GR20170100305A - Μικρορευστονικοι αντιδραστηρες και διαδικασια για την παραγωγη τους - Google Patents

Abstract

Μικρορευστονικοί αντιδραστήρες αποτελούμενοι από τουλάχιστον ένα κανάλι και/ή τουλάχιστον έναν θάλαμο σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος ή εύκαμπτο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος τα οποία σφραγίζονται μέσω ενός υμενίου πολυιμιδίου το οποίο περιλαμβάνει στην επιφάνεια συγκόλλησης ακρυλική κόλλα Β-σταδίου. Διεργασία για την κατασκευή τέτοιων μικρορευστονικών αντιδραστήρων και χρήσεις τους.

Description

Μικρορευστονικοί αντιδραστήρες και διαδικασία παραγωγής τους

Πεδίο εφεύρεσης

Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με τον τομέα της κατασκευής μικρορευστονικών διατάξεων και εργαστηρίων σε ψηφίδα. Πιο συγκεκριμένα, συνδέεται με σφραγισμένους μικρορευστονικούς αντιδραστήρες κατασκευασμένους σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος ή σε φύλλο εύκαμπτου υποστρώματος τυπωμένου κυκλώματος.

Υπόβαθρο της εφεύρεσης

Η μικρορευστομηχανική είναι το πεδίο της επιστήμης και της τεχνολογίας που σχετίζεται με τον χειρισμό και την επεξεργασία μικρών (στην κλίμακα των μικρο/νανολίτρων) ποσοτήτων ρευστών, χρησιμοποιώντας μικρορευστονικά δίκτυα με ελάχιστη διάσταση της τάξης δεκάδων μέχρι εκατοντάδων μικρομέτρων.

Χαρακτηριστικά πλεονεκτήματα των μικρορευστονικών συστημάτων περιλαμβάνουν τη δυνατότητα χρήσης πολύ μικρών ποσοτήτων ακριβών αντιδραστηρίων και σπάνιων δειγμάτων, τη διεξαγωγή ανίχνευσης υψηλής ανάλυσης, ακρίβειας και ευαισθησίας, τη μείωση του χρόνου ανάλυσης, του κόστους και του αποτυπώματος για τις αναλυτικές μικροδιατάξεις [Whitesides; Nature; 2006; 368-373; 442],

Το ενδιαφέρον για τις μικρορευστονικές διατάξεις συνεχώς αυξάνεται τις δύο τελευταίες δεκαετίες. Η σμίκρυνση συμβατικών εργαστηριακών διεργασιών σε μικρορευστονικές πλατφόρμες χρησιμοποιώντας καλά εδραιωμένες μικροκατασκευαστικές τεχνολογίες για την κατασκευή μικροδιατάξεων έχει προσελκύσει την προσοχή, και έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη των λεγάμενων διατάξεων ή συστημάτων εργαστηρίων σε ψηφίδα. Τα εργαστήρια σε ψηφίδα έχουν ως στόχο την ολοκλήρωση, τη σμίκρυνση, την παραλληλοποίηση και την αυτοματοποίηση βιοχημικών διεργασιών, οι οποίες διενεργούνται σε μια μικρή ψηφίδα με διαστάσεις από μερικά τετραγωνικά χιλιοστά μέχρι μερικά τετραγωνικά εκατοστά [Erickson and Li; Analytica Chimica Acta; 2004; 11-26; 507],

Τα συνδυαζόμενα πλεονεκτήματα της ευκολίας στην κατασκευή, του χαμηλού κόστους, και της μεγάλης ποικιλίας των ιδιοτήτων των υλικών, καθιστούν τα πολυμερή ως το υλικό που επιλέγεται όταν πρόκειται για κατασκευή μικρορευστονικών διατάξεων είτε ως μεμονωμένες διατάξεις ή ως μέρη πλατφορμών εργαστηρίου σε ψηφίδα. Πολυμερή όπως το Πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο (PDMS) [McDonald, et al., Acc. Chem. Res.; 2002; 491-499; 35], η Πολυουρεθάνη (PU) [Marshall, et al.; Analytical chemistry; 2012; 9640-9645; 84], ο Πολυμεθυλομεθακρυλικός εστέρας (PMMA) [Hong, et al.; Microfluidics and nanofluidics; 2010; 1125-1133; 9], το συμπολυμερές κυκλικής ολεφίνης (COC) [Marshall, et al.; Journal of Chromatography A; 2014; 139-142; 1331], το πολυμερές κυκλικής ολεφίνης (COP) [Abad, et al.; ELECTROPHORESIS; 2012; 3187-3194; 33], το Πολυαιθυλένιο (PE) [Khademhosseini, et al.; Lab on a Chip; 2004; 425-430; 4], και το SU-8, μια συχνά χρησιμοποιούμενη εποξική αρνητική ρητίνη [Lin, et al.; Journal of Micromechanics and Microengineering; 2002; 590; 12], έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί για την κατασκευή μικρορευστονικών διατάξεων και εργαστηρίων σε ψηφίδα.

Πρόσφατα, υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη χρήση υποστρωμάτων τυπωμένου κυκλώματος (PCB) ως (σταθερό ή εύκαμπτο) υπόστρωμα για την ανάπτυξη μικρορευστονικών διατάξεων [Merkel, etal.; Sensors and Actuators, A: Physical; 1999; 98-105; 77, GaBmann, etal.; Sensors and Actuators, A: Physical; 2007; 231-235; 133, C. Aracil et al.; Microelectronic Engineering; 2015; 13-18; 131]. Η καλά εδραιωμένη τεχνολογία των υποστρωμάτων τυπωμένου κυκλώματος (PCB), η οποία είναι βιομηχανικά διαθέσιμη για τη μαζική παραγωγή ηλεκτρονικών κυκλωμάτων και καταναλωτικών ηλεκτρονικών ειδών, καθώς και το χαμηλό κόστος των υποστρωμάτων τα καθιστά εξαιρετικά ελκυστικά.

Επιπλέον, είναι τεράστιες οι δυνατότητες ολοκλήρωσης ηλεκτρονικών, μικρορευστονικών, αισθητήρων και ενεργοποιητών που προσφέρουν τα υποστρώματα τυπωμένου κυκλώματος.

Τα υποστρώματα τυπωμένου κυκλώματος (PCBs) συνήθως αποτελούνται από εναλλασσόμενα επίπεδα μονωτικών στρωμάτων πλαστικοποιητών - όπως το εύκαμπτο υπόστρωμα με επιβραδυντικό φλόγας (FR4), το οποίο είναι υαλοβάμβακας υφασμένος με μια εποξική ρητίνη- και στρώματα αγώγιμου μετάλλου. Το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο μέταλλο είναι ο χαλκός, ο οποίος μπορεί να βρίσκεται σε πολλά στρώματα, διαφορετικού πάχους αν είναι επιθυμητό.

Διάφορες υλοποιήσεις της τεχνολογίας τυπωμένου κυκλώματος (PCB) για μικρορευστονικές εφαρμογές έχουν προταθεί στη βιβλιογραφία για την σχηματοποίηση μικρορευστονικών σχεδίων και τη σφράγιση αυτών, για τη δημιουργία σφραγισμένων μικροκαναλιών και μικροθαλάμων. Οι περισσότερες από αυτές τις υλοποιήσεις απαιτούν τροποποιήσεις στη ροή της διαδικασίας κατασκευής των υποστρωμάτων τυπωμένου κυκλώματος, και κάποιου είδους προ/μετά επεξεργασία για την πραγματοποίηση σφραγισμένου μικρορευστονικού συστήματος. Παρακάτω ακολουθεί περιγραφή της τεχνολογίας αιχμής σχετικά με την κατασκευή μικρορευστομηχανικών συστημάτων και εργαστηρίων σε ψηφίδα και της σφράγισης με βάση την τεχνολογία τυπωμένων κυκλωμάτων (PCB).

