CN101665826A - 运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法，属于细菌检验技术领域，主要的技术方案设计了引物组序列，采用环介导恒温扩增技术进行检测，其环介导恒温扩增产物检测方法包括：(1)室温10,000g离心5分钟后阳性结果在试管底部可见白色沉淀；(2)加入显色剂，阳性结果为绿色；(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳结果有梯状电泳条带；可以选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。该方法具有检测准确、灵敏度高、特异性强、简便、快速的特点，可以快速准确地鉴定特异的目标菌，从而解决了传统检测方法无法满足临床检测发展要求的现状。

Description

运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法

技术领域

本发明涉及细菌检测技术，具体的说是运用环介导恒温扩增反应来检测临床肺炎支原体的方法。

背景技术

肺炎支原体(MP)是人类支原体肺炎的病原体，是引起儿童呼吸道感染及非典型肺炎的主要病原体之一。1/3以上的非细菌性肺炎都是由MP引起的，MP同时是社区获得性肺炎的重要病原体，人群密集的地方感染率高达50％。快速、准确的检测肺炎支原体是有效防止肺炎支原体感染的前提条件。目前临床上肺炎支原体的鉴定通常还是利用传统的生理生化方法进行鉴定，但由于肺炎支原体对培养要求高及培养时间长(通常需要3～4天)，需要消耗大量的人力和物力，现在已经越来越无法满足临床诊断发展的要求。

随着分子生物学的发展，临床诊断技术中已从传统的生化鉴定向分子生物学方法如PCR、探针杂交等技术发展。PCR检测方法灵敏度高、特异性强，但PCR法需昂贵的设备，操作复杂且对实验室的环境要求较高，检测费用亦较高，致临床无法普及。

环介导恒温扩增技术(简称LAMP)是2000年开发出的一种新的核酸扩增技术，它利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域。LAMP在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。LAMP具有简单、快速、特异性强的特点，能代替PCR方法的最新技术。现已被广泛应用于微生物检测及胚胎性别鉴定等领域。如何运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体在临床诊断技术发展中具有重大意义。

发明内容

为了提高肺炎支原体的诊断效率，节约时间，以解决传统检测方法无法满足临床诊断的发展要求，本发明通过无数次的试验检测，终于探索出一种运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法，该方法具有检测快速、便捷、低成本等特点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物用于环介导恒温扩增技术检测

(2)整合各引物使之不相互干扰

(3)以引物序列组扩增待测样品模板，进行目的基因片段的特异性扩增

(4)扩增完成后可通过离心直接目测白色沉淀检测结果，或通过加显色剂观察反应液颜色检测结果，还可以电泳带形分析检测结果

本发明用特异性的引物组扩增肺炎支原体，反应后目测结果与电泳结果均未发现假阳性和假阴性的结果。

该方法包括：应用该方法检测临床肺炎支原体所使用的引物组和与之配套的扩增反应条件。其中所使用的引物组序列如下：

引物序列1：ACCAATGCCATCAACCCG

引物序列2：TACCGGCGTAACGCAAAG

引物序列3：ATTTTCACCCGTGAGGGGGAGTTTTCGCTTAACCCCGTGAACG

引物序列4：ACAGCGCTAAGGGCATCACTGTTTTTCAAAGCCGCTTCGGTTC

环介导恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下：

成分                     浓度                  加样量

扩增体系预混合物         2×                   12.5μL

引物序列1                10pmol/uL             1μL

引物序列2                10pmol/uL             1μL

引物序列3                40pmol/uL             1μL

引物序列4                40pmol/uL             1μL

DNA样品                                        2μL

双蒸水                                         6.5μL

总体积                                         25μL

环介导恒温扩增程序为：

(1)65℃  1小时

(2)80℃  10分钟

环介导恒温扩增产物的检测方法包括：

(1)室温10,000g离心5分钟，阳性结果在试管底部可见白色沉淀；

(2)加入显色剂，阳性结果为绿色；

(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果有梯状电泳条带；

选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。环介导恒温扩增产物检测理论依据

1、阳性结果会产生白色沉淀：在环介导恒温扩增过程中，dNTP不断添加进新合成的核苷酸链，同时会生成大量的副产物——焦磷酸镁。焦磷酸镁是一种白色沉淀物，由于整个扩增试验都是在61℃进行，所以焦磷酸镁沉淀无法溶解，最终，随着阳性核苷酸链的增加，焦磷酸镁沉淀也在不断积累。从而在反应结束后可以直接通过观察白色沉淀而确定阳性反应。

2、阳性结果在加入SYBR Green染料，溶液变为绿色：阳性的环介导恒温扩增会合成大量的核苷酸链。反应后，向阳性反应产物中加入SYBR Green染料后，SYBR Green分子会大量嵌入核苷酸链中，从而使SYBR Green分子产生绿色荧光。而阴性结果由于没有目的基因片段，无法扩增出核苷酸链，SYBR Green也无法同核苷酸链结核，结果只能是橙色。

