JP2015513921A - 任意のポリメラーゼ伸長活性の高感度定量的測定と生細胞存在の決定とに有用なポリメラーゼ活性測定方法 - Google Patents
任意のポリメラーゼ伸長活性の高感度定量的測定と生細胞存在の決定とに有用なポリメラーゼ活性測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015513921A JP2015513921A JP2015505927A JP2015505927A JP2015513921A JP 2015513921 A JP2015513921 A JP 2015513921A JP 2015505927 A JP2015505927 A JP 2015505927A JP 2015505927 A JP2015505927 A JP 2015505927A JP 2015513921 A JP2015513921 A JP 2015513921A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna polymerase
- polymerase
- activity
- assay
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/101—DNA polymerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/119—RNA polymerase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
- G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
- G01N2333/40—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts from Candida
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
- G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- G01N2333/9125—Nucleotidyltransferases (2.7.7) with a definite EC number (2.7.7.-)
- G01N2333/9126—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
- G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- G01N2333/9125—Nucleotidyltransferases (2.7.7) with a definite EC number (2.7.7.-)
- G01N2333/9128—RNA-directed DNA polymerases, e.g. RT (2.7.7.49)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
新規の、極めて高感度で定量的かつ迅速なDPE−PCRアッセイを開示する。このアッセイは、精製または選択された細胞タイプを示す場合に原核細胞を数え上げるために使用することができ、ビーズ溶解とカップリングさせることを介して、10cfu未満の細菌から、DNAポリメラーゼ伸長活性を、再現性をもって測定するDPE−PCRの能力を有する。同様に開示されていることは、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、およびカンジダ種から構成される微生物のパネルを試験することにより、普遍的に微生物を検知するための本発明のDPE−PCRアッセイの可能性である。さらに、本発明のDPEーPCRアッセイは、細菌細胞の生存率を評価するために用いることができ、cfuの存在によって示されるように、DNAポリメラーゼ伸長活性と増殖との間の再現性のある強い相関を介して、提供されることが開示されている。本発明の開示されたアッセイは、医薬、環境、食品、および臨床の場で、広範囲の試験用途のための有用な定量的ツールであり得ると、考えられる。
Description
[関連出願の相互参照]
本出願は、非仮出願であり、2012年4月12日出願の米国特許仮出願第61/623,114号を参照により本明細書に援用するっとともに、その優先権を主張する。
本出願は、非仮出願であり、2012年4月12日出願の米国特許仮出願第61/623,114号を参照により本明細書に援用するっとともに、その優先権を主張する。
この欄およびこの開示全体で使用される参照番号は、本明細書中の「参照文献」の欄に説明される文献に言及している。
DNAポリメラーゼ活性は、すべての生物界(1〜3)にわたってゲノム複製および生物増殖にとって不可欠である。原核生物は、異なる5種類のDNAポリメラーゼを含む。しかし、哺乳類細胞は、15の異なった細胞DNAポリメラーゼを含むが、それらのうちの4種類のみがDNA複製に割り当てられ、残りは、遺伝的完全性の維持に実質的に貢献するプロセスである、DNA修復と特化したDNA合成とに充てられる。これらの酵素の大部分が核DNA修復と複製とに関係しているにもかかわらず、DNAポリメラーゼガンマ(Polg)はミトコンドリアのみで見出されるDNAポリメラーゼである(Hum.Mol.Genet.(1 July 2005)14(13):1775−1783)。その初期の特徴付け(4)から、インビトロでDNAポリメラーゼ活性を利用する能力は、分子生物学研究の分野において基本的なツールになった(5)。研究におけるその確立された重要性に加えて、DNAポリメラーゼ活性のインビトロ測定は、製薬および臨床の場の範囲内で、多数の役立つ用途を潜在的に提供する。例えば、細菌DNAポリメラーゼは新規抗菌剤の開発のために盛んに標的化されている(6、7)。このことから、DNAポリメラーゼ活性を測定可能である迅速かつ高感度なアッセイが望まれる。また、DNAポリメラーゼ活性の損失または獲得は、ヒトの疾患に密接に関係している。例えば、DNAポリメラーゼ活性と遺伝子異常との間の関連性が明らかになりつつあることから、この酵素が抗癌療法の標的に指定されている(8、9)。DNAポリメラーゼ活性の欠乏は、ミトコンドリア疾患にも関連している(10)。さらにまた、DNAポリメラーゼ活性の測定は、迅速かつ高感度な診断ツールとして使用される可能性を有し、滅菌が期待される所定の環境または生物学的マトリックス内に活性DNAポリメラーゼを持つ実質的にいかなる生物も検出することが可能である。
インビトロでDNAポリメラーゼ活性を測定するのに用いられる最も頻度が高い方法は、放射性標識ヌクレオチド(11)の取り込みに依存する。しかし、そのようなDNAポリメラーゼアッセイのルーチンな使用は、放射性同位元素に関連する固有のリスクと規制とにより望ましくない。したがって、ここ数十年の間、数多くの非放射性インビトロポリメラーゼアッセイが開発されてきた。いくつかは、一本鎖結合タンパク質のDNAポリメラーゼ媒介放出(12)または二本鎖DNAに対するPicoGreen(商標)の結合(13、14)により生ずる蛍光の測定に依存する。他の方法は、マイクロプレートカップリングと、蛍光性標識ヌクレオチド(15)の検出とに依拠している。最近になって、分子ビーコンベース(16)および電気化学ベース(17)のDNAポリメラーゼアッセイが開発されてきた。放射能の使用をうまく避けることにもかかわらず、上記のアッセイは、測定の感度が低いこと、すなわち線形ダイナミックレンジが小さいこと、または精製ポリメラーゼを使用することのいずれによっても、制限される。過去50年の間に、ポリメラーゼ活性のインビトロ測定は、必須の分子生物学ツールになった。インビトロでポリメラーゼ活性を測定するのに用いられる従来の方法は、放射性ヌクレオチドが利用されるため、望ましくない。蛍光ベースのポリメラーゼアッセイが開発されてきた。しかし、それらも様々な制限を受けている。
本発明によれば、上述の方法論の様々な限界に取り組み、迅速かつ極めて高感度な定量的アッセイが提供される。このアッセイは、精製ポリメラーゼから、または粗細胞ライセートもしくは直接細胞内小器官から、ポリメラーゼ伸長活性が測定可能である。精製DNAポリメラーゼを調べた場合、このアッセイは、優れた直線性(R2=0.992)を示す一方で、2×10−11Uほどの少ない酵素(≒50分子)を検出した。このアッセイは、ビーズミル溶解とカップリングさせた場合、R2=0.999を維持しながら入力グラム陽性またはグラム陰性細菌を少なくとも10コロニー形成単位まで落として、内因性DNAポリメラーゼ伸長活性を検出することも可能であった。さらに、本発明に従って、DNAポリメラーゼ伸長活性は、アッセイシグナルと生細胞計数との間に再現性を持った強い一致が見られることから、細胞生存率の指標であることが示された。同様に、選択的に試料となる細胞を調製することによって、インタクトな哺乳動物細胞もまた、DNAポリメラーゼ伸長アッセイによって、定量化と生存率評価とを行うことができる。同時に、本明細書中に述べられる方法は、所定の試料マトリックス内に活性ポリメラーゼを含む可能性のある任意の細胞または細胞内小器官を高感度で検出することに対して、著しい進歩を示す。
本発明者らは、酵素的テンプレート生成および増殖(enzymatic template generation and amplification;ETGA)を伴う方法論に関心を持ち続けてきた。例えば、2012年10月16日に出願され、本発明とともに本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第13/641,480号は、そのようなETGA方法論およびその使用に関する新規な技術を説明している。上記米国特許出願第13/641,480号のそのようなETGA方法論に関連したそのような技術が本明細書中に明確に述べられておらず、本明細書中に説明およびクレームされている発明の完全な開示に必要であると思われるという点で、ここで、上記米国特許出願の全ての開示は参照によりこの明細書に組み込まれる。
ここで、我々は、定量的PCRリードアウトにカップリングされたDNAポリメラーゼ伸長活性の測定に基づく、改善され、かつ新規のETGA方法論の特徴付けを説明する。ここで、我々は、このアッセイのアプローチを一般に、ETGAと呼び、または、DNAポリメラーゼ伸長カップリングポリメラーゼ連鎖反応(DPE−PCR)とも呼ぶ。試料調製のバリエーションは、特定の細胞またはポリメラーゼの種類による特定の用途のために、ETGAおよびDEP−PCRと組み合わせられる。
