CN110453010A - 一种用于检测非洲猪瘟病毒asfv的lamp引物组、试剂和试剂盒 - Google Patents

一种用于检测非洲猪瘟病毒asfv的lamp引物组、试剂和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物诊断技术领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组、试剂和试剂盒。本发明的LAMP引物组具有检测效率高、特异性好，可有效避免假阳性的检测结果。

Description

一种用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组、试剂和试 剂盒
技术领域
本发明属于分子生物诊断技术领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组、试剂和试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever，ASF)感染家猪和野猪引起的一种烈性疾病，致死率可高达100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疾病，其致病源为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)，是非洲猪瘟病毒属的唯一成员，归属于非洲猪瘟科。自1921年肯尼亚首次报道ASF疫情以来，ASFV已经蔓延到了大多数非洲地区、欧洲、加勒比、南美和中国。中国的首例ASF发现于沈阳，并被中国动物卫生防疫中心(CHAEC)确诊，截止到2019年4月9号，已经有30个省共122例ASF被报道，中国和整个世界在抑制ASF疫情的蔓延和控制ASF发展方面都还有很多工作要做。
由于当前尚未研发出可有效抑制ASFV的疫苗，阻止ASF疫情蔓延的手段仍集中于早期诊断和疫情控制，因此，实验室诊断仍占据重要地位。目前ASFV的诊断方法主要包括免疫印迹分析、ELISA抗体检测、PCR检测、巢试PCR、PCR分析、热启动多重PCR、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、交叉启动放大检测、聚合酶链式反应(PCLSR)和环介导等温扩增(LAMP)。上述诊断方法中，首选核酸分子诊断，灵敏度高、污染率低的real-time PCR是世界动物卫生组织(OIE)推荐采用的ASF诊断方法，但是由于real-time PCR诊断需要用到专门的检测仪器，由专业检测人员来完成，不适用于在发展中国家的推广。
环介导等温扩增法，英文名称为loop-mediatedisothermal amplification，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。环介导等温扩增(LAMP)可在恒温条件下实现核酸的扩增，且其检测的灵敏度和特异性好，检测所需时间也更短。因此，用于ASF诊断的real-time LAMP和可视化LAMP的研究有更好的应用前景，可以满足不同地区的需求。
此外，ASFV的宿主和传播媒介涉及家猪、各种野猪和部分软蜱，在其间保持着复杂的循环。ASFV一旦传入家猪，感染猪的排泄物、分泌物、血液、组织等均含有病毒，成为危险的传染源。ASFV可通过直接接触感染猪尸体、污染物、肉制品在地区甚至国际范围内传播。因此，一旦有感染ASFV的情况发生，就需要对大量样品进行检测，以便及时控制ASFV的传播。缩短ASFV的检测时间对于ASF疫情的控制有重要意义。
目前，采用LAMP方法检测ASFV的反应体系，反应时间大多在45-60min。例如，CN105463135A公开了一种快速检测非洲猪瘟病毒环介导等温扩增的方法，其以非洲猪瘟病毒K205R基因序列作为靶基因设计LAMP引物，需要在63℃恒温条件下反应45min才能实现对非洲猪瘟病毒的检测；文献《非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立》(《中国兽医科学》，王华等，2010,40(09)：940-944)公开了一组以非洲猪瘟病毒p72基因为靶基因的LAMP引物，其需要在62℃恒温反应60min才能实现对非洲猪瘟ASFV的检测；CN 109628644A公开了一种用于非洲猪瘟病毒LAMP检测的引物组，该引物组是以非洲猪瘟病毒PA104R基因为靶标设计的，需要在55-60℃恒温反应45-55min才能实现对非洲猪瘟病毒的检测。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种检测ASFV的LAMP引物组，当该LAMP引物组用于检测ASFV病毒时，40min内即可实现对ASFV的检测，以解决现有技术中ASFV检测所需的时间较长的问题。
本发明的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组采用如下技术方案：一种用于检
测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组的序列为
F3：5’-AAATGGCACTCCACTTCC-3’
B3：5’-AATATGGCTTGAATTTCTGGT-3’；
LB：5’-AAAAAATCCCACGAATGCGATGTTC；
FIP：5’-GCATAGCCTCCTTAATTGTTGTCTTTTTTCTTGAGATTCTAATGATAAATGGCA-3’；