Πρώιμη εργασία στην κατασκευή μικρορευστονικών διατάξεων χρησιμοποιώντας την τεχνολογία τυπωμένων κυκλωμάτων υπέδειξε τη χρήση του χαλκού ως δομικό υλικό για το σχηματισμό των μικρορευστονικών δικτύων. Χρησιμοποιώντας λιθογραφία ακολουθούμενη από αφαίρεση του εξωτερικού στρώματος χαλκού, σχηματίστηκαν [Merkel, et al.; Sensors and Actuators, A: Physical; 1999; 98-105; 77] [Nguyen and Huang; Sensors and Actuators A: Physical; 2001; 104-1 11; 88] κανάλια τριών πλευρών (χαλκός στα πλευρικά τοιχώματα, FR4 στον πυθμένα), διαδικασία που ακολουθήθηκε από τη σφράγιση των καναλιών με ένα επίπεδο πλακίδιο (π.χ. αποτελούμενο από γυαλί) χρησιμοποιώντας εποξική ρητίνη για το σχηματισμό πλήρως σφραγισμένων μικροκαναλιών. Ένας άλλος τρόπος σφράγισης μικροκαναλιών σχηματοποιημένων σε χαλκό (με λιθογραφία και υγρή εγχάραξη) βασίστηκε στην απόθεση με περιστροφή μιας κόλλας η οποία σκληραίνει μετά από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία και η οποία συγκολλάται στο γυάλινο κάλυμμα για να σχηματιστούν σφραγισμένα μικροκανάλια [Li, et al.; Lab on a Chip - Miniaturisation for Chemistry and Biology; 2014; 860-864; 14],

Επιπλέον, εγχάραξη ενός εξωτερικού στρώματος χαλκού για το σχηματισμό μικροκαναλιών (χαλκός στα πλευρικά τοιχώματα, FR4 στον πυθμένα) χρησιμοποιήθηκε σε δύο υποστρώματα τυπωμένου κυκλώματος, τα οποία στη συνέχεια, μετά από ευθυγράμμιση και επικόλληση (με εποξική ρητίνη), σχημάτισαν ένα πλήρως σφραγισμένο μικρορευστονικό δίκτυο [GaBmann, et al.; Sensors and Actuators, A: Physical; 2007; 231-235; 133, Wego, et al.; Journal of Micromechanics and Microengineering; 2001; 528-531; 11]. Αυτή η τεχνική μπορεί να επαναληφθεί όσες φορές είναι απαραίτητο για οποιονδήποτε αριθμό στρωμάτων πάνω στα οποία εκτείνεται το μικρορευστονικό δίκτυο.

Η κατασκευή μικρορευστονικών καναλιών αναφέρθηκε επίσης σε εύκαμπτο επιμεταλλωμένο φύλλο πολυιμιδίου (το οποίο αναφέρεται ως εύκαμπτο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος, FPC, το οποίο επίσης χρησιμοποιείται στη βιομηχανία τυπωμένων κυκλωμάτων), και πιο ειδικά σε ένα φωτοευαίσθητο τύπο εύκαμπτου φύλλου (π.χ. ΡΙ2732, DuPont), το οποίο μπορεί να σχηματοποιηθεί μέσω λιθογραφίας, και σε ένα μη-φωτοευαίσθητο τύπο (π.χ. ΡΙ2611, DuPont), το οποίο μπορεί να σχηματοποιηθεί με χρήση τεχνικών ξηρής εγχάραξης.

Η διαδικασία σφράγισης που ακολουθήθηκε χρησιμοποιεί διαλύτη η-μεθυλ-2-πυρρολιδόνης (το ΝΜΡ είναι ένας διογκωτικός παράγοντας) με στόχο την τροποποίηση και διόγκωση της επιφάνειας του μερικώς ιμιδοποιημένου πολυιμιδίου, επιτρέποντας μεγαλύτερη διάχυση στο κάλυμμα πολυιμιδίου [Metz, Holzer and Renaud; Lab on a Chip - Minituarization for Chemistry and Biology; 2001 ; 29-34; 1], Ένας μη-φωτοευαίσθητος τύπος πολυιμιδίου, το Pyralux™, μικροσχηματοποιήθηκε μέσω εγχάραξης πλάσματος (O2/SF6) και η διάταξη σφραγίστηκε χρησιμοποιώντας κάλυμμα πολυολεφίνης το οποίο διαθέτει κόλλα, με βάση το πολύ (διμεθυλο) σιλοξάνιο, που ενεργοποιείται μέσω πίεσης [Mavraki, et al.; Procedia Engineering; 2011; 1245-1248; 25], Ομοίως, κατασκευάστηκε μια άλλη διάταξη με την ίδια μέθοδο σχηματοποίησης και τα ίδια υλικά, αλλά η σφράγιση πραγματοποιήθηκε με μια εμπορικά διαθέσιμη σιλικονούχα κολλητική ταινία [Moschou, et al.; Sensors and Actuators B: Chemical; 2014; 470-478; 199], την Kapton® PI.

Επιπροσθέτως, μια ευρέως χρησιμοποιούμενη εποξική ρητίνη, η SU-8, έχει χρησιμοποιηθεί για το σχηματισμό μικροκαναλιών και μικροθαλάμων πάνω σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος. Στο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος κατασκευάστηκαν πρώτα τα ηλεκτρικά στοιχεία και στη συνέχεια το υπόστρωμα καλύφθηκε με ένα στρώμα SU-8 για να βοηθήσει την προσκόλληση των ρευστονικών, τα οποία σχηματοποιήθηκαν σε επόμενο στρώμα SU-8 [Aracil, et al.; Microelectronic Engineering; 2015; 13-18; 131], Μετά την κατεργασία με UV, το ψήσιμο και την εμφάνιση της SU-8, η διάταξη σφραγίστηκε με ένα παχύτερο στρώμα SU-8 με τη μέθοδο BETTS (Bonding, UV-Exposure and Transferring Technique in SU-8, τεχνική συγκόλλησης, έκθεσης σε UV και μεταφορά σε SU-8) [Aracil, et al.; Journal of Micromechanics and Microengineering; 2010; 035008; 20]. Η διάταξη που περιγράφηκε εξυπηρετούσε σκοπούς ανάμειξης. Σε μια άλλη περίπτωση, τα ηλεκτρικά στοιχεία σχηματοποιήθηκαν στο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος μέσω εγχάραξης του χαλκού. Έπειτα, με τη βοήθεια ενός στρώματος SU-8, η επιφάνεια του υποστρώματος τυπωμένου κυκλώματος επιπεδοποιήθηκε και κατασκευάστηκαν αντιστάσεις (Pt) μέσω εναπόθεσης λευκόχρυσου και εν συνεχεία διαδικασίας αφαίρεσής του (lift-off)· Τα μικρορευστονικά δίκτυα σχηματίστηκαν στη συνέχεια σε ένα δεύτερο στρώμα SU-8. Ακολούθως, ένα λεπτό στρώμα από ΡΜΜΑ εναποτέθηκε με επίστρωση στην επιφάνεια των καναλιών SU-8. Τέλος, η διάταξη σφραγίστηκε με παχύτερο πλακίδιο από ΡΜΜΑ, με θερμική συγκόλληση μέσω θερμικής πρέσας [Kontakis, et al.; Microelectronic Engineering; 2009; 1382-1384; 86].

Πολύ πρόσφατα, ξηρά υμένια φωτοευαίσθητης ρητίνης όπως το TMMF ή το 1002F έχουν χρησιμοποιηθεί για την επιπεδοποίηση, τον εγκλεισμό και τη δημιουργία μικρορευστονικών δικτύων αλλά και τη σφράγισή τους σε υποστρώματα τυπωμένου κυκλώματος. Πιο ειδικά, το TMMR S2000 ή αλλιώς το TMMF S20000 όταν το εμπορεύεται ως ξηρή ρητίνη η εταιρία Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd [Wangler, et al.; Journal of Micromechanics and Microengineering; 2011; 21], χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία μικρορευστονικών δικτύων στην επιφάνεια υποστρώματος τυπωμένου κυκλώματος.