図2は、本発明に従って、好ましいDPE−PCRアッセイを用いた精製DNAポリメラーゼの高感度検出の説明図を示す。DNAポリメラーゼIの商業的供給源を、1反応あたり2×10−5ユニット(U)から開始して2×10−11Uに至るまで、10倍インクリメントで、二重反復でアッセイした。典型的なDPE−PCR曲線を、各々のポリメラーゼ入力レベルと非入力対照(NIC)とについて示す。プロットは、2回の独立した実験から得た1ポリメラーゼ入力レベルあたりn=4データポイントから構成され、線形回帰分析を行った。2×10−7UのDNAポリメラーゼI、クレノウ、クレノウ(exo−)、および大腸菌DNAリガーゼを含む三重反復反応を、NICと比較して、アッセイした。典型的なDPE−PCR曲線は、アッセイされた酵素とNICとの各々について、示される。三重反復のDPE−PCR曲線は、50μMのdCTPまたはddCTPのどちらかが加えられた50μM[dATP、dGTP、dTTP]混合物を含む、対応するDNAポリメラーゼ伸長反応から示される。DNA基質内へのdCTPまたはddCTP取り込み用の第1の利用可能な部位のいくつかは、DPE−PCR曲線に隣接して、存在する。
2つの独立した検出限界実験からのデータをグラフ化した後に、DPE−PCRサイクル閾値(Ct)と入力市販DNAポリメラーゼIのユニットとの間に強い正の線形相関(R2=0.992)を有する回帰分析を示す。
野生型DNAポリメラーゼIと比較した場合、クレノウおよびクレノウexo−の両方は、本発明に従って、同様のレベルで検出された。このことから、DPE−PCRアッセイシグナルがDNAポリメラーゼ依存型伸長に由来し、固有のエキソヌクレアーゼ活性ではないという証拠が得られた。
ddCTPがDNAポリメラーゼによって取り込まれ得る基質内の第1の予想位置を示す。
図4は、本発明に従うDPE−PCRアッセイが、粗ライセートでのDNAポリメラーゼ伸長活性の測定を介して、グラム陰性およびグラム陽性細菌の高感度かつ定量的な検出を可能にすることを示す。大腸菌(E.coli)cfuの減少は、ビーズ溶解カップリングDPE−PCRにスパイクした。非入力対照群(NIC)も試薬バックグランドレベルを監視するために含めた。全てのcfuスパイクおよびNICは、三重反復で実施した。典型的なDPE−PCR曲線を、細菌入力の各々のレベルについて、以下に示す。コロニー計数平板培養およびgsPCRを、各々に入れられる実際のcfuのより良好な推定値を得ることを目的として、実行した。大腸菌DNAポリメラーゼ活性および線形回帰分析のプロットを示す。グラフの作成は、1×105〜1×101入力cfuまで変動している細菌スパイクの三重反復反応から得られた平均Ct値を用いて、行った。大腸菌に関して上述した通りに正確に、cfu滴定実験を黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対して実施した。コロニー計数平板培養
ビーズミル溶解と関連させた場合、本発明のDPE−PCRアッセイが溶解管あたり10コロニー形成単位(cfu)を下回るまで、入力大腸菌の広範囲なダイナミックレンジを検出することが可能であることを示す。
大腸菌検出の線形回帰分析も、入力細菌の10cfuに至るまで行われ、0.999のR2値により示されるように、入力cfuとDNAポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に強い正の線形相関があることが示される。
黄色ブドウ球菌ライセート由来のDNAポリメラーゼ伸長活性が類似の入力レベルであることが検出される。
10cfuの入力細菌に至るまで黄色ブドウ球菌検出がプロットされるとともに、入力cfuとDNAポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に強い線形相関(R2=0.999)が示される。
概略DNAポリメラーゼ伸長活性の測定は、限定されるものではないが、インビトロで候補ポリメラーゼ阻害剤をスクリーニング、または、細胞選択的試料調製に依存した、多様な範囲の試料タイプ内に存在する任意の生細胞タイプ(活性DNAポリメラーゼを持つ)の検出など、広範囲に及ぶ用途を備えた有用なツールを表し得る。これらの目的のために意図されるならば、放射性標識ヌクレオチドを取り込む従来のポリメラーゼアッセイのルーチンな使用は、魅力がない。従って、多数の非放射性DNAポリメラーゼ伸長アッセイがこの数十年の間に開発されている。放射能の使用を成功裏に防ぐにもかかわらず、蛍光に基づいた現在のDNAポリメラーゼアッセイは様々な欠陥を被る。例えば、いくつかの既存の非放射性アッセイを介したDNAポリメラーゼ活性の検出は、新たに生成された二本鎖DNAに結合するPicoGreen(商標)に依存している(13、14)。新たに溶解した生物のDNAポリメラーゼ活性を分析することを意図する場合、PicoGreen(商標)に基づくアッセイは、PicoGreen(商標)がゲノムDNAに結合することを介して、バックグラウンド蛍光によって妨げられると思われる。マイクロプレートに基づいたDNAポリメラーゼアッセイもまた、開発されている(15)。マイクロプレートベースアッセイの感度減少は、多数の理由から予想され得る。これらの理由には、生成物または基質のどちらかのマイクロプレートに対する中間結合および/あるいはDNAポリメラーゼによる修飾dNTPの不十分な取り込みに対する依存性が含まれる。より最近になって、分子ビーコンによるDNAポリメラーゼ活性のリアルタイム測定が説明されている(16)。感度が改善されたにもかかわらず、分子ビーコン蛍光の直接測定は、粗細胞ライセートにさらすことによって、潜在的に妨害される可能性がある。
本発明の開発において、我々は、精製された商業的供給源または新たに溶解した任意のタイプの生細胞に由来するDNAポリメラーゼ伸長活性を測定することが可能である、迅速で単純な、極めて高感度の定量的アッセイを、開発し始めた。図1Aは、qPCRに対してDNAポリメラーゼ伸長活性をカップリングさせることに関与する機構の模式的全体図を含む。とりわけ、オリゴ2は、Taq活性化に先立って、およびその間に、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)によって除去されるので、PCRサイクルの直前に基質の不要なTaq依存型伸長を妨げる。PCR増幅にT4DNAリガーゼ活性を連結させる微生物検出方法は、以前に報告されている(18)。この方法は、我々のDPE−PCRアッセイとの類似点を含んでおり、ETGA方法論の別の例である。しかし、我々の手の中では、この方法の修正版は、高感度かつ普遍的な微生物検出の欠如を被っている微生物由来NAD依存型DNAリガーゼ活性の検出を目指しており、本明細書中に説明され、かつDPE−PCRと呼ばれる改良された新規のDNAポリメラーゼに基づいたアプローチの開発に我々を導く。
実施例1:
精製DNAポリメラーゼ伸長活性の高感度かつ直線的な検出、相対的定量アッセイの基礎 我々は、市販のDNAポリメラーゼIを用いて、DPE−PCRアッセイの適当な分析感度の決定を開始した。この例では、DNAポリメラーゼIの量が減少することに由来するDPE−PCRシグナルを、入力DNAポリメラーゼなしの同様の反応(以下、「非入力対照」またはNICと呼ぶ)と比較した。図2Aに示すように、DNAポリメラーゼI伸長活性の検出は、広範囲の入力酵素で達成された。実際、DNAポリメラーゼI伸長活性は、NICから2×10−11ユニット(U)ほど少ない酵素(約50分子のポリメラーゼと等価)に至るまで、識別可能であった。我々の知る限りでは、このレベルでのDNAポリメラーゼ伸長活性の検出は既存のDNAポリメラーゼアッセイでは明らかにされていない。理論上、このレベルの感度は、単細胞を容易に検出可能にし得る。なぜなら、大腸菌のような微生物検出は、1細胞あたり約400のDNAポリメラーゼI分子を含むことが報告されている(11)。1細胞あたり同様の分子数が哺乳類DNAポリメラーゼで報告されている。回帰分析は、2つの独立した検出限界実験のデータをグラフ化した後、DPE−PCRサイクル閾値(Ct)と入力された市販のDNAポリメラーゼIのユニットとの間に、強い正の線形相関(R2=0.992)を示した(図2B)。50のDNAポリメラーゼ分子に至るまでのこの驚くほど優れた線形関係は、DNAポリメラーゼ分子、インタクトな細胞、ならびに核およびミトコンドリアなどの、これらのポリメラーゼを持つ細胞内小器官に対する信頼かつロバストな定量アッセイの開発の基礎を提供する。
精製DNAポリメラーゼ伸長活性の高感度かつ直線的な検出、相対的定量アッセイの基礎 我々は、市販のDNAポリメラーゼIを用いて、DPE−PCRアッセイの適当な分析感度の決定を開始した。この例では、DNAポリメラーゼIの量が減少することに由来するDPE−PCRシグナルを、入力DNAポリメラーゼなしの同様の反応(以下、「非入力対照」またはNICと呼ぶ)と比較した。図2Aに示すように、DNAポリメラーゼI伸長活性の検出は、広範囲の入力酵素で達成された。実際、DNAポリメラーゼI伸長活性は、NICから2×10−11ユニット(U)ほど少ない酵素(約50分子のポリメラーゼと等価)に至るまで、識別可能であった。我々の知る限りでは、このレベルでのDNAポリメラーゼ伸長活性の検出は既存のDNAポリメラーゼアッセイでは明らかにされていない。理論上、このレベルの感度は、単細胞を容易に検出可能にし得る。なぜなら、大腸菌のような微生物検出は、1細胞あたり約400のDNAポリメラーゼI分子を含むことが報告されている(11)。1細胞あたり同様の分子数が哺乳類DNAポリメラーゼで報告されている。回帰分析は、2つの独立した検出限界実験のデータをグラフ化した後、DPE−PCRサイクル閾値(Ct)と入力された市販のDNAポリメラーゼIのユニットとの間に、強い正の線形相関(R2=0.992)を示した(図2B)。50のDNAポリメラーゼ分子に至るまでのこの驚くほど優れた線形関係は、DNAポリメラーゼ分子、インタクトな細胞、ならびに核およびミトコンドリアなどの、これらのポリメラーゼを持つ細胞内小器官に対する信頼かつロバストな定量アッセイの開発の基礎を提供する。
感度および線形性の実験を行った後、重要なことは、DPE−PCRアッセイシグナルが固有のエキソヌクレアーゼ活性に依存しなかったかどうか決定することであった。この目的のために、我々は、続けて、2×10−7UのDNAポリメラーゼIによって生成されるシグナルを、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼI(クレノウ)から生成されたシグナルおよび全てのエキソヌクレアーゼ活性を欠く別の形態の酵素(クレノウexo−)から生成されたシグナルと比較した。さらなる特異性およびバックグラウンドシグナル測定については、2×10−7Uの大腸菌DNAリガーゼおよびNICを平行して試験した。図2Cに示すように、クレノウおよびクレノウexo−は、野生型DNAポリメラーゼIと比較した場合、同様のレベルで検出され、DPE−PCRアッセイシグナルがDNAポリメラーゼ依存型伸長に由来し、固有のエキソヌクレアーゼ活性には由来しないという証拠が得られた。
