KR101459295B1 - 온도 구배 형성을 위한 합금 중간층을 갖는 pcr 마이크로 디바이스 시스템 - Google Patents

온도 구배 형성을 위한 합금 중간층을 갖는 pcr 마이크로 디바이스 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR101459295B1
KR101459295B1 KR1020130127001A KR20130127001A KR101459295B1 KR 101459295 B1 KR101459295 B1 KR 101459295B1 KR 1020130127001 A KR1020130127001 A KR 1020130127001A KR 20130127001 A KR20130127001 A KR 20130127001A KR 101459295 B1 KR101459295 B1 KR 101459295B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pcr
microchannel
single heater
intermediate layer
alloy
Prior art date
Application number
KR1020130127001A
Other languages
English (en)
Inventor
이내윤
큐더론 트린
Original Assignee
가천대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가천대학교 산학협력단 filed Critical 가천대학교 산학협력단
Priority to KR1020130127001A priority Critical patent/KR101459295B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101459295B1 publication Critical patent/KR101459295B1/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/36—Apparatus for enzymology or microbiology including condition or time responsive control, e.g. automatically controlled fermentors
    • C12M1/38—Temperature-responsive control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

온도 구배를 위한 합금 중간층을 갖는 PCR 마이크로 디바이스 시스템이 개시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템은 단일히터; 상기 단일히터 상부에 배치되는 합금 중간층; 및 상기 합금 중간층의 상부에 배치되는 것으로, 내부에 샘플유체를 유입시켜 PCR 반응을 일으킨 후에 상기 샘플유체를 외부로 유출시키는 마이크로 채널을 구비하는 PCR 마이크로 디바이스를 포함하고, 상기 합금 중간층은 인바(INVAR)합금으로 형성된다.