Ο σχηματισμός του μικρορευστονικού δικτύου επιτεύχθηκε μέσω έκθεσης σε ακτινοβολία UV, εμφάνιση και ψήσιμο σε συγκεκριμένες συνθήκες. Τα κανάλια σφραγίστηκαν τελικώς με ένα δεύτερο στρώμα TMMF το οποίο επίσης εκτέθηκε σε UV και σκληρύνθηκε για μια μέρα [Palacios-Aguilera, et al.; International Conference on Quantum Nano and Micro Technologies (ICQNM); 2011; 71-76]. To πολυμερές 1002F έχει χρησιμοποιηθεί για την επιπεδοποίηση και τον εγκλεισμό στοιχείων που είναι τοποθετημένα στην επιφάνεια υποστρωμάτων τυπωμένου κυκλώματος, χύνοντας το πολυμερές και χρησιμοποιώντας μια θερμαινόμενη πρέσα και έκθεση σε ακτινοβολία UV. Ένα δεύτερο στρώμα πολυμερούς 1002F χρησιμοποιήθηκε για τη σχηματοποίηση του μικρορευστονικού δικτύου. Ομοίως, χρησιμοποιήθηκε θερμαινόμενη πρέσα για να επιπεδοποιήσει το στρώμα του πολυμερούς 1002F και μετά από UV λιθογραφία επιτεύχθηκε ο σχηματισμός του μικρορευστονικού δικτύου. Η σφράγιση της διάταξης επιτεύχθηκε με διαδικασία επικόλλησης στους 1 10°C χρησιμοποιώντας ταινία ή ένα λεπτό στρώμα κατεργασμένου πολυμερούς 1002F [Wu, et al.; Proceedings - Electronic Components and Technology Conference; 2011; 1576-1581, Wu, et al.; 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences 2011, MicroTAS 2011; 2011; 1819-1821 ; 3],

Για τη διευκόλυνση της μαζικής παραγωγής σε χαμηλό κόστος μικρορευστονικών διατάξεων, ερευνητές έχουν προτείνει υλικά με τα οποία οι κατασκευαστές υποστρωμάτων τυπωμένου κυκλώματος είναι εξοικειωμένοι, όπως ξηρές ρητίνες με βάση το πολυιμίδιο οι οποίες έχουν πρόσφατα χρησιμοποιηθεί ως στρώματα σχηματοποίησης πάνω στην επιφάνεια εμπορικά διαθέσιμων υποστρωμάτων τυπωμένων κυκλωμάτων. Για παράδειγμα, μικροαναμείκτες διαφόρων γεωμετριών, έχουν κατασκευαστεί, μετά από σφράγισή τους με λεπτό υμένιο πολυολεφίνης [Papadopoulos, et al.; Microelectronic Engineering; 2014; 42-46; 124, Kefala, et al.; Microfluidics and Nanofluidics; 2015; 1047-1059; 19],

Επιπροσθέτως, έχουν κατασκευαστεί μικρού μήκους κανάλια σε πολυεπίπεδα υποστρώματα τυπωμένου κυκλώματος με τη συμβατική μέθοδο επεξεργασίας υποστρωμάτων τυπωμένου κυκλώματος, ωστόσο εξαιτίας του μικρού μήκους των καναλιών δεν αναπτύσσονται υψηλές πιέσεις κατά τη λειτουργία τους [Vasilakis, et al.; Applied Surface Science; 2016; 69-75; 368], Επιπλέον, έχουν κατασκευαστεί μικρορευστονικές διατάξεις για ενίσχυση DNA με μηχανική κατεργασία αριθμητικού ελέγχου μέσω υπολογιστή ή με λιθογραφία σε υμένιο φωτοευαίσθητης ξηρής ρητίνης πολυιμιδίου, για το σχηματισμό μαιανδρικών μικροκαναλιών. Στην τελευταία δουλειά, ο χαλκός διευκόλυνε την ενσωμάτωση θερμαντικών μικροαντιστάσεων στην ίδια ψηφίδα, οι οποίες καθορίζουν τις θερμικές ζώνες που είναι απαραίτητες για ισοθερμικές ή μη αντιδράσεις ενίσχυσης DNA όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) [Kaprou, et al.; Microsystem Technologies; 2016; 22:1529-1536], [Kaprou, et al.; Progress in Biomedical Optics and Imaging - Proceedings of SPIE; 2015; 9518]. Μέθοδοι και υλικά για την κατασκευή μικρορευστονικών διατάξεων με βάση το PCB για την εκτέλεση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης έχουν περιγράφει επίσης στην US2013/02 10080 Α1 , ωστόσο η διαδικασία σφράγισης δεν έχει περιγράφει καθόλου.

Για το σχηματισμό μικροκαναλιών και τη σφράγισή τους, στις περισσότερες από τις προαναφερθείσες δουλειές, με εξαίρεση τη δουλειά των Pagel και συνεργατών [Gabmann et al S & A: A 2007, Wego et al JMM 2001] όπου τα υποστρώματα τυπωμένου κυκλώματος είναι κολλημένα το ένα πάνω στο άλλο, έχουν χρησιμοποιηθεί φύλλα επικάλυψης και συγκολλητικά υλικά τα οποία δεν χρησιμοποιούνται συχνά στη βιομηχανία PCB (όπως είναι το γυαλί, το ΡΜΜΑ, η SU-8, το 1002F, η πολυολεφίνη ή σιλικονούχες κόλλες, κ.ά.).

Πιο ειδικά, για σφράγιση μικρορευστονικών καναλιών/θαλάμων/δικτύων, ακόμα και στη δουλειά των Pagel και συνεργατών, προτείνεται ένα βήμα μη-τυπικό για την τεχνολογία PCB: χρησιμοποιείται μια εποξική ρητίνη για να καλύψει τα PCB βυθίζοντας και αποσύροντας τις πλακέτες από το διάλυμα της ρητίνης, και αφήνοντάς τες να στεγνώσουν, χρησιμοποιώντας έτσι μια πολύπλοκη και χρονοβόρα διαδικασία. Σε άλλες εργασίες [Mavraki et al. 2011 , Proceedia Eng. 1245-1248, Moschou etal. 2014470-478], έχουν χρησιμοποιηθεί υλικά με βάση το πολυιμίδιο, όπως ταινίες Kapton ή πολυολεφίνης με σιλικονούχα κόλλα η οποία ενεργοποιείται με πίεση, και έχουν συχνά οδηγήσει σε σφραγισμένες διατάξεις με μικρή αντοχή και μικρή απόδοση παραγωγής τους, ειδικά όταν χρησιμοποιούνται για εφαρμογές όπου απαιτείται υψηλή θερμοκρασία για τη διεξαγωγή βιολογικών αντιδράσεων.

Παρόλα αυτά, οι διαδικασίες σφράγισης είναι πολύ σημαντικές για την κατασκευή μικρορευστονικών διατάξεων, και πράγματι η σφράγιση διατάξεων LoC θεωρείται από τους ειδικούς ως μια σημαντική πρακτική πρόκληση [Temiz, et al.; Microelectronic Engineering; 2015; 156-175; 132] και ένα εμπόδιο για την εμπορευματοποίηση των μικρορευστονικών διατάξεων, δεδομένου ότι έχει μεγάλη επίπτωση στο κόστος κατασκευής και στην επίδοση των τελικών διατάξεων. Η κοινωνία των μικρορευστονικών διατάξεων (ακαδημαϊκοί, ερευνητές, βιομηχανία) στερείται κατάλληλων υλικών για την οικονομική, εύκολη, αντιστρεπτή, ανθεκτική και μαζική σφράγιση διατάξεων καναλιών μεγάλου μήκους (όπου αναμένεται να αναπτυχθούν υψηλές πιέσεις, ειδικά σε υψηλές θερμοκρασίες).

Σύνοψη της εφεύρεσης

Η παρούσα εφεύρεση παρέχει ένα μικρορευστονικό αντιδραστήρα, ο οποίος αποτελείται από τουλάχιστον ένα κανάλι ή/και τουλάχιστον ένα θάλαμο κατασκευασμένα σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος ή σε εύκαμπτο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος, σφραγισμένο με υμένιο πολυιμιδίου το οποίο διαθέτει ακρυλική κόλλα στην επιφάνεια όπου γίνεται η συγκόλληση. Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επίσης μια διαδικασία κατασκευής μικρορευστονικών αντιδραστήρων οι οποίοι αποτελούνται από τουλάχιστον ένα κανάλι ή/και τουλάχιστον ένα θάλαμο κατασκευασμένα σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος ή σε εύκαμπτο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος, όπου η διαδικασία περιλαμβάνει το βήμα της σφράγισης τουλάχιστον ενός καναλιού ή/και τουλάχιστον ενός θαλάμου κατασκευασμένου σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος ή σε εύκαμπτο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος με υμένιο σφράγισης από πολυιμίδιο το οποίο διαθέτει ακρυλική κόλλα στην επιφάνεια όπου γίνεται η συγκόλληση.