エキソヌクレアーゼ活性を持たないポリメラーゼを用いることに加え、qPCRに先立って、DNA基質のDNAポリメラーゼ依存型伸長にDPE−PCRアッセイシグナルが由来することをさらに立証する試みを行う。ジデオキシヌクレオチドの取り込みは、DNAポリメラーゼ鎖伸長活性の終結に使用される十分に確立された方法で(19、20)あることから、我々は、我々のDNAポリメラーゼ伸長反応混合物内でジデオキシCTP(ddCTP)によってdCTPを置換することを選択する。図2Dに示す模式図は、ddCTPがDNAポリメラーゼによって取り込まれ得る基質内の第1の予想位置を示す。ddCTPがこの位置に取り込まれる場合、オリゴ1の伸長産物は、qPCRプライマー1によるその後の検出には不十分な長さであろう(図1Aおよび図1Bの模式図を参照)。図2Dに示すように、ddCTPによるdCTPの置換は、DNAポリメラーゼIによって生成されるシグナルを除去し、それによって、DPE−PCRアッセイシグナルがqPCRに先立って基質のDNAポリメラーゼ伸長に依存することを示している。低量のコピー競合内部増幅の存在は、DNAポリメラーゼアッセイ試薬からキャリーオーバーされる低量のddCTPの存在によってqPCRが阻害されなかったことを裏付けている。
さらに、弱いが検出可能なシグナルは、入力DNAポリメラーゼ(非入力対照)が無い状態で観察された。DPE−PCRアッセイの精巧な感度により、我々は、弱いバックグランドノイズシグナルの原因が、反応アセンブリに先立ってDNAポリメラーゼ伸長ストック試薬に存在する「コンタミ」DNAポリメラーゼ活性にあり得ることを示した。DNAポリメラーゼ伸長試薬の前処理(材料と方法の欄を参照)は、日常的に実施され、観察されるコンタミDNAポリメラーゼシグナルを除去するのに十分である(一例として図2Aを参照)。さらに、我々は、望まないTaq依存型のシグナルの主な潜在的な源が活性UDGをqPCRマスターミックスに添加する際の操作者の過ちに起因し得ることを示した。例えば、qPCRマスターミックスからUDGを故意に省くことは、DNA基質のTaq依存伸長に由来する高バックグラウンドシグナルをもたらす(図2B)。しかし、我々は、方法の欄で説明したようにUDGを添加した場合に、高バックグラウンドシグナル(UDG非存在に起因)を観察したことがない。増大バックグランドシグナルの別の仮定されたソ源は、実験の設定中に操作者によって導入されるDNAポリメラーゼに由来し得る。したがって、本発明の実施において、DNAポリメラーゼ伸長とアッセイのqPCR部分とのための試料および試薬を調製する際に操作者は良好な無機技術を示す(コンタミネーション防止に推奨される材料および方法の欄参照)。上記のものを考えると、NICを各々の実験と平行して実行することで、開始試薬がコンタミネーション無く、UDGがqPCRマスターミックスに添加されていることがたいへん重要である。
結論:これらのデータは、検出の下限が50DNAポリメラーゼ分子レベルあたりに至る、少なくとも5桁の大きさの線形ダイナミックレンジを有する優れた線形関係を示す。この例のデータは、DNAポリメラーゼ分子、インタクトな細胞、ならびに核およびミトコンドリアなどの、これらのポリメラーゼを持つ細胞内小器官に対する信頼かつロバストな定量アッセイの開発の基礎を提供する。
方法:
黄色ブドウ球菌および大腸菌培養をOD600の値が1.0±0.2(約1×109cfu/mL)になるまで増殖させた。各々の生物について、1mLの培地をペレット化し、T.Eで3回洗った。細菌懸濁液をT.Eで連続希釈し、各々のストックの5μLを、50μLのDNAポリメラーゼ伸長反応混合物(組成について上記参照)を含むビーズミル溶解管に添加した。各々の1×105から1×100cfu/反応の滴定曲線を、各々の生物について、三重反復で実行した。これには、細菌懸濁液無しの三重反復反応も含まれる。
黄色ブドウ球菌および大腸菌培養をOD600の値が1.0±0.2(約1×109cfu/mL)になるまで増殖させた。各々の生物について、1mLの培地をペレット化し、T.Eで3回洗った。細菌懸濁液をT.Eで連続希釈し、各々のストックの5μLを、50μLのDNAポリメラーゼ伸長反応混合物(組成について上記参照)を含むビーズミル溶解管に添加した。各々の1×105から1×100cfu/反応の滴定曲線を、各々の生物について、三重反復で実行した。これには、細菌懸濁液無しの三重反復反応も含まれる。
ビーズミル溶解管は、100μLサイズのエッペンドルフチップを用いて、60μL(湿容量)の0.1mmガラスビーズ(Scientific Industries cat# SI−G01)を、そして、改造した1000μLサイズのエッペンドルフチップ(より再現性があり、かつ正確に0.5mmビーズをディスペンスすることができるように、1000μLサイズのエッペンドルフチップの末端を、滅菌カミソリ刃を用いて内径1mmに切断した)を用いて、50μL(湿容量)の0.5mmガラスビーズ(Scientific Industries cat# SI−BG05)を、ピペッティングすることによって、生成した。両サイズのビーズのスラリーを1.5mL管(ねじ蓋付き)に分注し、続いて、真空源に取り付けられた滅菌ゲル充填ピペットチップを用いて水性の上澄みを吸引した。吸引後、管をキャップし、使用前に加熱処理した(上記の加熱処理の欄を参照)。
5μLの細菌ストックを添加した後、ディスラプターヘッドを備えたデジタル式のVortex Genie(Scientific Industries)を用いて、反応管を6分間、2800rpmでビーズミリングした。破砕直後に、試料管を37℃に20分間、置いた。20分間インキュベートした後、試料管を95℃、5分間に移し、そして取り出して室温で冷やした。次に、試料管を12,000×gで30秒間遠心し、各々の反応の3μLをDPE−PCRアッセイのqPCR部分に入れた。各々の細菌ストックの5μLを配置し、より正確なcfu入力レベルを得た。遺伝子特異的PCRも、DNAポリメラーゼ検出のために用いられる同一の細胞ライセート上で実行した。
DNA基質設計および調製DNA基質の配列は、T4DNAリガーゼを介して細菌由来ATPを測定するために事前に使用されたDNAオリゴから、構成された(18)。オリゴ1(5'−gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagactgaccgaccgataagctagaacagagagacaacaac−3')およびオリゴ2(5'−uaggcgucggugacaaacggccagcguuguugucucu[ジデオキシシチジン]−3')は、Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)によって合成された。オリゴ2の中の「u」はデオキシウリジンを表わす。ジデオキシシチジン(ddC)は、DNAポリメラーゼ媒介伸長を妨げるべく、オリゴ2の3'末端上の最後の塩基として、含まれる(図1Bの模式図を参照)。最初に、凍結乾燥したオリゴ1およびオリゴ2を、終濃度100μMでTris−EDTA(T.E)pH8.0(Ambion)に再懸濁した。基質のルーチンプレアニーリングを以下のように行った。まず、100μLのオリゴ1(100μMストック)と100μLのオリゴ2(100μMストック)とを800μLのアニーリング緩衝液(200mM Tris、100mM塩化カリウム、および0.1mM EDTA)pH8.45に添加して、各々10μMのオリゴ1およびオリゴ2の1mL混合物を得た。10μMオリゴ混合物の100μLアリコートを、薄肉の0.2mL PCR管に分注し、キャップし、そして、GeneAmp(登録商標)9700サーモサイクラー(Applied Biosystems)に入れて、以下のプレアニーリングプログラムを実行した。95℃を2分間、デフォルト速度で25℃に下げていき、5分間インキュベートし、デフォルト速度で4℃に下げていく。オリゴアニーリング緩衝液(上述)を1:10で滅菌水(Ambion、cat#AM9932)に希釈して、基質希釈緩衝液を調製した。続いて、プレアニーリングしたDNA基質をオリゴ希釈緩衝液に希釈して終濃度0.01μM(10倍ストック)にし、等分量に分けて−20℃に保存した。
定量的PCRプライマー、プローブ、および競合内部対照設計ここで説明されるDPE−PCRプライマーは、T4DNAリガーゼにより修飾されたDNA基質を増幅するために以前に使用されたもの(18)であり、以下の通りである。すなわち、フォワードプライマー(5'−ggacaacggccgaactgggaaggcg−3')、リバースプライマー(5'−taggcgtcggtgacaaacggccagc−3')。この検討で用いた検出プローブは、(5'FAM−actgaccgaccgataagctagaacagagag−IABk−FQ3')である。qPCR抑制を監視するツールとして、競合内部対照を生成し、これには以下の配列が含まれる(5'−gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagatcagcaggccacacgttaaagacagagagacaacaacgctggccgtttgtcaccgacgccta−3')。内部対照配列は、Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)によって、「ミニ遺伝子」として、合成およびクローニングされた。受け取りに際して、内部対照ミニ遺伝子プラスミドを、制限酵素PvuI(New England Biolabs)を用いて線状化し、T.Eで所望の濃度に希釈し、PCRクリーンアップカラム(Qiagen)を用いて再精製した。精製内部対照を、Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific、ND−1000)を用いて定量し、T.Eで所望の濃度に希釈し、さらに、−20℃に保存した。内部対照DNAに特異的なプローブは、Integrated DNA Technologiesによって合成された(5'TX615−atcagcaggccacacgttaaagaca−IAbRQSp3')。基質/競合内部対照内のプライマー/プローブの相対的な配置を含む詳細な図解も図1Aおよび図1Bに見出すことができる。
DNAポリメラーゼ伸長反応条件 DNA Pol I(NEB cat# M0209L)、クレノウ(NEB cat# M0210S)およびクレノウexo(−)(NEB cat# M0212S)を、滅菌T.E、pH8.0に希釈して、示されるU/μLストックを得た。まず、各々の濃度のDNAポリメラーゼストック2μLを、以下の成分を含む50μLのDNAポリメラーゼ伸長反応混合物に入れた。50μM dNTP、20mM Tris pH8.0、10mM硫安、10mM塩化カリウム、2mM硫酸マグネシウム、1%BSA、0.1% Triton X−100、0.1%Tween20、および0.001μMプレアニーリング済DNA基質(上述)。2μLのT.E(DNAポリメラーゼなし)を、完全DNAポリメラーゼ伸長反応混合物を含む新たな管に、規定通りに添加し、「非入力対照」(NIC)と呼ぶことにした。DNAポリメラーゼ(または非入力対照)を含む反応を軽くボルテックスし、37℃に20分間置いた。20分後、3μLの精製DNAポリメラーゼを含む各々の反応を直ちにqPCR反応に入れた(qPCR条件については以下を参照)。
