CN108165611A - 一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法和应用 - Google Patents

一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组酶聚合酶恒温扩增结合胶体金试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，步骤如下：设计特异性的金黄色葡萄球菌引物对，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行重组酶聚合酶恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。本发明方法快速简便，不需要昂贵的仪器设备，在40℃恒温条件下仅需扩增10min就可产生可检测水平的产物，不需要繁琐的电泳过程，用胶体金试纸条检测5min内即可获取结果，结果直接肉眼观察；另外，本方法特异性强，未与其他菌属发生反应，灵敏度高，弥补了现有传统检测技术的不足。本方法有望应用于基层检验检疫机构，成为常规检测手段，对于提高食品卫生水平，保证食品安全和推动食品国际贸易发展具有重要意义。

Description

一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌 的方法和应用
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，涉及针对金黄色葡萄球菌的恒温扩增快速检测技术，尤其是一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法和应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)广泛存在于自然界中，主要污染肉类、乳制品和蔬菜等，都可以引起人和动物患病，可导致多种类型的感染，如：皮肤软组织感染、关节炎、蜂窝织炎、乳腺炎、坏死性肺炎、眼眶蜂窝组织炎、心内膜炎和败血症等。在全世界范围内，金黄色葡萄球菌都是导致食物中毒最重要的食源致病微生物之一。美国疾病控制中心 (CDC)的报告显示，所有细菌性食物中毒事件中，33％是由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的，其数量仅低于大肠杆菌。在加拿大，其比例更是高达45％，在我国，由金黄色葡萄球菌导致的细菌性食物中毒事件约占总体中毒事件的20％～25％，因此现在世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。
目前金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括细菌分离鉴定，免疫学方法，分子生物学方法等。细菌分离鉴定工作量大，成本较低，但检测周期长，灵敏度低；免疫学方法易交叉污染，假阳性严重，灵敏度偏低；分子生物学方法应用最广泛的是PCR，但操作繁琐耗时，必须依赖昂贵的实验设备，不便于在基层或现场检测进行推广。
近年来，重组酶聚合酶(RPA)方法受到关注，该方法是一种新型核酸扩增技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，自2006年问世后，已应用于农业、食品安全、医学和转基因检测等多个领域。可在恒温条件下(37℃～42℃)实现对核酸的快速、特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，被认为是最接近所谓的“等温扩增”，具有广阔的应用前景。胶体金试纸条(LF)最大的特点是快捷迅速、灵敏准确、安全简便、成本低廉且不需要专业人员和仪器设备，通常几分钟内就可用肉眼观察到的检测结果。本发明将恒温扩增技术可以简便快捷地检测金黄色葡萄球菌。
通过检索，尚未发现与本发明申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法和应用，该方法具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作简单、便携式的特点。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，步骤如下：
设计对金黄色葡萄球菌具有特异性的引物对，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。
而且，所述引物对为：
正向引物的核苷酸序列SEQ1：GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG；
反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT。
而且，所述正向引物的5’端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5’端用生物素biotin 标记。
而且，所述胶体金试纸条包括背板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述背板沿水平方向设置，该背板上由左至右依次相连接设置金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处部分重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置羊抗鼠抗体。
