CN106282381A - 检测肺炎支原体的lamp引物组及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测肺炎支原体的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括MP1‑F3引物、MP1‑B3引物、MP1‑FIP引物以及MP1‑BIP引物。本发明还提供了一种利用所述LAMP引物组检测肺炎支原体的方法。本发明的LAMP引物组，可实现对肺炎支原体的检测，并且检测仪器简单，无需昂贵的PCR仪投入，结果便于判断，降低了实验室投入，适合基层实验室推广使用。

Description

检测肺炎支原体的LAMP引物组及其方法
技术领域
本发明属于医学生物分子检测技术领域，具体涉及检测肺炎支原体的LAMP引物组及其方法。
背景技术
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）是人类支原体肺炎的病原体，主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎，通常临床症状较轻，例如头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，甚至根本无症状，但也有个别死亡报道。支原体肺炎一年四季均可发生，但多在秋冬时节。由于支原体肺炎的临床表现和胸部X线检查并不具特征性，因此，单凭临床表现和胸部X线检查无法做出诊断，若要明确诊断，通常需要进行病原体的检测。
目前，国内支原体肺炎的诊断主要依靠血清学检测，但是这种检测方法的结果往往受抗体出现的时间及患儿年龄、机体免疫系统状况等多方面的影响。具体而言，存在以下缺陷：1）阳性病例病程长；这是由于发病初期，机体中尚未产生抗体而不能被检测出，进而造成提示发病所需的时间较长；2）经过多种药物治疗的患儿在采用此方法进行检测时，具有较高的阳性率。
为克服上述技术问题，现有技术中还出现了采用荧光定量PCR检测肺炎支原体的方法，但是荧光定量PCR需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，不仅需要投入高昂的仪器，并且检测操作繁琐、检测成本较高。
鉴于此，目前亟待提出一种方法以实现简便、快速、精确、低价地检测肺炎支原体。
环介导等温扩增技术（英文名称为loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）能在等温条件下，短时间内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，可降低检测成本。目前尚未出现可用于检测肺炎支原体且适于大规模应用的LAMP引物组及其方法。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种可用于检测肺炎支原体且适于大规模应用的LAMP引物组。
本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中检测肺炎支原体的方法存在检测敏感度不高、特异性及敏感性不理想、需要投入高昂的仪器、检测操作繁琐、检测成本较高的问题，进而提供一种检测灵敏度高、特异性及敏感性好、操作简单、检测成本低的检测肺炎支原体的方法。
本发明的检测肺炎支原体的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括MP1-F3引物、MP1-B3引物、MP1-FIP引物以及MP1-BIP引物；其中，所述MP1-F3引物具有如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述SEQ ID No.1为5`-CTTTCAAAACTGAAAACGACAAT-3`；所述MP1-B3引物具有如SEQ ID No.2所示的序列结构，所述SEQ ID No.2为5`-TGATAGCTGTTTCCAACTACC-3`；所述MP1-FIP引物具有如SEQ ID No.3所示的序列结构，所述SEQ ID No.3为5`-TTAGTGCCAAGGCATCCACCTTTTTCTAGTTCCAAATAAATACCAAAGG-3`；所述MP1-BIP引物具有如SEQID No.4所示的序列结构，所述SEQ ID No.4为5`-ATGAAGGACGTGTTAACCTGCTTTTGGATTGCTCCATTCGGAA-3`。
优选地，所述MP1-F3引物、MP1-B3引物、MP1-FIP引物以及MP1-BIP引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）。
优选地，所述LAMP引物组还包括MP1-LB引物，所述MP1-LB引物具有如SEQ ID No.5所示的序列结构，所述SEQ ID No.5为5`-GTGGTAAGAACCTCAGATCCGG-3`。
进一步优选地，所述MP1-F3引物、MP1-B3引物、MP1-FIP引物、MP1-BIP引物以及MP1-LB引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）：（2-12）。
本发明的检测肺炎支原体的方法，利用本发明所述的检测肺炎支原体的LAMP引物组进行检测。
优选地，所述的检测肺炎支原体的方法，包括以下步骤：将所述的检测肺炎支原体的LAMP引物组与待测溶液混合，将混合液置于55-65℃下培育10min以上，观察或检测所述混合液的变化情况。
优选地，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸。