2',3'−ジデオキシシチジン−5'−三燐酸塩(ddCTP)に基づいたジデオキシ鎖終結実験ddCTPによる精製DNAポリメラーゼ伸長活性の終結:DNAポリメラーゼ伸長反応を、50μM dCTPまたは50μM ddCTP(Affymetrix #77332)のいずれかが添加された50μM[dATP、dGTP、dTTP]混合物により、上述したように調製した。dCTPまたはddCTPのいずれかが添加された50μM[dATP、dGTP、dTTP]混合物を有する50μL DNAポリメラーゼ伸長反応を、DNAポリメラーゼI(New England Biolabs # M0209)の1×10−9U/μLストックの2μLで、スパイクした。三重反復反応を37℃で20分間インキュベートし、続いて各々の反応3μLをqPCRに入れた。
DNAポリメラーゼ伸長反応成分の熱処理使用に先立って、DNAポリメラーゼ伸長反応試薬ストック(DNA基質なし)を以下のように熱処理した。すなわち、10×dNTP混合物[500μM dATP、dCTP、dGTP、dTTP]を90℃で30分間加熱した。10×コア反応混合物[200mM Tris pH8.0、100mM硫安、100mM塩化カリウム、20mM硫酸マグネシウム]を90℃で30分間加熱した。1.43×BSA/界面活性剤混合物[1.43%BSA、0.143%Triton X−100、0.143%Tween 20]を75℃で45分間加熱した。基質アニーリング緩衝液(200mM Tris、100mM塩化カリウム、および0.1mM EDTA)pH8.45を90℃で30分間加熱した。ビーズミル管を95℃で20分間加熱した。
定量的PCR組成物および熱サイクルパラメータ各々の30μL qPCR反応は、1×LightCycler 480 Master Mix(2×ストックから、Roche cat#04707494001)、333nMのフォワードおよびリバースプライマー、166nMの検出プローブ(FAM)、166nMの内部対照プローブ(TxRed)、1.2UのウラシルDNAグリコシラーゼ(以後、UDGと略、Bioline cat# BIO−20744)、および40コピーの競合内部対照DNA(上述)を含んだ。3μLの各々のDNAポリメラーゼ伸長反応(精製DNAポリメラーゼまたは微生物細胞ライセートから)を27μLのqPCRマスターミックスに添加し、二段階熱サイクルプロトコルを、以下のようにしてSmartCycler(Cepheid,Sunnyvale CA)上で実行した。最初のインキュベーションは40℃で10分間、50℃で10分間、および95℃で5分間行う(Taqを活性化させて、オリゴ2のUDG媒介DNA主鎖加水分解を完了する)。その後、95℃での変性5秒と65℃でのアニーリング/伸長20秒とを45サイクル実施したサイクル閾値(Ct)を、出現するqPCR曲線の2次微分分析を用いてSmartCyclerソフトウェアにより、自動的に生成した。
実施例2:
細胞ビーズミルライセートからの直接的な内在性DNAポリメラーゼ伸長活性の測定を介した微生物の高感度、定量的、および普遍的な検出精製ポリメラーゼ活性の検出に加えて、微生物由来DNAポリメラーゼ活性を測定する単純で高感度な普遍的方法がかなり望ましいと考えられる。例えば、DNAポリメラーゼ伸長活性の測定は、活性DNAポリメラーゼ持つ任意の微生物の存在について、環境的または生物学的試料をスクリーニングするために使用し得る。この目的のために、我々は、微生物溶解を我々のDPE−PCRアッセイと組み合わせる単純な方法を開発した。図3に示すように、微生物を含有することが知られている、または含有することが疑われる液体試料を、ビーズミル溶解管に添加し、破砕し、さらにDPE−PCRアッセイに直ちに移す。我々は、粗細胞ライセートにおいて微生物由来DNAポリメラーゼ伸長活性を測定する我々のアッセイの能力を示すべく、1種類のグラム陰性細菌(大腸菌)と1種類のグラム陽性細菌(黄色ブドウ球菌)とを選択する。図4Aに示すように、ビーズミル溶解と関連させた場合、DPE−PCRアッセイが溶解管あたり10コロニー形成単位(cfu)を下回るまで、入力大腸菌の広範囲なダイナミックレンジを検出することが可能である。大腸菌検出の線形回帰分析も、入力細菌の10cfuに至るまで行われ、0.999のR2値により示されるように、入力cfuとDNAポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に強い正の線形相関があることが示された(図4B)。コロニー計数平板培養および大腸菌遺伝子特異的qPCR(gsPCR)を平行に実行し、1反応あたりのcfuの入力レベルと、まったく同一のライセートに由来するインタクトなゲノムDNAを監視する能力との両方を確認する。黄色ブドウ球菌ライセートからのDNAポリメラーゼ伸長活性は、同様の入力レベルに検出された(図4C)。黄色ブドウ球菌検出は、10cfuの入力細菌に至るまでプロットされ、入力cfuとDNAポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に、強い線形相関も示された(R2=0.999、図4D)。コロニー計数平板培養とgsPCRとを平行して行い、各々のビーズ溶解管に存在する黄色ブドウ球菌の量と、直接分析可能なゲノムDNAの存在とを、確認した。
細胞ビーズミルライセートからの直接的な内在性DNAポリメラーゼ伸長活性の測定を介した微生物の高感度、定量的、および普遍的な検出精製ポリメラーゼ活性の検出に加えて、微生物由来DNAポリメラーゼ活性を測定する単純で高感度な普遍的方法がかなり望ましいと考えられる。例えば、DNAポリメラーゼ伸長活性の測定は、活性DNAポリメラーゼ持つ任意の微生物の存在について、環境的または生物学的試料をスクリーニングするために使用し得る。この目的のために、我々は、微生物溶解を我々のDPE−PCRアッセイと組み合わせる単純な方法を開発した。図3に示すように、微生物を含有することが知られている、または含有することが疑われる液体試料を、ビーズミル溶解管に添加し、破砕し、さらにDPE−PCRアッセイに直ちに移す。我々は、粗細胞ライセートにおいて微生物由来DNAポリメラーゼ伸長活性を測定する我々のアッセイの能力を示すべく、1種類のグラム陰性細菌(大腸菌)と1種類のグラム陽性細菌(黄色ブドウ球菌)とを選択する。図4Aに示すように、ビーズミル溶解と関連させた場合、DPE−PCRアッセイが溶解管あたり10コロニー形成単位(cfu)を下回るまで、入力大腸菌の広範囲なダイナミックレンジを検出することが可能である。大腸菌検出の線形回帰分析も、入力細菌の10cfuに至るまで行われ、0.999のR2値により示されるように、入力cfuとDNAポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に強い正の線形相関があることが示された(図4B)。コロニー計数平板培養および大腸菌遺伝子特異的qPCR(gsPCR)を平行に実行し、1反応あたりのcfuの入力レベルと、まったく同一のライセートに由来するインタクトなゲノムDNAを監視する能力との両方を確認する。黄色ブドウ球菌ライセートからのDNAポリメラーゼ伸長活性は、同様の入力レベルに検出された(図4C)。黄色ブドウ球菌検出は、10cfuの入力細菌に至るまでプロットされ、入力cfuとDNAポリメラーゼ伸長活性シグナルとの間に、強い線形相関も示された(R2=0.999、図4D)。コロニー計数平板培養とgsPCRとを平行して行い、各々のビーズ溶解管に存在する黄色ブドウ球菌の量と、直接分析可能なゲノムDNAの存在とを、確認した。
ddCTP置換を介した微生物のDPE−PCR検出の消去 図2Dに既に示されたように、DNAポリメラーゼ伸長反応混合物中のddCTPによるdCTPの置換は、我々のアッセイにおけるオリゴ1の伸長を妨げるための強力なツールを示す。細菌のスパイクに由来のシグナルがそのDNAポリメラーゼ伸長活性に依存し、ライセートに存在する他の内在性細菌酵素活性に依存しなかったことを示すべく、我々は、(dATP、dTTP、dGTP、ddCTP)を含む反応混合物に対して、(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)を含む標準的なDNAポリメラーゼ反応混合物を用いて大腸菌および黄色ブドウ球菌から得られたDPE−PCRシグナルを比較する実験をセットアップした。図5Aおよび図5Bに示すように、標準反応混合物と比較した場合、ddCTPの置換は大腸菌由来のシグナル、黄色ブドウ球菌cfuスパイクの生成を妨げる。加えて、提示されたデータは、微生物DNAポリメラーゼ伸長活性をDPE−PCRアッセイが特異的に検出しており、シグナルがDNAポリメラーゼ以外の酵素活性を介する基質の修飾に由来するものではないという、特許請求の範囲を強く支持する。
結論:まとめると、本発明に従って、我々は、新規の極めて高感度で定量的かつ迅速なDPE−PCRアッセイを開発した。このアッセイは、精製または選択された細胞タイプを示す場合に原核細胞を数え上げるために使用することができる。これらのデータは、少なくとも5桁の大きさの線形ダイナミックレンジで優れた線形関係を示す。我々は、ビーズ溶解とカップリングさせることを介して、10cfu未満の細菌から、DNAポリメラーゼ伸長活性を、再現性をもって測定するDPE−PCRの能力を示した。我々はまた、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、およびカンジダ種から構成される微生物のパネルを試験することにより、普遍的に微生物を検出するための本発明のDPE−PCRアッセイの可能性も示した。さらに、DPE−PCRアッセイは、細菌細胞の生存率を評価するために用いることができるとともに、DNAポリメラーゼ伸長活性とcfuの存在によって示される増殖との間の再現性のある強い相関を介して、提供されたことが示されている。本明細書中に示されるデータを鑑みると、我々は、本発明のDPE−PCRアッセイによって例証されるETGA方法論が医薬、環境、食品、および臨床の場で、広範囲の試験用途のための有用な定量的ツールになる可能性を有していると、信じる。
実施例3:
インタクトなヒト血小板濃縮液は、高レベルのDNAポリメラーゼ伸長活性を有する
目的:
本発明のETGAアッセイを用いて検出可能なDNAポリメラーゼ伸長活性の存在、3つの異なる方法論、すなわち誘導全血、非白血球を減らした血液成分選択、および白血球を減らした血液成分選択を介して回収された生存可能なヒト血小板濃縮液(PC)から得た粗ビーズミルライセートの活性を調べること。
インタクトなヒト血小板濃縮液は、高レベルのDNAポリメラーゼ伸長活性を有する
目的:
本発明のETGAアッセイを用いて検出可能なDNAポリメラーゼ伸長活性の存在、3つの異なる方法論、すなわち誘導全血、非白血球を減らした血液成分選択、および白血球を減らした血液成分選択を介して回収された生存可能なヒト血小板濃縮液(PC)から得た粗ビーズミルライセートの活性を調べること。
方法:
血小板を除去 インキュベータから血小板袋を取り外す。
青色の「スライドピンチクランプ」を管に加え、管の首に隣接させる。
大きなペーパクリップを用いてフードシーリングからバックをつるす。
剪刀/クリッパーを炎消毒して、除去に使用される管の端部をアルコールワイプで拭く。
15mlコニカルを管の下方に置く(管にトラップされた血小板容積を「パージする」ため)。
滅菌クリッパーを用いて管の閉端部近傍を切断する。
クランプを「開」位置へゆっくりスライドさせ、5mlの血小板を15mlコニカルバイアルに流し込み、さらに、「閉」位置にスライドさせる。
