盖塔病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述针对盖塔病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述针对盖塔病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述辛德毕斯病毒探针的探针序列如SEQ ID No.5所示。

3.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述针对盖塔病毒的探针序列如SEQID No.6所示。

4.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述辛德毕斯病毒探针、盖塔病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

5.如权利要求4所述的引物探针组，其特征在于，所述辛德毕斯病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

6.如权利要求5所述的引物探针组，其特征在于，所述盖塔病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

7.如权利要求6所述的引物探针组，其特征在于，所述辛德毕斯病毒探针上标记的荧光报告基团、所述盖塔病毒探针上标记的荧光报告基团的荧光波长不相同。

8.一种双重荧光定量PCR检测辛德毕斯病毒、盖塔病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7任一所述引物探针组。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA抽提试剂、RT-PCR试剂和阳性对照中的一种或多种。

10.一种如权利要求8所述的试剂盒的双重荧光定量PCR检测辛德毕斯病毒、盖塔病毒的检测方法，具体包括如下步骤：

1)标本的核酸提取：使用病毒RNA抽提试剂盒提取标本RNA；

2)标本RNA逆转录：使用RT-PCR试剂，将标本RNA进行逆转录PCR，获得标本的逆转录产物；

3)核酸荧光PCR检测混合液的配制：将针对辛德毕斯病毒的特异性引物、辛德毕斯病毒探针、针对盖塔病毒的特异性引物、盖塔病毒探针、工艺用水组成核酸荧光PCR检测混合液体系；

4)试剂配制：对核酸荧光PCR检测混合液体系进行振荡混匀，并离心；

5)加样：将步骤4所得混合液置于PCR管中，然后将步骤2所得标本逆转录产物、阳性对照品、DEPC-H2O分别加入PCR管中，离心后立即进行PCR扩增反应；

6)通过定量荧光PCR仪器对样品进行PCR反应，并通过荧光信号的强度判断辛德毕斯病毒和盖塔病毒的阳性和阴性。