而且，所述背板为带有不干胶的衬垫。
而且，所述金标垫的制备步骤如下：
⑴制备胶体金
根据柠檬酸钠还原法制备胶体金方法制备20nm的胶体金，方法如下：
将含转子的锥形瓶中加入100mL超纯水，加热煮沸后保持3min后弃除水分；取99mL超纯水和1mL质量浓度为1％的已过滤的氯金酸加至锥形瓶，加热至沸腾煮沸后加入2.25mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠不断搅拌，溶液变至酒红色，颜色保持稳定不再变化时，再继续加热15min；溶液冷却至室温，用超纯水恢复至原始体积，得胶体金，4℃避光保存；
⑵胶体金标记抗体
取1mL步骤⑴的胶体金，加入18μL 0.2mol/LK2CO3调节胶体金至pH＝8.5，取10μL抗地高辛抗体加到胶体金溶液中，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃静置1h，滴加混合后溶液总体积2％的质量浓度为20％的BSA溶液，混合后溶液总体积1％的质量浓度为20％的PEG 20000溶液，混匀后，得混合后溶液，混合后溶液于4℃静置30min，然后2000rpm，4℃，离心15min，取上清液至干净的离心管中，10000r/min，4℃，离心30min，弃除上清液，胶体金颗粒沉淀用5倍体积的金标复溶液复溶，将溶液以30μL/cm喷涂在金标垫上，真空干燥过夜。
而且，具体步骤如下：
⑴RPA反应体系：
10μM正向引物和反向引物各2.4μL，1×rehydration buffer 29.5μL，5ng样品模板 DNA2.5μL，双蒸水10.7μL，重组酶聚合酶，280mmol/μL乙酸镁2.5μL，反应总体积50μL；
⑵RPA反应体系扩增：
向无菌离心管中依次加入rehydration buffer、双蒸水、正向引物、反向引物、模板DNA 和重组酶聚合酶，充分振荡混匀，最后加入280mmol/μL乙酸镁，充分混合，简短离心，40℃水浴锅反应10min，取出反应管，得扩增产物；
⑶试纸条检测：
取100μL扩增产物到900μL PBST中混合，然后将混合液滴加到胶体金试纸条上，室温下静置5min，通过试纸条显色情况判断扩增结果；
当试纸条检测线、质控线都有条带出现，说明结果阳性，存在金黄色葡萄球菌；若只有质控线有条带，检测线位置无条带则说明结果阴性，不存在金黄色葡萄球；若质控线未出现条带，结果无效。
一种如上所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法在金黄色葡萄球菌的检测中的应用。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明方法实验条件要求低，操作简便，速度快，在40℃恒温条件下就可扩增，且仅需10分钟即得到可检测产物，用胶体金试纸条进行检测，5分钟内获得最终结果，检测结果直观准确。
2、本发明方法特异性强，与其他菌属均不发生交叉反应；灵敏度高，可检测限可达到 500fgDNA。
3、本发明方法简便易携带，胶体金试纸条所用材料廉价易得，而且在封闭保存的条件下，试纸条的有效使用期可达3-6个月。
3、本发明方法易推广，整个反应是一个恒温扩增过程，没有温度变化，不需要昂贵的 PCR仪，对操作人员的专业性要求不高，可以应用于偏远、资源贫乏地区和现场检测，有望成为简易常规的检测金黄色葡萄球菌手段，对保证食品安全有重要意义。
附图说明
图1为本发明方法中胶体金试纸条的检测试纸条工作原理、组装方法及结构连接示意图；
图2为本发明方法优化温度与时间的结果图；其中，图a中的1-6分别依次表示30℃， 32℃，38℃，40℃，42℃和45℃，图b中的1-6分别依次表示5min，10min，15min，20 min，25min和30min；
图3为本发明方法优化羊抗鼠二抗和链霉亲和素浓度图；其中，图a中1-4分别依次表示0.1、0.5、0.8、1mg/mL的不同羊抗鼠二抗浓度，图b中1-4依次分别表示0.5、1.0、1.5、2mg/mL的不同链霉亲和素浓度；
图4为本发明方法检测金黄色葡萄球菌的特异性结果图；
图5为本发明方法检测金黄色葡萄球菌的灵敏度结果图；
图6为本发明方法检测实际样品的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明方法进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，步骤如下：
设计对金黄色葡萄球菌具有特异性的引物对，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。
具体地，所述引物对为：
正向引物的核苷酸序列SEQ1：GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG；
反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT。
具体地，所述正向引物的5’端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5’端用生物素biotin 标记。