第2の15mlコニカルを管の下方に置く。
クランプを「開」位置へゆっくりスライドさせ、5mlの血小板を15mlコニカルバイアルに流し込み、さらに、「閉」位置にスライドさせる。
管の開口端部近傍に外科鉗子を配置し、アルコールパッドで拭いてその開口端部から滴を除去する。
血小板を除去 インキュベータから血小板袋を取り外す。
青色の「スライドピンチクランプ」を管に加え、管の首に隣接させる。
大きなペーパクリップを用いてフードシーリングからバックをつるす。
剪刀/クリッパーを炎消毒して、除去に使用される管の端部をアルコールワイプで拭く。
15mlコニカルを管の下方に置く(管にトラップされた血小板容積を「パージする」ため)。
滅菌クリッパーを用いて管の閉端部近傍を切断する。
クランプを「開」位置へゆっくりスライドさせ、5mlの血小板を15mlコニカルバイアルに流し込み、さらに、「閉」位置にスライドさせる。
第2の15mlコニカルを管の下方に置く。
クランプを「開」位置へゆっくりスライドさせ、5mlの血小板を15mlコニカルバイアルに流し込み、さらに、「閉」位置にスライドさせる。
管の開口端部近傍に外科鉗子を配置し、アルコールパッドで拭いてその開口端部から滴を除去する。
プレETGA調製
新しい手袋を身につけて、IPAで清浄する。
フリーザーから以下の試薬の等分量を取り、指示された温度で解凍する。
5X/dNTP[青色キャップ]−室温(2',3'−ジデオキシシチジン−5'−三燐酸塩(ddCTP)DNAポリメラーゼ伸長終結実験用に、dCTPの代わりにddCTPを用いて新しいdNTP混合物を構築する)。
基質[白色キャップ]−室温
BSA/界面活性剤[緑色キャップ]−室温
qPCRオリゴ混合物[橙色キャップ]−室温
Roche Probes Master Mix[橙色キャップ]−室温
新しい手袋を身につけて、IPAで清浄する。
フリーザーから以下の試薬の等分量を取り、指示された温度で解凍する。
5X/dNTP[青色キャップ]−室温(2',3'−ジデオキシシチジン−5'−三燐酸塩(ddCTP)DNAポリメラーゼ伸長終結実験用に、dCTPの代わりにddCTPを用いて新しいdNTP混合物を構築する)。
基質[白色キャップ]−室温
BSA/界面活性剤[緑色キャップ]−室温
qPCRオリゴ混合物[橙色キャップ]−室温
Roche Probes Master Mix[橙色キャップ]−室温
ETGA
試料調製
0.5mLのPCを別の空の管に添加し、「非溶解PC」と命名してキャップする。
滅菌を確認するために100μLのPCで平板培養された血液寒天培地細菌培養(多くの場合、8mLのPCを好気性および嫌気性血液培養瓶にもイノキュレートしてPCユニットの滅菌を確認した)。プレートを37℃で48時間インキュベートし、コロニー数を記録。イノキュレートされた血液培養瓶を自動インキュベータで5日間、インキュベートした。
8000×gで3分間遠心。
上清を捨て、プラスチック裏引層のあるラボワイプ(Thomas Cat# 2904N90)上に管を逆さにする(3秒間保つ)。
0.6mlの滅菌塩類溶液を非溶解対照に添加し、ピペットを上下して混合し、同時に、予め標識したビーズミル管に移す。
8000×gで3分間遠心。
1mlピペットを用いて注意深く上清を取り除く。(ビーズ層の過剰な破砕無しに可能な限り多くの残液を除去することが重要である。)
以下のように溶解混合物を構築。
試料調製
0.5mLのPCを別の空の管に添加し、「非溶解PC」と命名してキャップする。
滅菌を確認するために100μLのPCで平板培養された血液寒天培地細菌培養(多くの場合、8mLのPCを好気性および嫌気性血液培養瓶にもイノキュレートしてPCユニットの滅菌を確認した)。プレートを37℃で48時間インキュベートし、コロニー数を記録。イノキュレートされた血液培養瓶を自動インキュベータで5日間、インキュベートした。
8000×gで3分間遠心。
上清を捨て、プラスチック裏引層のあるラボワイプ(Thomas Cat# 2904N90)上に管を逆さにする(3秒間保つ)。
0.6mlの滅菌塩類溶液を非溶解対照に添加し、ピペットを上下して混合し、同時に、予め標識したビーズミル管に移す。
8000×gで3分間遠心。
1mlピペットを用いて注意深く上清を取り除く。(ビーズ層の過剰な破砕無しに可能な限り多くの残液を除去することが重要である。)
以下のように溶解混合物を構築。
細胞溶解混合物準備。n=10×50μl反応(以下にリストする順序で試薬を添加)に十分:
管を解凍した後、ボルテックスおよびパルス遠心して含有物を回収。
100μLの5X/dNTP混合物(青色キャップ)をBSA/界面活性剤混合物(緑色キャップ)に添加。
50μLの基質(白色キャップ)をBSA/界面活性剤混合物(緑色キャップ)に添加。
BSA/界面活性剤混合物(緑色キャップ)管をキャップし、ボルテックスして混合。
パルス遠心して含有物を回収。
50μLの溶解混合物を試料および対照に添加。
管を解凍した後、ボルテックスおよびパルス遠心して含有物を回収。
100μLの5X/dNTP混合物(青色キャップ)をBSA/界面活性剤混合物(緑色キャップ)に添加。
50μLの基質(白色キャップ)をBSA/界面活性剤混合物(緑色キャップ)に添加。
BSA/界面活性剤混合物(緑色キャップ)管をキャップし、ボルテックスして混合。
パルス遠心して含有物を回収。
50μLの溶解混合物を試料および対照に添加。
細胞溶解:
50μL溶解混合物を各々のビーズミル管に添加。
ビーズミル管をディスラプターヘッドに入れて、2800rpmで6分間ボルテックス。
5μLのDNAポリメラーゼ(プレ希釈PCストック)をDNAポリメラーゼ対照管に添加し、軽くボルテックス。
50μL溶解混合物を各々のビーズミル管に添加。
ビーズミル管をディスラプターヘッドに入れて、2800rpmで6分間ボルテックス。
5μLのDNAポリメラーゼ(プレ希釈PCストック)をDNAポリメラーゼ対照管に添加し、軽くボルテックス。
基質の酵素修飾:
各々の管を37℃に20分間置く。
各々の管を95℃ヒートブロックに5分間移す。
この5分間インキュベーションの間にPCRマスターミックス(×2)を構築。
150μLのRoche Probes Mastermixをオリゴ混合管に添加。
12μLのUNGをオリゴ混合管に添加。
ボルテックスおよびパルス遠心して回収。
95℃で加熱後、管を室温に1分間放置。
27.2μLのPCRマスターミックスを各々のプレ標識SMARTサイクラー管(Cepheid Part# 900−0003)に添加。
12000×gで30秒間、ビーズミル管を遠心。
4μLのライセートをPCR反応管に添加。
以下のPolMASLBNアッセイ定義を用いてSMARTサイクラー上でPCRを実行:
1サイクル 40℃ 10分間
50℃ 10分間
95℃ 5分間
45サイクル
95℃ 5秒間
65℃ 20秒間。
各々の管を37℃に20分間置く。
各々の管を95℃ヒートブロックに5分間移す。
この5分間インキュベーションの間にPCRマスターミックス(×2)を構築。
150μLのRoche Probes Mastermixをオリゴ混合管に添加。
12μLのUNGをオリゴ混合管に添加。
ボルテックスおよびパルス遠心して回収。
95℃で加熱後、管を室温に1分間放置。
27.2μLのPCRマスターミックスを各々のプレ標識SMARTサイクラー管(Cepheid Part# 900−0003)に添加。
12000×gで30秒間、ビーズミル管を遠心。
4μLのライセートをPCR反応管に添加。
以下のPolMASLBNアッセイ定義を用いてSMARTサイクラー上でPCRを実行:
1サイクル 40℃ 10分間
50℃ 10分間
95℃ 5分間
45サイクル
95℃ 5秒間
65℃ 20秒間。
結果:
1.調べた全てのユニットは、平板培養、血液培養、またはその両方のいずれかのインキュベーションによる細菌の存在に関して陰性であった。
2.PCを調製する3つの方法全ては、インタクトなPC細胞膜がビーズミルにより破砕されて細胞含有物を遊離させた後に、ロバストDNAポリメラーゼシグナルを得た。
3.全3つの方法について、DNAポリメラーゼは、ddCTP連鎖停止反応実験を介して測定された伸長活性の主な原因であることが証明された。ddCTP連鎖停止反応を介した上記およびDNAポリメラーゼ特異性実験DNAのグラフィックデータ表示に関する図6を参照せよ。注:化学的に溶解/変性した「非溶解PC」ではなかったインタクトなPCのETGA分析は、DNAポリメラーゼなどの固有の酵素活性を含む粗細胞ライセートを形成する形質膜をその後にビーズミルにより破砕することに先立って、行われた。
1.調べた全てのユニットは、平板培養、血液培養、またはその両方のいずれかのインキュベーションによる細菌の存在に関して陰性であった。
2.PCを調製する3つの方法全ては、インタクトなPC細胞膜がビーズミルにより破砕されて細胞含有物を遊離させた後に、ロバストDNAポリメラーゼシグナルを得た。
3.全3つの方法について、DNAポリメラーゼは、ddCTP連鎖停止反応実験を介して測定された伸長活性の主な原因であることが証明された。ddCTP連鎖停止反応を介した上記およびDNAポリメラーゼ特異性実験DNAのグラフィックデータ表示に関する図6を参照せよ。注:化学的に溶解/変性した「非溶解PC」ではなかったインタクトなPCのETGA分析は、DNAポリメラーゼなどの固有の酵素活性を含む粗細胞ライセートを形成する形質膜をその後にビーズミルにより破砕することに先立って、行われた。
結論:
ddCTP実験は、これらのヒトPC由来シグナルがDNAポリメラーゼ伸長活性に依存しているということを証明する。したがって、ETGAアッセイは、PC調製の方法に関係なくビーズミルによる膜破砕に続いて、滅菌されたインタクトな血小板濃縮液から高レベルのDNAポリメラーゼシグナルを検出する。この哺乳類PCのETGAシグナルは、血小板が核を欠いていることから、血小板由来ミトコンドリアガンマDNAポリメラーゼ活性から主に由来すると期待される。しかし、PCにおいて、マイナーなポリメラーゼシグナルの寄与は、核をもつ白血球のコンタミを除外することができない。この文献に基づいて、すべての哺乳類の血液細胞型が、核とミトコンドリアとを欠如している赤血球を除いて、強いDNAポリメラーゼシグナルを出すと合理的に予想される。当業者は、核またはミトコンドリアを含むいかなる哺乳動物細胞であっても検出の候補と本発明のこの新規アッセイを経た定量化であると更に予想されることを理解するであろう。
ddCTP実験は、これらのヒトPC由来シグナルがDNAポリメラーゼ伸長活性に依存しているということを証明する。したがって、ETGAアッセイは、PC調製の方法に関係なくビーズミルによる膜破砕に続いて、滅菌されたインタクトな血小板濃縮液から高レベルのDNAポリメラーゼシグナルを検出する。この哺乳類PCのETGAシグナルは、血小板が核を欠いていることから、血小板由来ミトコンドリアガンマDNAポリメラーゼ活性から主に由来すると期待される。しかし、PCにおいて、マイナーなポリメラーゼシグナルの寄与は、核をもつ白血球のコンタミを除外することができない。この文献に基づいて、すべての哺乳類の血液細胞型が、核とミトコンドリアとを欠如している赤血球を除いて、強いDNAポリメラーゼシグナルを出すと合理的に予想される。当業者は、核またはミトコンドリアを含むいかなる哺乳動物細胞であっても検出の候補と本発明のこの新規アッセイを経た定量化であると更に予想されることを理解するであろう。