Ο μικρορευστονικός αντιδραστήρας ο οποίος προκύπτει είναι ανθεκτικός σε θερμοκρασίες μέχρι 100 °C και σε αυτή τη θερμοκρασία μπορεί να αντέξει πτώσεις πίεσης το ελάχιστο μέχρι 1.65 bar, για αυτό είναι κατάλληλος για τη διεξαγωγή βιολογικών αντιδράσεων (εντός αυτού) οι οποίες απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες ακόμα και σε μεγάλου μήκους μικροκανάλια στα οποία αναπτύσσεται μεγάλη πτώση πίεσης σε υψηλές ογκομετρικές παροχές. Σε θερμοκρασία δωματίου, ο μικρορευστονικός αντιδραστήρας μπορεί να αντέξει πτώση πίεσης 8.3 bar κατ’ ελάχιστο.

Οι μικρορευστονικοί αντιδραστήρες της παρούσας εφεύρεσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διαφορετικούς λόγους, όπως για τη διεξαγωγή ενίσχυσης DNA μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ή μέσω ισοθερμικής ενίσχυσης DNA, όπως ακόμα και για θερμική λύση κυττάρων όπου απαιτείται υψηλή θερμοκρασία 96°C -98°C. Η παρούσα εφεύρεση παρέχει ανθεκτικούς μικρορευστονικούς αντιδραστήρες οι οποίοι κατασκευάζονται με οικονομικό και εύκολο τρόπο, ο οποίος είναι άμεσα και εύκολα προσαρμόσιμος στη βιομηχανία τυπωμένων κυκλωμάτων (PCB).

Σύντομη περιγραφή των σχηματικών

Η εικόνα 1 δείχνει τρεις μικρορευστονικούς θαλάμους μαιανδρικού τύπου όπως αναφέρονται στην παρούσα εφεύρεση, κατασκευασμένους σε PCB (πάνω από μια θερμαντική μικροαντίσταση).

Η εικόνα 2 δείχνει το σχηματικό ενός αντιδραστήρα συνεχούς ροής, κλειστού βρόγχου σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, ο οποίος αποτελείται από 3 μικροθαλάμους κατασκευασμένους πάνω σε PCB (ευρισκόμενους πάνω από 3 θερμαντικές μικροαντιστάσεις).

Η εικόνα 3 δείχνει το ποσοστό (%) του όγκου του δείγματος σε κάθε μικροθάλαμο με θερμοκρασία μέσα στο αποδεκτό εύρος (θερμοκρασία στόχος ±1.5 °C) ως συνάρτηση της ογκομετρικής παροχής του δείγματος για ένα μικρορευστονικό αντιδραστήρα σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, σχεδιασμένο για τη διεξαγωγή ενίσχυσης DNA με βάση την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.

Η εικόνα 4 δείχνει μια φωτογραφία μικροαντιδραστήρα συνεχούς ροής κλειστού βρόγχου σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, ο οποίος αποτελείται από μαιανδρικά μικροκανάλια (ευρισκόμενα πάνω από 3 θερμαντικές μικροαντιστάσεις) κατασκευασμένα σε PCB. Η εικόνα 5 δείχνει το σχέδιο ενός μικροαντιδραστήρα συνεχούς ροής με μαιανδρικά μικροκανάλια (ευρισκόμενα πάνω από 3 θερμαντικές μικροαντιστάσεις) ο οποίος θα κατασκευαστεί πάνω σε PCB με μηχανική κατεργασία αριθμητικού ελέγχου μέσω υπολογιστή ή με λιθογραφία, θα σφραγιστεί σύμφωνα με την εφεύρεση και είναι σχεδιασμένος για τη διεξαγωγή ενίσχυσης DNA με βάση την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.

Η εικόνα 6 δείχνει το σχέδιο ενός μικροαντιδραστήρα, ο οποίος αποτελείται από έναν στατικό θάλαμο (ευρισκόμενο πάνω από μια θερμαντική μικροαντίσταση) σε σειρά με ένα μαιανδρικά μικροκανάλι συνεχούς ροής (ευρισκόμενο πάνω από 3 θερμαντικές μικροαντιστάσεις), που θα κατασκευαστεί σε PCB, θα σφραγιστεί σύμφωνα με την εφεύρεση και έχει σχεδιαστεί για την εκτέλεση κυτταρικής λύσης η οποία ακολουθείται από ενίσχυση DNA με βάση την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.

Λεπτομερής περιγραφή της εφεύρεσης

Η παρούσα εφεύρεση παρέχει ένα μικρορευστονικό αντιδραστήρα, ο οποίος αποτελείται από τουλάχιστον ένα κανάλι ή/και τουλάχιστον ένα θάλαμο, κατασκευασμένα σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος ή σε εύκαμπτο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος, σφραγισμένα με υμένιο σφράγισης από πολυιμίδιο το οποίο αποτελείται από ακρυλική κόλλα Β-σταδίου στην επιφάνεια όπου γίνεται η συγκόλληση.

Τα υποστρώματα τυπωμένου κυκλώματος (PCB) συνήθως αποτελούνται από επίπεδα μονωτικά στρώματα όπως το FR4 (υαλοβάμβακας υφασμένος με εποξική ρητίνη) και στρώματα από αγώγιμο μέταλλο, πιο συχνά χαλκό, στη μια ή και στις δύο πλευρές του κεντρικού μονωτικού στρώματος. Τα εύκαμπτα υποστρώματα τυπωμένου κυκλώματος (FPC) συνήθως αποτελούνται από ένα λεπτό μονωτικό πολυμερικό υμένιο όπως πολυιμίδιο (ΡΙ), πολυαιθερο αιθερο κετόνη (PEEK), ή πολυεστέρα και στρώματα αγώγιμου μετάλλου, χαλκού πιο συχνά, τοποθετημένο στη μια ή και στις δύο πλευρές του λεπτού μονωτικού πολυμερικού υμενίου.

Τα πολυιμίδια είναι πολυμερή μονομερών ιμιδίου και περιλαμβάνουν, ανάλογα με την πολυμερική αλυσίδα και την παρουσία άλλων λειτουργικών ομάδων, γραμμικά

ή κυκλικά (αρωματικά ή αρωματικά-αλειφατικά) πολυιμίδια, με την ακόλουθη δομή, αντίστοιχα:

Κατά προτίμηση, σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση το πολυιμίδιο είναι ένα αρωματικό πολυιμίδιο. Κατά προτίμηση, το πολυιμίδιο είναι πολυ(4,4’-οξυδιφαινυλπυρομελλιτιμίδιο) το οποίο έχει τη δομή του τύπου (I)

Ένα παράδειγμα ενός πολυ(4,4’-οξυδιφαινυλ-πυρομελλιτιμίδιου) υμενίου επικαλυμμένου από τη μια πλευρά με ακρυλική κόλλα Β-σταδίου είναι το προϊόν της DuPont™ Pyralux® LF coverlay, το οποίο συχνά χρησιμοποιείται από τη βιομηχανία των PCB/FPC για τον εγκλεισμό χαραγμένων μεταλλικών λεπτομερειών σε εύκαμπτες και σταθερές-εύκαμπτες πολυστρωματικές κατασκευές για περιβαλλοντική και ηλεκτρική μόνωση.

Το υμένιο σφράγισης μπορεί επίσης να είναι επίστρωμα πολυιμιδίου ενδεδυμένο με μέταλλο από τη μία πλευρά. Αυτά τα επιστρώματα αποτελούνται από στρώματα αρωματικού πολυιμιδίου και μεταλλικά φύλλα στη μία πλευρά. Όταν χρησιμοποιούνται σαν υμένια σφράγισης, όπως στην περίπτωση της παρούσας εφεύρεσης, το μεταλλικό φύλλο καλύπτει την επιφάνεια του υμενίου, η οποία βρίσκεται στην αντίθετη πλευρά σε σχέση με την επιφάνεια σφράγισης. Διάφορα μέταλλα όπως χαλκός, αλουμίνιο, και χρυσός μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επένδυση του υμενίου του πολυιμιδίου για εφαρμογές κυκλωμάτων σε εύκαμπτα υποστρώματα (μόνωση, παθητικοποίηση, κ.τ.λ.) και είναι εμπορικά διαθέσιμα.

Η ακρυλική κόλλα σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση είναι μια κόλλα που περιλαμβάνει ενεργές ακρυλικές πρόδρομες ενώσεις, όπως μεθακρυλικό οξύ και μεθακρυλικό μεθυλεστέρα και ένα σύστημα εκκινητή/ευαισθητοποιητή ελευθέρων ριζών, όπως τα οργανικά περοξείδια (R-0-O-R') ή οι αζο-ομάδες (R-N=N-R').

