JP2745816B2 - ダブルｄループ形成の診断応用 - Google Patents

ダブルｄループ形成の診断応用

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、同時係属中で同時所有の1990年３月７日に
出願された米国出願第07/520,321号の一部継続出願であ
る、同時係属中で同時所有の1991年９月４日に出願され
た米国出願第07/755,462号の一部継続出願である、同時
係属中で同時所有の1992年７月９日に出願された米国出
願第07/910,791号の、一部継続出願である。
発明の分野 本発明は、２種のプローブ捕捉／検出系、RecAで促進
されたDNA増幅、およびインサイチューハイブリダイゼ
ーションを包含する種々の診断方法で利用され得る、Re
cAで触媒された安定なダブルＤループ構造の形成に関す
る。
参考文献 Ausubel,F.M.ら，Current Protocols in Molecular B
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0 305 145号,1989年３月１日 発明の背景 RecA＋タンパク質（野生型）は、Escherichia coliか
ら発見された37,842ダルトンのタンパク質であり、相同
的DNA組み換えに重要である。その生化学および酵素学
上の多くの情報は、精製RecA＋タンパク質を使用するイ
ンビトロの研究に由来している。多くのインビトロの研
究は、RecA＋タンパク質が、最終的に相同組み換え現象
を生じる、相同DNA配列間のペアリング反応に、本質的
に関係していることを示している（Radding;Coxら、ま
たはRocaらのRecA＋タンパク質の性質に関する最近の総
説を参照）。RecA＋タンパク質に、DNA診断への適用に
関して高い有用性を与えているのが、このペアリング反
応である。
ATPの存在下でRecA＋タンパク質は、多くの基質間で
鎖の置換を触媒し、DNAプローブに使用するとき、大部
分の基質は一本鎖DNAプローブおよび二本鎖DNAである。
RecAタンパク質でコートされた一本鎖DNAプローブは、
まず最初に、ハイブリダイズされ部分的に結合された
（単一）Ｄループ（または、特定のケースでは三本鎖構
造）と呼ばれる分子を含む、組み換え中間体を形成する
ことにより、二本鎖の（ネイティブな）標的配列の相同
な部分と相互作用する（Shibataら、1979）。次いで、
分岐点移動、そして、もとの一本鎖および二本鎖DNA間
の完全なハイブリッド分子を、それらのホモロジーの程
度に依存して形成する。
直鎖状標的上での、短い置換ループまたは三本鎖Ｄル
ープ構造は、通常、除タンパク質化の後は不安定であ
る。RecAタンパク質は、ATPγＳおよび過剰のRecAタン
パク質存在下で、長さが９から20bp（またはそれより長
い）の短いオリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成す
ることが認められている（Leahyら）。直鎖状の二本鎖
標的が使用される場合、RecA除去後の安定なプローブ標
的ペアリングは、（ｉ）少なくとも38から56bpの相同な
領域、および（ii）直鎖状の二重鎖の末端で、プローブ
標的ホモロジーがあること、を必要とするようである
（Hsiehら、1990;Gondaら）。
Rigasらは、標的として二本鎖の負のスーパーコイル
環状プラスミドDNAが使用された場合に、一本鎖の43マ
ーが、除タンパク質化に対して安定な、単一のＤループ
複合体を形成し得たことを報告した。
二本鎖の負のスーパーコイル環状標的DNAが使用され
た場合、RecAでコートされた一本鎖オリゴヌクレオチド
プローブはまた、そのRecAタンパク質の除去前にプソラ
レン（psoralen）架橋することにより、さらに安定化さ
れ得：プローブ−標的単一Ｄループ生成物は、そのオリ
ゴ塩基数が少なくとも30マーサイズであれば回収され得
る（Chengら、1989）。標的DNAとして、二本鎖の直鎖状
DNA二重鎖が使用される場合、プソラレン架橋で安定化
された単一Ｄループプローブ−標的複合体を得るため
に、プローブは、少なくとも80から107マーサイズでな
ければならない（Chengら、1988）：これらの反応は、
負のスーパーコイル環状標的との同様の反応に比べて、
非常に低い効率である。
本発明を支持するために実施した実験は、プローブ鎖
の間で相補的な配列を含む二重鎖プローブが、ハイブリ
ダイゼーション反応で使用されるという条件で、RecAタ
ンパク質で触媒される反応において、除タンパク質化に
対して安定なプローブ：標的DNA複合体が生じ得ること
を立証している。この発見は、この安定な、RecAタンパ
ク質で触媒されたプローブ：標的ハイブリダイゼーショ
ン複合体を用いる診断的使用の多くの機会を提供する。
発明の要旨 本発明は、第一鎖および第二鎖を有する、直鎖状二重
鎖DNA分析物を検出する診断方法を包含し、ここで上記
分析物は、第１の内部DNA標的配列を含有する。本方法
は、各々が第１標的配列鎖または第２標的配列鎖に相補
的な配列を有する２種のDNAプローブのセットを提供す
ることを教示し、ここで、これらのプローブはまた、相
互に相補的な重複部分領域を有する。次いで、両プロー
ブ鎖は、RecAタンパク質コーティング反応中で、RecAタ
ンパク質でコートされる。このRecAでコートされたプロ
ーブは、プローブ：標的複合体を生成する条件下で、標
的配列を含む直鎖状二重鎖DNAと結合する。このプロー
ブ：標的複合体は、両プローブ鎖および直鎖状二重鎖分
析物の両鎖を含む。本発明の方法では、除タンパク質化
は必ずしも必要でないけれども、上記プローブ：標的複
合体は、除タンパク質化に対して安定である。次いで上
記プローブ：標的複合体中の上記プローブDNAの存在が
検出される。
本発明の１つの実施態様において、RecAタンパク質
は、Escherichia coliの野生型RecAタンパク質である。
あるいは、RecAタンパク質は、Escherichia coliの変異
体RecA-803タンパク質、または、多くの供給源からのRe
cA様のタンパク質であり得る。
本発明のRecA−タンパク質コーティング反応は、ATP
γＳ、rATP（単独および再生系の存在下で）、dATP、GT
PγＳ、および、ATPγＳとrATPとの混合物、ならびにAT
PγＳとADPの混合物、を含む、種々のコファクターを用
いて実施され得る。
本発明の１つの実施態様において、上記プローブ鎖間
の相補的重複部分領域は、少なくとも約78塩基対から約
500塩基対以下である。上記プローブ鎖は、また、いず
れの標的鎖にも相補的でないDNAの末端伸張を含有し得
る。両方の鎖がこのような末端伸張を含有する場合は、
これらDNA伸張は、相互に相補的であり得る。
本発明の方法の検出工程を行う一つの方法は、上記プ
ローブ：標的複合体を除タンパク質化し、次いで、上記
プローブ：標的複合体を、遊離のプローブから電気泳動
的に分離することである。上記プローブ：標的複合体
は、SDSまたはプロテイナーゼＫを用いる処理を包含す
る種々の方法、および、フェノールを基礎にした方法の
様な標準的な化学的除タンパク質化法により、除タンパ
ク質化され得る。あるいは、上記検出工程は、上記プロ
ーブ：標的複合体をトラップする捕捉系の使用を包含し
得、ここで、第一のプローブ鎖は、捕捉部分でラベルさ
れ、第二プローブ鎖は検出部分でラベルされる。例え
ば、一方のプローブ鎖がビオチンでラベルされ得、他方
は、ジゴキシゲニンでラベルされ得る。次いで、上記プ
ローブ：標的複合体は、固体支持体−ストレプトアビジ
ン（またはアビジン）／ラベルされた抗ジゴキシゲニ
ン、または固体支持体−抗ジゴキシゲニン抗体／ラベル
されストレプトアビジン（またはアビジン）を用いて、
捕捉／検出される。別の実施態様では、第一プローブ鎖
が捕捉部分を含有し、第二プローブ鎖が、検出に使用さ
れる放射性ラベルを含有する。
上記プローブ鎖は、多くの方法で、例えば、プローブ
に結合したビオチンまたはジゴキシゲニン、および捕捉
のためのそれぞれストレプトアビジン（またはアビジ
ン）または抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、捕捉のため
にラベルされ得る。上記プローブ鎖は、また、放射性、
ビオチン、ジゴキシゲニン、を包含する、多くの異なる
部分を用いて、検出のためにラベルされ得る。放射性ラ
ベルは、例えば、オートラジオグラフィーまたはシンチ
レーション計測により、同定され得る。ビオチンまたは
ジゴキシゲニンの存在は、それぞれ、ストレプトアビジ
ンまたは抗ジゴキシゲニン抗体により検出され得る。こ
こで、上記ストレプトアビジン（またはアビジン）また
は抗ジゴキシゲニン抗体は、放射性ラベル、酵素ラベル
（例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダー
ゼ、ベータガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダ
ーゼ）または蛍光色素ラベル（例えば、フルオレセイ
ン、Ｒ−フィコエリトリン、またはローダミン）され得
る。上記プローブ：標的複合体中の上記プローブ鎖の検
出はまた、DNAポリメラーゼで促進される、各プローブ
鎖の３′末端からのプライマー伸張により達成され得
る。ここで、上記プライマー伸張は、４種のdNTP全てお
よび検出し得る部分を含有する一種またはそれ以上のdN
TPの存在下で実施される。
本発明の方法は、さらに、第一鎖および第二鎖を有
し、第２の二重鎖標的配列に相補的な、２種のDNAプロ
ーブの第二のセットの提供を包含する。ここで、上記プ
ローブの第一鎖は、第二の標的配列の一方の鎖に相補的
な配列を含有し、そして上記プローブの第二鎖は、第２
の標的配列の他方の鎖に相補的な配列を含有し、ここ
で、（ｉ）これらプローブはまた、相互に相補的な重複
部分領域を有し、そして（ii）上記第二のセットのプロ
ーブは、第一のセットのプローブとはハイブリダイズし
ない。上記の２種類のプローブセットは、RecAタンパク
質コーティング反応中で、RecAタンパク質でコートされ
る。RecAでコートされたプローブセットは、二種類の標
的配列を含む、直鎖状二重鎖DNAと結合する。この結合
は、４種のプローブ鎖すべてを含むプローブ：標的複合
体を生成する条件下で行われる。生じたプローブ：標的
複合体は、除タンパク質化に対して安定である。次いで
上記プローブ：標的複合体中の上記プローブDNAの存在
が検出される。
２種類のプローブセットを伴う本方法は、１種類のプ
ローブセットに関して、上記されたのと同様の多くの方
法で使用され得る。例えば、第一のプローブセットは、
捕捉部分でラベルされ得、第二のプローブセットは、検
出部分でラベルされ得る。
２種類のプローブセットを伴う二本鎖プローブ：二重
鎖標的複合体はまた、RecAタンパク質で促進されたDNA
増幅法に使用され得る。例えば、２種類のプローブセッ
トは、ATPγＳ［またはrATP（適切なATP再生系の存在下
または非存在下で）、dATP、ならびにATPγＳおよびADP
の混合物］の存在下で、それらの二重鎖標的配列とハイ
ブリダイズし得、そして、４種のdNTP全て、RecAタンパ
ク質およびDNAポリメラーゼをさらに含有する反応混合
物中で反応し得る。この反応は、二つの標的鎖の熱解離
に必要な温度未満で実施され、上記標的配列が所望され
る程度にまで増幅されるまで続行される。上記増幅反応
は、さらに、増幅反応進行中に、（ｉ）DNAポリメラー
ゼ、および（ii）RecAタンパク質でコートされたプロー
ブを繰り返し添加することを包含し得る。本発明に適用
し得る、増幅のその他のアプローチは、1990年５月７日
出願の同時係属中の米国出願第07/520,321号に開示され
ている。各プローブセットにおいて、一方の鎖の３′末
端は、２種類のプライマーセットにより規定される領域
の内側に在り：これら末端は、増幅反応にとって必要で
ある。しかしながら、２種類のプライマーセットにより
規定される領域の外側にある、各プライマーペアの反対
側の３′末端は、これら末端からの伸張産物の形成を阻
害するためにブロックされ得る。この増幅方法はまた、
検出方法として使用され得、ここで、プローブ：標的複
合体中の上記プローブの検出は、DNAポリメラーゼで促
進された各プローブ鎖の３′末端からのプライマー伸張
により達成される。ここで、プライマー伸張反応は、４
種のdNTP全ておよび検出し得る部分を含有する一種また
はそれ以上のdNTPの存在下で実施される。
二本鎖プローブ：二重鎖標的複合体はまた、任意の標
的にされた制限部位の切断をブロックするために使用さ
れ得る。切断のブロッキングは、（ｉ）プローブ：標的
複合体の形成、およびこの複合体の除タンパク質化前の
制限酵素を用いる処理；（ii）メチル基の存在に対して
選択された酵素の感受性に依存する、メチル化されたま
たはメチル化されないプローブの使用；および（iii）
標的にハイブリダイズした場合に、制限部位を排除する
ような配列ミスマッチの上記プローブの各鎖中への導
入、を包含する多くの方法により達成され得る。
上記二本鎖プローブ：二重鎖標的複合体はまた、二本
鎖標的DNAの部位特異的切断を生成するために使用され
得る。二本鎖プローブは、標的二重鎖の各鎖を切断し得
る部分で改変され得る：このプローブ改変は、切断部分
の性質に依存して、除タンパク質化の前または後で起こ
り得る。このような部分の例は、鉄FeII（鉄/EDTAで促
進される切断に用いる）、非特異的ホスホジエステラー
ゼ、および制限エンドヌクレアーゼである。いずれの場
合も、切断特異性は、上記二本鎖オリゴヌクレオチドプ
ローブにより規定される標的配列により付与される。
上記の制限部位保護法および部位特異的切断法の両者
は、制限フラグメント長多形性解析に有用である。
本発明の別の実施態様は、第一鎖および第二鎖を有
し、第１の内部DNA標的配列を含有する、直鎖状二重鎖D
NA分析物を分離する方法を包含する。ここで、上記二重
鎖DNA分析物は、核酸分子の混合物中に存在する。この
方法では、第一プローブ鎖および第二プローブ鎖を有す
る、２種のDNAプローブの１つのセットが提供される。
ここで、第一プローブ鎖および第二プローブ鎖は、
（ｉ）第一標的配列鎖および第二標的配列鎖に相補的な
配列を含有し、そして（ii）これら相補的配列はまた、
上記プローブ鎖間で相補的重複部分を含有する。上記プ
ローブは、次いでRecAタンパク質でコートされる。上記
プローブ鎖および両標的鎖を含有するプローブ：標的複
合体を生成する条件下で、このコートされたプローブ
は、標的配列を含有する直鎖状二重鎖DNAと結合する。
得られたプローブ：標的複合体は、除タンパク質化に対
して安定である。上記プローブ：標的複合体は、核酸分
子混合物から分離される。次いで、上記標的配列を含有
する二重鎖DNA分析物が、単離される。
この方法において、上記複合体は、例えば、ストレプ
トアビジンまたはアビジンで捕捉されるビオチン部分を
含有するプローブを用いて、上記核酸混合物から分離さ
れ得る。ストレプトアビジンまたはアビジンは、常磁性
ビーズのような固体支持体に結合し得る。
本方法は、さらに、（ｉ）上記複合体から標的配列を