実施例4:
ヒト細胞培養細胞数および生存率の高感度かつ定量的な指標としてのDNAポリメラーゼ伸長活性の測定
目的:ETGAがインビトロ培養Hep2細胞からDNAポリメラーゼ伸長活性を検出できるかどうかを決定すること。
方法:
Hep2細胞のコンフルエントなT75フラスコを得た。
PBSによりフラスコを洗って細胞を回収し、トリプシン溶液を添加し、さらに、培地によりクエンチング。
フラスコ(13mL)から含有物を15mLのコニカルバイアルへ移動。
15mLバイアルから、2×1mL等分量の細胞懸濁液を取り、PBSで3回洗浄。(各々、洗浄過程で、6,000rpmで2分間遠心)。
最終ペレットを1mL PBSに再懸濁。このストックをPBSで1:5希釈し、ヘマサイトメータを用いて細胞計数を実施。5μLのn=5の希釈細胞懸濁液(および非スパイク対照)を50μLのDPE混合物を含むビーズミル管に添加。
ヒト細胞培養細胞数および生存率の高感度かつ定量的な指標としてのDNAポリメラーゼ伸長活性の測定
目的:ETGAがインビトロ培養Hep2細胞からDNAポリメラーゼ伸長活性を検出できるかどうかを決定すること。
方法:
Hep2細胞のコンフルエントなT75フラスコを得た。
PBSによりフラスコを洗って細胞を回収し、トリプシン溶液を添加し、さらに、培地によりクエンチング。
フラスコ(13mL)から含有物を15mLのコニカルバイアルへ移動。
15mLバイアルから、2×1mL等分量の細胞懸濁液を取り、PBSで3回洗浄。(各々、洗浄過程で、6,000rpmで2分間遠心)。
最終ペレットを1mL PBSに再懸濁。このストックをPBSで1:5希釈し、ヘマサイトメータを用いて細胞計数を実施。5μLのn=5の希釈細胞懸濁液(および非スパイク対照)を50μLのDPE混合物を含むビーズミル管に添加。
生物溶解:50μL溶解混合物を各々のビーズミル管に添加。
ビーズミル管をディスラプターヘッドに入れて、2800rpmで6分間ボルテックス。
ビーズミル管をディスラプターヘッドに入れて、2800rpmで6分間ボルテックス。
基質の酵素修飾:
各々の管を37℃に20分間置く。
各々の管を95℃ヒートブロックに5分間移す。
この5分間インキュベーションの間にPCRマスターミックスを構築。
150μLのRoche Probes Mastermixをオリゴ混合管に添加。
12μLのUNGをオリゴ混合管に添加。
ボルテックスおよびパルス遠心して回収。
95℃で加熱後、管を室温に1分間放置。
27.2μlのPCRマスターミックスを各々のプレ標識SMARTサイクラー管(Cepheid Part#900−0003)に添加。
12000×gで30秒間、ビーズミル管を遠心。4μlのライセートをPCR反応管に添加。以下のPolMASLBNアッセイ定義を用いてSMARTサイクラー上でPCRを実行:
1サイクル 40℃ 10分間
50℃ 10分間
95℃ 5分間
45サイクル 95℃ 5秒間
65℃ 20秒間
各々の管を37℃に20分間置く。
各々の管を95℃ヒートブロックに5分間移す。
この5分間インキュベーションの間にPCRマスターミックスを構築。
150μLのRoche Probes Mastermixをオリゴ混合管に添加。
12μLのUNGをオリゴ混合管に添加。
ボルテックスおよびパルス遠心して回収。
95℃で加熱後、管を室温に1分間放置。
27.2μlのPCRマスターミックスを各々のプレ標識SMARTサイクラー管(Cepheid Part#900−0003)に添加。
12000×gで30秒間、ビーズミル管を遠心。4μlのライセートをPCR反応管に添加。以下のPolMASLBNアッセイ定義を用いてSMARTサイクラー上でPCRを実行:
1サイクル 40℃ 10分間
50℃ 10分間
95℃ 5分間
45サイクル 95℃ 5秒間
65℃ 20秒間
結果:
細胞計数
レベル1=1×106細胞
レベル2=2×105細胞
レベル3=4×104細胞
レベル4=8×103細胞
レベル5=1.6×103細胞
細胞計数
レベル1=1×106細胞
レベル2=2×105細胞
レベル3=4×104細胞
レベル4=8×103細胞
レベル5=1.6×103細胞
結論:
本発明に従って実行されるETGAアッセイ方法は、インビトロ培養Hep2細胞に関連したDNAポリメラーゼ伸長活性の検出が可能である。このアッセイ方法がどのようなインタクトな生細胞からでも何らかのDNAポリメラーゼを、および/または、核、ミトコンドリアなどの細胞内小器官に含まれているそれらのポリメラーゼを、検出し得ると、合理的に想定される。
本発明に従って実行されるETGAアッセイ方法は、インビトロ培養Hep2細胞に関連したDNAポリメラーゼ伸長活性の検出が可能である。このアッセイ方法がどのようなインタクトな生細胞からでも何らかのDNAポリメラーゼを、および/または、核、ミトコンドリアなどの細胞内小器官に含まれているそれらのポリメラーゼを、検出し得ると、合理的に想定される。
実施例5:
実施例:逆転写酵素(RT)検出アッセイ
目的:我々の基本的DPE−PCRアッセイ系内でDNA(S1)/RNA(AS)基質を用いて逆転写酵素を検出する能力を評価することを意図した実験を行うこと。本発明のETGAアッセイ技術のこの実施形態は、限定されるものではないが、薬剤開発産業のための逆転写酵素阻害剤のスクリーニングおよび生物学的試料内のウイルス粒子(HIV)の検出などの用途を可能にし得る。
実施例:逆転写酵素(RT)検出アッセイ
目的:我々の基本的DPE−PCRアッセイ系内でDNA(S1)/RNA(AS)基質を用いて逆転写酵素を検出する能力を評価することを意図した実験を行うこと。本発明のETGAアッセイ技術のこの実施形態は、限定されるものではないが、薬剤開発産業のための逆転写酵素阻害剤のスクリーニングおよび生物学的試料内のウイルス粒子(HIV)の検出などの用途を可能にし得る。
方法:
DNAオリゴヌクレオチド基質調製で説明した手順に基づいて、標準S1(DNA)とSASextオリゴヌクレオチドのRNAバージョンをプレアニーリング。
プレアニーリングされたオリゴヌクレオチド伸長基質を、終濃度が0.01μMとなるように、10×RT緩衝液に1:10で希釈。
DNAオリゴヌクレオチド基質調製で説明した手順に基づいて、標準S1(DNA)とSASextオリゴヌクレオチドのRNAバージョンをプレアニーリング。
プレアニーリングされたオリゴヌクレオチド伸長基質を、終濃度が0.01μMとなるように、10×RT緩衝液に1:10で希釈。
SSIIIキット(インビトロゲン)に同封されている試薬を用いて、以下の反応混合物を構築。1反応あたり添加
5μL 基質
2μL 10×RT緩衝液
4μL MgCl2(25mM)
2μL DTT (0.1M)
0.5μL RNase OUT
1μL dNTP混合物
3.5μL 水
18μL 1反応管あたり
+2μLのRT希釈溶液(T.Eで作製)
20μL
各RT希釈液2μL(または試薬対照として2μLのT.E)を添加した後、37℃で20分間インキュベート。
3μLの反応をPCR反応(UNGを含まず)に添加し、UNGプレインキュベーションステップなしでサイクリング。
5μL 基質
2μL 10×RT緩衝液
4μL MgCl2(25mM)
2μL DTT (0.1M)
0.5μL RNase OUT
1μL dNTP混合物
3.5μL 水
18μL 1反応管あたり
+2μLのRT希釈溶液(T.Eで作製)
20μL
各RT希釈液2μL(または試薬対照として2μLのT.E)を添加した後、37℃で20分間インキュベート。
3μLの反応をPCR反応(UNGを含まず)に添加し、UNGプレインキュベーションステップなしでサイクリング。
反応ID
1.RTの1E−2希釈
2.RTの1E−4希釈
3.RTの1E−6希釈
4.RTの1E−8希釈
5.RTの1E−10希釈
6.DNA Pol I(*多少の固有RT活性を有する)の1E−8希釈
7.T.E.
8.T.E.
9.PCRブランク(T.E)
1.RTの1E−2希釈
2.RTの1E−4希釈
3.RTの1E−6希釈
4.RTの1E−8希釈
5.RTの1E−10希釈
6.DNA Pol I(*多少の固有RT活性を有する)の1E−8希釈
7.T.E.
8.T.E.
9.PCRブランク(T.E)
結論:DNA−AS−オリゴヌクレオチドの代わりに単純なRNAオリゴヌクレオチドのみを用いて逆転写酵素活性の検出が成功裏に示された。試薬バックグラウンド(T.Eのみ)は、完全に陰性であり(PCRにUNGが無い場合でも)、TaqDNAポリメラーゼがDNA:RNAハイブリッドプライマー伸長基質を伸長しないことを示している。
実施例6:
例:ヒト免疫不全ウイルス(HIV)逆転写酵素検出アッセイ 目的:本発明のETGAアッセイ系内でDNA(S1)/RNA(AS)基質を用いて組換えHIV逆転写酵素活性を検出する能力を評価することを意図した実験を行うこと。
例:ヒト免疫不全ウイルス(HIV)逆転写酵素検出アッセイ 目的:本発明のETGAアッセイ系内でDNA(S1)/RNA(AS)基質を用いて組換えHIV逆転写酵素活性を検出する能力を評価することを意図した実験を行うこと。
方法:
組換えHIV RT(Calbiochem cat#382129)
SSIIIキット(インビトロゲン)に同封されている試薬を用いて、以下の反応混合物を構築。1反応あたり添加
5μL プレアニーリングしたRNA/DNA基質(0.01μM)
2μL 10×RT緩衝液
4μL MgCl2(25mM)
2μL DTT (0.1M)
0.5μL RNase OUT
1μL dNTP混合物
3.5μL 水
18μL 1反応管あたり
+2μLのRT希釈溶液(T.Eで作製)
20μL
各RT希釈液2μL(または試薬対照として2μLのT.E)を添加した後、37℃で20分間インキュベート。
3μLの反応をPCR反応(UNGを含まず)に添加し、UNGプレインキュベーションステップなしでサイクリング。
組換えHIV RT(Calbiochem cat#382129)
SSIIIキット(インビトロゲン)に同封されている試薬を用いて、以下の反応混合物を構築。1反応あたり添加
5μL プレアニーリングしたRNA/DNA基質(0.01μM)
2μL 10×RT緩衝液
4μL MgCl2(25mM)
2μL DTT (0.1M)
0.5μL RNase OUT
1μL dNTP混合物
3.5μL 水
18μL 1反応管あたり
+2μLのRT希釈溶液(T.Eで作製)
20μL
各RT希釈液2μL(または試薬対照として2μLのT.E)を添加した後、37℃で20分間インキュベート。
3μLの反応をPCR反応(UNGを含まず)に添加し、UNGプレインキュベーションステップなしでサイクリング。
反応ID
10.HIV−RTの1E−2希釈
11.HIV−RTの1E−4希釈
12.HIV−RTの1E−6希釈
13.HIV−RTの1E−8希釈
14.HIV−RTの1E−10希釈
15.Superscript III RT酵素(Pos対照)の1E−4希釈
16.T.E.