Ο όρος ‘κόλλα Β-σταδίου’ υποδηλώνει μια κόλλα στην οποία η μεγαλύτερη ποσότητα του διαλύτη έχει αφαιρεθεί και η πρόδρομη ένωση έχει μερικώς πολυμεριστεί για να επιτρέψει τον εύκολο χειρισμό του υμενίου σφράγισης μέχρι την τελική σκλήρυνση (πολυμερισμός) κατά την έκθεση της στίβας (συγκολλητικό υμένιο και υπόστρωμα) σε κατάλληλες συνθήκες (θέρμανση και πίεση, σε αυτή την εφεύρεση).

Σύμφωνα με μια προτιμώμενη εκδοχή, ο μικροαντιδραστήρας περιλαμβάνει μικροθερμαντικό στοιχείο. Το μικροθερμαντικό στοιχείο μπορεί να είναι οποιουδήποτε κατάλληλου τύπου όπως μικροθερμαντική αντίσταση ή επαγωγή. Τα μικροθερμαντικό στοιχεία είναι συνήθως ενσωματωμένα στο ίδιο PCB/FPC υπόστρωμα πάνω στο οποίο είναι σχηματοποιημένοι οι μικρο-θάλαμοι/κανάλια.

Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επίσης μια διεργασία κατασκευής μικρορευστονικών αντιδραστήρων αποτελούμενων από τουλάχιστον ένα κανάλι ή/και τουλάχιστον έναν θάλαμο σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος ή σε εύκαμπτο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος, όπου η διεργασία περιλαμβάνει το βήμα της σφράγισης τουλάχιστον ενός καναλιού ή/και τουλάχιστον ενός θαλάμου σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος ή σε εύκαμπτο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος με ένα υμένιο σφράγισης από πολυιμίδιο το οποίο έχει ακρυλική κόλλα Β-τύπου στην επιφάνεια σφράγισης.

Το μικρορευστονικό δίκτυο μπορεί να σχηματοποιηθεί πάνω στο PCB είτε με μηχανική κατεργασία αριθμητικού ελέγχου μέσω υπολογιστή για τη δημιουργία χαραγμένων δικτύων ή χρησιμοποιώντας φωτοευαίσθητο ξηρό υμένιο (υμένιο ξηρής ρητίνης) που χρησιμοποιείται συχνά στη βιομηχανία PCB/FPC, όπως το DuPont™ Pyralux® PC 1000. Το φωτοευαίσθητο ξηρό υμένιο DuPont™ Pyralux® PC 1000 αποτελείται από ένα ειδικά ανεπτυγμένο συνδυασμό ακρυλικού, ουρεθανίου και ενός υλικού με βάση το ιμίδιο και η προτεινόμενη χρήση του (από τον κατασκευαστή) είναι ο εγκλεισμός εύκαμπτων τυπωμένων κυκλωμάτων (χρησιμοποιούμενο κυρίως ως προστατευτική μάσκα κατά τη διάρκεια μεταλλικών κολλήσεων).

Για να χρησιμοποιηθούν τα υλικά που περιγράφονται σε αυτήν την εφεύρεση ως υμένια σφράγισης για μικρορευστονικά κανάλια ή θαλάμους, απαιτείται μια θερμαινόμενη πρέσα η οποία λειτουργεί σε υψηλή θερμοκρασία, και ταυτόχρονα σε υψηλή πίεση. Πρώτα, το υλικό σφράγισης επικολλάται πάνω στο σχηματοποιημένο PCB/FPC. Στη συνέχεια, η επικολλημένη δομή PCB/ ή FPC /κόλα/ΡΙ τοποθετείται στην πρέσα, όταν έχει αναπτυχθεί η επιθυμητή θερμοκρασία, κατά προτίμηση στο εύρος θερμοκρασιών 182°C-193°C (για θερμοκρασίες χαμηλότερες από 180°C η σφράγιση μπορεί να μην είναι αποτελεσματική για μικροκανάλια, ενώ για θερμοκρασίες μεγαλύτερες από 193°C τα μικροκανάλια μπορεί να φράξουν). Έπειτα ασκείται πίεση, κατά προτίμηση στο εύρος 450-750 psi, για διάρκεια 20-30 λεπτά συνήθως.

Σε αυτό το εύρος υψηλών πιέσεων, για αποφυγή κατάρρευσης του υμενίου σφράγισης μέσα σε μεγάλου μεγέθους μικροθαλάμους (όπως απεικονίζονται στις εικόνες 1. και 2.), διάτρητα πρότυπα (από PCB ή μεταλλικά) με τα ίδια σχέδια (διάτρητοι μικροθάλαμοι/κανάλια) όπως αυτά πάνω στο PCB/FPC (προς σφράγιση) μπορούν να τοποθετηθούν ακριβώς πάνω από τη δομή PCB / ή FPC/κόλα/ΡΙ (από την πλευρά του ΡΙ) και να πιεστούν πάνω στη δομή σε θερμαινόμενη πρέσα. Συνήθως μετά από 20-30 λεπτά, η θέρμανση κλείνει και η πρέσα αφήνεται να ψυχθεί μέχρι τους 100°C περίπου, πριν αφαιρεθεί η πίεση και η δομή απομακρυνθεί από την πρέσα. Τα καλύτερα αποτελέσματα από άποψη ανθεκτικότητας της σφράγισης επιτυγχάνονται σε θερμοκρασία 189°C και πίεση 450 psi, εφαρμοσμένα για 30 λεπτά, όταν σφραγίζονται μικροκανάλια που έχουν σχηματιστεί μέσω λιθογραφίας πάνω σε PCB.

Κατά προτίμηση, σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση η δύναμη συγκόλλησης της σφράγισης του υμενίου είναι τουλάχιστον 8.3 bar σε θερμοκρασία δωματίου και 1.65 bar στους 95°C, όπως μετρήθηκε σε μηχάνημα ελέγχου εφελκυσμού.

Το υλικό σφράγισης της παρούσας εφεύρεσης προτιμάται έναντι άλλων υλικών που διαθέτουν κόλλες που ενεργοποιούνται μέσω πίεσης όπως το Kapton® PI και οι ταινίες πολυολεφίνης, και τα δύο υλικά με σιλικονούχες θερμοσκληρούμενες κόλλες, εξαιτίας της υπεροχής του σε δύναμη συγκόλλησης. Σύμφωνα με τα πειράματα που διεξήγαμε, όταν χρησιμοποιήθηκε το Kapton® 7270 (που περιλαμβάνει ταινία Kapton® και σιλικονούχα θερμοσκληρυνούμενη κόλλα) ή το υμένιο Advanced Polyolefin StarSeal (αυτοκόλλητο από την εταιρία STARLAB International GmbH) για τη σφράγιση μαιανδρικών μικροκαναλιών, η δύναμη συγκόλλησης δεν ήταν ικανή να αντέξει την αναπτυσσόμενη πτώση πίεσης κατά τη διάρκεια λειτουργίας της διάταξης με συνεχή ροή νερού μέσα στα μικροκανάλια σε υψηλές θερμοκρασίες.

Πιο ειδικά, όταν χρησιμοποιήθηκε το Kapton® 7270 σαν υμένιο σφράγισης ενός μικρορευστονικού αντιδραστήρα με ενσωματωμένα μικροθερμαντικά στοιχεία, ξεκόλλησε σε λιγότερο από 5 λεπτά λειτουργίας, όταν η θερμοκρασία των μικροθερμαντικών στοιχείων έφτασε τους 72°C, ενώ έρρεε νερό με ογκομετρική παροχή 2 μΐ/min στο μικροκανάλι. Όταν χρησιμοποιήθηκε το υμένιο πολυολεφίνης StarSeal advanced polyolefin, ξεκόλλησε σε λιγότερο από 5 λεπτά λειτουργίας, όταν η θερμοκρασία των μικροθερμαντικών στοιχείων έφτασε τους 65°C, ενώ έρρεε νερό με ογκομετρική παροχή 2 μΐ/min στο μικροκανάλι.