BIP：5’-AACACGAATAATGAACAAACGAGTCTTTTGGATTTTTTTTAGGTGTTTCACTTG-3’，所述引物组用于检测非洲猪瘟病毒ASFV时，反应体系中还存在有混合物1或混合物2，所述混合物1的原料包括dNTP、Mg2+、Bst酶和Buffer，所述混合物2的原料包括dNTP、Mg2+、Mn2+、Bst酶、间苯二酚钠盐、Buffer和DMSO。
优选的，所述LAMP引物组是通过观察扩增曲线和熔解曲线筛选得到的。
优选的，根据引物的熔解曲线的峰值判断所述LAMP引物组的特异性，所述引物的熔解曲线的峰值越小或与扩增产物所在的熔解曲线的位置差别越大，所述LAMP引物组的特异性越好。
本发明的目的之二在于提供一种试剂，具体的技术方案为包括dNTP、Mg2+、Bst酶、Buffer和如权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组。
作为上述试剂的替代方案，所述试剂可为：包括dNTP、Mg2+、Mn2+、Bst酶、间苯二酚钠盐、Buffer、DMSO和如上所述的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组。
本发明的目的之三在于提供一种试剂盒，具体的技术方案为：包括如上所述的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组或如上所述的两种试剂中的任意一种(第一项试剂盒)。
优选的，所述试剂盒内包括10mM dNTP 1.2μL、50mM Mg2+1.2μL、50x SYBR Green 10.05μL、100U/μL Bst酶0.05μL、10X Buffer 1μL、LAMP引物组0.22μL、ddH2O补足10μL，其中所述LAMP引物组中FIP终浓度为0.8μM、BIP终浓度为0.8μM、LB终浓度为0.4μM、F3终浓度为0.1μM、B3终浓度为0.1μM(第二项试剂盒)。
优选的，所述试剂盒内包括10mM dNTP 2.4μL、50mM Mg2+1.6μL、10mM Mn2+1μL、100U/μL Bst酶0.1μL、10X Buffer 2μL、DMSO 1.4μL、10mM间苯二酚钠盐1μL、DEPC水补足20μL，其中所述LAMP引物组中FIP终浓度为0.8μM、BIP终浓度为0.8μM、LB终浓度为0.4μM、F3终浓度为0.1μM、B3终浓度为0.1μM。(第三项试剂盒)
本发明的目的还在于提供一种非疾病的诊断和治疗目的的检测非洲猪瘟病毒ASFV的方法。具体的技术方案为：包括如下步骤：得到样品DNA后，采用如上所述的试剂(包括dNTP、Mg2+、Mn2+、Bst酶、间苯二酚钠盐、Buffer、DMSO和如上所述的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组)或如上所述第一项或第三项的试剂盒配制反应体系，将反应体系置于55℃恒温反应10-40min，若反应液的颜色由棕红色变为浅黄色，则表明样品中存在有非洲猪瘟病毒ASFV；若反应液的颜色物无变化，则样品中不含有非洲猪瘟病毒ASFV或样品中非洲猪瘟病毒的总量小于30copies。应当说明的是，本发明的检测方法一般均可在40min内实现对样品的检测，在实际操作中，若已知某样品中所提取到的样品DNA较少，可适当延长LAMP反应的时间。
作为如上所述的非疾病的诊断和治疗目的的检测非洲猪瘟病毒ASFV的替代方法，具体的技术方案为：包括如下步骤：得到样品DNA后，采用如上所述的试剂或采用如上所述的第二项试剂盒配制反应体系，将反应体系置于实时荧光定量PCR仪中，设定温度为55℃，扩增时间10-40min，根据扩增曲线和熔解曲线判断样品中是否存在有非洲猪瘟病毒ASFV。应当说明的是，本发明的检测方法一般均可在40min内实现对样品的检测，在实际操作中，若已知某样品中所提取到的样品DNA较少，可适当延长LAMP反应的时间。
本发明的有益效果是：本发明的LAMP引物组具有高度特异性，且灵敏度高，结合本发明的可视化LAMP反应体系，40min内即可实现对样品的检测；本发明的LAMP引物组结合本发明的Real-time LAMP反应体系，最快10min即可实现对样品的检测，检测效率高。
本发明的LAMP引物组是结合扩增曲线和熔解曲线筛选得到的，相对于现有技术中仅通过观察扩增曲线或可视化LAMP反应液的颜色筛选到的引物，可有效避免假阳性的结果出现，引物的特异性更好。其中熔解曲线的判断规则为：引物的熔解曲线峰值越小，LAMP引物的特异性越高；若引物的熔解曲线峰值较高，则其对应的Tm值与扩增产物的Tm值的差值越大，LAMP引物组的特异性越高。根据上述熔解曲线的判断规则也适用于LAMP引物组的最适反应温度的确认。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pUC57-p10 DNA的限制性内切酶图谱，泳道1为pUC57-p10 DNA，泳道2为用PvuII限制性内切酶消化后的质粒泳道M为1kb DNA Marker；
图2为引物组No.1在53℃、55℃、57℃、59℃和61℃反应时的扩增曲线和熔解曲线；
图3为引物组No.2在53℃、55℃、57℃、59℃和61℃反应时的扩增曲线和熔解曲线；
图4为引物组No.5在53℃、55℃、57℃、59℃和61℃反应时的扩增曲线和熔解曲线；
图5为引物组No.2在55℃下分别进行Real-time LAMP实验和可视化LAMP实验的特异性测试结果图；
图6为引物组No.2所对应的靶序列在GenBank中的比对结果图；