3、阳性结果在电泳中表现为阶梯状电泳条带：环介导恒温扩增的原理在于：FIP引物杂交在目标DNA的F2C区段，启动互补链合成，导致DNA哑铃状结构的产生。此哑铃状结构很快以自身为模板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，该茎-环结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延伸，靶DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎-环结构的DNA。因此随着扩增的不断进行，积累了以这一环状结构为基数的核苷酸链，反映在电泳中即表现为形成阶梯状电泳条带。

本发明的有益效果是：相比传统生理生化检测方法，基于环介导恒温扩增的鉴定方法适用于直接从患者含菌体液、体液培养物等临床样品中扩增靶基因，只需要一次环介导恒温扩增反应就能够检测肺炎支原体是否存在，大大提高了检测效率。相比较其他PCR方法，本方法仅需要简单是设备——恒温水浴箱、离心机或普通电泳设备(电泳仪)即可，大大提高了性价比节约了成本。环介导恒温扩增方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高、简便、快速的特点，可以快速、准确的鉴定目标菌。环介导恒温扩增鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法准确。

附图说明

图1是环介导恒温扩增产物离心后待测样品目测沉淀结果：试管底部可见明显白色沉淀，阴性对照没有沉淀；

图2是环介导恒温扩增产物加入SYBR Green后染色结果：待测样品溶液呈现绿色，阴性对照为橙色；

图3是环介导恒温扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后检测结果：待测样品出现阶梯状条带，阴性对照没有条带。

具体实施方式

采用本发明的环介导恒温扩增检测肺炎支原体的方法对某医院肺炎患者漱口液样品进行检测，具体实施步骤如下：

1、样品处理

用30mL生理盐水湿润患者咽喉部后留在干净的无菌杯子中备用。

2、DNA提取

取100μL漱口液与300μL悬浮液(15％Chelex100树脂、100mmol/LTris-HCl pH8.0、0.1mmol/L EDTA、0.1％叠氮钠)于无菌试管中混合，振荡器上充分混匀30秒。煮沸10分钟，于冰上迅速冷却，10000转/分钟离心5分钟，取上清用于扩增。

3、环介导恒温扩增

扩增反应体系中各组分构成比例如下：

成分              浓度         加样量

扩增体系预混合物  2*           12.5μL

引物序列1         10pmol/uL    1μL

引物序列2         10pmol/uL    1μL

引物序列3         40pmol/uL    1μL

引物序列4     40pmol/uL   1μL

DNA样品                   2μL

双蒸水                    6.5μL

总体积                    25μL

环介导恒温扩增程序为：

(1)65℃  1小时

(2)80℃  10分钟

反应在恒温水浴箱中进行。

环介导恒温扩增共进行2管反应，其中一管加入样品DNA，另一管为无样品DNA的反应体系，作为阴性对照。

4、对被检样品结果进行观察

(1)环介导恒温扩增产物10000转离心5分钟后待测样品试管底部可见明显白色沉淀；阴性对照没有沉淀

(2)环介导恒温扩增产物加入SYBR Green染色后，待测样品溶液呈现绿色；阴性对照为橙色

(3)环介导恒温扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，待测样品出现阶梯状条带；阴性对照没有条带

可以选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。

试验表明样品中含有肺炎支原体。

4天后，通过常规微生物培养检测证明，所检测的目的菌为肺炎支原体。环介导恒温扩增检测结果与生理生化检测结果一致。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>珠海市银科医学工程有限公司

<120>运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(18)

<400>1

accaatgccatcaacccg    18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(18)

<400>2

taccggcgtaacgcaaag    18

<210>3

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(43)

<400>3

attttcacccgtgagggggagttttcgcttaaccccgtgaacg   43

<210>4

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(43)

<400>4

acagcgctaagggcatcactgtttttcaaagccgcttcggttc   43

Claims (4)

1、一种运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法，其特征在于，所使用的引物序列如下：

引物序列1：ACCAATGCCATCAACCCG

引物序列2：TACCGGCGTAACGCAAAG

引物序列3：ATTTTCACCCGTGAGGGGGAGTTTTCGCTTAACCCCGTGAACG

引物序列4：ACAGCGCTAAGGGCATCACTGTTTTTCAAAGCCGCTTCGGTTC

2、根据权利要求1所述的一种运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法，其特征在于，扩增反应体系中各组分构成比例如下：

成分               浓度         加样量

扩增体系预混合物   2×          12.5μL

引物序列1          10pmol/uL    1μL

引物序列2          10pmol/uL    1μL

引物序列3          40pmol/uL    1μL

引物序列4          40pmol/uL    1μL

DNA样品                         2μL

双蒸水                          6.5μL

总体积                          25μL

3、根据权利要求1所述的一种运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法，其特征在于，环介导恒温扩增程序为：

(1)65℃    1小时

(2)80℃    10分钟

4、根据权利要求1或2或3所述的一种运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法，其特征在于，环介导恒温扩增产物的检测方法包括：

(1)室温10,000g离心5分钟，阳性结果在试管底部可见白色沉淀；

(2)加入显色剂，阳性结果为绿色；

(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果有梯状电泳条带；

选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。

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