Μικροδιατάξεις κατασκευασμένες σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση μπορούν να χρησιμοποιηθούν με αξιοπιστία και επαναληψιμότητα σαν μικροαντιδραστήρες για την επιτυχή διεξαγωγή βιολογικών αντιδράσεων που απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες, όπως η θερμική λύση (απαιτούνται θερμοκρασίες μέχρι 96°C-98°C), όπως επίσης και η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (απαιτούνται θερμοκρασίες μέχρι 95 °C) ή ισοθερμικές αντιδράσεις ενίσχυσης. Τα πλεονεκτήματα της διεργασίας που περιγράφηκε στην παρούσα εφεύρεση περιλαμβάνουν τη χρήση υλικών και μεθόδων με τα οποία η βιομηχανία PCB/FPC είναι πλήρως εξοικειωμένη, βελτιώνοντας έτσι την πιθανότητα για χαμηλού κόστους μαζική παραγωγή τέτοιων μικροδιατάξεων από τη βιομηχανία PCB/FPC. Αυτή η διεργασία είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για την αξιόπιστη και μη αναστρέψιμη σφράγιση μικροδιατάξεων με μεγάλου μήκους μικροκανάλια (>1.5 μ), όπου αναμένεται η ανάπτυξη υψηλών πιέσεων κατά τη διάρκεια λειτουργίας τους.

Παραδείγματα

Παράδειγμα 1:

Α) Κατασκευή 3 σφραγισμένων μικρορευστονικών θαλάμων ευρισκόμενων πάνω από ένα μικροθερμαντικό στοιχείο (Εικ. 2)

Πρώτα, μια αντίσταση (μικροθερμαντικό στοιχείο) σχεδιάζεται σύμφωνα με τις επιθυμητές προδιαγραφές (π.χ. τιμή αντίστασης, συνολικές διαστάσεις διάταξης) και τους σχεδιαστικούς κανόνες του βιομηχανικού κατασκευαστή PCB (π.χ. πλάτος γραμμής χαλκού, οπών, κλπ.) και αποστέλλεται για κατασκευή σε εταιρία παραγωγής PCB. Έπειτα σχεδιάζονται οι μικρορευστονικοί θάλαμοι, σύμφωνα με τις επιθυμητές προδιαγραφές (όγκος δείγματος, βάθος). Μόλις παραληφθεί το PCB με το μικροθερμαντικό στοιχείο κατασκευασμένο από την εταιρία παραγωγής PCB, οι μικρορευστονικοί θάλαμοι εγχαράσσονται σύμφωνα με τις προδιαγραφές μας (π.χ. βάθος) και τις διαστάσεις του επιθυμητού σχεδίου. Σε αυτή την περίπτωση, εγχαράχθηκαν τρεις θάλαμοι, ο καθένας αποτελούμενος από κανάλια πλάτους 2 χιλιοστών και συνολικού μήκους 5 εκατοστών (οι θάλαμοι στην άκρη) και 2.5 εκατοστών (θάλαμος στη μέση).

Εναλλακτικά, χρησιμοποιείται φωτολιθογραφία σε ξηρό φωτοευαίσθητο υμένιο για το σχηματισμό των μικροθαλάμων. Πιο λεπτομερώς, το ξηρό φωτοευαίσθητο υμένιο επικολλάται στο PCB με χρήση κυλινδρικού πλαστικοποιητή. Έπειτα, χρησιμοποιείται η επιθυμητή φωτολιθογραφική μάσκα μέσω της οποίας η δομή της ξηρής φωτοευαίσθητης ρητίνης/PCB εκτίθεται σε ακτινοβολία UV. Μόλις τελειώσει η έκθεση, η δομή της ρητίνης/PCB τοποθετείται σε θερμαινόμενη πλάκα για 1-2 λεπτά στους 120°C (ελαφρύ ψήσιμο). Η εμφάνιση πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας υδατικό διάλυμα 1% ανθρακικού νατρίου. Μετά την εμφάνιση, τα σχηματοποιημένα PCB ξεπλένονται με αποσταγμένο νερό και στεγνώνονται χρησιμοποιώντας πεπιεσμένο άζωτο (με πιστολάκι αζώτου).

Τέλος, τοποθετούνται σε φούρνο για 2-3 ώρες σε θερμοκρασία 160°C για τελικό ψήσιμο. Έπειτα διανοίγονται διαμπερείς τρύπες για την είσοδο και την έξοδο των μικροθαλάμων. Το σχηματοποιημένο PCB με τα ενσωματωμένα μικροθερμαντικά στοιχεία καθαρίζεται ως εξής: Πρώτα χρησιμοποιείται ακετόνη, στη συνέχεια προπανόλη και τέλος ξεπλένεται με αποσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, το PCB στεγνώνεται χρησιμοποιώντας πεπιεσμένο άζωτο (πιστολάκι αζώτου) και στεγνώνεται περαιτέρω σε θερμαινόμενη πλάκα στους 120°C για 15 λεπτά. Μόλις στεγνώσει το PCB, αφαιρείται από την θερμαινόμενη πλάκα και αφήνεται να ψυχθεί έως ότου φτάσει σε θερμοκρασία δωματίου. Έπειτα ένα αρωματικό υμένιο πολυιμιδίου καλυμμένο από τη μια πλευρά με ακρυλική κόλα Β-σταδίου (DuPont™, Pyralux® LF coverlay) επικολλάται πάνω στο σχηματοποιημένο PCB.

Στη συνέχεια, η επικολλημένη δομή PCB/κόλλας/αρωματικού υμενίου πολυιμιδίου τοποθετείται σε πρέσα όπου έχουν εφαρμοστεί οι επιθυμητές συνθήκες θερμοκρασίας και εφαρμόζεται πίεση. Η πίεση (στη δομή) και η αυξημένη θερμοκρασία που εφαρμόζονται είναι, κατά προτίμηση, στο εύρος 450-750 psi and 182°C-193°, αντίστοιχα, για 20-30 λεπτά. Σε αυτή την υψηλή πίεση για να αποφευχθεί η κατάρρευση του υμενίου συγκόλλησης μέσα σε μεγάλους μικροθαλάμους (όπως στο Σχήμα 3) ή φράξιμο των μικροκαναλιών με την κόλλα, τοποθετείται ακριβώς πάνω από τη δομή PCB /κόλλας/ αρωματικού ΡΙ (από την πλευρά του ΡI) διάτρητο πρότυπο με τα ίδια σχέδια (διάτρητοι μικροθάλαμοι/κανάλια) όπως αυτά πάνω στο PCB (προς σφράγιση) και πιέζεται το ένα πάνω στο άλλο με θερμαινόμενη πρέσα.

Β) Ισοθερμική ενίσχυση DNA μέσα σε μικροθαλάμους

Στους θαλάμους που κατασκευάστηκαν σύμφωνα με τα προαναφερθέντα, διεξήχθησαν ισοθερμοκρασιακά πρωτόκολλα ενίσχυσης για παράδειγμα με τη μέθοδο Helicase Dependent Amplification (HD Α). Για τις αντιδράσεις HDA χρησιμοποιήθηκε ένα σετ από εκκινητές (Forward: 5'-TGA TGG GTT GTG TTT GGT TTC TTT CAG-3' and Reverse: 5'-ACC TTT CTG TCC TGG GAT TCT CTT GCT-3') οι οποίοι παράγουν ένα προϊόν 113 βάσεων, και μια αλληλουχία 157 βάσεων ως εκμαγείο (αρχικό υλικό) η οποία περιέχει την αλληλουχία ενδιαφέροντος (Vorkas et al. 2010). Προετοιμάστηκαν 25μ1 αντίδρασης HDA σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή (Biohelix, IsoAmp® II Universal tHDA Kit) και εισήχθησαν στη διάταξη και επωάστηκαν για 15 λεπτά (BRCA1), με το μικροθερμαντικό στοιχείο ρυθμισμένο στους 65 °C στους μικροθαλάμους. Επετεύχθη επιτυχής ενίσχυση DNA σε τέτοιου είδους διατάξεις<24>.

Στην περίπτωση όπου περισσότεροι μικροθάλαμοι (τρεις στη μικροδιάταξη της Εικ. 1) έχουν κατασκευαστεί πάνω από την περιοχή όπου θερμαίνεται, πολλές αντιδράσεις (που απαιτούν το ίδιο θερμοκρασιακό πρωτόκολλο) μπορούν να πραγματοποιηθούν ταυτόχρονα, αυξάνοντας έτσι την απόδοση (από πλευράς αριθμού αντιδράσεων) της ενίσχυσης DNA που μπορεί να επιτευχθεί σε τέτοιου είδους μικροδιατάξεις.

Παράδειγμα 2:

Σχεδιασμός και κατασκευή μικρορευστονικών αντιδραστήρων κλειστού βρόγχου, αποτελούμενων από 3 θαλάμους ή μαιανδρικά μικροκανάλια (Εικ.2 και Εικ. 4 αντίστοιχα) για τη διεξαγωγή ενίσχυσης DNA με βάση την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ή ισοθερμικά πρωτόκολλα.

