CN101665827A - 肺炎支原体快速检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肺炎支原体快速检测试剂盒及使用方法。其中试剂盒内包括环介导恒温扩增反应管、BstDNA聚合酶；反应管中含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、引物1：5－ACCAATGCCATCAACCCG－3、引物2：5－TACCGGCGTAACGCAAAG－3、引物3：5－ATTTTCACCCGTGAGGGGGAGTTTTCGCTTAACCCCGTGAACG－3、引物4：5－ACAGCGCTAAGGGCATCACTGTTTTTCAAAGCCGCTTCGGTTC－3、甜菜碱、氯化锰和钙黄绿素。检测肺炎支原体的方法包括待测样品或细菌DNA的提取、肺炎支原体的环介导恒温扩增反应和显色检测。本发明具有检测准确、灵敏度高、特异性强、简便、快速的特点。

Description

肺炎支原体快速检测试剂盒及使用方法

技术领域

本发明涉及一种利用环介导恒温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP)及使用方法。

背景技术

肺炎支原体(MP)是人类支原体肺炎的病原体，是引起儿童呼吸道感染及非典型肺炎的主要病原体之一。1/3以上的非细菌性肺炎都是由MP引起的，MP同时是社区获得性肺炎的重要病原体，人群密集的地方感染率高达50％。快速、准确的检测肺炎支原体是有效防止肺炎支原体感染的前提条件。目前临床上肺炎支原体的鉴定通常还是利用传统的生理生化方法进行鉴定，但由于肺炎支原体对培养要求高及培养时间长(通常需要3~4天)，需要消耗大量的人力和物力，现在已经越来越无法满足临床诊断发展的要求。

随着分子生物学的发展，临床诊断技术中已从传统的生化鉴定向分子生物学方法如PCR、探针杂交等技术发展。PCR检测方法灵敏度高、特异性强，但PCR法需昂贵的设备，操作复杂且对实验室的环境要求较高，检测费用亦较高，致临床无法普及。

环介导恒温扩增技术(简称LAMP)是2000年开发出的一种新的核酸扩增技术，它利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域。LAMP在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。LAMP具有简单、快速、特异性强的特点，能代替PCR方法的最新技术。现已被广泛应用于微生物检测及胚胎性别鉴定等领域。如何运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体在临床诊断技术发展中具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP)的制备和使用方法，以提高肺炎支原体的诊断效率，节约时间，解决传统检测方法无法满足临床诊断的发展要求，本发明通过无数次的试验检测，终于探索出一种运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法，该方法具有检测快速、便捷、低成本等特点。

本发明的主要原理是：利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域。其扩增原理是：FIP引物杂交在目标DNA的F2C区段，启动互补链合成，导致DNA哑铃状结构的产生。此哑铃状结构很快以自身为模板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，该茎-环结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延伸，靶DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎-环结构的DNA，数量级可达10⁹。LAMP在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。

本发明涉及的肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP)，其中的试剂包括如下：

(1)环介导恒温反应管：

包括10×ThermoPol反应缓冲液、5-10pmol的引物1、5-10pmol的引物2、20-40pmol的引物3、20-40pmol的引物4、1.4-1.6mmol/L的dNTP、4-6mmol/L的硫酸镁、0.8-1.2mol/L的甜菜碱、0.4-0.5mmol/L的氯化锰和25-50μmol/L的钙黄绿素；

其中，10×ThermoPol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁和1％的曲拉通X-100；

其中所述dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1

其中所述引物1为：5-accctcgggggcagtcag-3；

所述引物2为：5-ctgattgtccctgctggtcc-3；

所述引物3为：5-gttcagagctggaggttggctttttcgatgattacaggcggttc-3；

所述引物4为：5-gggcggggtgaaggaatgatattttctcgtgaacttggtgtggt-3；

(2)Bst DNA聚合酶：8U/μL。

上面所述环介导恒温扩增反应管中每管22μL反应液的最佳组成为：2.5μL 10×ThermoPol反应缓冲液、1μL 10pmol/μL的引物1、1μL 10pmol/μ L的引物2、1μL 40pmol/μL的引物3、1μL 40pmol/μL的引物4、3.5μL 10mmol/L dNTP、1μL 100mmol/L硫酸镁、5μL 5mol/L甜菜碱、1μL12.5mmol/L氯化锰、1μL 625μmol/L钙黄绿素和4μL的无菌双蒸水。

使用上述试剂盒快速检测肺炎支原体的方法，依次包括下列步骤：

(1)待检样品DNA提取：

A、取200μL待检样品或100μL菌培养液置于1.5mL无菌离心管中，加入600μL悬浮液(15％Chelex100树脂、100mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.1mmol/L EDTA、0.1％叠氮钠)，振荡器上充分混匀30秒；

B、于沸水浴中煮沸10分钟，后于冰上迅速冷却；

C、放入离心机10000转/分钟离心5-10分钟，取上清到无菌离心管中，即为待检模板DNA。

(2)肺炎支原体的环介导恒温扩增反应：

A、在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA和1μL Bst DNA聚合酶；

B、于恒温水浴箱或金属浴中60-65℃放置45-90分钟；

C、于80-95℃放置3-5分钟中止反应，取出观察结果；

(3)结果观察：

取出反应管，直接用肉眼观察颜色变化，若颜色为绿色，说明待检样品或菌液含有或者是肺炎支原体，若颜色为橙色，则说明样品或菌液不含有肺炎支原体。

本发明的有益效果是：本试剂盒根据肺炎支原体的P1基因序列为肺炎支原体各不同菌株型所共有，以保证从种的水平上检测不用来源的肺炎支原体的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术灵敏度高、特异性强，不需要昂贵的仪器设备，只需要普通的金属浴或水浴锅即可，且结果观察直观、简便快速。可用于肺炎支原体的检测，特别适用于临床快速检测。