含有する上記二重鎖DNA分析物を遊離するのに充分で、
かつ（ii）標的配列を含有する上記二重鎖DNA分析物の
融解温度未満である温度で、単離されたプローブ：標的
複合体の熱変性を包含する。これは、そのままの状態
（intact）の二重鎖分子の単離を可能とする。上記二重
鎖は、次いで、必要ならば、一本鎖に変性され得る。あ
るいは、プローブ：標的複合体は、（ｉ）上記複合体か
ら標的配列を含有する二重鎖DNA分析物を遊離するのに
充分で、かつ（ii）標的配列を含有する二重鎖DNA分析
物の融解温度またはそれ以上の温度で、熱変性され得
る。これは、捕捉され二重鎖由来の一本鎖DNA分子の単
離を生じる。
本発明の別の実施態様は、核酸分子混合物中の直鎖状
二重鎖DNA分析物の検出の方法である。この方法は、上
記のような、直鎖状二重鎖DNA分析物を単離する工程、
および二重鎖DNA分析物由来の一本鎖DNA分子を得る工程
を包含する：これは、代表的には、二重鎖の融解温度以
上で二重鎖を加熱する工程により達成される（熱変
性）。標的配列に相補的で二種のオリジナルなDNAプロ
ーブのいずれかに存在する配列を含有しない、少なくと
も一種のDNA合成プライマーが、上記一本鎖の標的DNA分
析物分子配列に添加される。上記DNA分析物の検出は、
プライマー３′末端からのDNAポリメラーゼで促進され
たプライマー伸張により達成される。ここで上記プライ
マー伸張は、４種のdNTPの全ておよび少なくとも一種
の、検出可能な部分を含有するdNTPの存在下で実施され
る。
本発明の上記二本鎖プローブ：二重鎖標的複合体はま
た、診断上のインサイチュー検出技術に使用され得る。
図面の簡単な説明 図１は、ラムダゲノムに対する、表１に列挙した、プ
ローブおよびプライマーの関係を示している。
図２は、ラムダゲノム領域500bpのヌクレオチド配列
を提示している：この配列は、配列番号:1としても提示
される。
図３は、DNAプローブへのRecAタンパク質の結合を例
証するための、DNAバンド−シフトゲル電気泳動アッセ
イのオートラジオグラムを示している。
図4Aは、500マーおよび280マープローブを使用した除
タンパク質化したハイブリダイゼーション反応の成分が
分離された、臭化エチジウムで染色されたゲルを示して
いる。図4Bは、図4Aに示されたゲルのオートラジオグラ
フを示している。
図5Aは、280マー、121マーおよび79マープローブを使
用する除タンパク質化したハイブリダイゼーション反応
の成分が分離された、臭化エチジウムで染色されたゲル
を示している。図5Bは、図5Aに示されたゲルのオートラ
ジオグラフを示している。
図6Aは、別々にラベルされた121マーDNAプローブを使
用する除タンパク質化したハイブリダイゼーション反応
の成分が分離された、臭化エチジチムで染色されたゲル
を示している。図6Bは、図6Aに示されたゲルのオートラ
ジオグラフを示している。図6Bは、安定な、除タンパク
質化した、RecAタンパク質に触媒されたハイブリダイゼ
ーション複合体には、２種のDNAプローブ鎖が必要であ
ることを示している。
図７は、安定な二本鎖プローブ：二重鎖直鎖状標的DN
A複合体のモデルを示している。
図８は、安定な二本鎖プローブ：二重鎖直鎖状標的DN
A複合体が単離されたゲルを示している。ここで、二重
鎖プローブ鎖は、別々にラベルされた。
図９は、種々の二本鎖プローブ：二重鎖直鎖状標的DN
A複合体を示している。
図10A、10B、および10Cは、単一の、二本鎖プロー
ブ：二重鎖直鎖状標的DNA複合体をベースとした、いく
つかの検出系を示している。
図11Aおよび11Bは、複数の、二本鎖プローブ：二重鎖
直鎖状標的DNA複合体をベースとした、いくつかの検出
系を示している。
図12は、ネイティブな標的DNA上でのRecAタンパク質
で触媒された２種のダブルＤループプライマーの位置付
け（図12A）、および、DNAポリメラーゼを用いたDNA増
幅と引き続くDNAリガーゼを用いた連結反応（プライマ
ー／プローブの置換の無い状態で）（図12B）を示して
いる。
図13は、単一ダブルＤループプローブ（図13A）また
は複数のダブルＤループ（図13B）を使用する、DNAポリ
メラーゼを用いるシグナル増幅反応を示している。図13
中のＸおよびＸ′は、同一または異なるものであり得
る：例えばＸは放射活性ラベルされ、そしてＸ′はジコ
キシゲニン部分を持ち得る。
図14は、標的と複合体を形成していない二本鎖プロー
ブの制限エンドヌクレアーゼによる切断を利用する検出
系を示している。ここで、生じる生成物の捕捉は、制限
酵素消化の前（図14B）または後（図14A）に行われる。
図15は、メチル化またはRecAタンパク質のいずれかに
よる、制限部位の保護を示している。メチル化による保
護の場合、上記ダブルＤループ複合体は、制限エンドヌ
クレアーゼ消化前に除タンパク質化される（図15A）。R
ecAタンパク質による保護の場合、上記ダブルＤループ
複合体は、制限エンドヌクレアーゼ消化後に除タンパク
質化される（図15B）。
図16は、熱変性された280マープローブおよび異なる
コファクター類を使用する、除タンパク質化された、Re
cAを介したダブルＤループハイブリダイゼーション反応
の成分が、電気泳動により分離された、臭化エチジウム
で染色されたアガロースゲルを示している。
図17は、図16に示すゲルの乾燥後の、オートラジオグ
ラムを示している。
図18は、熱変性された500マープローブおよびコファ
クターとしてATPγＳ、および、ATPγS/rATP混合物を使
用する、除タンパク質化されたRecAを介したダブルＤル
ープハイブリダイゼーションの反応の成分が、電気泳動
により分離されて臭化エチジウムで染色されたアガロー
スゲルを示している。
図19は、図18に示すゲルの乾燥後の、オートラジオグ
ラムを示している。
発明の詳細な説明 I.除タンパク質化に対して安定である、RecAで触媒され
たプローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体の生
成。
A.DNAプローブ類およびプライマー類 本発明を支持するために実施した実験は、短い二本鎖
DNA分子または相補的な一本鎖分子が、内部領域で直鎖
状標的DNA分子とハイブリダイゼーション複合体を生成
するのに使用され得、そして、これら複合体が除タンパ
ク質化に対して安定であることを示している。これらの
安定なハイブリダイゼーション複合体の例として、二本
鎖および長さを変えた相補的な一本鎖DNAが、プローブ
およびプライマーとしての使用に調製された（実施例
１、表１）。これらDNA分子は、ラムダファージゲノム
の500bp領域の種々の部分にホモロジーを有すよう選抜
された。表１に示したプローブおよびプライマーの、上
記ラムダゲノムに対する関係を図１に示す。上記500bp
のラムダゲノム領域のヌクレオチド配列を、図２に示
す。
B.RecAタンパク質の調製およびプローブコーティング 本発明におけるRecAタンパク質は、全てが実質的に以
下のような同一機能の全てまたは大部分を有する、RecA
様の組み換えタンパク質ファミリーを指し、特定する
と：（ｉ）次のDNAポリメラーゼによる伸張のために、
適切なプライマーをそれらと相同の標的上に配置させ
る、上記タンパク質の能力；（ii）DNA合成のためにト
ポロジー的にDNAを調製する、RecAタンパク質の能力；
および（iii）効果的に相補的な配列を検索し結合す
る、RecAタンパク質/DNAプライマー複合体の能力。最も
良く特徴付けられたRecAタンパク質はE.coli由来であ
る；野生型のタンパク質に加えて、数多くの変異型RecA
様タンパク質が同定されている（例えば、recA-803、Ma
dirajuら）。さらに、多くの生物がRecA様の鎖転移タン
パク質を有する（例えば、Fugisawa,H.ら;Hsieh,P.ら、
1986;Hsieh,P.ら、1989;Fishel,R.A.ら;Cassuto,E.ら;G
anea,D.ら;Moore,S.P.ら;Keene,K.ら;Kimeic,E.B.、198
4;Kimeic,E.B.、1986;Kolodner,R.ら;Sugino,A.ら;Halb
rook,J.ら;Eisen,A.ら;McCarthy,J.ら;Lowenhaupt,K.
ら）。
RecAタンパク質は、代表的には、上記タンパク質を過
剰生産する細菌株から得られる：実施例２で、このよう
な菌株からの野生型大腸菌RecAタンパク質および変異型
RecA-803タンパク質の精製を説明する。また一方で、Re
cAタンパク質は、例えばPharmacia（Piscataway NJ）か
ら購入できる。
RecAタンパク質およびATPγＳでDNAプローブをコート
するために用いられる条件は、実施例３で説明する。ま
た一方で、プローブ類は、GTPγＳ、rATP（単独またはr
ATP再生系（Boerhinger Mannheim社製）の存在下で）、
dATP、ATPγＳおよびrATPの混合物、または、ATPγＳお
よびADPの混合物を使用してコートされ得る。RecAタン
パク質コーティング反応における、コファクターとして
ATPγＳ、rATP、dATPおよびGTPγＳの使用は、実施例10
で説明する。これらコファクターを使用するダブルＤル
ープ複合体形成の結果は、図16および17に提示する。図
17は、ATPγＳ、rATP、dATPおよびGTPγＳの各々の存在
下で、除タンパク質化に対して安定な、ダブルＤループ
ハイブリダイゼーション複合体が形成されたことを示し
ている。さらに、実施例11に、RecAタンパク質コーティ
ング反応のためのコファクターとしてATPγS/rATP混合
物の使用を説明する。図18および19に示された結果は、
このような混合物の存在下で、除タンパク質化に対して
安定な、ダブルＤループハイブリダイゼーション複合体
が形成されたことを示している。ATPγS/rATPに加えて
他のコファクターの混合物もまた、RecAタンパク質コー
ティング反応で作用する。
RecAタンパク質によるプローブのコーティングは、多
くの方法で評価され得る。第一に、タンパク質のDNAへ
の結合は、バンド−シフトゲルアッセイを用いて試験さ
れ得る（McEnteeら）。実施例３で、DNAプローブへのRe
cAタンパク質の結合を示すための上記DNAバンド−シフ
トゲルアッセイの使用を説明する。ラベルされたプロー
ブは、ATPγＳ存在下でRecAタンパク質でコートされ、
そしてコーティング反応の生成物は、アガロースゲル電
気泳動により分離された：図３は、ゲル中の得られたDN
Aのオートラジオグラムを示している。図３に提示され
たデータは、RecAタンパク質と変性した二重鎖プローブ
DNAとのインキュベーション後に、RecAタンパク質が効
果的に、変性した二重鎖プローブ由来の一本鎖DNAプロ
ーブをコートすることを示している。プローブ中のヌク
レオチドに対するRecAタンパク質モノマーの比率が、12
1マーに対して０から1:27、1:2.7、3.7:1（それぞれレ
ーン１から４）まで、そして159マーに対して０から1:2
2、1:2.2、4.5:1（それぞれレーン５から８）まで増加
すると、DNAプローブの電気泳動での移動度は減少す
る。すなわち、DNAプローブへのRecAの結合によって遅
らされる。レーン２、３および６、７で認められるDNA
プローブ移動度の部分的な遅れは、RecAタンパク質でプ
ローブDNAが飽和されていないことを反映する。従っ
て、予想されたように（Leahyら）、DNAヌクレオチドに
対する過剰量のRecAモノマーが、短いDNAプローブの充
分なRecAコーティングに必要である。
DNAへのタンパク質の結合を評価する第二の方法は、
ニトロセルロースフィルター結合アッセイ（Leahyら;Wo
odburyら）の使用である。ニトロセルロースフィルター
結合方法は、ラベルされたDNAを用いるタンパク質:DNA
複合体の解離比を測定するのに特に有用である。上記フ
ィルター結合アッセイでは、DNA:タンパク質複合体は、
フィルター上に保持され、遊離DNAはフィルターを通過
する。このアッセイ法は、遊離のプローブからのDNA:タ
ンパク質複合体の分離が急速であるため、解離比の測定
に対してより定量的である。
代表的には、このようなフィルター結合アッセイを実
施するために、ニトロセルロースディスク（Schleicher
and schuell社製、BA85フィルター、またはHAW P0025
ニトロセルロースフィルター）が前処理され、緩衝液に
浸され、次いで真空フィルター装置上に置かれる。DNA:
タンパク質結合反応物は、しばしば複合体を解離するこ
となく、成分の濃度を下げるために希釈される。反応物
は、真空の使用で上記ディスクを通過させる。低塩濃度
条件下では、上記DNA:タンパク質複合体は、上記フィル
ターに付着し、遊離DNAは通過する。上記ディスクを、
シンチレーション計測液（New England Nuclear,Nation
al Diagnostics,Inc.）に入れ、そしてそのcpmがシンチ
レーションカウンターを使用して測定される。
C.DNA標的 プローブと、内部にある相同二本鎖直鎖状DNA標的と
のRecAで触媒された、ハイブリダイゼーションの特異性
を研究するため、以下を包含するいくつかのモデルラム
ダDNA標的系が使用された： （１）完全長ラムダゲノムDNA（48.5kb;Bethesda Resea
rch Laboratories、Gaithersburg MD）のDra I（Promeg
a社製）制限酵素消化により生じた92から8598bpのサイ
ズ範囲にある、14のDNAフラグメントの混合物。図１お
よび２で規定される領域と相同な標的フラグメントは、
8370bpのDra Iフラグメントである。表１に列記された
プローブとのホモロジー領域はすべて、二本鎖標的DNA
フラグメントの３′末端から少なくとも832塩基より内
側に存在する。
（２）完全長ラムダゲノムDNAのApa I制限酵素消化によ
り生じた二つのフラグメント（38、412および10,090b
p）の混合物。約10kbのフラグメントは、図１および２
で規定される領域を含有する。このホモロジー領域は、
二本鎖標的DNAフラグメントの３′末端から少なくとも2
460塩基に存在する。
（３）アガロースゲルで精製し、除タンパク質化され
た、ラムダDNAApa I消化10kbフラグメント。
（４）標的DNAフラグメントが2957bpであって、二本鎖
標的DNAフラグメントの３′末端から少なくとも832塩基
にプローブと標的とのホモロジーが存在する、Dra Iお
よびBamH Iを用いたラムダの二重消化物。
（５）全ラムダウイルスDNAもまた、標的として使用さ
れる。この場合、プローブ：標的のホモロジーは、全ラ
ムダゲノムの５′末端から少なくとも7131塩基に存在す
る。
D.RecAで促進された、二本鎖プローブおよび標的DNA
配列間のハイブリダイゼーション複合体の形成 RecAでコートされた一本鎖DNAプローブおよび標的DNA
の混合は、RecAでコートされたDNAプローブおよび二重
鎖標的DNA分子間のホモロジーの探索を開始する。単一
のプローブ配列の場合、いったんRecA:DNAプローブフィ
ラメントが形成されれば、それは、ホモロジーの検索、
ならびに相補的なプローブおよび標的DNA配列間のＤル
