CN101591713B - 小鹅瘟病毒lamp检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测小鹅瘟病毒的试剂盒及检测方法。本发明含有10X等温反应缓冲液、Bst DNA聚合酶8M/μL、10mM dNTP、100mM硫酸镁、10μM内引物1、10μM内引物2、10μM外引物1、10μM外引物2和4M甜菜碱的反应液A、反应液B(50mM MgCl2)和反应液C(100X的荧光染料SYBR Green I)。通过对组织样品中DNA、鹅泄殖腔棉拭子样品中DNA提取、小鹅瘟病毒的环介导等温扩增、扩增产物的显色检测，从而检测出小鹅瘟病毒。解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷。本发明具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于现场快速检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测小鹅瘟病毒的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速检测小鹅瘟病毒的方法。
背景技术
小鹅瘟(Gosling Plague，GP)又称鹅细小病毒病，最早由我国学者方定一1956年在扬州发现，并于1961年用鹅胚分离该病病毒(Goose Parvovirus，GPV)。该病主要发生于1月龄内雏鹅和雏番鸭，是一种传播快、死亡率高的高度接触性传染病。10日龄雏鹅发病率和死亡率可达100％，在易感群中的致死率高达70％。本病在世界各地均有不同程度的流行，广泛发生于中国、欧洲各国、以色列、日本等国，是目前危害养鹅业的主要疾病之一。
由于小鹅瘟病情急、病程短，因此，早发现、早治疗对控制本病十分重要。为了更好的控制小鹅瘟的传播和发病，并及时采取措施将其造成的经济损失控制在最小的范围，我们必须根据小鹅瘟的特点采取快速检测方案。
近年来，小鹅瘟病多继发其他疾病或与其他传染性疾病并发，其临床症状和病理解剖往往缺乏特征性，这样就给疾病的诊断和防治造成巨大困难，必须通过试验室诊断方可确诊。
目前实验室诊断方法有病毒的分离鉴定、琼脂扩散试验、聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)，几种方法均可以直接检测出病料中的小鹅瘟病毒，但是病毒的分离鉴定、琼脂扩散试验所需检测时间较长，琼脂扩散试验的灵敏度也较低，聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)必须配备专用仪器，操作较为繁琐，常有非特异性出现。与上述几种实验室诊断方法相比，环介导等温扩增(LAMP)对仪器设备要求不高，临床上容易做到，检测时间也较短，不超过3小时，为快速、准确诊断小鹅瘟探索一种新方法。
发明内容
本发明的目的就在于克服其他检测方法的缺陷，研制一种小鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法。
本发明的技术方案是：一种小鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：
(1)反应液A：
含有10×等温反应缓冲液、Bst DNA聚合酶8U/μL、10mM dNTP、10μM内引物1、10μM 内引物2、10μM外引物1、10μM外引物2和4M甜菜碱，其中：
10×等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8.8)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％(m/V)曲拉通X-100(pH8.8，25℃)；
内引物1为：ATGCTGCCACAGGTTCGGTGGGTGGTAGCAGTGCCGTA
内引物2为：CGGAGATATGGGCGACTCTTCGCCAATTTCCCGAGGCATTA
外引物1为：ACCGAGGAAGTCAGTGCG
外引物2为：CCCATCCATTGGGAATCGC
(2)反应液B：50mM MgCl2
(3)反应液C：100×的荧光染料SYBR Green I。
本发明的另一技术方案是：
一种小鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒检测小鹅瘟病毒的方法，其主要技术步骤包括：
(1)小鹅瘟病毒的环介导等温扩增
在装有24μl反应液A的反应管中加入1μL待检样品处理液，于60-65℃恒温水浴箱中放置70min；
(2)扩增产物的显色检测
在上述反应管中依次加入1μL反应液B和1μL反应液C，室温放置10min，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有小鹅瘟病毒；如果颜色为黄色，说明待检样品不含有小鹅瘟病毒。
本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：本发明建立了小鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法，本试剂盒根据小鹅瘟病毒的基因保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为小鹅瘟病毒所共有。本发明采用LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于小鹅瘟病毒的检测，特别适合于基层现场应用。
环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是对靶基因的6个部位设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。由于其反应是多种引物共同启动，使得反应结果比PCR更特异，另外，由于实行的是等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于现场快速检测。
本发明解决了现有技术中检测小鹅瘟病毒的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷，提供的小鹅瘟病毒的检测试剂盒及其检测方法，对小鹅瘟病毒进行LAMP检测，快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便，可广泛应用于兽医、食品、出入境检疫等领域。
具体实施方式