具体地，所述胶体金试纸条包括背板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述背板沿水平方向设置，该背板上由左至右依次相连接设置金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处部分重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置羊抗鼠抗体。
具体地，所述背板为带有不干胶的衬垫。
具体地，所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，具体步骤如下：
⑴RPA反应体系：
10μM正向引物和反向引物各2.4μL，1×rehydration buffer 29.5μL，5ng样品模板2.5μL，双蒸水10.7μL，重组酶聚合酶，280mmol/μL乙酸镁2.5μL，反应总体积50μL；
⑵RPA反应体系扩增：
向无菌离心管中依次加入rehydration buffer、双蒸水、正向引物、反向引物、模板DNA 和重组酶聚合酶，充分振荡混匀，最后加入280mmol/μL乙酸镁，充分混合，简短离心，40℃水浴锅反应10min，取出反应管，得扩增产物；
⑶试纸条检测：
取100μL扩增产物到900μL PBST中混合，然后将混合液滴加到胶体金试纸条上，室温下静置5min，通过试纸条显色情况判断扩增结果；当试纸条检测线、质控线都有条带出现，说明结果阳性，存在金黄色葡萄球菌；若只有质控线有条带，检测线位置无条带则说明结果阴性，不存在金黄色葡萄球；若质控线未出现条带，结果无效。
本发明重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法可以应用在金黄色葡萄球菌的检测中。
引物的设计与筛选
根据金黄色葡萄球菌nuc设计特异性引物序列，通过NCBI查找到公开的nuc基因序列 (GenBank:EF529607.1)。
根据保守区域，经过同源性分析后，进行RPA引物设计。
设计3组引物对进行最佳引物筛选，引物组及序列如下
第1组：
正向引物的核苷酸序列：GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG
反向引物的核苷酸序列：ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT
第2组：
正向引物的核苷酸序列：AGAGGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTGCTT
反向引物的核苷酸序列：ACCACTTCTATTTACGCCGTTATCTGTTTGT
第3组：
正向引物的核苷酸序列：TAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGC
反向引物的核苷酸序列：GGTGTATCAACCAATAATAGTCTGAATGTC
分别进行预实验，结果表明相同反应条件，第1组引物的扩增效果优于其他2组，因此选取第1组作为后续实验所用引物，并对正向引物的5’端用地高辛digoxin标记，反向引物的5’端用生物素biotin标记。
本发明方法的优化时间与温度的优化：
(1)根据DNA提取试剂盒说明书提取DNA，-20℃保存。提取的DNA用酶标仪检测其OD值，判断DNA的质量(OD260有显著吸收峰，OD260/OD280值在1.7-1.9间)。
(2)RPA反应体系
体系包括2.4μL各引物(10μM)，29.5μL1×rehydration buffer，10.7μL双蒸水，2.5μL DNA，重组酶聚合酶，迅速振荡混匀，最后加入2.5μL乙酸镁，放入水浴锅中反应。取100μL RPA产物，900μLPBST(PBS+混合液总体积0.05％的Tween 20)，将二者混匀，将1000μL混合物滴加在试纸条上，室温下静置5min，观察结果。
正向引物：5’—digoxin—GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG—3’；
反向引物：5’—biotin—ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT—3’；
所有引物由江苏金唯智公司合成。
阴性对照：无菌双蒸水
对RPA的反应时间和温度进行优化，设置反应温度为30℃，32℃，38℃，40℃，42℃和45℃，反应时间分别为5min，10min，15min，20min，25min和30min。结果如图2所示，图2a中的1-6分别表示30℃，32℃，38℃，40℃，42℃和45℃，图中可见40℃时的条带颜色最深，因此选取40℃作为后续的实验温度，图2b中的1-6分别表示5min，10min， 15min，20min，25min和30min，图中可见随着时间的增加，颜色逐渐变深，扩增反应时间为10min或15min，试纸条条带的亮度无显著差异，为了节约检测时间，选取10min作为后续的实验时间。因此扩增最佳温度为40℃，反应时间为10min。结果表明用本发明方法检测时间仅需要15min左右就能完成，大大缩短检测时间，可以达到快速检测金黄色葡萄球菌的目的。
较优地，本发明制备胶体金试纸条的方法可以如下：
1)制备胶体金
根据柠檬酸钠还原法制备胶体金方法制备20nm的胶体金，方法如下：向锥形瓶中加入100 mL超纯水，加热煮沸后保持3min后弃除水分。取99mL超纯水和1mL浓度为1％的已过滤的氯金酸加至锥形瓶，加热至沸腾煮沸后分别加入2.25mL浓度为1％柠檬酸三钠不断搅拌，溶液变至酒红色，颜色保持稳定不变后继续加热15min。待溶液冷却至室温，用超纯水恢复至原始体积，用锡纸包裹所得胶体金，4℃避光保存。