Description

온도 구배 형성을 위한 합금 중간층을 갖는 PCR 마이크로 디바이스 시스템{PCR MICRODEVICE SYSTEM WITH AN INTERMEDIATE METAL ALLOY LAYER FOR TEMPERATURE GRADIENT FORMATION}
본 발명은 PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소연쇄반응)에 이용되는 마이크로 디바이스 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 온도 구배 형성을 위한 합금 중간층을 갖는 PCR 마이크로 디바이스 시스템에 관한 것이다.
유체 기술과 MEMS(micro-electromechanical system)를 이용한 미세가공기술을 기존의 질병 분석/진단용 칩 기술에 접목시키고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있으며, 적은 양의 액체 시료(샘플)를 단위 칩에서 다룰 수 있도록 시료분석에 필요한 모든 구성요소를 소형화 및 집적화하여 랩온어칩(lap-on-a-chip)을 구현하고 있다.
이러한 랩온어칩 제조에 있어서는 타겟이 되는 DNA 증폭이 가장 중요하며, 일반적으로 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응)이 이용된다. 상기 PCR 방법을 적용하여 핵산을 증폭하는 마이크로 디바이스에서는 일반적으로 열변성(denaturation), 결합(annealing) 및 신장(extension) 단계를 위한 3개의 별도의 온도구역들이 필요하다. 표적 앰플리콘(amplicon)의 크기가 300bp 미만인 경우에는 열변성 및 신장 단계가 때로는 동일 온도에서 수행되고 있으나, 이러한 경우에도 여전히 2개의 별도 온도구역들이 요구되고 있다. 그리고 상기 온도구역들의 콘트롤을 위해 종래에는 금속 가열 블록, 박막 히터, 적외선 장치, 할로겐 램프, 마이크로웨이브, 백금 레지스터 또는 유도 가열장치들이 이용되어 왔다.
한편, 폴리디메틸실록산(Poly(dimethylsiloxane)), 이하 PDMS)이 이러한 PCR 마이크로 디바이스 제조에 일반적으로 이용되는 데, 이는 PDMS가 비교적 낮은 열전도도를 가지므로 마이크로채널을 형성할 경우 안정한 온도를 유지할 수 있기 때문이다. 상기 PDMS의 낮은 열전도도로 인해 특정 두께를 갖는 평평한 PDMS 벌크의 경우 수직방향으로 온도 구배를 가지며 히터 위에 놓으면 PDMS의 최저면 및 최상면은 두 개의 구별되는 온도범위를 나타낸다. 따라서, PDMS를 이용하여 마이크로 디바이스를 제조하는 경우에는 PCR 방법에 특히 유리하다. 그러나, 상기 PCR 반응에 사용되는 거대한 외부 장치들(예컨대, 샘플 주입 펌프나 히터 장치들)은 PCR 디바이스의 소형화를 가로막는 요인들이자, PCR 마이크로 디바이스의 휴대성을 악화시키는 원인으로 작용하고 있어 개선이 요구된다.
따라서, 이러한 거대한 외부 장치들의 사용을 줄이거나 대체함으로써 PCR 디바이스를 보다 소형화하고 휴대성을 강화시키고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있다.
본 발명의 실시예들에서는 단일히터를 통해 온도를 조절하여 소형화를 달성할뿐더러, 다양한 샘플에서 요구되는 반응 온도에 대응하여 온도 구배를 튜닝할 수 있는 PCR 마이크로 디바이스 시스템을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 단일히터; 상기 단일히터 상부에 배치되는 합금 중간층; 및 상기 합금 중간층의 상부에 배치되는 것으로, 내부에 샘플유체를 유입시켜 PCR 반응을 일으킨 후에 상기 샘플유체를 외부로 유출시키는 마이크로 채널을 구비하는 PCR 마이크로 디바이스를 포함하고, 상기 합금 중간층은 인바(INVAR)합금으로 형성되는 PCR 마이크로 디바이스 시스템이 제공될 수 있다.
이 때, 상기 단일히터는 핫플레이트일 수 있다.
또한, 상기 PCR 마이크로 디바이스는 유리 기판과, 상기 유리 기판 상부에 결합되고 마이크로 채널이 음각으로 새겨진 PDMS(폴리디메틸실록산)로 형성되는 반응채널부를 포함하고, 상기 마이크로 채널은 서펜틴(serpentine) 형태로 형성될 수 있다.
이 때, 상기 PCR 마이크로 디바이스는 상기 마이크로 채널의 일단부에 연결되어 상기 샘플유체를 유입시키는 입구도관과, 상기 마이크로 채널의 타단부에 연결되어 상기 샘플유체를 유출시키는 출구도관을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 합금 중간층은, 상기 단일히터 상부에 배치되는 가열부와 상기 단일히터 상부로부터 일측 방향으로 돌출된 돌출부를 포함하고, 상기 PCR 마이크로 디바이스는 상기 가열부 및 돌출부에 걸쳐서 배치될 수 있다.
또한, 상기 합금 중간층은 상기 단일히터에 대하여 수평방향으로 이동 가능하도록 배치될 수 있다.
본 발명의 실시예들은 높은 열전도도 및 낮은 열팽창계수를 갖는 인바 합금을 단일히터와 PCR 마이크로 디바이스 사이에 위치시킴으로써, 다양한 온도 구배를 형성할 수 있으며, 특히 인바 합금의 위치를 조정함으로써 다양한 샘플에서 요구되는 반응 온도에 대응하여 온도 구배를 튜닝 가능하다.
또한, PCR 마이크로 디바이스에 서펜틴 형태를 갖는 마이크로 채널을 구비하여 보다 용이하게 제조 가능하도록 단순화된 PCR 마이크로 디바이스를 제공하며, 전체 시스템의 소형화를 달성 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 도 1의 PCR 마이크로 디바이스 시스템의 단면을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 도 1의 PCR 마이크로 디바이스 시스템에서 PCR 마이크로 디바이스의 마이크로 채널 형태를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 4는 도 1의 PCR 마이크로 디바이스 시스템에서 PCR 마이크로 디바이스의 제조공정을 도시한 도면이다.
도 5a는 동일 면적을 갖는 다른 종류의 시트에서 발생된 온도 구배를 나타내는 IR 카메라 이미지이다.
도 5b는 도 4a에 표시된 17개의 지점(spot)에서의 온도 그래프이다.