Μια απαίτηση για αποδοτική ενίσχυση μέσω PCR είναι η θερμοκρασιακή ομοιομορφία του δείγματος DNA (η θερμοκρασιακή διακύμανση θα πρέπει να είναι μικρότερη από ±1.5 °C) σε κάθε μια από τις θερμοκρασιακές ζώνες. Για το λόγο αυτό, υπολογιστικές μελέτες είναι απαραίτητες για την εύρεση των κατάλληλων διαχωριστικών αποστάσεων ανάμεσα στους τρεις μικροθαλάμους (ο καθένας από τους οποίους έχει όγκο 5 μΐ και διαστάσεις 0.8 εκ x 1.3 εκ.), σε καθένα από τους οποίους διενεργείται ένα βήμα της αντίδρασης PCR (ένας θάλαμος για την αποδιάταξη που γίνεται συνήθως στους 95 °C, ένας θάλαμος για την υβριδοποίηση που γίνεται συνήθως στους 55 °C, και ένας θάλαμος για την επιμήκυνση που γίνεται συνήθως στους 72 °C). Με ταχύτητα εισόδου του ρευστού στα 30-90 μΐ/min, κατάλληλη για μια λογική διάρκεια ενός πρωτοκόλλου PCR (5 με 15 λεπτά για 30 κύκλους) εξετάσθηκε η θερμοκρασιακή ομοιομορφία κατά μήκος των τριών θαλάμων για βελτιστοποίηση των αποστάσεων μεταξύ τους και ελάχιστη ενεργειακή κατανάλωση.

Η θερμοκρασιακή ομοιομορφία σε μια ζώνη (π.χ. στη ζώνη της αποδιάταξης) ποσοτικοποιείται ως ποσοστό του όγκου του δείγματος στη ζώνη που βρίσκεται στο σωστό εύρος θερμοκρασιών ±1.5 °C γύρω από το σημείο-στόχο. Το Σχ. 3 δείχνει αυτό το ποσοστό για τις 3 ζώνες ως προς την ταχύτητα εισόδου. Με ταχύτητα εισόδου στο εύρος 30-90 μl/min, η θερμοκρασιακή ομοιομορφία ξεπερνά το 95% για όλες τις ζώνες, με τη ζώνη της αποδιάταξης να παρουσιάζει τη μεγαλύτερη ομοιομορφία. Έπειτα, τα στοιχεία αντιστάσεων (μικροθερμαντικά στοιχεία) σχεδιάζονται σύμφωνα με τις επιθυμητές προδιαγραφές (π.χ. τιμή αντίστασης, συνολικές διαστάσεις διάταξης) και τους σχεδιαστικούς κανόνες του κατασκευαστή PCB (π.χ. πλάτος γραμμής χαλκού, οπές, κλπ.). Αφού παραληφθεί το PCB με τα τρία μικροθερμαντικά στοιχεία από τον κατασκευαστή PCB, ο μικρορευστονικός αντιδραστήρας κατασκευάζεται και σφραγίζεται, όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο Παράδειγμα 1 (Α).

Παράδειγμα 3:

Α) Κατασκευή διάταξης συνεχούς ροής μαιανδρικών μικροκαναλιών για διεξαγωγή ενίσχυσης DNA με βάση την PCR.

Βασιζόμενοι στις απαιτήσεις για αποδοτική ενίσχυση μέσω PCR, οι οποίες εξηγούνται στο Παράδειγμα 2 (η θερμοκρασιακή διακύμανση θα πρέπει να είναι μικρότερη από ±1.5 °C σε κάθε ζώνη), σχεδιάστηκε ένα μικροκανάλι συνεχούς ροής (με πλάτος 300/500 μm, συνολικό μήκος 180 εκ.) και η σχετική θέση των τριών μικροαντιστάσεων (οι οποίες ορίζουν τις τρεις απαραίτητες ζώνες για την PCR) για να εξασφαλιστεί επιτυχής ενίσχυση DNA μετά από 30 κύκλους, δεδομένου ότι το δείγμα ρέει μέσα σε τέτοιου είδους μικροκανάλια (δες Εικ. 5).

Έπειτα, τα θερμαντικά στοιχεία σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις απαιτήσεις του σχεδίου (σε συμφωνία με τις προσομοιώσεις), τις προδιαγραφές των θερμαντικών στοιχείων (π.χ.

τιμή αντίστασης, συνολικές διαστάσεις της διάταξης) και τους σχεδιαστικούς κανόνες του κατασκευαστή των PCB (π.χ. διαστάσεις γραμμής χαλκού, οπές, κ.λπ.). Τα υποστρώματα PCB με τα ενσωματωμένα μικροθερμαντικά στοιχεία καθαρίζονται και στεγνώνονται όπως περιγράφηκε στο παράδειγμα 1. Η μικρορευστονική διάταξη σχηματοποιείται είτε με μηχανική κατεργασία αριθμητικού ελέγχου μέσω υπολογιστή δημιουργώντας μικροκανάλια ελάχιστου βάθους 90 μικρομέτρων ή με φωτολιθογραφία δημιουργώντας μικροκανάλια ελάχιστου βάθους 50 μικρομέτρων, όπως περιγράφεται στο Παράδειγμα 1.

Μετά την ολοκλήρωση του σχηματισμού του μικρορευστονικού δικτύου, διαμπερείς τρύπες διανοίγονται για την είσοδο και την έξοδο των μικροκαναλιών. Οι διατάξεις ξεπλένονται με αποσταγμένο νερό και στεγνώνονται με πεπιεσμένο άζωτο. Τέλος τα μικροκανάλια σφραγίζονται σύμφωνα με τη διεργασία που περιγράφεται λεπτομερώς στο Παράδειγμα 1. Εκτιμάται πως αναπτύσσεται μια πτώση πίεσης της τάξης των 8.3 bar όταν ρέει νερό εντός των μικροκαναλιών με ογκομετρική παροχή 100 μl/min. Η κατασκευασθείσα διάταξη αποδείχθηκε ανθεκτική μέχρι τουλάχιστον αυτή την υψηλή πίεση.

Β) Ενίσχυση DNA.

Το πρωτόκολλο ενίσχυσης DNA που εκτελέστηκε είναι με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Η PCR είναι μια θερμο-εξαρτώμενη μέθοδος ενίσχυσης DNA που καταλύεται από ένζυμα, η οποία απαιτεί 3 διαφορετικές θερμοκρασίες (αποδιάταξη που γίνεται συνήθως στους 95<o>C, υβριδοποίηση που γίνεται συνήθως στους 55 °C, επιμήκυνση που γίνεται συνήθως στους 72 °C). Επιπροσθέτως, όπως είναι κατανοητό από ένα άτομο έμπειρο στην περιοχή αυτή, είναι δυνατή και η χρήση 2 θερμοκρασιών για την ενίσχυση DNA, όπου η υβριδοποίηση και η επιμήκυνση γίνονται στη ίδια θερμοκρασία (σε αυτή την περίπτωση, απαιτούνται δύο μικροθερμαντικά στοιχεία αντί για τρία).

Πλασμιδιακό καθώς και μικρό κομμάτι ανθρώπινου DNA χρησιμοποιήθηκαν για να πιστοποιήσουν την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης DNA στη διάταξη. Ο pBR322 είναι ένας συχνά χρησιμοποιούμενος πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης στο Ε. Κόλι (Ε-coli). Το μόριο αυτό είναι διπλής έλικας με μήκος 4361 ζεύγη βάσεων. Ο pBR322 περιέχει τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για την αντίσταση στην αμπικιλίνη και την τετρακυκλίνη. Για την ενίσχυση δύο συγκεκριμένων γονιδιακών αλληλουχιών, που αντιστοιχούν στα γονίδια ανθεκτικότητας, χρησιμοποιήθηκαν δύο σετ από εκκινητές οι οποίοι παράγουν δύο προϊόντα μεγέθους 200 και 400 ζευγών βάσεων.