ープ形成を触媒し得る。従来の単一のＤループは、一本
鎖のRecAでコートされたDNAプローブと直鎖状で二本鎖
の標的DNAとの間で、約500塩基またはそれ以下のホモロ
ジーで形成され得る。プローブ：標的間のホモロジーの
位置が直鎖状標的の内部に位置する場合、これらＤルー
プは、タンパク質の除去後不安定である。
本発明を支持するために実施した実験は、二重鎖直鎖
状DNA標的上の内部部位で、500マーおよびより小さいプ
ローブが、安定な除タンパク質化されたRecAで触媒され
たダブルＤループプローブ：標的複合体を形成し得るこ
とを示した。しかしながら、このような安定な構造を形
成するためには、重複する相互に相補的な配列を有する
少なくとも二種のプローブが使用されなければならな
い。この二種のプローブは、RecAでコートされた一本鎖
DNAプローブであり、そしてRecAで触媒されたプロー
ブ：標的ハイブリダイゼーション反応に使用される。
実施例４で、RecAタンパク質を介するダブルＤルー
プ、すなわちマルチプレックスの形成を説明する。その
500マーおよび280マーのプローブは、RecAタンパク質で
コートされ、そしてその標的DNAは、上記の8369bpのラ
ムダDNAのDra Iフラグメントである。RecAタンパク質の
プローブ−ヌクレオチドに対する比率は、500マーにつ
いて1.5:1、そして280マーについては1.3:1であった。
二本鎖DNAプローブの、相同な二本鎖DNA標的フラグメン
トに対する比率は、500マーについては11:1、そして280
マーについては22:1であった。図4Aは、除タンパク質化
されたハイブリダイゼーション反応のDNA成分が分離さ
れた、臭化エチジウム染色されたゲルを示している。
図4Bは、図4Aに示すゲル中のDNAのオートラジオグラ
フを示している。図4Bに提示された結果は、除タンパク
質化に安定な500マー：標的および280マー：標的、DNA
ハイブリダイゼーション生成物の形成を示している。Re
cAタンパク質を含む反応と含まない反応間の比較は、Re
cAが、相同プローブ：標的DNA複合体の形成に必要であ
ることを示している。
pUC18二本鎖環状DNAは、実施例４でポジティブコント
ロールとして含めた。負のスーパーコイル二本鎖DNA環
状分子は、除タンパク質化に安定な短い一本鎖プローブ
を用いるRecAタンパク質に触媒された、プローブ：標的
ハイブリダイゼーション生成物を形成することが知られ
ている（Rigasら；およびChengら、1988）。
上記の実験で形成されたハイブリダイゼーション生成
物の同一性を確認するため、RecAタンパク質でコートさ
れたプローブをラムダゲノムDNAのDra I/BamH I二重消
化物由来の標的フラグメントと反応させた。この実験で
は、二重消化から生じた相同標的フラグメントは、鎖長
が2957bpであり、プローブ：標的配列のホモロジーの位
置は先の実験と変わらなかった（すなわち相同標的フラ
グメントの３′末端から832塩基）。ハイブリダイゼー
ション反応は、8370bpのラムダDNA Dra I標的フラグメ
ントについて記載したのと全く同一の条件下で実施され
た。
これらRecAタンパク質で触媒されたハイブリダイゼー
ション反応の電気泳動的分離、引き続く、オートラジオ
グラフィック解析は、除タンパク質化されたプローブ：
標的DNA複合体が2957bpの標的フラグメントの位置に丁
度移動したことを示し、プローブ：標的DNAハイブリダ
イゼーション反応が実際に特異的な相同標的との間でお
こることが確認された。
RecAタンパク質で触媒されたプローブ：標的反応が、
過剰量の非相同の直鎖状DNA標的分子の存在下で実行さ
れた。
実施例５で、小さい二本鎖プローブおよび直鎖状二本
鎖標的DNA間の、除タンパク質化に安定な複合体の形成
を説明する。実施例５に提示したハイブリダイゼーショ
ン反応では、変性プローブは、RecAタンパク質のプロー
ブ−ヌクレオチドに対する比率が、図5Aおよび5Bのそれ
ぞれレーン１から６に対応する、1.8:1、０、5.7:1、5.
9:1、2.6:1および11.8:1の割合でコートされた。上記二
本鎖プローブの二本鎖標的フラグメントに対する比率
は、4.8:1（280マー）、3.6:1（121マー）、および5.2:
1（79マー）である。図5Aは、除タンパク質化されたハ
イブリダイゼーション反応の成分が分離された、臭化エ
チジウム染色されたゲル上のDNAを示している。
図5Bは、図5Aに示すゲルのオートラジオグラフを示し
ている。図5Bに提示される結果は安定な除タンパク質化
されたハイブリダイゼーションプローブ：標的生成物
が、280塩基よりも短いサイズのプローブを用いて形成
し得ることを示している。過剰のRecAタンパク質の添加
は、DNAハイブリダイゼーション反応で形成された安定
な生成物の量を減少させるようである（レーン４、５お
よび６の対比）。本実験に使用した121マーおよび79マ
ーのプローブは、32Pで末端ラベルされた280マー、およ
び500マーの二重鎖プローブの制限酵素フラグメントに
由来し、各DNAプローブは、ラベルされた５′鎖または
３′鎖のいずれか（両方ではなく）を280マーと同様に
含有する：分子の５′および３′末端は、全ラムダDNA
に関して同定される。図5Bのレーン３から６に認められ
るシグナルは、上記５′または３′プローブ鎖が、プロ
ーブ：標的反応に関係することを示し、この観測結果
は、両方のプローブ鎖が、除タンパク質化に対して安定
なプローブ：標的DNAハイブリダイゼーション複合体の
形成に含まれるという結論に一致している。
実施例４および５に記載された基本的プロトコールに
従う多くのハイブリダイゼーション実験で、RecAタンパ
ク質で触媒されたハイブリダイゼーション反応が、広い
範囲の反応条件下で起こり得ることが確認された。代表
的には、異なる濃度の標的DNAが使用される場合、除タ
ンパク質化されたハイブリッドの収率は、反応物中の相
同標的DNA量に比例する。いくつかの反応条件が以下に
まとめられる： （ｉ）１から12mM間のATPγＳ濃度がプローブRecAコー
ティング反応で試された。このATPγＳ濃度範囲は、標
的添加後に、安定なハイブリダイゼーション生成物を与
えた。より好ましい範囲は、約2.4から8mMである。ATP
γＳ、rATP（単独または再生系の存在下で）、dATP、GT
PγＳ、ならびにATPγＳおよびrATPの混合物がまた、プ
ローブコーティング反応で作用する（実施例10および1
1）。さらに、ATPγＳの市販の調製物が反応で使用され
る場合、この調製物の純度は、調製物に応じて変動し得
る。Pharmacia社から入手したATPγＳは、通常、約95か
ら97％ ATPγＳである。Sigma社から入手したATPγＳ
は、通常、約75から約90％ ATPγＳの間で変動し、これ
らの調製物は、通常、約10から20％間のADPを含有す
る。Pharmacia社およびSigma社の両供給源からのATPγ
Ｓを試験した。いずれの供給源の調製物もRecAダブルＤ
ループ反応でよく作用する。従って、ATPγＳおよびADP
のコンビネーションもまた、RecAを介するダブルＤルー
プハイブリダイゼーション反応でまた作用する。さら
に、DNAプローブは、ATPγＳおよびrATPの混合物の存在
下、効果的にRecAタンパク質でコートされ、好ましい混
合物は各々約1.4および1mMの各成分を含む。これら実験
の結果は、ダブルＤループ複合体形成について、RecA
が、多くの種類のコファクターおよびそれらのコンビネ
ーションを使用し得ることを示している。
（ii）プローブおよび標的DNAを含有する最終反応物中
のMg++アセテートの濃度は、広範囲のMg++濃度で作用す
る:4から25mM、好ましくは約６から8mMの範囲； （iii）プローブコーティング反応物中で、8.4から41μ
Ｍの間でRecAタンパク質の濃度を試験し：各濃度が活性
であった。
（iv）プローブコーティングの間は、RecAタンパク質の
プローブ−ヌクレオチドに対する比率は、1:3から6:1の
間が効果的で、好ましい範囲は、約2:1から4:1の間の比
率であった； （ｖ）最終的に二本鎖DNAプローブの二本鎖DNA標的分子
に対する比率（マイクロモーラーで）が、2:1から22:1
の間のすべてで、安定な除タンパク質化されたプロー
ブ：標的ハイブリッドを生じた。
（vi）酢酸緩衝液中のプローブコーティングおよび鎖転
移は、トリス系より多くの生成物を与えるように見える
が、DNAハイブリダイゼーション反応は、類似のトリスH
Cl反応緩衝液（pH7.5）中で作用する。
（vii）RecA-803変異型タンパク質は、安定なハイブリ
ダイゼーション複合体形成で活性であった； （viii）ハイブリダイゼーション反応は、一本鎖結合
（SSB）タンパク質（Morricalら）の存在下で機能す
る； （ix）数日間−20℃に保管された、コートされた変性二
本鎖プローブ混合物を含む、RecAタンパク質でコートさ
れた一本鎖DNAプローブは、37℃で標的とのインキュベ
ーション後のハイブリダイゼーション複合体形成で活性
であった； （ｘ）ハイブリダイゼーション反応は、標的として、全
ラムダゲノムDNAを用いて実施され得る。プローブ：標
的ハイブリダイゼーション反応はまた、標的DNAがアガ
ロースプラグまたはマイクロビーズに包埋される場合に
も実施され得る：例えば、RecAタンパク質でコートされ
たプローブとアガロースプラグ内に包埋された無傷（in
tact）の48.5kbλDNA標的とを用いて、安定なダブルＤ
ループハイブリッドが形成される； （xi）プローブ鎖間の相補的な重複部分の領域は、代表
的には約79塩基であり約500塩基対よりは小さい。本発
明のRecAで触媒されたハイブリダイゼーション反応にお
いて、この程度の相補的重複部分を有するプローブは、
安定な生成物を内部の標的部位に形成する。安定なハイ
ブリダイゼーション生成物の生成はまた、直鎖状分子の
末端で立証された（例えば、80マープローブおよび標的
として500マー二重鎖の使用によって（図１））。標準
的なプローブ鎖の標的鎖に対する相補性は90から100％
の間である。しかしながら、RecAタンパク質は、いくら
かの非特異的塩基対の相互反応を包含するハイブリダイ
ゼーション複合体の形成を触媒することが知られている
（Chengら、1989）。従って、プローブ：標的相補性
は、プローブのサイズおよび検出反応で必要な特異性に
依存して低減され得る：代表的には相補性は、各プロー
ブ鎖および標的鎖間で70％の塩基対マッチよりも低くは
ない。
（xii）約79塩基対よりも少ない重複部分を有するプロ
ーブも本発明で使用され得る：これらのより小さいサイ
ズのプローブが使用されるとき、除タンパク質化後のダ
ブルＤループの安定化が有利である。ダブルＤループ複
合体をさらに安定化させる一つの方法がプソラレン架橋
（Chengら、1988）である：このような架橋は、過酷な
洗浄条件の使用を許容するため、特にインサイチューで
有用である。
図5Bに提示の結果は、両方のDNAプローブ鎖が同じ標
的分子に存在することから、観察されたプローブ：標的
生成物が除タンパク質化に対して安定であることを示し
ている。このような安定な複合体の一つの代表が、図７
に示されている。この構造は、本明細書中では、従来の
単一のＤループ、すなわち三本鎖置換ループまたは三重
らせん（トリプレックス構造）（二つの標的鎖および特
定の単一の標的鎖に相補的な単一のDNAプローブ）に対
して、ダブルＤループまたはマルチプレックスDNA構造
と呼ばれる。
実施例６は、直鎖状標的DNA分子上の内部のDNAホモロ
ジーの領域で、安定な、除タンパク質化されたプロー
ブ：標的ハイブリダイゼーション生成物の生成に、２種
のRecAタンパク質でコートされたDNAプローブ鎖が必要
であることを示している。個々の121マープローブ鎖
は、個々のプローブ鎖が少量の相補的（反対の）DNA鎖
によって汚染されないことを保証するために化学的に合
成された。２種の別々の相補的DNAプローブ鎖各々の存
在を区別するため、プローブは、区別してラベルされ
る：一方の鎖の５′末端を32Pラベルそして他方の単一
の５′末端をビオチンラベルした。
一方の鎖のみが放射活性ラベルされたため、各ダブル
ＤループDNAハイブリダイゼーション反応の32P特異活性
は、同一であった：従って、全ての実験の結果間の比較
はより便利であった。ハイブリダイゼーション反応は、
実施例６に記載のように実施された。図6Aは、除タンパ
ク質化されたハイブリダイゼーション反応物中のDNA構
成物が分離された、臭化エチジウムで染色されたゲルを
示している。
図6Bは、図6Aに示すゲル中のDNAオートラジオグラフ
を示している。図6Bでの結果は、二種のプローブ鎖が、
安定な、除タンパク質化されたプローブ：標的ハイブリ
ッド生成に必要であることを示している。さらに、上記
反応は、両方のプローブがRecAタンパク質で同時にコー
トされる場合、または別の反応で行われる場合いずれで
も行われる。さらに、上記ハイブリダイゼーション反応
は、DNAプローブが、反応に逐次的に添加される場合で
も、除タンパク質化された安定な複合体を生じる（レー
ン５および６）。32Pラベル鎖をはじめに反応混合物に
添加することは、より多くのDNAハイブリダイゼーショ
ン生成物を提供するようである。末端ビオチンラベルが
化学的スペーサーアーム（spacer arm）のサイズまたは
プローブ上のラベルの位置により、わずかに阻害的であ
ることは、起こりうることである。しかしながら、ハイ
ブリダイゼーション反応へのプローブ添加の順序とは無
関係に、二種のプローブ鎖が、安定な、除タンパク質化
された相同な複合体の生成に必要である。RecAタンパク
質を介した相同プローブ標的化反応はまた、内部位置に
取り込まれたビオチンを含有するプローブを使用し得
る。このようなプローブは、ポリメラーゼ鎖反応の改変
を用いて合成され得（Mullins;Mullinsら）、ここでbio
-14-dATPが、合成中に通常使用されるdATPのあるパーセ
ンテージ（たとえば５から25％）と置換されて使用され
る。
RecAで促進された、短いDNAプローブのそれらの同種
の標的配列への相同なペアリングの割合は、付着された
異型のDNAテイルの長さと正の相関があることが示され
た（Gondaら）。従って、本発明のハイブリダイゼーシ
ョン反応に使用されるプローブは、プローブ配列と標的
配列との相同なペアリングを早めるために、非相同のテ
イル、すなわち、標的DNAに対して非相同である末端配
列を含有し得る。
E.捕捉／検出法 同一の標的分子上での、32Pおよびビオチンラベルさ
れた、121マープローブ両鎖の存在は、さらに捕捉／検
出系を用いて、さらに確かめられた（実施例７）。除タ
ンパク質化されたダブルＤループ生成物をストレプトア
ビジン−磁性ビーズを用いて捕捉した。プローブを含む
ビオチンの捕捉は、32Pラベルされたプローブを同時に
捕捉した。図８は、ビオチン部分のストレプトアビジン
捕捉前に、プローブ：標的複合体が単離されたゲル上の
DNAを示している。DNA複合体は、プローブ：標的複合体
の予想されたサイズに対応するゲルフラグメントからの
抽出により単離された（実施例７）。抽出されたDNA
は、次いでストレプトアビジンでコートされた常磁性ビ
ーズにさらされた。このビーズは次いで単離され、そし