图7为引物组No.2在55℃下分别进行Real-time LAMP实验和可视化LAMP实验的灵敏度测试结果图；
图8将pUC57-p10 DNA配制为0.1fg/μL、0.08fg/μL、0.06fg/μL、0.04fg/μL和0.02fg/μL的样品进行更精细的灵敏度测试的扩增曲线；
图9为将pUC57-p10 DNA配制为0.1fg/μL、0.08fg/μL、0.06fg/μL、0.04fg/μL和0.02fg/μL的样品进行更精细的灵敏度测试的熔解曲线；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用的试剂来源，详见下表1
表1 试验试剂来源
实施例1
1.1引物设计：以ASFV的p10基因(GenBank登录号No.X68563.1)为靶标，采用PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)和Oligo 7(Molecular BiologyInsights,Inc.Colorado Springs,CO,USA)设计了5套引物(具体序列详见下表2)。
表2 以p10基因为靶标设计得到的用于检测ASFV的LAMP引物组
1.2核酸样品的制备
合成p10基因((GenBank accession No.X68563.1))的一个300bp的片段，并将其克隆到pUC57质粒中(下文简称pUC57-p10 DNA，电泳检测结果见说明书附图图1)，pUC57-p10 DNA及上表1中的5组引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成；pUC57-p10 DNA作为扩增模板用于后续LAMP反应体系的优化和灵敏度的确定，起到标准ASFV质粒的作用；伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)的DNA/cDNA采集自河南动物传染病分子诊断实验室，ASFV的基因组DNA采集自洛阳莱普生信息技术有限公司，上述DNA/cDNA样品可用于验证所设计的用于诊断ASF的LAMP反应的特异性。
pUC57-p10 DNA中p10基因的部分具体序列为：tacaaaaatt cagcttggagccattatcgc ccaacttgag attctaatga taaatggcac tccacttccg gcaaaaaaga caacaattaaggaggctatg cccttacctt catcaaacac gaataatgaa caaacgagtc ctcccgcctc aggcaaaacaagtgaaacac ctaaaaaaaa tcccacgaat gcgatgttct tcacgcgtag cgaatgggca tcctcgaatacttttcgaga aaagttttta acaccagaaa ttcaagccat attggatgag cagtttgcaa acaagaccgg
1.3 Real-Time LAMP反应温度优化
表3 Real-Time LAMP反应体系(10μL)：
上表3中的LAMP引物为将FIP(终浓度0.8μM)、BIP(终浓度0.8μM)、LB/LF(终浓度0.4μM)、F3(终浓度0.1μM)、B3(终浓度0.1μM)按8:8:4:1:1的比例混合的混合液。
采用如上表3所示的10μL反应体系，分别采用引物组No.1-5进行LAMP试验(PC，PC组中pUC57-p10 DNA的浓度为1pg/μL)。
采用StepOneTM System(美国应用系统公司)进行扩增，依次将反应温度设置为53℃、55℃、57℃、59℃和61℃，恒温扩增60min(每个循环30s)，获取相应的熔接曲线和扩增曲线；实验时，每组引物在不同的温度下做2组实验，且以等量ddH2O代替pUC57-p10 DNA(上表3中的模板DNA)作为阴性对照(NC)，阴性对照也分别做2组重复实验。
实验结果：扩增结果详见下表4，引物组No1、No2、No5的具体扩增曲线详见说明书附图图2-4
表4 5组引物在不同温度下的扩增结果
由表4可知，引物组No.3和No.4在以pUC57-p10 DNA作为扩增模板的扩增反应时，均有不能扩增的情况，不能实现检测ASFV的目的；
由表4和图2可知，引物组No.1的扩增结果为：阴性对照(采用ddH2O代替pUC57-p10DNA)在53℃、55℃、57℃、59℃和61℃条件下均不扩增；阳性对照(pUC57-p10 DNA作为模板DNA)在53℃、55℃、57℃和59℃下可以扩增，在61℃条件下不扩增；但是，通过对熔解曲线进行分析可知，在53℃、55℃、57℃和59℃下均有非特异性产物或引物二聚体产生，可能导致假阳性的结果；
由图3可知，对于引物组No.2，观察其扩增曲线可知：阴性对照(采用ddH2O代替pUC57-p10 DNA)在53℃、55℃、57℃、59℃和61℃条件下均不扩增；阳性对照(pUC57-p10DNA作为模板DNA)在53℃、55℃、57℃、59℃和61℃下均有明显的扩增曲线；观察其熔解曲线可知：引物组2在53℃、55℃、57℃、59℃和61℃下的非特异性产物或引物二聚体均更少，特异性更高。此外，引物组No.2的real-time LAMP反应的效率在55℃时最高，在real-timeLAMP反应体系中存在1pg pUC57-p10 DNA时，10min可达到指数扩增。