优选地，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、甜菜碱、MgSO4、去离子水中的一种或多种。
所述混合液中还包括金属指示剂；所述金属指示剂为4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐。
本发明还提供了包括所述的LAMP引物组的检测试剂盒。
本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
（1）本发明的检测肺炎支原体的LAMP引物组，可实现对肺炎支原体的检测，并且检测仪器简单，无需昂贵的PCR仪投入，只需简单的水浴锅即可，结果可以通过常规的电泳判断，也可以通过颜色变化直接判断，降低了实验室投入，适合基层实验室推广使用；
（2）本发明的检测肺炎支原体的LAMP引物组还包括MP1-LB引物，MP1-LB引物的设计加快了反应进程，缩短了反应时间，可实现肺炎支原体的快速检测；
（3）本发明的检测肺炎支原体的方法，采用4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐作为金属指示剂，由于环介导等温扩增反应的灵敏度高，极易造成污染，这也是环介导等温扩增容易产生假阳性的原因，本发明采用的所述金属指示剂能够在反应液配制时加入，反应结束后，不需开盖，直接通过反应液颜色变化即可判断结果，减少了气溶胶污染的可能性，避免了假阳性的产生；
（4）本发明的检测肺炎支原体，除将LAMP引物组与待测溶液混合外，还在混合液中加入了Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸，保证了环介导等温扩增的顺利进行，并且还加入了Bst DNA聚合酶缓冲液、MgSO4、甜菜碱、去离子水，多重试剂协同作用，使得其检测的灵敏度提高、特异性增强、检测率提高、检测速度加快，具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1 检测肺炎支原体的LAMP引物组的设计
本实施例中，检测肺炎支原体的LAMP引物组包括MP1-F3引物、MP1-B3引物、MP1-FIP引物以及MP1-BIP引物；其中，所述MP1-F3引物具有如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述MP1-B3引物具有如SEQ ID No.2所示的序列结构，所述MP1-FIP引物具有如SEQ ID No.3所示的序列结构，所述MP1-BIP引物具有如SEQ ID No.4所示的序列结构。
所述SEQ ID No.1：5`-CTTTCAAAACTGAAAACGACAAT-3`；
所述SEQ ID No.2：5`-TGATAGCTGTTTCCAACTACC-3`；
所述SEQ ID No.3：5`-TTAGTGCCAAGGCATCCACCTTTTTCTAGTTCCAAATAAATACCAAAGG-3`；
所述SEQ ID No.4：5`-ATGAAGGACGTGTTAACCTGCTTTTGGATTGCTCCATTCGGAA-3`。
实施例2 检测肺炎支原体的LAMP引物组的设计
本实施例中，检测肺炎支原体的LAMP引物组包括MP1-F3引物、MP1-B3引物、MP1-FIP引物、MP1-BIP引物以及MP1-LB引物；其中，所述MP1-F3引物具有如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述MP1-B3引物具有如SEQ ID No.2所示的序列结构，所述MP1-FIP引物具有如SEQ IDNo.3所示的序列结构，所述MP1-BIP引物具有如SEQ ID No.4所示的序列结构；所述MP1-LB引物具有如SEQ ID No.5所示的序列结构。
所述SEQ ID No.1：5`-CTTTCAAAACTGAAAACGACAAT-3`；
所述SEQ ID No.2：5`-TGATAGCTGTTTCCAACTACC-3`；
所述SEQ ID No.3：5`-TTAGTGCCAAGGCATCCACCTTTTTCTAGTTCCAAATAAATACCAAAGG-3`；
所述SEQ ID No.4：5`-ATGAAGGACGTGTTAACCTGCTTTTGGATTGCTCCATTCGGAA-3`；
所述SEQ ID No.5：5`-GTGGTAAGAACCTCAGATCCGG-3`。
实施例3 LAMP引物组的对肺炎支原体的检测
本实施例中使用的肺炎支原体16S-23S rRNA序列的大肠杆菌重组质粒购买自通用生物系统（安徽）有限公司，所述重组质粒中包含的肺炎支原体的基因片段具有如SEQ IDNo.6所示的序列结构，所述SEQ ID No.6为CTTTCAAAACTGAAAACGACAATCTTTCTAGTTCCAAATAAATACCAAAGGATCAATACAATAAGTTACTAAGGGCTTATGGTGGATGCCTTGGCACTAATAGGCGATGAAGGACGTGTTAACCTGCGATAAGCTTCGGGTAGGTGGTAAGAACCTCAGATCCGGAGATTTCCGAATGGAGCAATCCGGTAGTTGGAAACAGCTATCA；16S-23S rRNA序列的基因组DNA样品购买自通用生物系统（安徽）有限公司。需要说明的是，不仅仅是肺炎支原体16S-23S rRNA序列的大肠杆菌重组质粒、16S-23S rRNA序列的基因组DNA样品为现有技术公开的、市售的常规材料，本实施例中使用的Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、Bst DNA聚合酶缓冲液、甜菜碱、MgSO4、去离子水均为现有技术公开的、市售的常规材料，不同原料、来源以及制备方法得到的上述产品并不影响本发明的实施及其效果（下同，后文不再冗述）。