て32PラベルDNAプローブ鎖の検出のために、シンチレー
ション液中に置かれた。この解析の結果は、表２に提示
される。このデータは、二種のプローブ鎖およびRecAタ
ンパク質を使用した反応だけが、バックグラウンドを上
回る捕捉シグナルを与えることを示している。この実験
では、10kb標的DNAの位置に移動したDNA標的を捕捉のた
めに単離して用いた。それ故、個々の10kb標的分子上
に、ダブルＤループ構造を実際に有することなしに、捕
捉および検出され得る多重の10kb標的間での複合体組換
え生成物の存在の可能性を除外した。さらに、これらの
反応中で形成されたハイブリッド分子は、使用された単
離条件下できわめて安定であり捕捉された32Pのシグナ
ルが相補的なプローブの再会合によるアーティファクト
でないという結論を支持する。
II.有用性 図９は、多くの可能なダブルＤループ構造を示してい
る。図9Aは、DNA標的分子の内部部位でのダブルＤルー
プ構造の形成を表わす。図9Bは、プローブDNA分子が非
相同のDNAでテイリングされたこと（Gondaら）を除い
て、類似の構造を表している。このようなテイリング
は、いくつかの目的に役にたち得る：（ｉ）小さいプロ
ーブ上へのRecA付加の促進；（ii）プローブ中のラベル
の含有のための伸張分子の提供、例えば、ジゴキシゲニ
ンまたはビオチン；（iii）捕捉配列の提供；および（i
v）付加したレポーター分子にハイブリダイズする配列
の提供、等である。
図9Cは、相同末端伸張部（すなわち、標的DNAに相同
で他方のプローブとは相同でない）に加えて、相補的な
重複部分領域（すなわち、相互に相補性な領域）を有す
る場合の二種のプローブが、使用される状態を表わす。
図9Dは、非相同の末端伸張部（すなわち、標的DNAと
相同でなく他方のプローブとも相同的でない）に加え
て、相補的な重複部分領域を有している場合の二種のプ
ローブが、使用される状態を表わす。図9Fは、非相同の
末端伸張部が各プローブ鎖の５′および３′末端の両方
に存在する場合の類似の状態を表わす。図9Gは、相同な
テイルが、相互に相補的であるが、標的DNAとは相補的
でない場合の状態を表わす。
ダブルＤループ構造は、二種のプローブのみの構成で
ある必要はない。例えば、図9Eは、５つの別々のプロー
ブ鎖から生じたダブルＤループ構造を示している：内部
のプローブ鎖は、一種以上のプローブ鎖と相補的な重複
部分領域を有している。相補的重複部分の全領域は、代
表的には、79から500塩基対であるが、上記のように、
この領域はより小さい領域であり得る。
図９中の構造は、いくつかのしかし全てではない、い
くつかの、除タンパク質化に対して安定なダブルＤルー
プ構造を生じ得る、プローブおよび標的DNAの可能な組
合せを示している。ダブルＤループ反応に使用されるべ
き二本鎖プローブに共通な一つの特徴は、プローブ鎖間
に相補的な重複部分を有することである。
内部部位で、安定なRecAタンパク質で触媒された、除
タンパク質化された、ダブルＤループプローブ：標的複
合体を形成する能力は、相同な直鎖状DNA標的の特異的
な同定を可能とする。このダブルＤループ反応は、ハイ
ブリダイゼーション診断に新規な可能性を提供する。本
アッセイは、別々にラベルされた相補的なプローブ鎖
が、単一の反応で使用され得、そしてただ一つの小さい
標的配列が知られているだけでよいという長所を提供す
る。
相補的なプローブの再会合は、飽和レベルのRecAタン
パク質が使用されれば抑制される（Bryantら）。このよ
うなプローブの再会合はまた、プローブコーティング反
応中に、コファクターとしてATPγＳを含有させること
により減少する。
上記のように、RecAタンパク質でコートされたプロー
ブおよび標的DNA間で形成された、本発明の複合体は、
除タンパク質化反応に対して安定である（上記したよう
に）。しかしながら、いくつかの使用では、複合体から
のRecAタンパク質の除去は、本使用の実施に必要ではな
い。このような場合、唯一の制限は、残存するタンパク
質分子が本使用を妨害しないことである（例えば、以下
のセクションＦを参照）。
A.標的DNA 本発明の方法は、臨床サンプル中の生物により引き起
こされた感染症を診断するのに使用され得る。これらの
生物は、原因となる生物に特徴的な特異的DNAの検出に
より診断され得る。このような生物は、Salmonella、Ne
isseria、Chlamydia、ShigellaおよびStreptomyces、の
ようなバクテリア；単純ヘルパスウイルス−１（HSV−
１）、単純ヘルパスウイルス−２（HSV−２）、および
アデノウイルス、全ての二本鎖DNAウイルス、のような
ウイルス；PlasmodiumおよびGiardia、のような寄生
虫；Mycoplasma pneumonia、M.genitaliumおよびPneumo
cystis、のようなマイコプラズマ、を包含する。
任意の診断アッセイに対して、プローブ配列は、標的
DNA中の既知のホモロジー領域から選択される。標的DNA
は、標準技法により、多くの異なる供給源から調製され
得る：例えば、水溶液、哺乳動物組織、培養細胞、植物
組織、バクテリア、酵母、血液および血液成分（Ausube
lら;Maniatisら;Sambrookら;Davisら;Fey;Stricklerら;
Kingston;Wachsmuth）である。
一般に、本発明の検出法は、任意の核酸サンプル中の
二重鎖DNAの検出に適用され得る。感染症の臨床診断以
外の使用は、（ｉ）マイコプラズマのような汚染物の存
在に対する、培養哺乳動物細胞のスクリーニング（Zlvi
nら）、（ii）例えばα−地中海貧血、β−地中海貧
血、または慣性骨髄性白血病のような、哺乳動物のDNA
中の特異的な欠失／変異、挿入または再配置により引き
起こされた、特定の遺伝病、および、（iii）二重鎖DNA
分子中の与えられた標的配列の存在または非存在を区分
するためのハイブリダイゼーションプローブ、を包含す
る。
B.診断応用に対する一つのダブルＤループ構造の使用 図10は、二重鎖DNA標的中の対応する配列の単離およ
び同定のための、一つのダブルＤループ構造使用のいく
つかの実施態様を示している。一方のプローブは、捕捉
部分でラベルされ得る（例えば、実施例７でビオチンを
用いて行われたように）。次いで、もう一方のプローブ
は、放射性ラベル、ビオチン、または、ジゴキシゲニン
または他の修飾された塩基のような、検出部分でラベル
され得る。プローブは、コートされ、そして、標的配列
の存在を試験される核酸試料にハイブリダイズされる。
ハイブリダイゼーション反応物は、除タンパク質化され
るかまたは直接使用される。
捕捉部分でラベルされたプローブはトラップされる。
このトラッピングは、例えばビオチン部分でプローブを
ラベルすることにより、そして反応混合物を、固体支持
体に結合されたストレプトアビジンにさらすことにより
達成され得る。あるいは、上記捕捉部分は、ジゴキシゲ
ニンであり得、そして上記トラッピングは、固体支持体
に結合された抗ジゴキシゲニン抗体を用いて達成され得
る。別の基が、以下のようにして、都合よく、DNA分子
の末端に結合され得る。オリゴヌクレオチドプローブ
を、ジゴキシゲニン−11-dUTP（dTTPのアナログで、11
原子のスペーサーアームを介してジゴキシゲニンにカッ
プリングした、２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリ
ホスフェート、Boehringer Mannheim社製、Indianapoli
s IN）およびターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ（GI BCO BRL社製、Gaithersburg、MD）と
連結する。この方法を用いて取り込まれたdig-11-dUTP
部分の数は、５未満のようであった（おそらく１つまた
は２つ）。あるいは、dig-11-dUTP部分は、ビチオンの
場合のように、プローブのオリゴヌクレオチド配列の中
に取り込まれ得る。
代表的には、二本鎖プローブの以下の組合せが、捕捉
検出系で使用され得る：（ｉ）ビオチンまたはジゴキシ
ゲニンでラベルされた、第１のプローブ／捕捉、放射ラ
ベルされた第２のプローブ／検出；（ii）ビオチンでラ
ベルされた、第１のプローブ／捕捉、ジゴキシゲニンで
ラベルされた、第２のプローブ／検出；（iii）ジゴキ
シゲニンでラベルされた、第１のプローブ／捕捉、ビオ
チンでラベルされた、第２のプローブ／検出。
捕捉されたDNAを分離する一つの便利な方法は、実施
例７に記載されたように、ストレプトアビジンを結合さ
せた超常磁性ポリスチレンビーズの使用である。DNAの
捕捉後、磁性ラック中に反応チューブを置くことによ
り、上記ビーズは回収され得る。
あるいは、アビジンでコートされたアガロースビーズ
も使用され得る。ビオチン化されたアガロースビーズ
（固定化されたＤ−ビオチンを、Pierce社製）が、アビ
ジンに結合される。アビジンは、ストレプトアビジンの
ように、ビオチンに対して、４つの結合部位を有する。
これら結合部位の一つは、16原子スペーサーアームを介
してアガロースビーズに結合しビオチンにアビジンを結
合するのに使用される：他のビオチン結合部位は、利用
可能なままである。ビオチン化DNAを捕捉するため、上
記ビーズはハイブリダイゼーション複合体と混合される
（実施例７）。上に記載のビーズ捕捉法の別の方法（Ha
rlowら）は、以下のストレプトアビジン化またはアビジ
ン化された固体支持体を包含する：低タンパク質結合能
フィルター、または96ウェルプレート、またはイミノビ
オチン（Rigas、B.ら）のような改変ビオチン捕捉法。
上記のビーズ法のいずれかに対して、ビーズは単離さ
れ、そして、捕捉されたハイブリダイゼーション複合体
量が定量される。この定量法は、どのように第二DNAプ
ローブ鎖が調製されたかに依存する。上記第２のプロー
ブが放射性ラベルされる場合、上記ビーズはシンチレー
ションカウンター中で計測され得る。あるいは、上記捕
捉DNAは、化学発光、蛍光、または比色検出系を用いて
検出され得る。
上記実験の多くは、放射性ラベルされたオリゴヌクレ
オチドを使用した：実施例７は、ビオチンでラベルした
第一プローブの使用を放射活性ラベルの第二プローブと
組み合わせる。オリゴヌクレオチドの放射性ラベルに関
する手法は、以上で論じた。常法（例えば、アデノシン
［γ−32P］−５′トリホスフェートおよびT4ポリヌク
レオチドキナーゼによるオリゴヌクレオチドの末端ラベ
ル）を用いて、DNA 1μｇあたり108cpmの特異活性が、
ルーチンに達成される。この特異活性のレベルは、フィ
ルムにさらした、ゲルまたはフィルターのオートラジオ
グラフィー、またはシンチレーション液中のサンプルの
直接計測いずれによっても、少量のDNAの測定を可能と
する。
放射性ラベルおよび化学発光は（ｉ）非常に高感度
で、フェムトモル以下の量のオリゴヌクレオチドの検出
を可能とし、そして、（ii）よく確立された方法を用い
る。化学発光検出の場合、プロトコールは、マス−スク
リーニングアッセイの要求に適応させるよう考案され
た。放射性同位体を用いないDNA検出手法は、基質から
生成物への効率よい転換を与える酵素の能力、および、
化学発光または着色生成物を産する基質の入手可能なこ
とから、検出可能なラベルとして原則的にアルカリホス
ファターゼを取り入れた。
化学発光検出のために、ビオチン化されたまたはジゴ
キシゲニンラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ
は、Tropix、Incで開発された化学発光検出系「SOUTHER
N LIGHTS」を用いて検出され得る。その基本的な手法
は、ビーズ、フィルター上いずれかで捕捉された、また
は溶液中のDNAを検出するのに適用され得る。
アルカリホスファターゼは、捕捉されたDNA複合体に
結合される。これを行なうため、普通に使用されるELIS
A（Harlowら;Pierce社製、Rockford IL）手法由来のい
くつかの方法を使用し得る。例えば、第二鎖DNAプロー
ブは、ジゴキシゲニン−11-dUTP（dig-11-dUTP）および
ターミナルトランスフェラーゼ（上記のような）を用い
て末端ラベルされ得る。DNAが捕捉され、ハイブリダイ
ゼーション混合物から除去された後、次にアルカリホス
ファターゼが結合した抗ジゴキシゲニン抗体（Boehring
er Mannheim製、Indianapolis社製 IN）をジゴキシゲ
ニン含有オリゴヌクレオチドと反応させる。抗原性のジ
ゴキシゲニン部分は、前記抗体−酵素結合体により認識
される。
捕捉されたDNAハイブリダイゼーション生成物は、以
下のようにジゴキシゲニンに対する、アルカリホスファ
ターゼが結合した抗体を用いて検出される。アルカリホ
スファターゼに対する一つの化学発光基質は、３−
（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−
（３′−ホスホリルオキシ）フェニル−１′,2′−ジオ
キセタン二ナトリウム塩（AMPPD）である。AMPPDの脱リ
ン酸化は、不安定な化合物を生じ、それは分解し、長期
間の安定した477nmの発光を生じる。光測定は非常に高
感度であり、微少な量のDNA（例えば、102〜103アトモ
ル）を測定し得る。
アルカリホスファターゼ系の比色基質もまた試験し
た。比色基質も使用可能であるが、発光法の使用がより
高感度である。
上記のビオチン捕捉法の代替法は、第一鎖プローブを
修飾するビオチンの代わりにジゴキシゲニンを使用する
ことである。ビオチンは、次いで、上記の検出系中でジ
ゴキシゲニン部分と置き換えられる。この再配置では、
抗ジゴキシゲニン抗体は、DNAハイブリダイゼーション
複合体を捕捉するのに使用される。アルカリホスファタ
ーゼに結合したストレプトアビジンは、次いで捕捉され
たオリゴヌクレオチドの存在を検出するのに使用され
る。
他の代替の捕捉法は以下を包含する。（ｉ）DNA結合
性タンパク質およびその同種の結合性配列、ここで同種
の結合性配列は、第一鎖プローブ中の５′末端配列とし
て包含される捕捉部分である（Kempら）；（ii）ハイブ
リダイゼーション捕捉の使用、ここでポリ（Ｔ）のよう
な標的と相補的でないDNA配列が、第一プローブ中の
５′末端配列として組み込まれ、そしてポリ（Ａ）のよ
うな相補的核酸が、上記プローブおよびハイブリダイゼ
ーションにより会合した核酸を、捕捉するのに使用され
る。これら二つの方法のいずれも、固体支持体との結合
で使用され得る。
別の代替系は、膜に一方のプローブを固定し（Saiki
ら）、プローブをコートし、標的および第２のコートさ
れたプローブを添加し、除タンパク質化し、洗浄しそし
て検出することである。
図10は、一つのダブルＤループ構造検出のためのいく
つかの配置を示す。図10Aは、ビオチンのような、捕捉
部分でラベルされた第一プローブ鎖、およびジゴキソゲ
ニンのような、検出部分でラベルされた第二プローブ鎖
を示す。図10Bはジゴキシゲニンのような、捕捉部分で
ラベルされた第一プローブ鎖、およびビオチンのよう
な、複数の検出部分でラベルされる相同なテイル伸張を
有する第二プローブ鎖を示す。図10Cは、二本鎖プロー