从图4可知，相较于引物组No.1和No.2，引物组No.5的LAMP反应的效率低，此外，也有明显的非特异性扩增产物或引物二聚体产生。综上，根据扩增效率和从溶解曲线上是否有非特异性扩增产物来判断，选定引物组No.2作为本发明的检测ASFV的LAMP引物组，其最适反应温度为55℃。
1.4 Real-time LAMP实验和可视化LAMP实验的特异性
Real-time LAMP实验和可视化LAMP实验均选用引物组No.2对PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PPV和ASFV的基因组DNA或cDNA以及pUC57-p10 DNA进行进一步检测确定。
其中：Real-time LAMP实验：按照表3配制10μL反应体系，ddH2O作为阴性对照，各做2组重复实验；StepOneTM System参数设置为：反应温度55℃，恒温扩增60min(每个循环30s)；
可视化LAMP实验的反应体系见下表5：
表5 可视化LAMP实验的反应体系
上表5中的混合引物为将FIP(终浓度0.8μM)、BIP(终浓度0.8μM)、LB(终浓度0.4μM)、F3(终浓度0.1μM)、B3(终浓度0.1μM)按8:8:4:1:1的比例混合的混合液。
可视化LAMP实验方法：按照上表5配制反应体系后(上表5中的DNA分别采用pUC57-p10 DNA、ASFV DNA、PRV DNA、PCV2 DNA、CSFV cDNA、PRRSV cDNA、PRRSV cDNA或ddH2O)，将PCR管置于55℃恒温水浴锅中，观察反应液的颜色是否发生变化。
实验结果：
可视化LAMP实验的实验结果：55℃恒温反应40min后，1号和2号PCR管中的反应液的颜色由棕红色转变为浅黄色，3-10号PCR管中反应液的颜色不变；继续1-10号PCR管进行55℃恒温保温20min，1-10号PCR管中反应液的颜色与40min时相同。表明本发明的LAMP引物组特异性好，且检测效率高，可视化LAMP实验40min即可实现对样品的检测。
可视化LAMP实验55℃恒温反应40min时反应液的照片详见说明书附图图5中的左下图，其中1号PCR管中的DNA为pUC57-p10 DNA，2号PCR管中的DNA为ASFV DNA，3号PCR管中的DNA为PRV DNA，4号PCR管中的DNA为PCV2 DNA，5号PCR管中的DNA为CSFV cDNA，6号PCR管中的DNA为PRRSV cDNA，7号PCR管中的DNA为PRRSV cDNA，8-10号PCR管中的DNA用ddH2O代替。
Real-time LAMP实验结果：详见下表6和说明书附图5中的扩增曲线和熔解曲线；
表6 引物组No 2在55℃下进行Real-time LAMP反应的特异性检测结果
由图5及表6可知，Real-time LAMP实验和可视化LAMP实验均具有高度特异性，只有添加有ASFV的基因组DNA和pUC57-p10 DNA的反应体系发生了扩增。引物组No 2对应的产物为222bp，在GenBank中比对，与29个ASFV病毒株的序列完全一致(比对结果详见说明书附图图6)。
由此可知，以引物组No 2配制得到的Real-time LAMP反应体系和可视化LAMP反应体系均有高度特异性。
实施例2 Real-time LAMP实验和可视化LAMP实验的灵敏度
(1)对pUC57-p10 DNA进行梯度稀释，依次配制为100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL和0.01fg/μL的溶液备用(作为模板DNA)；
Real-time LAMP实验灵敏度的检测：反应体系同上表3，将配制好的10微升反应体系置于StepOneTM实时荧光定量PCR系统，设置扩增温度55℃，扩增时间60min；模板DNA浓度为0.1fg/μL以上时，均有明显的扩增曲线和熔解曲线，表明可用于ASFV的检测；模板DNA浓度为0.01fg/μL时，没有扩增曲线和熔解曲线，表明该浓度下的样品超过了本发明的Real-time LAMP实验的检测限。
可视化LAMP实验灵敏度检测：反应体系同上表5，配制好后置于55℃恒温水浴锅中进行扩增，恒温反应40min时，模板DNA浓度为0.1fg/μL以上的PCR管中反应液的颜色均已由棕红色变为了浅黄色，表明模板DNA浓度为0.1fg/μL时，均发生了扩增，可用于ASFV的检测；继续加热20min，模板DNA浓度为0.01fg/μL的PCR管中反应液的颜色和以ddH2O代替模板DNA的PCR管中反应液的颜色均为棕红色，未发生改变，表明0.01fg/μL的pUC57-p10 DNA没有发生扩增，不能实现对pUC57-p10 DNA的检测。
实验结果详见说明书附图图7，由说明书附图图7可知，Real-time LAMP实验和可视化LAMP实验的检测限均可达到0.1fg/μL，相当于30copies/μL；当采用本发明的LAMP反应体系时，从待检测样品中提取到的DNA达到30copies即可实现对样品的检测。
(2)对pUC57-p10 DNA进行进一步梯度稀释，依次配制50pg/μL、0.1fg/μL、0.08fg/μL、0.06fg/μL、0.04fg/μL和0.02fg/μL的样品，备用(作为LAMP反应的扩增模板)。
按照上表3配制10微升反应体系，置于StepOneTM实时荧光定量PCR系统，设置扩增温度55℃，扩增时间60min(每个浓度做两组试验，以ddH2O作为阴性对照)；