17.T.E.
18.PCRブランク(T.E)
10.HIV−RTの1E−2希釈
11.HIV−RTの1E−4希釈
12.HIV−RTの1E−6希釈
13.HIV−RTの1E−8希釈
14.HIV−RTの1E−10希釈
15.Superscript III RT酵素(Pos対照)の1E−4希釈
16.T.E.
17.T.E.
18.PCRブランク(T.E)
結論:単純なAS−オリゴ置換RNA−オリゴヌクレオチドのみを用いたHIV逆転写酵素活性の検出は、本発明の新規アッセイによって可能になるように、示された。試薬バックグラウンド(T.Eのみ)は、完全に陰性であり(PCRにUNGが無い場合でも)、TaqDNAポリメラーゼがDNA:RNAハイブリッドプライマー伸長基質伸長を認識しないことを示している。この例は、HIV逆転写酵素が、RT酵素活性の検出および定量化用のDNAポリメラーゼ、および/あるいは活性HIV RTもしくは生存可能なウィロイドを持つ任意の細胞または細胞内小器官成分の代わりに置換し得ることを、示している。
この出願の全体にわたって引用される参照文献、特許、および公開特許出願の内容は、あたかも同程度で、個々の出版物、特許、または特許出願が援用されるように具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に援用される。
前述の詳細な説明は、理解を明瞭にするためのみなされ、変形が当業者にとって明らかであることから、そこから不必要な限界が推定されてはならない。本明細書中に提供される情報のいずれも先行技術であるか、または現在クレームされた発明に関連すること、あるいは具体的または暗黙裏に参照された任意の刊行物が先行技術であることを、認めるものではない。
別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。
本発明がその特定の実施形態に関連して説明され一方で、さらなる改変が可能であり、また、この出願が、本発明のいかなる変形、使用、または適用を包含することを意図していることは理解されよう。それらは、一般に、本発明の原理に従うものであり、また、本発明が関係する当該技術分野で公知または慣習的に行われているものの範囲内および本明細書において先に説明された必須の特徴に適用可能であるものとして、本開示から逸脱するものを含む。
参照文献
1.Rothwell,P.J and Waksman,G.(2005)Structure and mechanism of DNA polymerases.Advan.Prot.Chem.71 401−440.
2.Joyce,C.M.and Steitz,T.A.(1994)Function and structure relationships in DNA polymerases.Annu.Rev.Biochem.63,777−822.
3.Mar Alba,M.(2001)Replicative DNA polymerases.Genome Biol.2,30021−3002.4.
4.Lehman,I.,Bessman,M.,Simms,E.and Kornberg,A.(1958)Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid.I.preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli.J.Biol.Chem.233,163−170.
5.Hamilton,S.C.,Farchaus,J.W.,and Davis,M.C.(2001)DNA polymerases as engines for biotechnology.BioTechniques31,370−383.
6.Tarantino,P.M.,Zhi,C.,Wright,G.E.,and Brown,N.C.(1999)Inhibitors of DNA polymerase III as novel antimicrobial agents and gram−positive bacteria.Antimicrob.Agents Chemother.43,1982−1987.
7.Kuhl,A.,Svenstrup,N.,Ladel,C.,Otteneder,M.,Binas,A.,Schiffer,G.,Brands,M.,Lampe,T.,Ziegelbauer,K.,Rubsamen−Waigmann,H.,Haebich,D.and Ehlert,K.(2005)Biological characterization of novel inhibitors of he gram−positive DNA polymerase IIIC enzyme.Antimicrob.Agents Chemother.49,987−995.
8.Lange,S.S.,Takata,K.and Wood,R.D.(2011)DNA polymerases and cancer.Nat.Rev.Cancer 11,96−110.
9.Martin,S.A.,McCabe,N.,Mullarkey,M.,Cummins,R.,Burgess,D.J.,Nakabeppu,Y.,Oka,S.,Kay,E.,Lord,C.J.and Ashworth,A.(2010)DNA polymerases as potential therapeutic targets for cancers deficient in the DNA mismatch repair proteins MSH2 or MLH1.Cancer Cell 17,235−248.
10.Naviaux,R.K.,Markusic,D.,Barshop,B.A.,Nyhan,W.L.and Haas,R.H.(1999)Sensitive assay for mitochondrial DNA polymerase γ.Clin.Chem.45,1725−1733.
11.Richardson,C.C.,Schildkraut,C.L.,Vasken Aposhian,H.and Kornberg,A.(1964)Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid.J.Biol.Chem.239,222−232.
12.Griep,M.A.(1995)Flurescence recovery assay:A continuous assay for processive DNA polymerase applied specifically to DNA polymerase III holoenzyme.Anal.Biochem.232,180−189.
13.Seville,M.,West A.B.,Cull,M.G.and McHenry,C.S.(1996)Fluorometric assay for DNA polymerases and reverse transcriptase.Biotechniques 21,664,668,670,672.
14.Tveit,H.and Kristensen,T.(2001)Fluorescence−based DNA polymerase assay.Anal.Biochem.289,96−98.
15.Yu,Liming,Hu,G.and Howells,L.(2002)Fluorescence−based,high−throughput DNA polymerase assay.Biotechniques 33,938−941.
16.Ma,C.,Tang,Z.,Wang,K.,Tan,W.,Li,J.,Li,W.,Li,Z.,Yang,X.,Li,H.and Liu,L.(2006)Real−time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.Anal.Biochem.353,141−143.
17.Luo,X.and Hsing I.(2011)Immobilization−free electrochemical DNA polymerase assay.Electroanalysis 23,923−926.
18.Banin,S.,Wilson,S.and Stanley C.(2007)The LiMA technology:measurement of ATP on a nucleic acid testing platform. Clin Chem 53,2034−2036.
19.Toji,L.and Cohen,S.S.(1969)The enzymatic termination of polydeoxynucleotides by 2'3'−dideoxyadonsine triphosphate.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63,871−877.
20.Sanger,F.,Nicklen,S.and Coulson,R.(1977)DNA sequencing with chain−terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463−5467.
21.Davey,H.M.(2011)Life,death,and in−between:Meanings and methods in microbiology.Appl.Environ.Microbiol.77,5571−5576.
22.Rappe,M.S.and Giovannoni,S.J.(2003)The uncultured microbial majority.Annu.Rev.Microbiol.57,369−394.
23.Riley,B.(2004)Rapid microbiology methods in the pharmaceutical industry.Amer.Pharm.Rev.1−4.
24.Keer,J.T.and Birch,L.(2003)Molecular methods for the assessment of bacterial viability.J.Microbio.Meth.53,175−183.
25.Masters,C.,Shallcross,J.and Mackey,B.(1994)Effect of stress treatments on the detection of Listeria monocytogenes and enterotoxigenic Escherichia coli by the polymerase chain reaction.J.Appl.Bacteriol.77,73−79.
26.Sheridan,G.E.C.,Masters,C.I.,Shallcross,J.A.and Mackey,B.M.(1998)Detection of mRNA by reverse transcription−PCR as an indicator of viability in Escherichia coli cells.Appl.Environ.Microbiol.64,1313−1318.
1.Rothwell,P.J and Waksman,G.(2005)Structure and mechanism of DNA polymerases.Advan.Prot.Chem.71 401−440.
2.Joyce,C.M.and Steitz,T.A.(1994)Function and structure relationships in DNA polymerases.Annu.Rev.Biochem.63,777−822.
3.Mar Alba,M.(2001)Replicative DNA polymerases.Genome Biol.2,30021−3002.4.
4.Lehman,I.,Bessman,M.,Simms,E.and Kornberg,A.(1958)Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid.I.preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli.J.Biol.Chem.233,163−170.
5.Hamilton,S.C.,Farchaus,J.W.,and Davis,M.C.(2001)DNA polymerases as engines for biotechnology.BioTechniques31,370−383.
6.Tarantino,P.M.,Zhi,C.,Wright,G.E.,and Brown,N.C.(1999)Inhibitors of DNA polymerase III as novel antimicrobial agents and gram−positive bacteria.Antimicrob.Agents Chemother.43,1982−1987.
7.Kuhl,A.,Svenstrup,N.,Ladel,C.,Otteneder,M.,Binas,A.,Schiffer,G.,Brands,M.,Lampe,T.,Ziegelbauer,K.,Rubsamen−Waigmann,H.,Haebich,D.and Ehlert,K.(2005)Biological characterization of novel inhibitors of he gram−positive DNA polymerase IIIC enzyme.Antimicrob.Agents Chemother.49,987−995.
8.Lange,S.S.,Takata,K.and Wood,R.D.(2011)DNA polymerases and cancer.Nat.Rev.Cancer 11,96−110.
9.Martin,S.A.,McCabe,N.,Mullarkey,M.,Cummins,R.,Burgess,D.J.,Nakabeppu,Y.,Oka,S.,Kay,E.,Lord,C.J.and Ashworth,A.(2010)DNA polymerases as potential therapeutic targets for cancers deficient in the DNA mismatch repair proteins MSH2 or MLH1.Cancer Cell 17,235−248.
10.Naviaux,R.K.,Markusic,D.,Barshop,B.A.,Nyhan,W.L.and Haas,R.H.(1999)Sensitive assay for mitochondrial DNA polymerase γ.Clin.Chem.45,1725−1733.
11.Richardson,C.C.,Schildkraut,C.L.,Vasken Aposhian,H.and Kornberg,A.(1964)Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid.J.Biol.Chem.239,222−232.
12.Griep,M.A.(1995)Flurescence recovery assay:A continuous assay for processive DNA polymerase applied specifically to DNA polymerase III holoenzyme.Anal.Biochem.232,180−189.