Περίπου 25 μl αντίδρασης PCR προετοιμάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του προϊόντος ΚΑΡΑ Taq HotStart PCR Kit. Οι ογκομετρικές παροχές που χρησιμοποιήθηκαν για αυτές τις αντιδράσεις κυμαίνονται από 1 μl/min έως 20 μl/min. Επετεύχθη ικανοποιητική ενίσχυση DNA μέσα σε λίγα λεπτά (5 λεπτά για το μικρού μήκους κομμάτι DNA). Η πτώση πίεσης που αντιστοιχεί στη μεγίστη ογκομετρική παροχή που χρησιμοποιήθηκε (20 μl/min) κατά τη διάρκεια χρήσης της μικροδιάταξης εκτιμάται στο 1.65 bar. Παρόλα αυτά, η διάταξη ήταν ικανή να αντέξει πολύ υψηλότερες πιέσεις σε θερμοκρασία δωματίου, όπου χρησιμοποιήθηκαν ογκομετρικές παροχές που φτάνουν τα 100 μl/min (οδηγώντας σε πτώση πίεσης 8.3 bar κατά μήκος της διάταξης) χωρίς να αποκολληθεί το φύλλο σφράγισης.

Παράδειγμα 4:

Κατασκευή μικροεργαστηρίου σε ψηφίδα, αποτελούμενου από στατικό θάλαμο σε συνδυασμό με μαιανδρικά μικροκανάλια συνεχούς ροής για τη διεξαγωγή κυτταρικής λύσης και ενίσχυσης DNA με βάση την PCR (Εικόνα 6).

Το μικρορευστονικό δίκτυο (Σχ. 6) αποτελείται από ένα στατικό θάλαμο όπως περιγράφεται στο Παράδειγμα 1 και από μαιανδρικά μικροκανάλια συνεχούς ροής όπως περιγράφεται στο Παράδειγμα 3. Πιο ειδικά, ο στατικός θάλαμος αποτελείται από κανάλια με πλάτος 2 χιλ. και συνολικό μήκος 2.5 εκ. ενώ το μικροκανάλι συνεχούς ροής αποτελείται από 28 κύκλους (αντί 30, όπως στο Παράδειγμα 3). Η έξοδος του στατικού θαλάμου συνδέεται με την είσοδο του μικροκαναλιού συνεχούς ροής.

Ο στατικός θάλαμος βρίσκεται πάνω από μικροθερμαντικό στοιχείο, σχεδιασμένο και κατασκευασμένο όπως περιγράφεται στο Παράδειγμα 1 , ενώ το μαιανδρικό μικροκανάλι βρίσκεται πάνω από 3 μικροθερμαντικό στοιχεία, σχεδιασμένα και κατασκευασμένα όπως στο Παράδειγμα 3. Το μικρορευστονικό δίκτυο είναι κατασκευασμένο σε PCB είτε μέσω μηχανικής κατεργασίας αριθμητικού ελέγχου μέσω υπολογιστή ή με φωτολιθογραφία χρησιμοποιώντας υμένιο φωτοευαίσθητης ξηρής ρητίνης, όπως περιγράφηκε στο Παράδειγμα 1. Τέλος, το σχηματοποιημένο μικρορευστονικό δίκτυο σφραγίζεται με το υμένιο σφράγισης και σύμφωνα με τη διεργασία που περιγράφεται λεπτομερώς στο Παράδειγμα 1. Βιολογικό δείγμα που περιέχει τα επιλεγμένα βακτήρια μαζί με τα αντιδραστήρια της PCR εισάγεται στο στατικό θάλαμο και ο θάλαμος θερμαίνεται μέσω του ενσωματωμένου μικροθερμαντικού στοιχείου σε θερμοκρασία μεταξύ 93°C-98°C για να επιτευχθεί η λύση των κυττάρων και να ελευθερωθεί το γενωμικό DNA-στόχος.

Έπειτα, ο στατικός θάλαμος υπόκειται σε θερμικούς κύκλους χρησιμοποιώντας το ίδιο μικροθερμαντικό στοιχείο, έτσι ώστε να διεξαχθούν οι 2 πρώτοι κύκλοι της PCR του γενωμικού DNA στον ίδιο μικροθάλαμο. Μετά την ολοκλήρωση των 2 κύκλων της PCR, το δείγμα που περιέχει το DNA εισάγεται στα μαιανδρικά κανάλια όπου το DNA ενισχύεται, καθώς ρέει μέσα στα μαιανδρικά μικροκανάλια. Αυτός ο μικροαντιδραστήρας (αποτελούμενος από στατικό θάλαμο συνδυασμένο με μαιανδρικά μικροκανάλια συνεχούς ροής) συνδυάζει τα πλεονεκτήματα στατικού θαλάμου σε σχέση με την ικανότητα επιτυχούς διεξαγωγής των 2 πρώτων κύκλων PCR για την ενίσχυση γενωμικού DNA, με τα πλεονεκτήματα μικροκαναλιών συνεχούς ροής σε σχέση με την ικανότητα για γρήγορη ενίσχυση DNA. Είναι επίσης ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα μικροεργαστηρίου σε ψηφίδα όπου ενσωματώνονται διάφορες βιοχημικές διεργασίες, όπως η κυτταρική λύση και η ενίσχυση DNA (σε αυτή την περίπτωση) και διενεργούνται στην ίδια διάταξη.

Claims (15)

Αξιώσεις

1. Ένας μικρορευστσνικός αντιδραστήρας αποτελού μένος από τουλάχιστον ένα κανάλι και/ή τουλάχιστον έναν θάλαμο σε υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος ή σε εύκαμπτο υπόστρωμα τυπωμένου κυκλώματος, σφραγισμένο από υμένιο σφράγισης πολυιμιδίου που περιλαμβάνει ακρυλική κόλλα B -σταδίου στην επιφάνεια σφράγισης.

2. Ένας μικρορευστσνικός αντιδραστήρας σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου το πολυιμίδιο είναι ένα αρωματικό πολυιμίδιο.

3. Ένας μικρό ρευστονικός αντιδραστήρας σύμφωνα με την αξίωση 1 ή 2, όπου το πολυιμίδιο είναι πολυ(4,4’- οξυδιφαινυλενο-πυρομελλιτιμίδιο).

4. Ένας μικρορευστσνικός αντιδραστήρας σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου το υμένιο σφράγισης είναι φύλλο πολυιμιδΐου επιστρωμένο με μέταλλο από τη μια πλευρά.

5. Ένας μικρορευστσνικός αντιδραστήρας σύμφωνα με την αξίωση 4, όπου το μέταλλο έχει επιλεγεί από την ομάδα που αποτελείται από χαλκό, αλουμίνιο, και χρυσό.

6. Ένας μικρορευστονικός αντιδραστήρας σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 5, όπου η δύναμη συγκόλλησης του υμενίου σφράγισης, μετρημένη με τη μέθοδο εφελκυσμού, είναι τουλάχιστον 8.3 bar σε θερμοκρασία δωματίου και τουλάχιστον 1.65 bar στους 95°C.

7. Ένας μικρορευστονικός αντιδραστήρας σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 6, όπου ο αντιδραστήρας περιλαμβάνει επιπλέον ένα μικροθερμαντικό στοιχείο.

8. Ένας μικρορευστονικός αντιδραστήρας σύμφωνα με την αξίωση 7, όπου το μικροθερμαντικό στοιχείο είναι μικροθερμαντικό στοιχείο αντίστασης.

9. Μια διεργασία για την κατασκευή ενός μικρορευστονικού αντιδραστήρα σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 8, όπου η διεργασία αποτελείται από το βήμα σφράγισης των καναλιών και/ή θαλάμων του υποστρώματος τυπωμένου κυκλώματος ή του εύκαμπτου υποστρώματος τυπωμένου κυκλώματος με υμένιο σφράγισης πολυιμιδίου που περιλαμβάνει ακρυλική κόλλα Β-σταδίου στην επιφάνεια σφράγισης.

10. Μια διεργασία σύμφωνα με την αξίωση 9, όπου η σφράγιση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία μεταξύ 182°C και 193°C.

11. Μια διεργασία σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 9 ή 10, όπου η σφράγιση πραγματοποιείται εφαρμόζοντας πίεση από 450-750 psi.

12. Μια διεργασία σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 9 έως 11 , όπου η σφράγιση πραγματοποιείται για 20-30 λεπτά.

13. Χρήση ενός μικρορευστονικού αντιδραστήρα σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 7 ή 8 για τη διεξαγωγή ενίσχυσης DNA.

14. Χρήση ενός μικρορευστονικού αντιδραστήρα σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 7 ή 8 για τη διεξαγωγή θερμικής λύσης κυττάρων.

15. Χρήση ενός μικρορευστονικού αντιδραστήρα σύμφωνα με την αξίωση 7 ή 8 για τη διεξαγωγή μιας σειράς βιοχημικών διεργασιών.