도 6은 시제작된 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템의 이미지와, 온도 구배 시험 결과를 나타내는 이미지이다.
도 7은 본 발명에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템에서 수행된 DNA 증폭 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 대하여 구체적으로 설명하도록 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템(100)을 개략적으로 도시한 도면이고, 도 2는 도 1의 PCR 마이크로 디바이스 시스템(100)의 단면을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, PCR 마이크로 디바이스 시스템(100)은 단일히터(110)와, 단일히터(110) 상부에 배치되는 합금 중간층(120)과, 합금 중간층(120) 상부에 배치되는 PCR 마이크로 디바이스(130)를 포함한다.
단일히터(110)는 다양한 공지의 열원수단을 사용 가능하며, 특정 열원수단에 한정되지 않는다. 예컨대, 단일히터(110)는 핫플레이트(hot plate)일 수 있다. 단일히터(110)의 크기가 작아질수록 전체 PCR 마이크로 디바이스 시스템(100)이 소형화될 수 있다.
합금 중간층(120)은 단일히터(110)로부터 열을 전달받아 PCR 마이크로 디바이스(130)에 전달하는 기능을 수행한다. 합금 중간층(120)은 플레이트(plate)형으로 형성되고 두께는 한정되지 않는다. 예컨대, 합금 중간층(120)의 두께는 밀리미터 급일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템(100)에서 합금 중간층(120)을 이루는 물질은 인바(INVAR) 합금일 수 있다. 인바 합금은 Fe-Ni(철-니켈) 합금의 일종으로 예컨대 Fe-36% Ni합금일 수 있다. 또한, Fe, Ni 이외에 Co(코발트), Cr(크롬), Pt(백금)이 추가될 수 있다. 이러한 인바 합금의 종류로는 Fe-32% Ni-4% Co 등이 있다.
상기 인바 합금은 열전도도(thermal conductivity) 및 열팽창계수(coefficient of linear thermal expansion)이 각각 10WK-1m-1 및 1.6×10-6K-1로, 상대적으로 높은 열전도도를 가지면서도 낮은 열팽창계수를 가지고 있다는 특징이 있다(참고로 유리의 열전도도 및 열팽창계수는 각각 1.1WK-1m-1 및 8.5×10-6K-1임).
본 발명의 발명자들은 인바 합금을 열원에 해당하는 단일히터(110)와 PCR 반응이 일어나는 PCR 마이크로 디바이스(130) 사이에 개재함으로써, PCR 반응에 필요한 적절한 온도 구배를 형성할 수 있음을 시험을 통해 발견하였다.
1차적 열전달 상황을 가정할 경우, 열 유속(heat flux) 및 열 전달 길이가 동일할 때, 열전달 기재(substrate)의 열전도도는 온도 구배(Temperature gradient)와 반비례 관계에 있다. 따라서 구리나 알루미늄과 같이 상대적으로 높은 열전도도를 가진 재료들에서의 온도 구배는 작으며, 유리나 PDMS(폴리디메틸실록산)과 같이 상대적으로 낮은 열전도도를 가진 재료들에서의 온도 구배는 크므로 PCR 반응에 적절한 온도 구배를 형성할 수 없음에 반해, 인바 합금과 같이 상기 언급된 재료들의 중간 정도에 해당하는 열전도도를 갖는 재료의 경우 PCR 반응에 적절한 온도 구배를 형성할 수 있다. 이에 대해서는 후술할 시험예에서 보다 구체적으로 설명하도록 한다.
상술한 것과 같이 인바 합금으로 형성되는 합금 중간층(120)은 가열부(121)와 돌출부(122)를 포함한다. 가열부(121)와 돌출부(122)는 단일히터(110)에 대한 합금 중간층(120)의 상대적 위치를 나타내는 것으로, 가열부(121)는 합금 중간층(120)에서 단일히터(110) 상부에 배치되는 영역을 의미하고, 돌출부(122)는 단일히터(110) 상부로부터 일측 방향으로 돌출되는 영역을 의미한다.
즉, 가열부(121) 및 돌출부(122)는 모두 일체형의 합금 중간층(120)의 부분 영역을 의미하며, 하부에 단일히터(110)가 배치된 영역이 가열부(121)이고, 단일히터(110)가 배치되지 않은 영역이 돌출부(122)이다. 예컨대 도 1 및 도 2에서는 단일히터(110)의 좌측 방향으로 합금 중간층(120)의 일부 영역이 돌출되어 있으며, 이 때 상기 돌출된 영역이 돌출부(122)로 정의된다. 가열부(121)는 단일히터(110)와 직접 맞닿아 있으므로 단일히터(110)로부터 직접 열이 전달되는 영역이고, 돌출부(122)는 단일히터(110)와 직접 맞닿아 있지는 않으므로 단일히터(110)로부터 간접적으로 열이 전달되는 영역이다. 따라서 가열부(121) 및 돌출부(122) 사이에는 온도 차이가 발생하게 되며, 이는 합금 중간층(120)에서 온도 구배가 발생하는 이유다.
한편, 합금 중간층(120)은 돌출부(122)가 형성된 방향 및 그와 반대되는 방향으로 이동 가능하도록 배치된다. 예컨대 도 1 및 도 2에서 합금 중간층(120)은 단일히터(110)의 좌측 방향 및 우측 방향으로 직선 이동될 수 있다. 이 경우 가열부(121) 및 돌출부(122)의 길이는 합금 중간층(120)의 이동에 따라 달라질 수 있다. 관련하여 도 1에서는 돌출부(122)의 길이를 "L"로 표기하였다.
합금 중간층(120)의 이동 방식은 특정되지 않는다. 예컨대 단일히터(110) 상부에 합금 중간층(120)이 평행하게 삽입될 수 있도록 소정 크기의 홈(미도시)을 형성하고, 상기 홈에 삽입된 합금 중간층(120)이 상기 홈을 따라 슬라이딩 이동되는 방식을 취할 수 있으며, 그 외의 다른 방법을 적용하는 것도 가능하다.
합금 중간층(120)의 이동은 PCR 마이크로 디바이스 시스템(100)이 다양한 샘플에서 요구되는 PCR 반응 온도에 대응하여 온도 구배를 튜닝 가능하도록 만든다. 샘플마다 DNA 크기별로 증폭에 요구되는 반응 온도가 상이한데, 본 발명에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템(100)은 합금 중간층(120)을 이동시켜 단일히터(110)와의 상대적 위치를 변화시키는 간단한 동작만으로도, 다양한 시료를 증폭할 수 있는 온도 구배를 형성할 수 있다는 장점이 있다. 이에 대해서는 후술할 시험예에서 구체적으로 설명하도록 한다.