实验结果详见说明书附图图8(扩增曲线)和图9(熔解曲线)，由说明书图8和图9可知，当pUC57-p10 DNA的浓度为0.06fg/μL、0.04fg/μL和0.02fg/μL，不能扩增，表明上述浓度超出了本发明的LAMP反应体系的检测限；当pUC57-p10 DNA的浓度为0.08fg/μL时，只有一条扩增曲线，检测结果不稳定；当pUC57-p10 DNA的浓度为0.1fg/μL和50pg/μL时，均有2条扩增曲线，且从熔解曲线上来看也没有明显非特异性产物产生，本发明的引物组No.2及LAMP的反应体系的检测限为0.1fg/μL，检测结果稳定、可靠。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 许昌学院
<120> 一种用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组、试剂和试剂盒
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggtgtttca cttgttttgc ctgtttttca tcaaacacga ataatgaaca 50
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtagcgaat gggcatcctc tttttccaat atggcttgaa tttctg 46
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggaggctat gcccttac 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcttgtttgc aaactgctc 19
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggcgggagg actcgtt 17
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gactcgtttg ttcattattc gtgtttttta aaagacaaca attaaggagg c 51
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggcaaaac aagtgaaaca cctttttagt attcgaggat gcccat 46
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaatggcact ccacttcc 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatatggctt gaatttctgg t 21
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaaaatccc acgaatgcga tgttc 25
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcatagcctc cttaattgtt gtcttttttc ttgagattct aatgataaat ggca 54
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacacgaata atgaacaaac gagtcttttg gatttttttt aggtgtttca cttg 54
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaattcagct tggagcca 18
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgtgaagaac atcgcattc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcccgcctc aggcaaa 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gactcgtttg ttcattattc gtgttttttc ttccggcaaa aaagacaa 48
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgcctcaggc aaaacaagtg tttttacgcg tgaagaacat cg 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctaatgataa atggcactcc a 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtattcgagg atgcccat 18
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagggcatag cctccttaat tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtaagggca tagcctcctt aattttttta atgataaatg gcactccact t 51
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacacgaata atgaacaaac gagtcttttg gatttttttt aggtgtttca cttg 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttatcgccca acttgagat 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtgaagaac atcgcattc 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcccgcctc aggcaaa 17