具体实施方式

下列实施实例不说明本发明，但不应当作对本发明的限制。

按下列配方制作肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP)：

(1)LAMP反应管

含有2.5μL 10×ThermoPol反应缓冲液、1μL 10μmol/L引物1、1μL10μmol/L引物2、1μL 40μmol/L引物3、1μL 40μmol/L引物4、3.5μL 10mmol/L dNTP、1μL 100mmol/L硫酸镁、5μL 5mol/L甜菜碱、1μL 12.5mmol/L氯化锰、1μL 625μmol/L钙黄绿素、4μL无菌双蒸水。其中，10×ThermoPol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁和1％的曲拉通X-100；

其中所述dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1；

其中所述的引物1：5-ACCAATGCCATCAACCCG-3、

引物2：5-TACCGGCGTAACGCAAAG-3、

引物3：5-ATTTTCACCCGTGAGGGGGAGTTTTCGCTTAACCCCGTGAACG-3、

引物4：5-ACAGCGCTAAGGGCATCACTGTTTTTCAAAGCCGCTTCGGTTC-3、

(2)Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μL。

检测程序依次包括下列步骤：

(1)待检样品DNA提取：

A、取200μL待检样品或100μL菌培养液置于1.5mL无菌离心管中，加入600μL悬浮液(15％Chelex100树脂、100mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.1mmol/L EDTA、0.1％叠氮钠)，振荡器上充分混匀30秒；

B、于沸水浴中煮沸10分钟，后于冰上迅速冷却；

C、放入离心机10000转/分钟离心5-10分钟，取上清到无菌离心管中，即为待检模板DNA。

(2)肺炎支原体的环介导恒温扩增反应：

A、在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA和1μL Bst DNA聚合酶；

B、于恒温水浴箱或金属浴中60-65℃放置45-90分钟；

C、于80-95℃放置3-5分钟中止反应，取出观察结果；

(3)结果观察：

取出反应管，直接用肉眼观察颜色变化，若颜色为绿色，说明待检样品或菌液含有或者是肺炎支原体，若颜色为橙色，则说明样品或菌液不含有肺炎支原体。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>珠海市银科医学工程有限公司

<120>肺炎支原体快速检测试剂盒及使用方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(18)

<400>1

accctcgggggcagtcag      18

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>2

ctgattgtccctgctggtcc    20

<210>

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(40)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(44)

<400>3

gttcagagctggaggttggctttttcgatgattacaggcggttc    44

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(44)

<400>4

gggcggggtgaaggaatgatattttctcgtgaacttggtgtggt    44

Claims (3)

1、一种肺炎支原体快速检测试剂盒，其特征在于，其中的试剂包括：

(1)环介导恒温反应管：

包括10×ThermoPol反应缓冲液、5-10pmol的引物1、5-10pmol的引物2、20-40pmol的引物3、20-40pmol的引物4、1.4-1.6mmol/L的dNTP、4-6mmol/L的硫酸镁、0.8-1.2mol/L的甜菜碱、0.4-0.5mmol/L的氯化锰和25-50μmol/L的钙黄绿素；

其中，10×ThermoPol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁和1％的曲拉通X-100；

其中所述dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1

其中所述引物1为：5-accctcgggggcagtcag-3；

所述引物2为：5-ctgattgtccctgctggtcc-3；

所述引物3为：5-gttcagagctggaggttggctttttcgatgattacaggcggttc-3；

所述引物4为：5-gggcggggtgaaggaatgatattttctcgtgaacttggtgtggt-3；

(2)Bst DNA聚合酶：8U/μL。

2、根据权利要求1所述的肺炎支原体快速检测试剂盒，其特征在于，环介导恒温扩增反应管中每管22μL反应液的组成为：2.5μL 10×ThermoPol反应缓冲液、1μL 10pmol/μL的引物1、1μL 10pmol/μL的引物2、1μL40pmol/μL的引物3、1μL 40pmol/μL的引物4、3.5μL 10mmol/L dNTP、1μL 100mmol/L硫酸镁、5μL 5mol/L甜菜碱、1μL 12.5mmol/L氯化锰、1μL 625μmol/L钙黄绿素和4μL的无菌双蒸水。

3、一种肺炎支原体快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于，依次包括下列步骤：

(1)待检样品DNA提取：

A、取200μL待检样品或100μL菌培养液置于1.5mL无菌离心管中，加入600μL悬浮液，振荡器上充分混匀30秒；

B、于沸水浴中煮沸10分钟，后于冰上迅速冷却；

C、放入离心机10000转/分钟离心5-10分钟，取上清到无菌离心管中，即为待检模板DNA。

(2)肺炎支原体的环介导恒温扩增反应：

A、在装有22μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA和1μL Bst DNA聚合酶；

B、于恒温水浴箱或金属浴中60-65℃放置45-90分钟；

C、于80-95℃放置3-5分钟中止反应，取出观察结果；

(3)结果观察：

取出反应管，直接用肉眼观察颜色变化，若颜色为绿色，说明待检样品或菌液含有或者是肺炎支原体，若颜色为橙色，则说明样品或菌液不含有肺炎支原体。