ブのどちらかおよび／または両方の鎖に付着した非相同
テイルへの検出部分（または捕捉部分）の添加を表す。
C.診断応用に対する複数のダブルＤループ構造の使用 捕捉／検出系での単一のダブルＤループ構造複合体の
利用に加え、同様に複数のダブルＤループ構造が使用さ
れ得る。例えば、より長いプローブを使用するような、
プローブ鎖の再会合が問題となり得る場合に、複数のダ
ブルＤループ構造の使用が、バックグラウンドの減少を
提供する。本方法では、標的配列中で２種またはそれ以
上の配列が知られていることが重要である。
図11は、二つのダブルＤループ構造に基づく検出のた
めのいくつかの配置を示す。図11Aは、第１の二重鎖プ
ローブの両鎖を捕捉部分でラベル、および、第２の二重
鎖プローブの両鎖を、レポーティング／検出基でラベル
する例を示している。捕捉部分は、第１のプローブセッ
トの一方または両方の鎖に含有され得る。この系では、
ハイブリダイゼーション複合体は上記のように捕捉され
る。しかしながら、第１の二重鎖プローブ鎖の再会合
は、いずれの鎖もレポーター／検出基を含有しないた
め、反応に対するバックグラウンドを全く生じない。捕
捉後、ハイブリダイゼーション複合体は、ハイブリダイ
ゼーション複合体中の第２の二重鎖プローブの存在に基
づいて検出される。レポーター基の検出は、上記のよう
にして達成される。
標的複合体中の複数のダブルＤループ構造の存在に基
づく、この系の第２の実施態様を、図11Bに示す。この
場合では、第１の二重鎖プローブの一方の鎖のみが捕捉
部分でラベルされ、そして第２の二重鎖プローブの一方
の鎖のみがレポーター部分でラベルされる。
単一のダブルＤループ構造検出について上記されたよ
うに、非相同のテイルおよび標的DNAに相同な配列が、
二重鎖プローブに添加され得る。
D. RecAタンパク質で促進されるDNA増幅反応へのダブル
Ｄループの使用 DNA増幅反応は、連続した増幅のための調製物中の鎖
分離のための熱変性に、優先的に依存すること（Mulli
s;Mullisら;Scharfら）が記載されている。以下の記載
は、単一のまたは複数のダブルＤループの形成に続くDN
A増幅に基づく、二つの検出系である。
（ｉ）本発明の一つの増幅／検出法は、熱変性の必要な
しに増幅を促進するために複数のＤループを利用する。
本発明を支持するために実施した実験は、本発明のハ
イブリダイゼーション反応物中で、二本鎖標的の異なる
領域に相同な、二組の相補的なDNAプライマーの使用
が、標的DNAに二つのダブルＤループの形成を生じるこ
とを立証している。これらダブルＤループは、ネイティ
ブな二重鎖標的上のDNAの特定の領域に隣接しおよび規
定する（図12A）:DL801/2およびDL803/4（表１）は、こ
の反応に関係し得るプローブ／プライマーである。
得られたDNA標的構造は、DNA合成の基質として、種々
のDNAポリメラーゼにより認識可能となる。このような
増幅反応の一つの例が、実施例８で提示される。実施例
８に記載の増幅反応のための基質はラムダDNAゲノムで
ある。プライマーは、約500bpの標的領域を規定する。
代表的には、上記増幅反応は、DNAポリメラーゼ（例え
ば、クレノウ断片）、RecAタンパク質でコートされたプ
ライマー、ATPγＳ（またはrATP（単独および再生系の
存在下で）、dATP、GTPγＳ、ならびにATPγＳおよびrA
TP、またはATPγＳおよびADPの混合物）、標的である基
質、必要なコファクターおよび４種dNTPの全て（修飾さ
れたまたは認識されたdNTPsを包含する）を含有する。
これらの反応はまた、DNAヘリカーゼ、トポイソメラー
ゼ、または他の類似のDNA巻戻し剤および／または他のD
NAポリメラーゼを含有し得る。
これらの反応条件は、５′から３′方向へのプライマ
ー伸長へと続く、プライマー３′末端の伸張に有利であ
る。ポリメラーゼによる、上記構造中の４種のDNAプラ
イマーのうちの二つまたはそれ以上の３′末端伸張は、
DNAプライマー間のDNA標的増幅の領域を規定する（図13
参照）。規定された領域に対するDNA増幅を制限するた
めに、それらが化学的または物理的にブロックされなけ
れば、他の二種のプライマーのDNAポリメラーゼ伸張も
また、それらの３′末端で起こり得る（実施例８）。
プライマーペア間の、DNAポリメラーゼが触媒する
３′伸張は、同じ鎖上のプライマーを置換し得、また
は、その一方で、新たに合成された生成物は、熱抵抗
性、または熱感受性のDNAリガーゼ（Epicentre Technol
ogies、Madison、WI）を包含する、DNAリガーゼによ
り、上記プライマーと結合され得る。適切なDNAヘリカ
ーゼ、トポイソメラーゼ、一本鎖結合性タンパク質（SS
B）、遺伝子32（または、他の類似の）タンパク質、ま
たは、いくつかのものがヘリカーゼ活性を付随する、Re
cBCDでコードされた酵素または他のタンパク質の添加に
より、複製が促進され得る。RecAタンパク質により適正
に位置されたプライマーはいずれも、複製開始に使用さ
れ得る。
代表的には、二つのダブルＤループでRecAタンパク質
で触媒されたDNA増幅で使用されたプローブは、約60か
ら80bpのサイズである。より長い、またはより短いプロ
ーブがまた、同様に使用され得るが、反応条件は改変さ
れる必要があり得、例えば、安定化ペプチド（例えば、
SSBまたは遺伝子32タンパク質）、薬剤、抗体、ポリア
ミンまたは架橋剤を含有し得る。
異なるサイズの複数のプライマーもまた使用され得
る。プライマーはまた、それらの全長に沿って、標的DN
A二重鎖に相同であり得、またはそれらは、非相同のテ
イルのような、部分的に非相同な末端または内部の領域
を含有し得る（上記参照）。これらプライマーに対する
唯一の要求は、所望の増幅生成物の３′伸張のために使
用された塩基が、DNA合成を始めるのに利用可能である
という点である。上記のようにプライマーはまた、ビオ
チンまたはジゴキシゲニンのような、または、DNA修飾
酵素および化学試薬で付加された機能で、修飾されたリ
ン酸骨格または塩基を含有し得る。
RecAタンパク質でコートされた、過剰のプライマーの
存在下の反応は、新たに複製されおよび増幅されたDNA
上に、新たな複数またはダブルＤループの形成を可能と
する。上記RecAタンパク質でコートされたプライマー
は、さらなるラウンドのDNA合成を開始するのに役立
ち、そしてこのようにDNA標的は、増幅プライマーを位
置するために、標的DNAを熱変性する必要なしに増幅さ
れる。
DNA増幅反応は、以下を包含する、任意の多くのDNAポ
リメラーゼまたはポリメラーゼ混合物を使用し得る：E.
coli DNAポリメラーゼＩのクレノウ大断片;T7;T4;およ
び／または他のウイルスまたは細胞のDNAポリメラーゼ
およびそれらの変異型、例えば、エキソヌクレアーゼ活
性を有さないダブルクレノウ変異タンパク質。
二つのダブルＤループ反応のDNA生成物は、使用したD
NAプライマーにより規定される。増幅されるダブルＤル
ープ領域の左右のプライマーが、新たに合成されたDNA
増幅生成物の５′末端を規定する。プライマーが置換さ
れない場合、新たに合成されたDNA生成物は、図12Bに表
されるように、RecAで触媒された増幅反応で連結され得
る。
複数のプライマーセットを使用して、付着末端を有す
るDNA増幅生成物を生じることもまた可能である。次い
でDNA生成物は、それらの重複する付着末端でハイブリ
ダイズし得、そしてこれらの会合したDNAの鎖長は、続
いて伸張される（Haaseら）。存在する鎖の伸張、置換
合成、およびRecAで触媒された、重複領域での塩基のペ
アリングは、大きなDNA標的の収率を増大し得る。これ
は、RecAで触媒される細胞内でのインサイチューDNA増
幅に重要であり得、それは、特定の条件下（Haaseら）
で、インサイチューで保持されるような大きいDNA生成
物または付加された基を必要とする。
上記ダブルＤループ反応、または複数のダブルＤルー
プは、インサイチューな増幅反応のためにアガロース中
で安定に形成され得る。異なるタイプのアガロースが可
能ではあるが、代表的に上記アガロースは、低融解温度
種であり、アガロース濃度は約0.4〜１％である。これ
らの条件下で、アガロースゲルはまた、より短いDNA生
成物の保持をさらに可能とする限定媒体を提供する：こ
れは、特にインサイチュー反応で有用である（以下参
照）。
RecA促進されたDNA増幅反応は、37℃、および標的DNA
二重鎖またはプライマー：標的ハイブリッドの熱変性温
度未満である、高められた温度、例えば50〜60℃で実行
され得る。これらの反応で高められた温度の使用は、プ
ライマー伸張に利用可能な酵素の範囲を広げ、そしてよ
り長い領域のDNAが合成されるのを可能とし得る。増幅
反応の温度は、反応成分の選択を指定する：例えば、野
生型E.coli RecAタンパク質でコートされたプローブ
は、37〜39℃で標的DNAに添加され、次いで、DNA合成
は、Thermus aquaticusのDNAポリメラーゼを用いて、50
〜55℃で達成され、次いで反応温度が、37〜39℃に低下
され、そしてRecA−タンパク質でコートされたプローブ
が添加、再添加される。あるいは、高温下で、熱抵抗性
のRecA様のタンパク質が、野生型E.coli RecAタンパク
質に置き換わり得る（同時係属中で、同時所有の米国出
願第07/520,321号で論述するように）。
DNA増幅反応のための、RecAタンパク質で触媒された
プライマー位置付けを位置する、二つのダブルＤルー
プ、または複数のダブルＤループ反応は、溶液中の診断
またはインサイチュー診断でDNA検出および増幅のため
の診断応用に重要である。
（ii）ダブルＤループおよびDNA増幅を活用する、第２
の検出方法は、シグナル増幅のために、ラベルされた標
識化または修飾されたdNTPのポリメラーゼ付加を使用す
る。DNAポリメラーゼを使用する、単一（三本鎖）のＤ
ループ構造中のプライマーの３′末端の伸張は、Cheng
ら（19888）により立証された。標的DNA分子中の単一の
ダブルＤループの形成後、DNAポリメラーゼ、必要なコ
ファクター、および４種のdNTP全てを反応に添加する。
鎖伸張は、二本鎖プローブの一方または両方のプローブ
鎖の３′末端から起こる（図13A）。あるいは、捕捉部
分を含有する鎖の３′末端は、プライマー伸張を防止す
るためにブロックされ得る。一種またはそれ以上のdNTP
が、常法（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、また
は、蛍光または放射活性部分）により、検出のために標
識され得る。ラベルされたdNTPの取り込みは、検出シグ
ナルの増幅を生じる。
この方法は、さらに、目的の領域を標的とする複数の
ダブルＤループ構造の使用により活用され得る（上記の
ように）。標的領域の外部にある二本鎖プライマー３′
末端は、ブロックされ得（アステリスクで図13Bに示し
たように）またはされない。シグナル増幅のこの方法
は、上記のように、ラベルされた部分の存在下で、RecA
で促進された増幅の多重を用いてさらに増強される。
シグナル増幅を伴う標的検出はまた以下のように達成
され得る。ダブルＤループが、二種のプローブ鎖を使用
して標的配列で形成され、ここで少なくとも上記鎖の一
方は、捕捉部分を含有する。生じたダブルＤループ複合
体は、除タンパク質化され、そして捕捉媒体を有する捕
捉部分との接触を介して捕捉され得る。捕捉された複合
体は、加熱により遊離される：上記複合体は、dsDNAま
たはssDNAのいずれかとして遊離され得る。必要であれ
ば、例えば、複合体がdsDNAとして遊離されるならば、
複合体は変性され、そして標的DNAが遊離される。この
混合物に、標的配列に相補的なDNA合成プライマーが添
加される。これらのプライマーは、もとの二本鎖プロー
ブに存在する配列は含有しない。次いで、ハイブリダイ
ズしたプライマーからDNAを合成するため、適切な緩衝
液条件下で、DNAポリメラーゼおよびdNTPが添加され
る。このプライマーによって導かれる鋳型合成が、ラベ
ルされたdNTP、例えば、放射性ラベルされたdNTP、ビオ
チンラベルされたdNTP、FITCラベルされたdNTP、または
他の適切にラベルされたDNA前駆体の存在下で実施され
得る。ラベルの含有は、例えば、FITCラベルされたdNTP
の場合の蛍光光度計のような、適切な検出系を介する標
的検出を可能とする。
E. RecAタンパク質で促進されたインサイチューハイブ
リダイゼーションでのダブルＤループ構造の使用 ダブルＤループ構造を利用する、別の検出方法が、固
定された細胞を用いるインサイチューハイブリダイゼー
ションである（実施例９）:RecAで促進されたインサイ
チューハイブリダイゼーション法は、1993年３月18日に
公開された、同時所有のPCT国際公開番号第WO 93/05177
号「インサイチューハイブリダイゼーション法」に記載
される。RecAタンパク質でコートされた二重鎖プローブ
のインサイチューハイブリダイゼーションは、共焦点レ
ーザー走査顕微鏡（van Dekkenら）を用いて、単離され
固定された生物構造、あるいは核または核容積内で他の
標的とされた配列および／または核膜に対して、標的配
列を局在化する能力を提供する。
インサイチュー方法の一つの応用は、実施例9Dに記載
される。この方法で、分裂するHEp-2核が固定され、そ
してRecA/染色体ＸαサテライトDNAプローブ複合体でプ
ローブされ、そしてFITC−アビジンでラベルされる。分
裂する核中でプローブ結合のパターンが、標準的な光蛍
光またはレーザー走査顕微鏡手法を用いて評価される。
結合したプローブを局在化するため、同一の視野が、レ
ンズ焦点を変更することなく位相差顕微鏡により観察さ
れる。得られた２種類の顕微鏡写真を重ね合わせること
により、核膜および核の分裂面の相対位置が、プローブ
でラベルされた染色体に関連して認識され得る。
本発明のこの局面は、生物構造中で標的配列を局在化
するための単純化されたインサイチューな手順を提供す
る。代表的には、固定された細胞または細胞より小さい
構造物が、懸濁液中またはスライド上でプローブされ、
引続きフローサイトメトリーまたは顕微鏡で解析され
る。本方法は、熱変性工程の必要性を排除することによ
り、アーチファクトを減少させ、そして、より急速で特
異的な標的配列の検出を可能とする。本方法は、唯一、
低コピー、および／または高コピー数の標的配列のいず
れにもよく適用され得る。
特に、本方法は、低コピー数配列を、最初に増幅する
必要なしに検出する。大部分の遺伝子マッピングおよび
染色体研究は、特異的な、唯一、または低コピー数の配
列を含むと予想されるので、本インサイチュー方法は、
遺伝子マッピング研究、および、唯一、または低コピー
数の正常体、変異体または病原体の配列を包含する診断
応用に重要な利点を提供する。さらに本方法は、フロー
サイトメトリー解析により、染色体含量の測定も可能と
する。
このインサイチュー法の一つの一般的な診断応用は、
染色体中、および／または染色体の特定領域中の、選択
された遺伝子または調節配列のマッピングにおける使用
である。標的遺伝子は、（ａ）選択された遺伝子産物を
生じる、（ｂ）細胞またはウイルスのオンコジーンのよ
うな重要な細胞調節機能を果たしていると考えられる、