13.Seville,M.,West A.B.,Cull,M.G.and McHenry,C.S.(1996)Fluorometric assay for DNA polymerases and reverse transcriptase.Biotechniques 21,664,668,670,672.
14.Tveit,H.and Kristensen,T.(2001)Fluorescence−based DNA polymerase assay.Anal.Biochem.289,96−98.
15.Yu,Liming,Hu,G.and Howells,L.(2002)Fluorescence−based,high−throughput DNA polymerase assay.Biotechniques 33,938−941.
16.Ma,C.,Tang,Z.,Wang,K.,Tan,W.,Li,J.,Li,W.,Li,Z.,Yang,X.,Li,H.and Liu,L.(2006)Real−time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.Anal.Biochem.353,141−143.
17.Luo,X.and Hsing I.(2011)Immobilization−free electrochemical DNA polymerase assay.Electroanalysis 23,923−926.
18.Banin,S.,Wilson,S.and Stanley C.(2007)The LiMA technology:measurement of ATP on a nucleic acid testing platform. Clin Chem 53,2034−2036.
19.Toji,L.and Cohen,S.S.(1969)The enzymatic termination of polydeoxynucleotides by 2'3'−dideoxyadonsine triphosphate.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63,871−877.
20.Sanger,F.,Nicklen,S.and Coulson,R.(1977)DNA sequencing with chain−terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463−5467.
21.Davey,H.M.(2011)Life,death,and in−between:Meanings and methods in microbiology.Appl.Environ.Microbiol.77,5571−5576.
22.Rappe,M.S.and Giovannoni,S.J.(2003)The uncultured microbial majority.Annu.Rev.Microbiol.57,369−394.
23.Riley,B.(2004)Rapid microbiology methods in the pharmaceutical industry.Amer.Pharm.Rev.1−4.
24.Keer,J.T.and Birch,L.(2003)Molecular methods for the assessment of bacterial viability.J.Microbio.Meth.53,175−183.
25.Masters,C.,Shallcross,J.and Mackey,B.(1994)Effect of stress treatments on the detection of Listeria monocytogenes and enterotoxigenic Escherichia coli by the polymerase chain reaction.J.Appl.Bacteriol.77,73−79.
26.Sheridan,G.E.C.,Masters,C.I.,Shallcross,J.A.and Mackey,B.M.(1998)Detection of mRNA by reverse transcription−PCR as an indicator of viability in Escherichia coli cells.Appl.Environ.Microbiol.64,1313−1318.
Claims (12)
- 活性ポリメラーゼを含む生細胞または細胞内小器官の存在の指標として、試料中のポリメラーゼ活性を検出する方法であって、
(a)前記試料を、前記試料中のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる段階と、
(b)ポリメラーゼ活性に適した複数の条件下で、前記接触した試料をインキュベートする段階と、
(c)前記基質の核酸分子上の前記活性ポリメラーゼの前記作用に起因する核酸分子の存在および定量的量のいずれか1つを決定することで、前記試料中の前記生細胞または前記細胞内小器官の存在あるいは全ポリメラーゼ活性を示す段階と、を備える方法。 - 前記ポリメラーゼはDNAポリメラーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼはRNAポリメラーゼでもよい、請求項1または2に記載の方法。
- 前記生細胞または前記細胞内小器官は、前記試料中のインタクトな生細胞または細胞内小器官である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インタクトな生細胞または細胞内小器官は、核酸ポリメラーゼの遺伝子およびその翻訳された活性タンパク質ポリメラーゼが前記生細胞の生存率またはポリメラーゼ活性小器官の基質として作用することが可能である核酸分子に不可欠である、請求項4に記載の方法。
- ポリメラーゼ活性の基質として作用する前記核酸分子が固定化される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は、差次的細胞溶解調製方法を用いて調製されることで、前記生細胞または前記細胞内小器官からの前記ポリメラーゼ活性のみがポリメラーゼ活性用の前記基質を修飾することが可能になる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は、複数の粗細胞ライセートまたは精製された複数の細胞画分から調製される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、生細胞または細胞内小器官のゲノムまたはトランスクリプトーム配列分析を行う段階を、さらに備える、請求項8に記載の方法。
- 前記配列分析は、単一の試料調製を用いて行われる、請求項9に記載の方法。
- 前記配列分析は、複数の患者における複数の病理学的条件の診断および管理に有用な抗生細胞または細胞内小器官あるいは抗ポリメラーゼ活性を持つ複数の作用物質を検出する段階を、さらに備える、請求項9または10に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法に有用な複数の試薬を備えるアッセイキットであって、前記キットは、前記試料中の生細胞または細胞内小器官の存在または非存在について、および診断、予後、または患者管理情報の提供のために、スクリーニングするのに有用である、アッセイキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261623114P | 2012-04-12 | 2012-04-12 | |
US61/623,114 | 2012-04-12 | ||
PCT/US2013/036264 WO2013155361A1 (en) | 2012-04-12 | 2013-04-12 | Methods for measuring polymerase activity useful for sensitive, quantitative measurements of any polymerase extension activity and for determining the presence of viable cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015513921A true JP2015513921A (ja) | 2015-05-18 |
Family
ID=49328180
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015505927A Pending JP2015513921A (ja) | 2012-04-12 | 2013-04-12 | 任意のポリメラーゼ伸長活性の高感度定量的測定と生細胞存在の決定とに有用なポリメラーゼ活性測定方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160083776A1 (ja) |
EP (1) | EP2836610A4 (ja) |
JP (1) | JP2015513921A (ja) |
KR (1) | KR20150009539A (ja) |
CN (1) | CN104520438A (ja) |
AU (1) | AU2013245832A1 (ja) |
CA (1) | CA2908941A1 (ja) |
IN (1) | IN2014DN09421A (ja) |
WO (1) | WO2013155361A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2800822B1 (en) * | 2012-01-05 | 2017-03-29 | Zeus Scientific, Inc. | Improved dna polymerase activity assays and methods enabling detection of viable microbes |
GB201412316D0 (en) | 2014-07-10 | 2014-08-27 | Momentum Bioscience Ltd | Detecting the absence of micro-organisms |
GB201805479D0 (en) * | 2018-04-03 | 2018-05-16 | Momentum Bioscience Ltd | Microorganism separation and detection |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011130584A2 (en) * | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Zeus Scientific, Inc. | Methods for measuring enzyme activity useful in determining cell viability in non-purified samples |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE462497B (sv) * | 1988-11-30 | 1990-07-02 | Clas Fredrik Runesson Kaelland | Saett foer att aktivitetsbestaemma polymeraser |
GB9909793D0 (en) * | 1999-04-28 | 1999-06-23 | Glaxo Group Ltd | Improved assay and reagents therefor |
AU2003260815A1 (en) * | 2002-08-08 | 2004-02-25 | University Of Lausanne | Method for the rapid assessment of the presence and viability of bacterial cells and use thereof________________________ |
GB0508981D0 (en) * | 2005-05-03 | 2005-06-08 | Acolyte Biomedica Ltd | Distinguishing cells in a sample |
US20100291564A1 (en) * | 2007-07-09 | 2010-11-18 | Microsen Medtech Limited | Methods for Detection of Micro-Organisms |
EP2659001A4 (en) * | 2010-12-31 | 2014-07-02 | Zeus Scientific Inc | IMPROVED METHODS FOR DETERMINING THE VITABILITY OF CELLS USING NUCLEIC ACID-BASED PROCESSES |
-
2013
- 2013-04-12 CA CA2908941A patent/CA2908941A1/en not_active Abandoned
- 2013-04-12 EP EP13775260.6A patent/EP2836610A4/en not_active Withdrawn
- 2013-04-12 KR KR1020147031688A patent/KR20150009539A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-04-12 IN IN9421DEN2014 patent/IN2014DN09421A/en unknown
- 2013-04-12 AU AU2013245832A patent/AU2013245832A1/en not_active Abandoned
- 2013-04-12 WO PCT/US2013/036264 patent/WO2013155361A1/en active Application Filing
- 2013-04-12 US US14/391,758 patent/US20160083776A1/en not_active Abandoned
- 2013-04-12 JP JP2015505927A patent/JP2015513921A/ja active Pending
- 2013-04-12 CN CN201380019842.5A patent/CN104520438A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011130584A2 (en) * | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Zeus Scientific, Inc. | Methods for measuring enzyme activity useful in determining cell viability in non-purified samples |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2836610A4 (en) | 2015-12-30 |
KR20150009539A (ko) | 2015-01-26 |
CN104520438A (zh) | 2015-04-15 |
AU2013245832A1 (en) | 2014-11-27 |
EP2836610A1 (en) | 2015-02-18 |
CA2908941A1 (en) | 2013-10-17 |
WO2013155361A1 (en) | 2013-10-17 |
IN2014DN09421A (ja) | 2015-07-17 |
US20160083776A1 (en) | 2016-03-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6258360B2 (ja) | 抗生物質耐性細菌を検出するための方法およびキット | |
Gao et al. | RT-qPCR based quantitative analysis of gene expression in single bacterial cells | |
Jensen | Protocol for the detection of Mycoplasma genitalium by PCR from clinical specimens and subsequent detection of macrolide resistance-mediating mutations in region V of the 23S rRNA gene | |
US20130059290A1 (en) | Detection of nucleic acids in crude matrices | |
Schnetzinger et al. | Use of propidium monoazide and increased amplicon length reduce false-positive signals in quantitative PCR for bioburden analysis | |
US10870894B2 (en) | Methods for measuring enzyme activity useful in determining cell viability in non-purified samples | |
US20100291564A1 (en) | Methods for Detection of Micro-Organisms | |
JP6840207B2 (ja) | マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 | |
CA2897010C (en) | Improved dna polymerase activity assays and methods enabling detection of viable microbes | |
JP2014533963A (ja) | グラム陰性菌中のカルバペネムに対する高レベル耐性に関与するkpc遺伝子を増幅および検出するための分子アッセイ | |
JP6007652B2 (ja) | メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーおよびプローブ、ならびに、それらを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法 | |
JP2015513921A (ja) | 任意のポリメラーゼ伸長活性の高感度定量的測定と生細胞存在の決定とに有用なポリメラーゼ活性測定方法 | |
EP3438280A1 (en) | Haemoplasma detection method | |
Abdeldaim et al. | PCR detection of Haemophilus influenzae from respiratory specimens | |
CN117721228A (zh) | mecA基因扩增用引物对、mecA基因检测试剂盒及mecA基因检测方法 | |
Class et al. | Patent application title: Methods for Detection of Micro-Organisms Inventors: Christopher John Stanley (Cambridge, GB) Stuart Wilson (London, GB) Assignees: MICROSEN MEDTECH LIMITED |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160329 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170124 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20170815 |