PCR 마이크로 디바이스(130)는 합금 중간층(120)의 상부에 배치되는 것으로 샘플유체가 PCR 반응을 일으키는 곳에 해당한다. 구체적으로, PCR 마이크로 디바이스(130)는 합금 중간층(120)의 가열부(121) 및 돌출부(122)에 걸쳐서 배치된다. 따라서, PCR 마이크로 디바이스(130)가 가열부(121)와 돌출부(122)에 걸쳐 형성된 온도 구배에 영향을 받을 수 있다.
PCR 마이크로 디바이스(130)는 유리 기판(131)과, 유리 기판(131) 상부에 결합되고 내부에 샘플유체를 유입시켜 PCR 반응을 일으킨 후에 상기 샘플유체를 외부로 유출시키는 마이크로 채널(133)이 음각으로 새겨진 PDMS(폴리디메틸실록산)로 형성되는 반응채널부(132)를 포함한다.
유리 기판(131)은 반응채널부(132)를 하부에서 지지하는 기판 역할을 하는 것으로, 반응채널부(132)와 결합되어 폐쇄형의 마이크로 채널(133)을 형성한다. 반응채널부(132)에는 마이크로 채널(133)이 음각으로 새겨져 있는 바, 유리 기판(131)을 반응채널부(132)의 하부에 결합시킴으로써 마이크로 채널(133)이 완성된다.
반응채널부(132)는 가스 투과성(gas-permeable) 특성을 갖는 PDMS에 마이크로 채널(133)이 음각으로 새겨진 형태를 갖는다. 한편, 본 명세서에서 "샘플 유체"는 시험 샘플들(예컨대, DNA 주형 및 PCR 시약들)이 혼합되어 있는 시약 일반을 의미하며, 그 형태는 샘플 플러그(sample-plug)일 수 있다.
PCR 마이크로 디바이스(130)는 마이크로 채널(133)의 일단부에 연결되어 상기 샘플유체를 유입시키는 입구도관(134)과, 마이크로 채널(133)의 타단부에 연결되어 상기 샘플유체를 유출시키는 출구도관(135)을 더 포함한다. 즉, 입구도관(134)으로 유입된 샘플유체가 마이크로 채널(133)을 통과하면서 PCR 반응하고, 다시 출구도관(135)을 통해 유출된다. 입구도관(134) 및 출구도관(135)의 길이나 직경 등은 특정되지 않으며, 실리콘 튜브를 이용하여 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템(100)에서 PCR 마이크로 디바이스(130)에 형성되어 있는 마이크로 채널(133)은 서펜틴(serpentine) 형태로 형성될 수 있다. 이와 관련하여, 도 3에서는 도 1의 PCR 마이크로 디바이스 시스템(100)의 마이크로 채널(133) 형태를 개략적으로 도시하였다.
서펜틴 형태란 소위 "뱀이 똬리를 튼 형상"과 같이 유로가 구불구불하게 형성되어 있음을 의미한다. 예컨대, 도 3에 도시된 것과 같이 유로가 소정 간격을 두고 x방향 또는 y방향으로 평행 배치되되 하나의 유로 단부가 유체 진행방향으로 인접한 다른 유로의 단부와 연결됨으로써, 유체가 x방향 또는 y방향으로 오르락 내리락 하면서 각 유로들을 순차적으로 통과하도록 형성되는 형태를 서펜틴 형태라고 한다. 한편, 도 3에서는 마이크로 채널(133)의 형태를 설명하기 위해 유로 간격을 넓게 도시하였으나, 실제 유로 간격은 수 마이크로미터에 지나지 않음을 밝혀둔다.
합금 중간층(120)에 형성된 온도 구배에 의해, PCR 마이크로 디바이스(130)내에 형성된 마이크로 채널(133) 내에서도 온도 구배가 일어난다. 예컨대, 마이크로 채널(133)의 전단부(도 3에서 상측)에서는 열변성 온도를 가지고, 중단부 및 후단부(도 3에서 하측)에서는 결합/신장 온도를 가질 수 있다. 따라서, 마이크로 채널(133)을 따라 흐르는 샘플유체가 복수 회에 이르는 사이클(cycle)로 반응될 수 있다.
도 4는 도 1의 PCR 마이크로 디바이스(130)의 제조공정을 도시한 도면이다. 도 4를 참조하면, PCR 마이크로 디바이스(130)를 제조하기 위하여 서펜틴 형태를 갖는 마이크로 채널을 패턴화한 마스터 몰드(1)를 제조한다. 마스터 몰드(1)는 실리콘 웨이퍼에 SU-8(상품명: SU-8 3050, 에폭시 기반의 네가티브 포토레지스트)을 이용하여 포토리소그래피 공정을 통해 마이크로 채널을 패턴화함으로써 형성될 수 있다. 상기 마이크로 채널은 도 3에 도시된 패턴(서펜틴 패턴)으로 형성된다.
다음으로, 마스터 몰드(1) 상부에 PDMS 프리폴리머와 경화제의 10:1(w/w) 혼합물(2)을 채운다. 이어 상기 혼합물(2)을 열경화 하면 하부면에는 마스터 몰드(1)에 패턴 형성된 마이크로 채널이 복제되어 음각 형성된 반응채널부(132)를 얻을 수 있다. 다음으로 반응채널부(132)의 하부에 유리 기판(131)을 압착함으로써 내부에 마이크로 채널(133)을 형성할 수 있으며, 마이크로 채널(133)의 양 단부와 각각 연결되도록 입구도관(134) 및 출구도관(135)을 삽입함으로써 PCR 마이크로 디바이스(130)가 제조될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 실시예들은 높은 열전도도 및 낮은 열팽창계수를 갖는 인바 합금을 단일히터와 PCR 마이크로 디바이스 사이에 위치시킴으로써, 다양한 온도 구배를 형성할 수 있으며, 특히 인바 합금의 위치를 조정함으로써 다양한 샘플에서 요구되는 반응 온도에 대응하여 온도 구배를 튜닝 가능하다. 또한, 서펜틴 형태를 갖는 마이크로 채널을 구비하여 보다 용이하게 제조 가능하도록 단순화된 PCR 마이크로 디바이스를 제공하며, 전체 시스템의 소형화를 달성 가능하다.
이하, 본 발명에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템의 실시예 및 시험예에 대하여 설명한다.
실시예 및 시험예
1. 재료의 준비
SU-8 3050 및 SU-8 디벨로퍼는 마이크로캠 에서 구입했다. 폴리디메틸실록산(PDMS) 프리폴리머(Sylgard 184) 및 경화제는 다우코닝에서 구입했다. 인바(INVAR) 42 시트(110mm×200mm×0.5mm)는 닐라코에서 구입했다. PCR 완충용액, Taq 중합효소, dNTPs 및 pGEM-3Zf(+) 플라스미드 벡터는 프로메가에서 구입했다. 인간 유전체 DNA는 로체에서 구입했다. 인터페론-베타(IFN-β) 프로모터의 처음 282bp의 증폭을 위한 프라이머들은 바이오니어에서 구입했다. 100bp DNA급 마커 및 아가로오스 분말은 바이오샵에서 구입했다. 브롬화 에티듐(EtBr) 염료(Loding STAR)는 다인바이오에서 구입했다. 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA, V fraction)과 미네랄 오일은 시그마에서 구입했다. Bio-Rad C1000 써멀사이클러가 이용됐다.