（ｃ）繰り返し配列に関する、（ｄ）活性な遺伝子産物
の発現を抑制する、遺伝的な欠損を含むと考えられる、
（ｅ）既知の遺伝地図位置を有するマーカープローブ領
域に対する染色体位置に関連し得る、および／または、
（ｆ）組み込まれたウイルスの配列を表し得る、遺伝子
であり得る。
インサイチューハイブリダイゼーションのためのプロ
ーブ鎖は、フルオレセイン−11-dUTP（Boehringer-Mann
heim）のような蛍光部分を用いる直接ラベリングを包含
する多くの方法でラベルされ得る。さらに、個々のプロ
ーブ鎖が、結合された蛍光系を生じるために使用され得
る。例えば、第１の蛍光部分（一方の鎖に組み込まれ
た）の放出エネルギーが、第二プローブ鎖に取り込まれ
た第２の蛍光部分の励起エネルギーで光を放射する。こ
のような結合された蛍光系は、ダブルＤループ複合体中
の近接したプローブ鎖を利用する。
DNAプローブが、特異的な細胞性病原体に対し向けら
れたとき、代表的には感染細胞中のウイルスまたは細菌
病原体の検出に対してであり、固定され標識された細胞
が、細胞中の感染性病原体を検出し、そして局在化する
ために、光学または蛍光顕微鏡により試験される。ある
いは、細胞感染、および感染された細胞のパーセント
が、懸濁液中の核または細胞に対するRecAタンパク質で
コートされた二重鎖プローブのインサイチューハイブリ
ダイゼーション後に、蛍光活性化細胞ソーター（FACS）
により測定され得る（Traskら）。
F.制限酵素切断に基づく検出系でのダブルＤループ構造
の使用 本発明のダブルＤループ構造は、標的／ダブルＤルー
プ複合体に変更を導入することにより、サンプル中の標
的DNAの存在を検出するのに使用され得、この変更は、
制限酵素消化に対するこの複合体の応答を検出できる方
法で修飾する。このような検出系のいくつかの実施例を
以下に記載する。
ダブルＤループおよび制限酵素消化を活用する検出方
法の一つを以下に示す。標的DNA中のある領域が二本鎖
プローブ配列として選抜される。上記プローブ配列は、
標的DNA中には存在しない内部制限部位を含有するよう
に改変される。このような制限部位は、標的およびプロ
ーブ間の塩基対ミスマッチが最小となるように選択され
得る（図14）。次いでダブルＤループが形成され、そし
て複合体が除タンパク質化される。上記複合体は、次い
で固体支持体上に捕捉され、そして、上記プローブ配列
に導入された部位に対する制限酵素で消化される（図14
AのPvu II）。あるいは、上記複合体は、捕捉前に制限
エンドヌクレアーゼで消化され得る（図14B）。プロー
ブが標的配列にハイブリダイズされた場合は、Pvu II制
限部位が再構築されないので、制限酵素は復元されたプ
ローブ：プローブ複合体のみ切断し、プローブ：標的複
合体を切断しない。固体支持体は洗浄され、そして検出
部分の存在について検査される。本方法は、プローブの
復元により発生し得るいかなるバックグラウンドシグナ
ルの減少も可能とする。
第２の検出法も同様の原則で作用する。本方法では、
標的DNAはメチル化されず、そして二本鎖プローブDNA
は、RecAタンパク質のコーティング前にメチル化され
る。ダブルＤループ複合体が形成され、複合体が捕捉さ
れ、そして除タンパク質化される。次いでサンプルは、
例えば、両方の鎖のＡ残基がメチル化された場合のみ、
その認識部位（配列番号:2）を切断するDpn Iで消化さ
れる。プローブが標的配列にハイブリダイズするとき
は、メチル化された制限部位が形成されないので、Dpn
I切断は、プローブが復元された場合のみ起きる。固体
支持体は洗浄され、そして検出部分の存在について検査
される。上記のように、本方法はまた、プローブの復元
により生じるいかなるバックグラウンドシグナルの減少
も可能にする。
DNAのメチル化状態はまた、標的／ダブルＤループ複
合体を用いて、以下のように活用され得る。この方法で
は、RecAタンパク質コーティング前に標的DNAがメチル
化されるか、または二本鎖プローブがメチル化されるか
のいずれかである。上記ダブルＤループ複合体が形成さ
れ、上記複合体は、捕捉され、そして除タンパク質化さ
れる。捕捉された複合体は、固体支持体から単離され
得、そして多数のサンプルに分けられる。一つのサンプ
ルが、メチラーゼ感受性またはメチラーゼ依存性制限酵
素で消化され、そして別のサンプルが、メチラーゼ非感
受性の制限酵素で消化される：例えば、Mbo Iは、Ａ残
基がメチル化される場合はDNAを切断せず、Sau3A Iは、
同じ制限部位をＡ残基のメチル化状態に依存せずに切断
する。
これらサンプルは、次いで、サイズ分画（例えば、ア
ガロースまたはアクリルアミドゲル上、またはHPLCによ
り）され得、そしてサンプルのバンドのパターンが比較
される。この方法は、単離およびそれに続く、異なる供
給源からの多くのサンプル間で選択されたフラグメント
の制限フラグメント長多形性の検査を可能とする。
メチル化はまた、消化から特異的制限酵素部位を保護
するのに使用され得る（Nelsonら）。例えば、もし、特
定の領域にまたがるMbo Iフラグメントの単離が所望さ
れ、しかし、その領域の内側にMbo I部位が存在する場
合は、上記フラグメントは、以下のように単離され得
る。メチル化プローブを用いて、標的DNA中の内部制限
部位にダブルＤループ構造が形成される。標的／ダブル
Ｄループ複合体は、除タンパク質化され、Mbo Iで消化
され、そして捕捉される（図15A）。この方法は、
（ｉ）異なる供給源から得られたフラグメント中の保護
された部位に近接した制限部位で制限酵素多形性を検査
する、または（ii）その酵素について内部切断部位が存
在する場合であっても制限酵素を使用して所望の配列を
捕捉し、クローンするために使用され得る。除タンパク
質化されたダブルＤループ構造が、制限酵素切断を受け
易いという事実は、500マープローブと2.9kbの相同標的
フラグメントで形成されたプローブ：標的複合体の、Pl
e I制限エンドヌクレアーゼによる部位特異的切断によ
り立証された。
二本鎖のRecAタンパク質でコートされたプローブは、
それら自身、消化から特異的な制限酵素部位を保護する
のに使用され得る。この場合は、上記複合体は、除タン
パク質化されない。標的／ダブルＤループ複合体は、制
限エンドヌクレアーゼで消化され、そして捕捉される
（図15B）。あるいは、上記二本鎖のRecAタンパク質で
コートされるプローブは、例えば、メチル化部位であ
る、修飾部位を修飾から保護するために使用され得る。
この場合は、上記の制限部位保護に関するのと同様に、
上記複合体は、除タンパク質化されない。上記標的／ダ
ブルＤループ複合体は、修飾試薬で処理され、次いで除
タンパク質化される。標的／ダブルＤループ複合体内部
の修飾標的部位は、保護され、そして修飾を欠く。
制限部位切断をブロックする能力は、遺伝子マッピン
グで有用である。例えば、標的DNAが、ラムダゲノム上
の約26.3kbにあるPvu I部位のような、ゲノム中の既知
の領域を規定する場合、その既知の部位は、上記のアプ
ローチの一つにより保護される。保護されなかった、お
よび保護されたラムダゲノムDNAは、Pvu Iで消化され
る。二つの消化間での制限フラグメントパターンの変化
は、ブロックされた制限部位を含有するサンプル中の、
バンドの消失および新たなバンドのサイズに基づいて、
どのフラグメントが他のフラグメントの次であると推定
することを可能とする。
制限酵素、およびそれらのメチル化状態に対する応答
は、普通に利用可能であり、これらの使用に対する条件
は、当該分野で公知である（Ausubelら;Maniatisら）。
G. DNA中に部位特異的切断を生じるダブルＤループの使
用 オリゴヌクレオチドは、特異的な一本鎖および二本鎖
核酸部位に対して切断剤を導くのに使用される（Corey
ら;Dreyer.G.B.ら;Moserら）。オリゴヌクレオチド特異
的切断の一つの利点は、実験者が、存在する切断機能に
もはや依存しないことである：任意の所望されたDNA切
断機能が仕立てられ得る。本発明のRecAタンパク質でコ
ートされた二本鎖プローブは、多くの方法で、部位特異
的切断を生じ得る。例えば、特異的な標的配列が選択さ
れ、そしてその選択された配列に対応する二本鎖DNAプ
ローブが生成される。EDTA部分が、オリゴヌクレオチド
プローブの一方または両方の鎖に付加される。チミジン
のＣ−５を介する、オリゴデオキシヌクレオチドへのED
TAを付加する一つの方法が、Dreyerらにより記載されて
いる。上記プローブは、次いでRecAタンパク質でコート
され得、そして標的DNAとダブルＤループ複合体が形成
され得る。切断は、EDTA−プローブ：標的ハイブリッド
に対し、Fe（II）および還元剤（通常はDTT）の添加に
際し、酵素の存在下で起こる。
あるいは、切断は、オリゴヌクレオチドプローブに付
着するDNA結合性／切断性タンパク質（Sluka、J.P.ら）
由来のペプチドフラグメントを用いて達成され得る。さ
らに、幾つもの切断部位を有する制限エンドヌクレアー
ゼ、または、ぶどう球菌（staphylococcal）ヌクレアー
ゼの様な、相対的に非特異的なホスホジエステラーゼ
が、配列特異性の増大した、ハイブリッド触媒剤を生成
するため、オリゴヌクレオチドに付着され得る（Corey
ら）。
オリゴヌクレオチドは、RecAタンパク質コーティング
前、またはダブルＤループ複合体形成および除タンパク
質化後のいずれかで、ホスホジエステラーゼ、または他
の切断剤に付加される。ホスホジエステラーゼ、ヌクレ
アーゼまたはペプチドとダブルＤループ複合体との会合
後、反応条件は、部位特異的な様式で両方の標的DNA鎖
が加水分解できるように改変される。触媒剤の活性に依
存して、二本鎖プローブの一方または両方の鎖が、上記
触媒剤を含有するよう修飾される。
H. DNA濃縮におけるダブルＤループの使用 本発明のダブルＤループハイブリダイゼーション複合
体はまた、選択された標的DNA配列の分離および濃縮の
ために使用され得る。例えば、二本鎖プローブが、プロ
ーブ鎖の一方または両方に捕捉部分を含有して形成され
得る。ダブルＤループ複合体は、上記二本鎖プローブお
よびDNA混合物中に存在する標的DNAの間で形成される。
次いで、上記プローブおよび標的配列を含有する上記ダ
ブルＤループ複合体は、反応混合物から捕捉部分を用い
て、例えば固体支持体への付着により分離される。次い
で上記複合体は、上記固体支持体から加熱により標的二
重鎖を遊離させ分離され得、そしてもし必要であれば、
遊離したDNAは復元され、元の標的二重鎖DNAを再生す
る。あるいは、全ダブルＤループ複合体は、固体支持体
から簡単に遊離され得る。
標的された二重鎖DNAが、簡単に加熱によりそのハイ
ブリッドから遊離されるかどうかを試験するため、32P
−末端ラベルされた500マープローブおよび10.1kbのApa
I標的フラグメントで形成された、除タンパク質化され
たダブルＤループハイブリッドの熱安定性が試験され
た：上記ハイブリッドは、１×TBE緩衝液中で、75℃で
全く安定であった。DNAプローブ鎖の約半分が80℃で遊
離された。実質的にDNAプローブ鎖の全てが85℃で標的
から遊離された。この融解プロフィールは、RecAタンパ
ク質の非存在下で反応物混合物を加熱し、次いで徐々に
冷却することによって形成された、二重鎖プローブ：標
的ハイブリッドについてのそれと類似である。上記ハイ
ブリッド融解プロフィールは、二重鎖500マープローブ
のそれより、約10℃低くて、同一のイオン条件下で、自
己アニールされた。
以下の理由により、上記ハイブリダイゼーション反応
は、配列でタグされた部位（sequence-tagged site）
（STSs）（01 sonら）によってのみ同定された、染色体
または遺伝子フラグメントを標的することに対して潜在
的に有用である： （ｉ）ハイブリッド形成のために、RecAを介したハイブ
リダイゼーション反応は、二重鎖DNA標的の変性を必要
せず、そして （ii）プローブ：標的複合体からプローブを分離し、し
かし、標的を含有する二重鎖の分析物、例えば、染色体
または遺伝子を含有するフラグメントを変性させない温
度まで加熱することによって、標的は、単離されたハイ
ブリッドから遊離される。上記標的DNA分析物は、次い
で二重鎖形態で回収し得る。
さらに、ハイブリッド融解温度の注意深い調節は、プ
ローブと部分的なホモロジーのみ有し得るハイブリッド
に対する選択を可能にし得る。プローブが標的DNAの複
雑な混合物に使用される場合、厳重な融解温度の選択が
重要であり得る。一本鎖変性標的DNAに対する、二重鎖
標的DNA回収の一つの利点は、完全に変性された一本鎖D
NAよりも二重鎖DNAは、剪断力により抵抗性である傾向
がある。本発明の方法による、二重鎖標的DNAの回収
は、特異的二重鎖遺伝子、または大きい染色体フラグメ
ントを包含するゲノムセグメントの濃縮および単離を許
容し得、次いでさらなる操作および／または解析に使用
され得る。
この方法により得られた標的DNA二重鎖は、DNA増幅反
応（Mullins;Mullinsら）または標準的なクローニング
手法（Ausubelら;Maniatisら）に使用され得る。
I.均一診断アッセイ 特異的なネイティブな標的DNA二重鎖を検出し得る均
一な診断アッセイの一つのプロトコールが試験された。
このアッセイは、以下に詳細に記載するように、ダブル
Ｄループハイブリッド、次いでDNAシグナル増幅を用い
ることにより二本鎖標的の捕捉することを含む。
（ｉ）二本鎖DNA標的の捕捉 ラムダDNAゲノム（〜50kb）のような大きい二本鎖DNA
を特異的に捕捉するために、ダブルＤループハイブリッ
ドを用いることに対して、一つの手法が良好に作用し得
る。
この反応はまた、より小さい二重鎖DNA標的の捕捉に
適用可能である。この手法は、ビオチンのような捕捉部
分でラベルされ、RecAコートされた、好ましくは平均サ
イズ300〜500塩基の、一本鎖プローブを使用する。全て
のDNAプローブは、二重鎖DNA標的の、好ましくは約1000
塩基の領域内の配列に相同であるように選ばれる。ビオ
チン化プローブは、bio-14-dATPの存在下で、好ましく
は、約1000bpのDNA二重鎖フラグメントを、ニックトラ
ンスレートすることによって提供される。熱変性プロー
ブDNAは、RecAタンパク質でコートされ、次いで二重鎖
標的DNAと反応させる。プローブ：標的ハイブリッド形
成後、ハイブリダイゼーション反応混合物は、例えば、
20mM EDTAを用いそして0.5M塩で処理され反応停止され
得る。ハイブリッドは、洗浄された磁性Dynabeads M-2
80ストレプトアビジン（Dynal）上に捕捉され得る。捕
捉後、ビーズを、1M塩を含有する緩衝液中で３回洗浄す
る。結合したRecAタンパク質部分が少なくとも部分的に
除去された高温濃度条件である。標的DNAの捕捉は、32P
でラベルされたラムダDNAの使用、および洗浄後のビー
ズに結合したままの放射活性を直接計測することによっ
て測定され得る。大きなラムダDNAゲノム（〜50kb）を
使用する捕捉反応の結果を表３に示す。二本鎖標的とハ
イブリダイズされたビオチン化プローブの捕捉のための
反応の特異性は、３つのコントロール反応（表３、反応
２〜４）の包含により立証された。これらの反応は、次