2)胶体金标记抗体
取1mL的胶体金，加入18μL 0.2mol/L K2CO3调节胶体金至pH＝8.5，取10μL抗地高辛抗体加到胶体金溶液中，充分混合后置于4℃孵育1h，孵育结束后加入20μL浓度为20％的BSA和10μL浓度为20％的PEG 20000，充分混合后置于4℃孵育30min，然后4℃，2000 r/min离心15min，取上清液移至新的离心管中，4℃，10000r/min离心30min，弃上清，胶体金颗粒沉淀用5倍体积的金标复溶液复溶，再将溶液以30μL/cm均匀地喷涂在金标垫上，真空干燥过夜。
3)NC膜包被质控线和检测线抗体
该试纸条的硝酸纤维膜上设有检测线和质控线，检测线(T线)上有链霉亲和素包被，质控线(C线)上有羊抗鼠抗体，为了确定二者的最佳浓度，分别将羊抗鼠抗体稀释为0.1、 0.5、0.8和1mg/mL，将链霉亲和素用PB缓冲液稀释浓度分别为0.5、1.0、1.5和2mg/mL，利用划膜仪在硝酸纤维素膜上按1μL/cm划出C、T线，37℃过夜干燥。根据显色结果分析不同稀释条件组合其检测线的颜色强度、稳定性、显色时间、节约成本等因素，选择最合适的羊抗鼠二抗和链霉亲和素浓度。结果如图3所示，图3a中1-4分别表示0.1、0.5、0.8和1 mg/mL的不同羊抗鼠二抗浓度，图中可见，随着羊抗鼠二抗浓度越大，C线的颜色越深，因此选取1mg/mL为后续实验所用浓度，图3b中1-4分别表示0.5、1.0、1.5和2mg/mL的不同链霉亲和素浓度，图中可见，随着链霉亲和素浓度越大，T线的颜色越深，因此选取2mg/mL 为后续实验所用浓度。最终在本发明方法中确定1mg/mL羊抗鼠二抗和2mg/mL链霉亲和素分别作为C线和T线，条带清晰且稳定性好。
本发明方法检测金黄色葡萄球菌的特异性：
按照本发明方法检测金黄色葡萄球菌ATCC 25923，表皮葡萄球菌ATCC 14990，腐生葡萄球菌ATCC 49907，大肠杆菌ATCC 10305，肠炎沙门氏菌ATCC 13076和单增李斯特菌ATCC 19115以及阴性对照。结果如图5所示，图中1-7分别表示金黄色葡萄球菌ATCC 25923，表皮葡萄球菌ATCC 14990，腐生葡萄球菌ATCC 49907，大肠杆菌ATCC 10305，肠炎沙门氏菌ATCC 13076，单增李斯特菌ATCC 19115和阴性对照，图中可见除金黄色葡萄球菌 ATCC25923结果为阳性，其他菌种检测均为阴性。结果表明本发明方法具有良好特异性，可应用于特异检测金黄色葡萄球菌。
本发明方法检测金黄色葡萄球菌的灵敏度：
对金黄色葡萄球菌基因组DNA进行定量，稀释至浓度分别为50ng，5ng，500pg，50pg， 5pg，500fg和50fg，采取本发明方法来确定检测金黄色葡萄球菌的灵敏度。结果如5所示，图中1-7分别表示50ng，5ng，500pg，50pg，5pg，500fg，50fg和阴性对照的实验结果，图中可见500fg DNA的结果与阴性对照有明显差异，因此确定本发明方法检测限为500fg。结果表明本发明方法具有较高的灵敏度，可以满足检测较低含量金黄色葡萄球菌的要求。
本发明方法对实际样品的检测应用
1.样品采购及检验
所使用的实际样品来自于当地超市，包括鸡肉、猪肉和牛奶。采集后的样品应立即置于 4℃冰箱保存，尽可能及早检验，根据国标法GB 4789.10-2010进行鉴定，确认所使用样品中不包含金黄色葡萄球菌。
2.样品增菌和检测
向225mL质量百分数为7.5％的氯化钠肉汤培养液加入25g(mL)样品，再添加1.2×100 CFU的金黄色葡萄球菌，置于37℃培养。每隔1小时采集1ml样品，10000r/min离心2min去上清，用1ml的PBS缓冲液重悬，95℃水浴中孵育5min，10000r/min离心5min取上清。所取的DNA作为模板进行RPA-LF。
4.检测结果
按照本发明方法进行检测，分别检测增菌0h，1h，2h，3h和4h后的样品。结果如图6所示，图中a，b和c分别表示鸡肉、猪肉和牛奶的检测结果，1-6分别表示0h，1h，2h， 3h，4h和阴性对照，图中可见增菌3h后的检测结果与阴性对照有明显差异，因此1.2×100 CFU的金黄色葡萄球菌增菌3h后就可以被检测到。结果表明本发明方法具有较高的灵敏度，适合于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法和应用
<130> 2017-12-22
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 正向引物的核苷酸序列SEQ1()
<400> 1
gcatcacaaa cagataacgg cgtaaataga ag 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 反向引物的核苷酸序列SEQ2()
<400> 2
acattaattt aaccgtatca ccatcaatcg ct 32
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 第2组 正向引物的核苷酸序列()
<400> 3
agaggttttt ctttttcgct actagttgct t 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 第2组 反向引物的核苷酸序列()
<400> 4
accacttcta tttacgccgt tatctgtttg t 31