2. PCR 마이크로 디바이스 시스템
서펜틴 형태를 갖는 마이크로 채널을 포토리소그래피 공정 및 PDMS 레플리카 몰드를 이용하여 형성했다. 먼저 포토리소그래피 공정으로 실리콘 웨이퍼 상에 서펜틴 마이크로 채널을 갖는 SU-8 마스터 몰드를 제조했다. 그리고 PDMS 프리폴리머와 경화제의 10:1(w/w) 혼합물을 완전히 탈기시키고 상기 마스터 몰드에 부었다. 이후, 80℃에서 30분간 경화시킴으로써 형성되는 PDMS 레플리카 몰드를 상기 마스터 몰드로부터 벗겨냈다. 상기 PDMS 레플리카 몰드에 샘플 유출입을 위한 홀(2mm 크기)을 펀칭하고, 서펜틴 마이크로 채널이 형성된 면을 산소 플라즈마(90W, 0.7torr, 40초)로 처리한 후에, 플라즈마 처리된 유리 기판과 영구적으로 접합시켜 마이크로 채널을 형성했다. 마지막으로 실리콘 튜브(내경 1mm, 외경 2mm)를 샘플 유출입구에 각각 삽입했다.
히터로 기능하는 통상의 핫 플레이트 위에 인바 시트를 배치하고, 인바 시트 위에는 상기 마이크로 채널을 배치함으로써 PCR 마이크로 디바이스를 제조했다. 서펜틴 형태를 갖는 마이크로 채널(대략 200~400bp 길이를 갖는 세 개의 타겟의 증폭을 위한 32써멀 사이클로 구성됨)의 폭, 높이, 총 길이는 각각 200㎛, 75㎛, 2.7m였다. 전체 PCR 마이크로 디바이스의 크기는 75mm×50mm였다.
3. 온도 측정 및 결과
온도 구배 형성에 재료가 미치는 영향을 비교하기 위하여 유리, PDMS, 인바(INVAR), 구리 및 알루미늄 시트의 표면 온도를 적외선(IR) 카메라(FLIR Thermovision A320)를 이용하여 측정했다. 상용되는 핫플레이트(MSH-20D)가 히터로 사용됐다. 정확한 온도 측정을 위해 흑색 절연테이프가 위에 언급한 시트들에 부착되었고, 각 온도는 이미지 분석프로그램(ThermaCAM Researcher 2.8)을 사용하여 평가됐다. 측정은 랜덤하게 선택된 17 지점에 대해서 60분 가량 진행되었다.
도 5a는 동일 면적(2.5mm×7.5mm)을 갖는 다른 종류의 시트에서 발생된 온도 구배를 나타내는 IR 카메라 이미지이고, 도 5b는 도 2a에 나타난 17개의 지점(spot)에서의 온도 그래프이다. 측정된 온도는 3회 반복 실험에서의 평균값이다.
도 5a를 참조하면 재료의 종류에 따라 다른 온도 구배를 보임을 확인할 수 있고, 도 5b를 참조하면 인바(INVAR) 시트에서 측정된 최고 온도와 최저온도는 각각 대략적으로 94.3±0.2℃ 및 58.8±1.1℃였다. 유리 및 PDMS 시트는 가장 낮은 온도가 각각 대략적으로 31.6±0.2℃ 및 32.8±1.1℃로 측정됐다. 반면, 구리(열 전도율 398WK-1m-1) 및 알루미늄(열 전도율 247 WK-1m-1) 시트는 가장 낮은 온도가 각각 대략적으로 82.0±0.3℃ 및 79.9±0.3℃로 측정됐다.
시험에 이용된 프라이머들(409bp, 282bp, 230bp 유전자 단편)의 계산된 녹는 온도(Tm)가 각각 59℃, 60℃, 72℃임을 감안하여, 결합(annealing)은 상기 계산된 값보다 5℃낮은 온도에서 수행되었고, 그 결과, 인바(INVAR) 시트가 단일 히터를 구비한 PCR 마이크로 디바이스에 가장 적합함을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 구리 및 알루미늄 시트의 경우에는 가장 낮은 온도조차 타겟의 증폭에 이용되기에는 너무 높았으며, 이는 구리 및 알루미늄 시트의 길이가 시편보다 길어져야 함을 의미한다. 즉, 구리 및 알루미늄 시트의 경우 소형화를 도모하는 PCR 마이크로 디바이스에 부적합하다. 또한, 유리 및 PDMS 시트의 경우에는 온도 변화가 너무 커서 결합 및 신장에 필요한 효율적인 시간을 제공하기 어려우므로, 마찬가지로 PCR 마이크로 디바이스에 부적합하다. 따라서, PCR 마이크로 디바이스에 적용 가능한 면적에 있어서는, 상대적으로 균일한 온도 구배를 보이는 인바(INVAR) 시트가 PCR 마이크로 디바이스에서 다양한 결합 온도를 구현하기에 적합한 소재임을 확인할 수 있었다.
추가적으로, 인바 시트가 적용된 PCR 마이크로 디바이스에서의 온도 측정도 이루어졌다.
도 6a는 시제작된 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템의 이미지이다. 도 6a를 참조하면, 인바 시트가 PCR 마이크로 디바이스 및 히터 사이에 개재되어 있음을 확인할 수 있다.
도 6b는 인바 시트와 유리 기판 사이의 온도 구배를 보여주는 이미지이다. 도 6b를 참조하면, 열은 인바 시트에서 유리 기판의 표면으로 전달되었고, 상기 유리 기판의 표면에서 측정된 온도가 히터 온도와 거의 동일한 것으로 볼 때 열 손실이 거의 없음을 알 수 있다. 이는 인바 시트에 나타난 온도 구배가 PCR 마이크로 디바이스의 서펜틴 형태를 갖는 마이크로 채널 내부의 온도 구배와 거의 동일하다는 것을 의미한다. 한편, 인바 시트가 보라색으로 표시되는 것은 흑색 절연테이프가 부착되지 않아 IR 카메라에 의해 정확한 온도가 측정되지 않기 때문이다.
도 6c 내지 6e는 유리 기판이 배치된 인바 시트의 단부와 단일 히터 사이의 거리에 따른 온도 구배를 보여주는 이미지이다. 인바 시트의 일측 단부는 단일 히터 위에 놓여지고(본 명세서에서 가열부로 지칭), 타측 단부는 상기 단일 히터를 벗어나도록 배치된다(본 명세서에서 돌출부로 지칭). 도 5c 내지 도 5e에서 상기 돌출부의 길이는 각각 3cm, 4cm, 5cm이다. 상기 돌출부의 길이는 단일 히터의 단부에서 돌출부의 바깥 단부까지의 수직 거리를 의미한다. 단일 히터의 온도는 95℃로 맞춰졌다. 그리고 흑색 절연테이프는 유리 슬라이드에만 부착됐다.