のことを示した：（１）RecAなしの反応では、有意なシ
グナルが得られなかった（反応２）ことから、RecAでコ
ートされたビオチン化プローブが、特異的な標的DNA捕
捉に必要であった（反応１）、（２）RecAでコートされ
た、非ビオチン化、非相同DNAプローブ存在下では、バ
ックグラウンドレベルのDNA捕捉しか起こらなかったの
で、反応中のRecA含有は、標的捕捉の原因ではなかった
（反応３）。そして（３）平均バックグラウンド、非特
異的な、標的DNA捕捉は、約3.5％であった（反応２〜
４）。
（ii）捕捉DNAからのシグナル増幅 ビーズに捕捉された標的DNAを検出するための基本型
プロトコールを、以下に簡潔に記載する。この工程で
は、捕捉された標的は、一種またはそれ以上が標識され
るdNTP前駆体（例えば、bio-14-dATP、または、FITC-11
-dUTP等のような直接検出可能なラベルを有するdNTP）
を含有する反応混合物で加熱することによりビーズから
遊離され、そして元の捕捉プローブ配列に非相同的で、
標的配列にのみ相同的な、ssDNAプライマー（または複
数）が添加され、そして標的DNAの一本鎖とアニールさ
せる。アニーリング後、反応物を冷却し、そしてDNAポ
リメラーゼ酵素、好ましくはDNAポリメラーゼT7（Seque
nase Version 2.0、USB製）、および、適切な緩衝液を
添加し、プライマー伸張によるDNA合成を行なう。ある
いは、高温ポリメラーゼもまた使用され得、そして反応
物はDNA合成進行を行える温度でインキュベートされ得
る。プライマー伸張の間に、ラベルされたDNA前駆体
は、新たに合成されたDNA鎖に取り込まれる。DNAプライ
マーは、前に使用されたRecAでコートされたプローブに
相同的でないため、ラベルの組み込みは、特異的に、正
しく捕捉された標的の存在を示している。ポリ（Ａ）の
ように直接上記プライマーに結合された、または後で添
加され得るいずれかの捕捉部分の使用は、磁性ビーズ、
セルロースなどに付着したオリゴ（dT）上の、増幅され
た標的シグナルのその後の捕捉を可能とする。捕捉に引
続き、増幅されたDNAから取り込まれなかった前駆体ラ
ベルを除去し、そして必要であれば、例えばI-Block（S
outhern-LightTM、Tropix社製）のようなブロッキング
剤が、捕捉マトリックスに対する検出部分（例えば、AV
IDx-AP、Tropix社製）の非特異結合をブロックするため
に使用される。ブロッキング後、増幅された標的DNA由
来の特異的シグナル検出を可能とするために、基質が添
加され、そしてシグナルが任意の適切な手段により検出
される。均一な診断ダブルＤループアッセイの図式的な
アウトラインを以下に示す。特異的なラベリング、捕
捉、および検出スキームの概要が提示され、さらに多く
の方法で、このようなアッセイが実施され得る。
ダブルＤループハイブリッドを用いる二重鎖DNA標的
に対する均一診断アッセイの図式的なアウトラインを以
下に示す。
以下の実施例は、本発明を説明し、いかなる方法でも
本発明を制限する意図はない。
材料と方法 制限酵素は、Boehringer Mannheim（Indianapolis I
N）またはNew England Biolabs（Beverly MA）から入手
し、製造業者の指示に従って使用した。
通常、オリゴヌクレオチドは、［γ−32P］ATPおよび
T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射性ラベルし
た。ラベリング反応は、緩衝液中で、製造業者（New En
gland Biolabs、Beverly MA;Bethesda Research Labora
tories、Gaithersburg MD;またはBoehringer/Mannhei
m、Indianapolis IN）により推奨された方法により実施
した。オリゴヌクレオチドは、予め形成されたカラムNe
nsorb 20（NEN-DuPont,Boston,MA）を、製造業者の指示
に従って使用して、緩衝液および取り込まれていないト
リホスフェートから分離し、そして必要ならば、続いて
ddH2Oに対して透析した。
実施例１ RecAでコートされたプローブの調製 一連の二本鎖および一本鎖DNAプローブ、ならびにプ
ライマーを生成した。ラムダファージゲノムの隣接500
塩基対領域に関するこれらプローブおよびプライマーの
位置を、図１に示す：ラムダゲノムのこの領域のヌクレ
オチド配列を図２に提示する。ラムダウイルスのゲノム
に対して、各プローブおよびプライマーの５′および
３′末端の塩基位置を表１に列挙する。
＊サンプル反応の説明は図８を参照。パーセンテージ
は、各捕捉反応物を１×酢酸反応緩衝液で３回洗浄後
に、Dynal社製ストレプトアビジンでコートされたビー
ズ上に残存する32P計測数から計算した。１分間の全予
測32P計測値を、図８中と同一の実験由来の細断したゲ
ル薄片中の、DNAのシンチレーション計測により測定し
た。反応３に放射活性DNAを添加されなかったため（ビ
オチン捕捉プローブのみ含有）、この反応では放射活性
計測は予測されない。
＋ DNAの放射活性32Pの計測値は、バックグラウンドDNA
計測値（すなわち、ビオチン捕捉プローブなしの反応２
での計測値）である非特異的なビーズ捕捉に対して補正
される。
プライマーPCR01およびPCR02は、「GENEAMP」DNA増幅
試薬キット（Perkin Elmer Cetus、Norwalk CT）中で提
供されたプライマーに相当する。
一本鎖プライマー類（PCR01、PCR02およびPCR03A）お
よび一本鎖プローブ鎖（DL80-1から４、ビオチン−12
1、121-32P、およびビオチン−79）は、Applied Biosys
tems 380B DNA synthesizer（Applied Biosystems、Fos
ter City CA）で、市販のホスホルアミダイト前駆体を
使用して化学的に合成した。
DNA分子は脱ブロッキング前に、末端の５′塩基にビ
オチンホスホルアミダイトを反応させてビオチン化した
（New England Nuclear-Dupont、Boston、MA）。全ての
化学合成DNA分子は、製造業者の仕様書に従って脱ブロ
ック化した。
短いDNAプローブ（25マー）は、さらなる精製を行わ
ずに使用した。一本鎖80マーおよび121マーDNAプローブ
は、それぞれ８％、および５％または８％のポリアクリ
ルアミドゲルを使用する、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により精製した。完全長のDNA生成物を、正しいサ
イズのDNA分子に対応するゲルからDNAバンドを摘出する
ことによって得た。DNA分子を「ELUTRAP」システム（Sc
hleicher and Schuell、Keene、NH）を使用する電気溶
出によりゲル片から回収した。プローブおよびプライマ
ーのいずれも、標準的エタノール沈澱により濃縮した
（Maniatisら）。プローブおよびプライマーDNAの濃度
は、希釈したDNAの260nmでのUV吸収を基に測定した。
ラムダゲノムの二本鎖500および280bp領域（図１）
は、それぞれプライマーPCR01およびPCR02、またはPCR0
3AおよびPCR02、Taqポリメラーゼならびに標準的なDNA
増幅反応条件（Perkin Elmer Cetus;Mullis;Mullisら）
を使用して合成した。増幅産物を、0.7％アガロース（S
igma Type II、Sigma、St.Louis MO）ゲル（500マー）
または４％「NUSIEVE」（FMC Bioproducts、Rockland、
ME）アガロースゲル（280マー）を用いた電気泳動によ
り、DNAプライマーから分離した。上記増幅産物に対応
するバンド中のDNA分子を、電気溶出し、濃縮し、そし
て上記のように、それらの実際の濃度を測定した。
二本鎖の121マーおよび159マープローブは、酵素Alu
I（New England Biolabs、Beverly MA）を使用する、精
製した280マーの制限消化により得た。上記DNAプローブ
を、ゲル電気泳動で単離し、上記のように電気溶出しそ
して濃縮した。
二本鎖79マープローブは、酵素Hpa IIを使用する、精
製した500マーの制限消化により得た。この消化生成物
を分離し、３％または４％いずれかの「NUSIEVE」（FMC
BioProducts）ゲルもしくは１％アガロースゲルを使用
する電気泳動により、切断されていないDNAから精製し
た。特異的DNAフラグメントを、上記のようにしてゲル
から回収した。
一本鎖または二本鎖DNA分子を、［γ−32P］ATPおよ
びT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Promega、Madison W
I）で、５′末端ラベルした。必要な場合は、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼによるラベリングの前に、上記DNA
分子をアルカリホスファターゼ（Boehringer Mannhei
m、Indianapolis IN）で脱リン酸化した。取り込まれな
かったラベルは、「NENSORB 20」核酸精製カラム（NEN-
DuPont）を使用して除去した。ラベルされたDNA分子
は、滅菌２回蒸留水に対する透析により、さらに精製さ
れ得、引続き凍結乾燥により濃縮され得る。32Pでラベ
ルされた121、159または79マーもまた、32Pで末端ラベ
ルされた280マーまたは500マーの、適切な制限酵素消化
により得た。
実施例２ 野生型RecAおよび変異型RecA 803タンパク質の精製 RecAおよびrecA-803タンパク質を過剰産生株JC12772
およびJC15369（A.J.ClarkおよびM.Madirajuから入手）
から単離した。これらの菌株は、RecAおよびrecA-803コ
ーディング配列を細胞に高コピー数で存在するプラスミ
ド上で含有する。変性条件下での、SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動による、JC12772およびJC15369細胞
抽出物から得た全タンパク質の解析は、38,000ダルトン
のRecAまたはrecA-803タンパク質が、これらの菌株で産
生された主要なタンパク質であることを示した。
RecAおよびrecA-803タンパク質を、粉末で入手したヒ
ドロキシアパタイトカラム（BioRad）と引続くアニオン
交換カラム（「MONO Q］、Pharmacia）を用いる高速タ
ンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）を使用する確
立された手法（Shibataら、1981;Griffithら、1985）の
改変法により精製した。タンパク質の精製を以下のよう
にモニターした： （ｉ）SDS-PAGE（「PHASTGEL」システム、Pharmacia、P
iscat away NJ）による38,000ダルトンのRecAタンパク
質の同定； （ii）［γ−32P］ATPおよび一本鎖DNA（Shibataら、19
81）を使用する、RecA ssDNA依存性ATPアーゼ活性のア
ッセイ。上記反応での生成物を、PEIセルロース薄層ク
ロマトグラフィー（EM Science、NJ）を用いて分離し:P
EIプレートを0.5M LiClおよび0.25Mギ酸の溶剤中で展開
した。生成物をオートラジオグラフィーで検出した。
（iii）DNアーゼ活性のアッセイ。DNアーゼ活性を、Rec
Aタンパク質サンプルを、RecA鎖転移緩衝液（Chengら、
1988）中で、直鎖状化されたφX174およびスーパーコイ
ル環状二本鎖RFの混合物、ならびに環状一本鎖DNAと、3
7℃で、１時間インキュベートすることによりモニター
した。除タンパク質化後のDNAニッキングおよび消化
を、アガロース電気泳動後の臭化エチジウムによるDNA
の可視化および、RecAとインキュベートしたサンプル中
の各DNAタイプの量を、RecAを含まない緩衝液でインキ
ュベートしたそれらと比較することによりモニターし
た。DNアーゼ活性が認められないRecAタンパク質のみを
使用した。
（iv）Chengら（1988）の方法を改変した方法を使用す
る500マーオリゴヌクレオチドプローブを用いるＤルー
プ活性のアッセイ。
最終の「MONO-Q」で精製したRecAおよびrecA-803タン
パク質の銀染色SDS−ポリアクリルアミドゲルのプロフ
ィールは、実質的に他の細胞性ポリペプチドを含まない
各調製物由来の単一の38,000ダルトンのバンドを示し
た。
実施例３ RecAタンパク質コーティング反応 プローブのRecAタンパク質コーティングは、通常、標
準的な１×RecAコーティング反応緩衝液中（10×RecA反
応緩衝液:100mMトリス酢酸（37℃でのpH7.5）、20mM酢
酸マグネシウム、500mM酢酸ナトリウム、10mM DTTおよ
び50％グリセロール）（Chengら、1988）で実施した。
上記プローブの全ては、二本鎖または一本鎖にかかわら
ず、使用前に、95〜100℃で５分間の加熱することによ
り変性し、１分間氷上に置き、そして、０℃で約20秒間
の遠心分離（10,000rpm）するため、Tomy製遠心機に供
した。変性したプローブは、直ちに室温の、ATPγＳを
混合し、必要に応じて希釈した（２回蒸留した水で）Re
cAコーティング反応緩衝液に添加した。
この反応混合物は、代表的に以下の成分を含有する：
（ｉ）2.4mM ATPγS;および（ii）10〜40ng間の二本鎖
プローブ。この混合物に、（ｉ）通常5.2mg/mlのRecAタ
ンパク質（Pharmaciaから購入するか、または上記のよ
うに精製した）を１μｌ、または（ii）等容量のRecA貯
蔵緩衝液（20mM Tris-HCl pH7.5、0.1mM EDTA、1.0mM D
TT、および50％グリセロール）のいずれかを、急速に添
加し混合した。プローブのRecAコーティングの最終反応
容量は、通常約10μｌであった。プローブのRecAコーテ
ィングは、37℃で10分間プローブ−RecA混合物をインキ
ュベートすることにより開始された。
コーティング反応中のRecAタンパク質濃度は、プロー
ブサイズおよび添加したプローブの量に応じて変化させ
た:RecAタンパク質濃度は、代表的には、6.8から51μＭ
の範囲であった。一本鎖DNAプローブを、それらの相補
的プローブ鎖とは無関係に、RecAでコートした場合は、
ATPγＳおよびRecAタンパク質の濃度は、それぞれ二本
鎖プローブで使用した濃度の半分に減らした：すなわ
ち、RecAタンパク質およびATPγＳの濃度比率を、個々
のプローブ鎖の供試濃度に対して一定に維持した。
図３に、DNAバンドシフトアッセイにより測定した、1
21マーおよび159マーDNAプローブに対するRecAタンパク
質の結合を表わす、オートラジオグラムを示す。上記の
ように、熱変性した32Pでラベルされた二本鎖の、121マ
ーおよび159マーDNAプローブをRecAタンパク質と反応さ
せた。最終のRecA-DNA反応混合物は、2.4mMのATPγＳを
含有する。RecAタンパク質またはRecA貯蔵緩衝液を、0.