采用实施例1中所述的LAMP引物组进行肺炎支原体的检测，具体步骤如下：
（1）肺炎支原体阳性对照液及阴性对照液的制备：
肺炎支原体阳性对照液：用化学合成方法合成肺炎支原体基因16S-23S ribosomalRNA intergenic spacer，TA克隆至pUC57载体上，作为阳性对照模板，该阳性对照液由通用生物系统（安徽）有限公司提供；
阴性对照液：用LB培养基过夜培养大肠杆菌ATCC 25922，生物工程（上海）有限公司DNA提取试剂盒提取DNA，作为阴性对照模板。
（2）肺炎支原体的检测：
将实施例2中所述的MP1-F3引物、MP1-B3引物、MP1-FIP引物、MP1-BIP引物分别与步骤（1）中制备得到肺炎支原体阳性对照液及阴性对照液混合，将两组混合液分别置于60℃下培育60min，电泳所述混合液，观察所述混合液的变化情况；
观察结果：加入所述阳性对照液的混合液产生梯状DNA条带；加入所述阴性对照液的混合液未产生梯状DNA条带。由此可以说明，本发明的LAMP引物组可实现对肺炎支原体的检测。
实施例4 LAMP引物组的对肺炎支原体的检测
采用实施例2中所述的LAMP引物组进行肺炎支原体的检测，具体步骤如下：
取1µl浓度为10µM的所述MP1-F3引物、1µl浓度为10µM的所述MP1-B3引物、1µl浓度为40µM的所述MP1-FIP引物、1µl浓度为40µM的所述MP1-BIP、1µl浓度为20µM的所述MP1-LB引物、5µl浓度为5M的甜菜碱（英文名betaine）、3µl浓度为150mM的脱氧核糖核苷三磷酸（简称dNTP）、0.5µl浓度为100mM的MgSO4、2.5µl 浓度为10×的Bst DNA聚合酶缓冲液（英文名BstDNA Polymerase Buffer）、1µl 浓度为8U/µl 的Bst DNA聚合酶（英文名Bst DNAPolymerase）、5µl的去离子水，分别与2µl的实施例3中所述的阳性对照液、所述阴性对照液混合，将两组所述混合液置于65℃下培育60min，电泳所述混合液，观察电泳结果。
其中，所述Bst DNA聚合酶缓冲液的成分为：200 mMTris-HCl (pH 8.8 @ 25°C),100 mMKCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100。需要说明的是，所述BstDNA聚合酶缓冲液的成分并不唯一，只要能在反应过程中起到缓冲作用的溶液即可，本实施例只是提供一种具体的实现方式，本领域技术人员可根据实际情况替换为其他成分的缓冲液（下同，后文不再冗述）。
观察结果：加入所述阳性对照液的混合液产生梯状DNA条带；加入所述阴性对照液的混合液未产生梯状DNA条带。由此可以说明，本发明的LAMP引物组可实现对肺炎支原体的检测。
实施例5 LAMP引物组的对肺炎支原体的检测
采用实施例2中所述的LAMP引物组进行肺炎支原体的检测，具体步骤如下：
取1µl浓度为10µM的所述MP1-F3引物、1µl浓度为10µM的所述MP1-B3引物、1µl浓度为40µM的所述MP1-FIP引物、1µl浓度为40µM的所述MP1-BIP、1µl浓度为20µM的所述MP1-LB引物、5µl浓度为5M的甜菜碱（英文名betaine）、3µl浓度为150mM的脱氧核糖核苷三磷酸（简称dNTP）、0.5µl浓度为100mM的MgSO4、2.5µl 浓度为10×的Bst DNA聚合酶缓冲液（英文名BstDNA Polymerase Buffer，200 mMTris-HCl (pH 8.8 @ 25°C), 100 mMKCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100）、1µl 浓度为8U/µl 的Bst DNA聚合酶（英文名BstDNA Polymerase）、1µl浓度为0.4mM的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐、1µl浓度为0.4mM的MnCl2、5µl的去离子水，分别与实施例3的步骤（1）中制备得到2µl肺炎支原体肺炎支原体阳性对照液及2µl阴性对照液混合，将两组混合液分别置于65℃下培育60min，观察所述混合液的变化情况。
需要说明的是，作为本实施例的优选实现方式，两组混合液分别置于65℃下培育60min，采用水浴锅进行恒温培育。
观察结果：加入所述阳性对照液的混合液的颜色变为浅黄色；加入所述阴性对照液的混合液颜色保持橘红色。由此可以说明，本发明的LAMP引物组可实现对肺炎支原体的检测。
实施例6
采用实施例2中所述的LAMP引物组进行肺炎支原体的检测，具体步骤如下：
取1µl浓度为10µM的所述MP1-F3引物、1µl浓度为10µM的所述MP1-B3引物、1µl浓度为40µM的所述MP1-FIP引物、1µl浓度为40µM的所述MP1-BIP、1µl浓度为20µM的所述MP1-LB引物、5µl浓度为5M的甜菜碱（英文名betaine）、3µl浓度为150mM的脱氧核糖核苷三磷酸（简称dNTP）、0.5µl浓度为100mM的MgSO4、2.5µl 浓度为10×的Bst DNA聚合酶缓冲液（英文名BstDNA Polymerase Buffer，其成分为200 mMTris-HCl (pH 8.8 @ 25°C), 100 mMKCl, 100mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100）、1µl 浓度为8U/µl 的Bst DNA聚合酶（英文名Bst DNA Polymerase）、1µl浓度为0.4mM的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐、1µl浓度为0.4mM的MnCl2、5µl的去离子水，分别与实施例3的步骤（1）中制备得到2µl肺炎支原体肺炎支原体阳性对照液及2µl阴性对照液混合，每组设置6个重复，将两组混合液分别置于65℃下培育60min，观察所述混合液的变化情况。