도 6c 내지 도 6e를 참조하면, 상기 돌출부의 길이에 따라 조금씩 다른 온도 구배 패턴이 형성됨을 확인할 수 있으며, 이와 관련하여 도면에는 A,B,C로 각 온도 구간을 표기하였다. 상기 A,B,C는 PCR 수행에 있어 각각 열변성, 결합, 신장 온도 영역에 대응한다. 즉, 인바 시트의 위치를 조절함으로써(돌출부의 길이 조정) 다양한 온도 구배 패턴을 형성할 수 있으며, 이는 사용되는 주형 길이에 대응하는 열변성, 결합 및 신장 온도 영역을 튜닝 가능함을 의미한다. 예컨대, 인간 유전체 DNA와 같이 상당히 큰 사이즈의 주형은 상대적으로 열변성 온도 영역에서 긴 시간이 요구된다. 인간 유전체 DNA는 409bp 및 282bp 유전자 단편을 증폭시키기 위한 주형으로 이용되는 바, 상기 돌출부의 길이는 4cm에서 고정되었고, 상대적으로 짧은 플라스미드 벡터는 230bp 유전자 단편을 증폭시키기 위한 주형으로 이용되는 바 상기 돌출부의 길이가 5cm에서 고정되었다. 한편, 돌출부의 길이가 3cm인 경우에는 열변성 영역에서 상대적으로 긴 시간이 소요되고, 결합 영역에서 상대적으로 짧은 시간이 소요되므로 샘플 증폭에는 적합하지 않았다. 돌출부의 길이가 4cm일 때, 열변성, 결합, 신장 단계에서의 평균 온도는 각각 95.7±0.8℃, 56.7±1.4℃, 73.2±2.8℃이었고, CV값으로 표현되는 온도 정확도들은 0.8%(n=15), 2.4%(n=15), 3.8%(n=15)였다.
4. PCR 수행 및 결과
제조된 PCR 마이크로 디바이스 시스템을 이용하여 PCR을 수행했다. pGEM-3Zf(+) 플라스미드 벡터와 인간 유전체 DNA를 주형으로 사용하였다. pGEM-3Zf(+) 플라스미드 벡터(1μgμL-1)를 더 희석시키고 PCR 시약에 첨가하여 반응 당 50pg의 최종 주형 농도로 만들었다. 인간 유전체 DNA(200ngμL-1)를 더 희석시키고 PCR 시약에 첨가하여 반응 당 20ng의 최종 주형 농도로 만들었다. pGEM-3Zf(+) 플라스미드 벡터에서 230bp 유전자 단편을 증폭시키기 위한 프라이머 시퀀스는 다음과 같다: 5'-CCG GCG AAC GTG GCG AGA AAG GAA GGG AAG AAA GC-3' (순행) 및 5'-TCG CCT TGC AGC ACA TCC CCC TTT CGC CAG C-3' (역행). TTF-1에서 409bp 유전자 단편을 증폭시키기 위한 프라이머 시퀀스는 다음과 같다: 5'-CAC CTT GCT ATA CGG TCG GAC-3' (순행) 및 5'-AGA GTC CAG AGC CAT GTC AGC-3' (역행).
상기 PCR은 25μL 샘플을 이용하여 수행되었고, 상기 샘플은 10x 완충제, 0.16mM dNTPs 혼합물, 0.06U/㎕의 Taq 중합효소, 0.5μM의 순행 프라이머(forward primer)와 역행 프라이머(reverse primer)들 및 1.5㎎/㎖의 BSA를 포함했다. 상기 BSA는 내부 마이크로 채널의 부동태화(passivate)를 위해 6μL/min의 유속으로 도입되었다. 그리고 미네랄 오일이 발생 가능한 공기버블의 형성을 억제하기 위해 동일한 유속으로 도입되었다. 미네랄 오입의 도입 직후에 PCR 혼합물이 대략 2μL/min의 유속으로 도입되었다. 결과는 아가로스겔 전기영동으로 분석되었고, 타겟 엠플리콘은 EtBr로 착색되고 Gel Doc EZ system으로 탐지됐다. 비교를 위해 써멀사이클러(Bio-Rad C1000 thermal cycler)를 이용하여 PCR이 수행됐다. pGEM-3Zf(+) 플라스미드 벡터에서 230bp 유전자 단편을 증폭시키기 위해, 써멀사이클링이 25초간 95℃에서, 30초간 70℃에서, 30초간 72℃에서 32사이클 수행됐다(5분간 95℃에서 초기 열변성 수행). 282bp IFN-β 및 409bp TTF-1 유전자 단편을 증폭시키기 위해, 써멀사이클링이 30초간 95℃에서, 30초간 57℃에서, 40초간 72℃에서 32사이클 수행됐다(7분간 95℃에서 초기 열변성 수행). 모든 반응의 최종 신장 단계는 7분간 72℃에서 수행됐다.
도 7은 본 발명에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템에서 수행된 DNA 증폭 결과를 나타내는 도면이다. 409bp 및 282bp 유전자 단편의 증폭을 위해 인바 시트의 돌출부 길이는 4cm로 고정되었고(도 5d 참조), 230bp 유전자 단편의 증폭을 위해 인바 시트의 돌출부 길이는 5cm로 고정되었다(도 5e 참조). 전체 반응은 주형에 관계없이 대략 29분간 진행되었다. PCR 마이크로 디바이스의 마이크로 채널의 총 부피는 대략 51.8 μL이었고, 상기 마이크로 채널 내로 도입된 샘플의 유속은 2μL/min으로 통제되었다. 발생 가능한 에어 버블의 형성은 미네랄 오일로 억제했다. 230bp 타겟 엠플리콘이 pGEM-3Zf(+) 플라스미드 벡터를 이용해 증폭됐고, 282bp 및 409bp 유전자 단편이 인간 유전자 DNA를 이용해 증폭됐다.
도 7을 참조하면, 도 7에 도시된 그래프는 Image J 소프트웨어를 이용한 밴드 강도(intensity)들을 분석함으로써 얻어진 타겟 엠플리콘들의 상대적 강도 스케일을 나타낸다. 각 그래프에는 비교를 위해 써멀사이클러를 이용한 PCR 수행 결과가 함께 나타나 있다. 도 7a를 참조하면, pGEM-3Zf(+) 플라스미드 벡터의 경우, 본 발명에 따른 PCR 마이크로 디바이스를 이용하여 얻어진 밴드 강도들은 써멀사이클러를 이용해 얻어진 강도들의 대략 92.0% 및 76.2%였다. 도 7b를 참조하면, IFN-β의 경우, 본 발명에 따른 PCR 마이크로 디바이스를 이용하여 얻어진 밴드 강도들은 써멀사이클러를 이용해 얻어진 강도들의 대략 64.2%, 51.3%, 40.8%였다. 도 7c를 참조하면, TTF-1의 경우, 본 발명에 따른 PCR 마이크로 디바이스를 이용하여 얻어진 밴드 강도들은 써멀사이클러의 강도들의 대략 38.2%였다. IFN-β 및 TTF-1의 경우 써멀사이클러를 이용해 얻어진 강도들의 절반 이하의 세기를 보였지만, 타겟들을 명확히 구분하기에는 도 7에 나타난 것과 같이 무리가 없었는 바, 본 발명에 따른 PCR 마이크로 디바이스 시스템이 PCR 반응을 수행하기에 신뢰할 만한 성능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
100: PCR 마이크로 디바이스 시스템 110: 단일히터
120: 합금 중간층 121: 가열부
122: 돌출부 130: PCR 마이크로 디바이스
131: 유리기판 132: 반응채널부
133: 마이크로 채널 134: 입구도관
135: 출구도관