下列实例进一步说明本发明，但不应该当作对本发明的限制。
实施例1：
按下列配方制作小鹅瘟病毒的环介导等温扩增检测试剂盒：
(1)反应液A：
含有10×等温反应缓冲液、Bst DNA聚合酶8U/μL、10mM dNTP、10μM内引物1、10μM内引物2、10μM外引物1、10μM外引物2和4M甜菜碱，其中：
10×等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8.8)，100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100(pH8.8，25℃)；
内引物1为：ATGCTGCCACAGGTTCGGTGGGTGGTAGCAGTGCCGTA
内引物2为：CGGAGATATGGGCGACTCTTCGCCAATTTCCCGAGGCATTA
外引物1为：ACCGAGGAAGTCAGTGCG
外引物2为：CCCATCCATTGGGAATCGC
(2)反应液B：50mM MgCl2
(3)反应液C：100×的荧光染料SYBR Green I。
环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管24μl的最佳组成为：5μL 10×等温反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶(8U/μL)、3.5μL 10mM dNTP、2.5μL 10μM内引物1、2.5μL 10μM内引物2、0.4μL 10μM外引物1、0.4μL 10μM外引物2以及5.0μL 4M甜菜碱。
实施例2：利用小鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒检测小鹅瘟病毒
待测样本处理液制备：以样本取自内脏或泄殖腔为例
(1)组织样品的处理
A.取十二指肠、肝、肾等组织0.5g，加入含双抗的生理盐水在研磨器中充分研磨3-5min呈悬浊液，将悬浊液置于1.5mL离心管中；
B.12,000×g离心15min，吸取上清；
C.将上清液煮沸，并于100℃维持15min；
D.12,000×g离心15min，吸取上清，-20℃冰箱中保存备用；
(2)雏鹅禽泄殖腔棉拭子样品中DNA的提取
取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于300μL生理盐水中10min，12,000×g离心15min，取上清200μL，采用(1)中从组织样品处理方法处理；
检测：
(1)小鹅瘟病毒的环介导等温扩增
在装有24μL反应液A的反应管中加入1μL上述制得的组织样品或泄殖腔棉拭子样品处理液，于60-65℃恒温水浴箱中放置70min；
(2)扩增产物的显色检测
在上述反应管中依次加入1μL反应液B和1μL反应液C，室温放置10min，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有小鹅瘟病毒；如果颜色为黄色，说明待检样品不含有小鹅瘟病毒。
实施例3：小鹅瘟病毒LAMP检测方法灵敏度试验
取小鹅瘟病毒尿囊液，提取病毒基因组，按10倍比稀释作为LAMP检测试验模板，使每μL稀释液中含有模板基因组拷贝数分别为108，107，106，105，104，103，102，10，1；
在装有24μL反应液A的反应管中分别加入1μL上述病毒基因组稀释液，同时设置不加病毒基因组的空白对照，于60-65℃恒温水浴箱中放置70min；
在上述反应管中加入2μL反应液B，室温放置10min，直接用肉眼观察颜色变化，结果显示，加有病毒基因组稀释液的反应管颜色均变为绿色，对照管颜色为黄色，说明该试剂盒的检测灵敏度至少为1个病毒基因组拷贝。
SEQUENCE LISTING
<110>扬州大学
<120>鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法
<130>
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgctgccac aggttcggtg ggtggtagca gtgccgta 38
<210>2
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cggagatatg ggcgactctt cgccaatttc ccgaggcatt a 41
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
accgaggaag tcagtgcg 18
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cccatccatt gggaatcgc 19
Claims (1)
1. 一种小鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分:
（1）反应液A以每管24μ1计，为：5μL 10×等温反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶8U/μL、3.5μL l0mM dNTP、2.5μL 10μM内引物1、2.5μL 10μM内引物2、0.4μL l0μM外引物1、0.4μL l0μM外引物2以及5.0μL 4M甜菜碱，其中：
10×等温反应缓冲液含有200mM pH8.8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐，100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和pH8.8、25℃的1%曲拉通X-100;
内引物1为:ATGCTGCCACAGGTTCGGTGGGTGGTAGCAGTGCCGTA
内引物2为:CGGAGATATGGGCGACTCTTCGCCAATTTCCCGAGGCATTA
外引物1为:ACCGAGGAAGTCAGTGCG
外引物2为:CCCATCCATTGGGAATCGC
（2）反应液B：50mM MgCl2
（3）反应液C：100×的荧光染料SYBR Green I。
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| 周碧君，郑大恒.小鹅瘟病原学与检测方法的研究.《中 国 预 防 兽 医 学 报》.2005,第27卷(第4期),全文. * |
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