需要说明的是，作为本实施例的优选实现方式，两组混合液分别置于65℃下培育60min，采用水浴锅进行水下恒温培育，相比公开号为CN103276083B的专利文献，本发明将所述混合液置于水下，进行恒温水浴，偶尔泄露的气体将经过水洗将扩增产物溶解在水中，可防止核酸扩增产物引起的气溶胶污染，极大的减少了假阳性的产生，解决了环介导等温扩增技术推广应用的瓶颈：气溶胶污染。
观察结果：加入所述阳性对照液的混合液的颜色变为浅黄色，6个重复全部变为浅黄色；加入所述阴性对照液的混合液颜色保持橘红色，6个重复均保持橘红色。由此可以说明，本发明的LAMP引物组可实现对CaMV35S启动子的检测。本发明中金属指示剂4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐所检测的是环介导等温扩增的副产物焦磷酸根，即可以提前加入到反应体系中，又不受引物二聚体的影响，实现了可视化检测；相比公开号为CN103276083B的专利文献中使用的商业化恒温扩增仪，本发明由于采用水浴锅水下扩增，成本低，更适合在基层部门推广应用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 许昌学院
<120> 检测肺炎支原体的LAMP引物组及其方法
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> MP1-F3
<400> 1
ctttcaaaac tgaaaacgac aat 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> MP1-B3
<400> 2
tgatagctgt ttccaactac c 21
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> MP1-FIP
<400> 3
ttagtgccaa ggcatccacc tttttctagt tccaaataaa taccaaagg 49
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> MP1-BIP
<400> 4
atgaaggacg tgttaacctg cttttggatt gctccattcg gaa 43

Claims (10)

1.检测肺炎支原体的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括MP1-F3引物、MP1-B3引物、MP1-FIP引物以及MP1-BIP引物；其中，所述MP1-F3引物具有如SEQ ID No.1所示的序列结构；所述MP1-B3引物具有如SEQ ID No.2所示的序列结构；所述MP1-FIP引物具有如SEQ ID No.3所示的序列结构；所述MP1-BIP引物具有如SEQ ID No.4所示的序列结构。
2.根据权利要求1所述的检测肺炎支原体的LAMP引物组，其特征在于，所述MP1-F3引物、MP1-B3引物、MP1-FIP引物以及MP1-BIP引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）。
3.根据权利要求1或2所述的检测肺炎支原体的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组还包括MP1-LB引物，所述MP1-LB引物具有如SEQ ID No.5所示的序列结构。
4.根据权利要求3所述的检测肺炎支原体的LAMP引物组，其特征在于，所述MP1-F3引物、MP1-B3引物、MP1-FIP引物、MP1-BIP引物以及MP1-LB引物的摩尔比为（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）：（2-12）。
5.检测肺炎支原体的方法，其特征在于，利用权利要求1-4中任一所述的检测肺炎支原体的LAMP引物组进行检测。
6.根据权利要求5所述的检测肺炎支原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-4中任一所述的检测肺炎支原体的LAMP引物组与待测溶液混合，将混合液置于55-65℃下培育10min以上，观察或检测所述混合液的变化情况。
7.根据权利要求6所述的检测肺炎支原体的方法，其特征在于，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸。
8.根据权利要求7所述的检测肺炎支原体的方法，其特征在于，所述混合液中还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、甜菜碱、MgSO4、去离子水中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的检测肺炎支原体的方法，其特征在于，所述混合液中还包括金属指示剂；所述金属指示剂为4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚钠盐。
10.一种包括权利要求1-4中任意一项所述的LAMP引物组的检测试剂盒。
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