Claims (6)

  1. 단일히터;
    상기 단일히터 상부에 배치되는 합금 중간층; 및
    상기 합금 중간층의 상부에 배치되는 것으로, 내부에 샘플유체를 유입시켜 PCR 반응을 일으킨 후에 상기 샘플유체를 외부로 유출시키는 마이크로 채널을 구비하는 PCR 마이크로 디바이스를 포함하고,
    상기 합금 중간층은 인바(INVAR)합금으로 형성되는 PCR 마이크로 디바이스 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단일히터는 핫플레이트인 PCR 마이크로 디바이스 시스템.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 PCR 마이크로 디바이스는 유리 기판과, 상기 유리 기판 상부에 결합되고 마이크로 채널이 음각으로 새겨진 PDMS(폴리디메틸실록산)로 형성되는 반응채널부를 포함하고, 상기 마이크로 채널은 서펜틴(serpentine) 형태로 형성되는 PCR 마이크로 디바이스 시스템.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 PCR 마이크로 디바이스는 상기 마이크로 채널의 일단부에 연결되어 상기 샘플유체를 유입시키는 입구도관과, 상기 마이크로 채널의 타단부에 연결되어 상기 샘플유체를 유출시키는 출구도관을 더 포함하는 PCR 마이크로 디바이스 시스템.
  5. 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
    상기 합금 중간층은, 상기 단일히터 상부에 배치되는 가열부와 상기 단일히터 상부로부터 일측 방향으로 돌출된 돌출부를 포함하고, 상기 PCR 마이크로 디바이스는 상기 가열부 및 돌출부에 걸쳐서 배치되는 PCR 마이크로 디바이스 시스템.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 합금 중간층은 상기 단일히터에 대하여 수평방향으로 이동 가능하도록 배치되는 PCR 마이크로 디바이스 시스템.
KR1020130127001A 2013-10-24 2013-10-24 온도 구배 형성을 위한 합금 중간층을 갖는 pcr 마이크로 디바이스 시스템 KR101459295B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130127001A KR101459295B1 (ko) 2013-10-24 2013-10-24 온도 구배 형성을 위한 합금 중간층을 갖는 pcr 마이크로 디바이스 시스템