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<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tacaaaaatt cagcttggag ccattatcgc ccaacttgag attctaatga taaatggcac 60
tccacttccg gcaaaaaaga caacaattaa ggaggctatg cccttacctt catcaaacac 120
gaataatgaa caaacgagtc ctcccgcctc aggcaaaaca agtgaaacac ctaaaaaaaa 180
tcccacgaat gcgatgttct tcacgcgtag cgaatgggca tcctcgaata cttttcgaga 240
aaagttttta acaccagaaa ttcaagccat attggatgag cagtttgcaa acaagaccgg 300

Claims (10)

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组的序列为
F3：5’-AAATGGCACTCCACTTCC-3’
B3：5’-AATATGGCTTGAATTTCTGGT-3’；
LB：5’-AAAAAATCCCACGAATGCGATGTTC；
FIP：5’-GCATAGCCTCCTTAATTGTTGTCTTTTTTCTTGAGATTCTAATGATAAATGGCA-3’；
BIP：5’-AACACGAATAATGAACAAACGAGTCTTTTGGATTTTTTTTAGGTGTTTCACTTG-3’，所述引物组用于检测非洲猪瘟病毒ASFV时，反应体系中还存在有混合物1或混合物2，所述混合物1的原料包括dNTP、Mg2+、Bst酶和Buffer，所述混合物2的原料包括dNTP、Mg2+、Mn2+、Bst酶、间苯二酚钠盐、Buffer和DMSO。
2.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组是通过观察扩增曲线和熔解曲线筛选得到的。
3.根据权利要求2所述的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组，其特征在于，根据引物的熔解曲线的峰值判断所述LAMP引物组的特异性，所述引物的熔解曲线的峰值越小或与扩增产物所在的熔解曲线的位置差别越大，所述LAMP引物组的特异性越好。
4.一种试剂，其特征在于，包括dNTP、Mg2+、Bst酶、Buffer和如权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组。
5.一种试剂，其特征在于，包括dNTP、Mg2+、Mn2+、Bst酶、间苯二酚钠盐、Buffer、DMSO和如权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组或如权利要求4或5所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括10mM dNTP 1.2μL、50mM Mg2+1.2μL、50x SYBR Green 1 0.05μL、100U/μL Bst酶0.05μL、10X Buffer 1μL、LAMP引物组0.22μL、ddH2O补足10μL，其中所述LAMP引物组中FIP终浓度为0.8μM、BIP终浓度为0.8μM、LB终浓度为0.4μM、F3终浓度为0.1μM、B3终浓度为0.1μM。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括10mM dNTP 2.4μL、50mM Mg2+1.6μL、10mM Mn2+1μL、100U/μL Bst酶0.1μL、10X Buffer 2μL、DMSO 1.4μL、10mM间苯二酚钠盐1μL、DEPC水补足20μL，其中所述LAMP引物组中FIP终浓度为0.8μM、BIP终浓度为0.8μM、LB终浓度为0.4μM、F3终浓度为0.1μM、B3终浓度为0.1μM。
9.一种非疾病的诊断和治疗目的的检测非洲猪瘟病毒ASFV的方法，其特征在于，包括如下步骤：得到样品DNA后，采用如权利要求5所述的试剂或如权利要求6或8所述的试剂盒配制反应体系，将反应体系置于55℃恒温反应10-40min，若反应液的颜色由棕红色变为浅黄色，则表明样品中存在有非洲猪瘟病毒ASFV；若反应液的颜色物无变化，则样品中不含有非洲猪瘟病毒ASFV或样品中非洲猪瘟病毒的总量小于30copies。
10.一种非疾病的诊断和治疗目的的检测非洲猪瘟病毒ASFV的方法，其特征在于，包括如下步骤：得到样品DNA后，采用如权利要求4所述的试剂或采用如权利要求7所述的试剂盒配制反应体系，将反应体系置于实时荧光定量PCR仪中，设定温度为55℃，扩增时间10-40min，根据扩增曲线和熔解曲线判断样品中是否存在有非洲猪瘟病毒ASFV。
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