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 第3组 正向引物的核苷酸序列()
<400> 5
tagtttcaag tctaagtagc tcagc 25
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 第3组 反向引物的核苷酸序列()
<400> 6
ggtgtatcaa ccaataatag tctgaatgtc 30

Claims (8)

1.一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤如下：
设计对金黄色葡萄球菌具有特异性的引物对，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。
2.根据权利要求1所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述引物对为：
正向引物的核苷酸序列SEQ1：GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG；
反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT。
3.根据权利要求2所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述正向引物的5，端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5，端用生物素biotin标记。
4.根据权利要求1所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述胶体金试纸条包括背板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述背板沿水平方向设置，该背板上由左至右依次相连接设置金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处部分重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置羊抗鼠抗体。
5.根据权利要求4所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述背板为带有不干胶的衬垫。
6.根据权利要求4所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述金标垫的制备步骤如下：
⑴制备胶体金
根据柠檬酸钠还原法制备胶体金方法制备20nm的胶体金，方法如下：
将含转子的锥形瓶中加入100mL超纯水，加热煮沸后保持3min后弃除水分；取99mL超纯水和1mL质量浓度为1％的已过滤的氯金酸加至锥形瓶，加热至沸腾煮沸后加入2.25mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠不断搅拌，溶液变至酒红色，颜色保持稳定不再变化时，再继续加热15min；溶液冷却至室温，用超纯水恢复至原始体积，得胶体金，4℃避光保存；
⑵胶体金标记抗体
取1mL步骤⑴的胶体金，加入18μL 0.2mol/LK2CO3调节胶体金至pH＝8.5，取10μL抗地高辛抗体加到胶体金溶液中，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃静置1h，滴加混合后溶液总体积2％的质量浓度为20％的BSA溶液，混合后溶液总体积1％的质量浓度为20％的PEG20000溶液，混匀后，得混合后溶液，混合后溶液于4℃静置30min，然后2000rpm，4℃，离心15min，取上清液至干净的离心管中，10000r/min，4℃，离心30min，弃除上清液，胶体金颗粒沉淀用5倍体积的金标复溶液复溶，将溶液以30μL/cm喷涂在金标垫上，真空干燥过夜。
7.根据权利要求1至6任一项所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：具体步骤如下：
⑴RPA反应体系：
10μM正向引物和反向引物各2.4μL，1×rehydration buffer 29.5μL，5ng样品模板DNA2.5μL，双蒸水10.7μL，重组酶聚合酶，280mmol/μL乙酸镁2.5μL，反应总体积50μL；
⑵RPA反应体系扩增：
向无菌离心管中依次加入rehydration buffer、双蒸水、正向引物、反向引物、模板DNA和重组酶聚合酶，充分振荡混匀，最后加入280mmol/μL乙酸镁，充分混合，简短离心，40℃水浴锅反应10min，取出反应管，得扩增产物；
⑶试纸条检测：
取100μL扩增产物到900μL PBST中混合，然后将混合液滴加到胶体金试纸条上，室温下静置5min，通过试纸条显色情况判断扩增结果；
当试纸条检测线、质控线都有条带出现，说明结果阳性，存在金黄色葡萄球菌；若只有质控线有条带，检测线位置无条带则说明结果阴性，不存在金黄色葡萄球；若质控线未出现条带，结果无效。
8.一种如权利要求1至7任一项所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法在金黄色葡萄球菌的检测中的应用。
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