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130127001A KR101459295B1 (ko) 2013-10-24 2013-10-24 온도 구배 형성을 위한 합금 중간층을 갖는 pcr 마이크로 디바이스 시스템

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101459295B1 true KR101459295B1 (ko) 2014-11-10

Family

ID=52287375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130127001A KR101459295B1 (ko) 2013-10-24 2013-10-24 온도 구배 형성을 위한 합금 중간층을 갖는 pcr 마이크로 디바이스 시스템

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101459295B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130059290A1 (en) * 2009-09-25 2013-03-07 Alere San Diego, Inc. Detection of nucleic acids in crude matrices

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130059290A1 (en) * 2009-09-25 2013-03-07 Alere San Diego, Inc. Detection of nucleic acids in crude matrices

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Bulk-micromachined submicroliter-volume PCR chip with very rapid thermal response and low power consumption
US8616227B1 (en) Multilevel microfluidic systems and methods
US8173077B2 (en) Reusable PCR amplification system and method
Guijt et al. Chemical and physical processes for integrated temperature control in microfluidic devices
US9383295B2 (en) Microfluidic devices and methods
Hsieh et al. Enhancement of thermal uniformity for a microthermal cycler and its application for polymerase chain reaction
Chen et al. Analytical study of a microfludic DNA amplification chip using water cooling effect
JP2010528676A (ja) 集積リアルタイムｃｅ検出を用いるマイクロチップ大容量ｐｃｒ
Trinh et al. Planar poly (dimethylsiloxane)(PDMS)–glass hybrid microdevice for a flow-through polymerase chain reaction (PCR) employing a single heater assisted by an intermediate metal alloy layer for temperature gradient formation
Ma et al. Peanut detection using droplet microfluidic polymerase chain reaction device
Wu et al. Hand-held syringe as a portable plastic pump for on-chip continuous-flow PCR: miniaturization of sample injection device
US11772099B2 (en) Integrated thermoplastic chip for rapid PCR and HRMA
JP2017063779A (ja) Ｐｃｒ用温度調節装置及び核酸増幅装置
US20220193682A1 (en) Thermocycling system, composition, and microfabrication method
Mahjoob et al. Rapid microfluidic thermal cycler for polymerase chain reaction nucleic acid amplification
Nie et al. Multichannel oscillatory-flow PCR micro-fluidic chip with controllable temperature gradient
Kim et al. PID temperature control system-based microfluidic PCR chip for genetic analysis
KR101459295B1 (ko) 온도 구배 형성을 위한 합금 중간층을 갖는 pcr 마이크로 디바이스 시스템
US20070004032A1 (en) Chip device for a thermally cycled reaction
Chien et al. A micro circulating PCR chip using a suction-type membrane for fluidic transport
CN111500406B (zh) 一种微流控pcr芯片
Yu et al. Fabrication and characterization of a flow-through PCR device with integrated chromium resistive heaters
WO2004040645A1 (en) Microfluidic heat exchanger for locatized temperature control
Hsieh et al. A two-dimensional, self-compensated, microthermal cycler for one-step reverse transcription polymerase chain reaction applications
GR20170100305A (el) Μικρορευστονικοι αντιδραστηρες και διαδικασια για την παραγωγη τους

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171026

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181105

Year of fee payment: 5