01μｇの変性した121または159マーDNAプローブのいず
れかを含有する、４種の反応の各々に添加した。各反応
中のRecAの最終濃度は、レーン１および５、２および
６、３および７、または４および８が、それぞれ、０、
0.137、1.37、または13.7μＭである（図３）。全てのR
ecA/DNAプローブコーティング反応を、最終容量が10μ
ｌで実施した。RecA結合は、全ての反応物を37℃、10分
間インキュベートすることにより開始した。各反応での
５μｌアリコートを１×TBE緩衝液中の２％アガロース
ゲルに充填し、そして9.2v/cmで２時間電気泳動した。
φX-174DNA（GIBCO-BRL、Gaithe rsburg MD）のHae III
消化物を、二本鎖DNAのサイズマーカー（Ｍ）として供
した。マーカーDNAは、上記のように、32Pで５′末端ラ
ベルした。上記ゲルを、65℃でBioscyclerオーブン中で
サランラップ上で風乾した。乾燥したゲルを次いでＸ線
フィルムにさらした。
図３から認められるように、DNAプローブの電気泳動
移動度の遅延は、RecA濃度の上昇に伴い増大する。
上記と同一の条件をRecA-803についても使用した。
実施例４ RecAタンパク質を介したマルチプレックスの形成 プローブコーティング反応を実施例３に記載のように
実施した。コーティング反応が完了した後、標的DNAを
各反応に添加した。標的DNAは、上記ラムダウイルスゲ
ノムに由来し、そして制限酵素で切断した場合は、プロ
ーブの配列に相同なDNAフラグメントおよび同様に非相
同なフラグメントを含有した。代表的には0.66〜1.5μ
ｇの標的DNAを１×反応緩衝液中の各反応物に添加し
た。全反応物中のマグネシウムイオン濃度を、0.2M酢酸
マグネシウムのアリコートの添加により、12mMに調整し
た。最終の反応容量は、標的DNAの添加後、通常20μｌ
であった。
RecAで触媒された、相同的なプローブ：標的反応を行
うため、プローブ標的混合物を37℃でインキュベートし
た。60分間のインキュベーションの後、反応物を、37℃
で15〜20分、プロテイナーゼＫ（10mg/ml）で、続い
て、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を最終濃度0.5〜1.
2％（w/v）となるよう添加して、除タンパク質した。ト
ラッキング色素（Maniatisら）の添加後、各反応物のア
リコートを、0.7〜1.0％アガロースゲルのウェルに充填
した。上記ゲルを室温または４℃のいずれかで電気泳動
した。上記ゲルを臭化エチジウムで染色し、そしてUVラ
イトでDNA分子を可視化した。上記ゲルを、赤色フィル
ターおよびPolaroid 667の白黒フィルムを使用して写真
に撮った。
放射性ラベルしたDNAプローブを反応に使用した場合
は、プローブ：標的複合体は、DuPont社製の「CRONEX Q
UANTA III」または「LIGHTENING PLUS」増強スクリーン
のいずれかおよびKodak社製「X-OMAT AR5」フィルムを
使用して、湿潤または乾燥したアガロースゲルのいずれ
かのオートラジオグラフィーにより検出した。シグナル
定量のために、オートラジオグラム上でシグナルを示す
標的DNAのバンドをゲルから切取り、粉砕し、シンチレ
ーションカクテル（「AQUASOL-2」、DuPont-NEN、Bosto
n MA）に懸濁し、そしてPackard 2000 CA Tri-Carb液体
シンチレーションアナライザー中で、放射活性を計測し
た。
二本鎖の280マーおよび500マープローブ（表１）を上
記のように二本鎖の直鎖状標的DNAフラグメント（各プ
ローブ配列を含有する、8370bpのラムダDra I消化フラ
グメント）と反応させた。変性プローブDNA分子は、2.4
mMのATPγＳおよび34.2μＭのRecAタンパク質存在下
で、RecAタンパク質でコートした。RecAタンパク質でコ
ートされない変性プローブをRecAタンパク質を含まない
以外は同一の反応条件下に添加した。37℃で10分間のイ
ンキュベーション後、制限酵素Dra Iで消化した、0.66
μｇのラムダゲノムDNAを、各プローブ混合物に添加し
た：上記ゲノムDNAを、上記のように、Mg++濃度を調整
した１×反応緩衝液に懸濁した。二本鎖プローブの、相
同な二本鎖標的フラグメントに対する最終マイクロモル
比は、500マーについては10.6:1そして280マーについて
は21.6:1であった。プローブ：標的反応物のインキュベ
ーションは、上記のように実施された。
上記反応物を除タンパク質化し、そして0.7％アガロ
ースゲルに充填した。プローブと標的DNAフラグメント
とを分離するため、上記DNAを電気泳動に供した。図4A
に、これら反応物を含有する上記ゲル中の臭化エチジウ
ムで染色されたDNAの写真を示す。左側の３つの反応物
は、pUC18二本鎖環状DNA標的およびRecAでコートされた
一本鎖69マープローブを使用した、コントロール反応で
ある（これらコントロール基質は、B.Johnston、SRI、M
enlo Park、CAより提供された）。中央のレーンは、1kb
のマーカーDNA（GIBCO-BRL）を含有する。ゲル右側の４
つの反応物が、上記ラムダDra I切断標的DNAである。
このゲルを乾燥し、そして上記のようにＸ線フィルム
にさらした。図4Bに、得られたオートラジオグラムを示
す。RecAでコートされた500マーおよび280マープローブ
いずれも、正しいDra IラムダDNA消化標的フラグメント
特異的にハイブリダイズした。プローブ：標的DNAのホ
モロジーの位置は、8370bp標的フラグメントの３′末端
から少なくとも832bpに存在する。この結果は、除タン
パク質化に安定な、500マーおよび280マーRecA促進DNA
ハイブリダイゼーション生成物の形成を立証している。
これらの安定なDNA複合体の生成には、RecAタンパク質
が必要である。
実施例５ 小さい二本鎖プローブおよび直鎖状二本鎖標的DNA間の
安定な複合体の形成 この実施例で、除タンパク質化に安定な、直鎖状二本
鎖DNAとの複合体を生成するための、小さい二本鎖プロ
ーブの使用を説明する。
以下のハイブリダイゼーション反応は、実施例４に記
載のように実行した。全てのRecAタンパク質コーティン
グ反応の容量は10μｌであった。別に記載がなければ、
各反応とも2.4mMのATPγＳおよび20.5μＭのRecAを含有
した。最終の反応物は、1.3μｇのDra Iで消化されたラ
ムダDNAを含有した。以下の反応条件は、図5Aおよび5B
中のレーンに対応する：レーン１および２は、280マー
プローブのそれぞれRecAタンパク質を有するものと有さ
ないものであり；レーン３は、RecAタンパク質を有する
121マープローブであり；レーン４〜６は、RecAタンパ
ク質を有する79マープローブである。レーン５および６
の反応物は、RecAプローブコーティング反応の間、RecA
タンパク質濃度が、各々8.54および41μＭであった。上
記反応物を除タンパク質化し、0.7％アガロースゲルに
充填した。プローブと標的DNAフラグメントとを分離す
るため、上記ゲルを電気泳動に供した。
図5Aは、上記反応物からのラムダDra I消化標的フラ
グメントを示す、アガロースゲル中の臭化エチジウムで
染色されたDNAの写真を示す。図5Bは、図5Aに示すアガ
ロースゲル中のDNAのオートラジオグラムを示す。図中
の矢印は、使用された上記プローブに相同的な、Dra I
ラムダ標的フラグメントの移動位置を表している。この
結果は、除タンパク質化に安定な複合体が、全てのRecA
でコートされたDNAプローブ:280マー、121マー、および
79マー、を用いて達成され得ることを表している。上記
のように、安定な複合体が、直鎖状二本鎖DNA標的分子
の末端から少なくとも832塩基で形成された。
実施例６ 安定な複合体形成は、二本鎖プローブを必要とする A.二本鎖DNAプローブの必要性 RecAでコートされたDNAプローブを、実施例４に記載
のように、反応（60分）あたり3.0μｇのラムダDra I消
化された標的DNAとのハイブリダイゼーションに使用し
た。二種の化学的に合成された一本鎖DNA121マーを使用
した。この鎖は、相互に相補的であった。一方の鎖をビ
オチンラベルし、他方は、32Pラベルした。
以下の反応番号は、図6Aおよび6B中のレーンに対応す
る。反応１、２、５、６および３、４は、各々2.4mMま
たは4.8mMのATPγＳを含有する。全ての反応で、20ngの
32PラベルされたDNAプローブ鎖および10.4μｇのRecAタ
ンパク質を使用した：各反応は、同一の32P比活性を含
有していた。反応３〜６は、さらに上記ビオチンラベル
された鎖を含有していた。反応３および４では、最初の
10μｌのRecA反応液に両方のDNAプローブを、同時に添
加した。反応５および６については、上記32Pおよびビ
オチンでラベルされたプローブを、各々別々の10μｌ反
応液中でRecAでコートし、次いで各反応混合物の半分
を、一緒にしていないRecAでコートされた相補的なDNA
プローブの添加前に30分間、標的DNAとインキュベート
した。32PでラベルされたDNA鎖は、反応５では最初に、
反応６では、二番目に添加した。
全ての反応物は電気泳動前に、プロテイナーゼＫおよ
びSDSで除タンパク質化した。図6Aは、上記反応物から
のラムダDra I切断標的フラグメントを示す、アガロー
スゲル中の臭化エチジウム染色されたDNAの写真を示
す。上記反応条件を図6Aおよび6B中に要約する。風乾し
た図6Aのゲルのオートラジオグラムを、図6Bに示す。
直鎖状標的DNA上の相同内部の配列で形成された安定
な除タンパク質化された生成物の生成に、二種のDNAプ
ローブ鎖が必要である（レーン３、５、および６とレー
ン２との比較）。RecAタンパク質がまた、生成物形成に
必要である（レーン３、５および６とレーン４との比
較）。
B.二本鎖の安定な生成物のモデル 除タンパク質化された二本鎖のRecAで触媒されたハイ
ブリダイゼーション生成物の可能なモデルを図７に示
す。図７は、短い末端ラベルされたDNAプローブと二本
鎖直鎖状DNA標的とで形成された、安定なダブルＤルー
プマルチプレックスを表している。図示されたこのモデ
ルは、8370bpのDra Iラムグ標的DNA上のハイブリダイゼ
ーションを描写し、ここで、プローブ：標的のホモロジ
ーは、標的の短末端（全ラムダゲノムに関して３′末
端）から少なくとも832の塩基で始まる。上記Dra Iフラ
グメントは、ラムダの塩基93〜8462を含有する。ホモロ
ジーの正確な領域は表１で規定される。一北鎖のRecAタ
ンパク質でコートされたプローブは、除タンパク質化に
安定な、複合体を生じない（上記の図6B参照）。
実施例７ プローブ：標的の捕捉およびDNAの検出 A.ハイブリダイゼーション反応 相補的な121マーDNAプローブ（表１）を別々に化学的
に合成した。この相補的な鎖は、［γ−32P］ATPおよび
ビオチン（それぞれレポーターおよび捕捉部分）を使用
して、別々にラベルした。全てのプローブコーティング
反応混合物は、10μｌの反応あたり、2.4mMのATPγＳ、
20ngの一本鎖プローブ、5.2μｇのRecAタンパク質（5.2
μg/μl;Pharmacia）、または等量のRecA貯蔵緩衝液（R
ecAタンパク質なし）を含有した。ビオチンおよび32Pで
ラベルされた、両方のプローブ（反応１および４）を使
用する実験に対しては、類似のビオチンまたは32Pでラ
ベルされた、プローブコーティング反応の10μｌアリコ
ートを、これら混合物を標的DNA混合物に添加する前
に、一緒に（20μｌとなる）混合した。全ての反応容量
を一定に保つため、ただ一種の一本鎖プローブ鎖（反応
２および３）を用いる反応は、10μｌのプローブ混合
物、10μｌのプローブ反応緩衝液（すなわち、第二鎖の
プローブはない）および20μｌの標的DNA混合物を使用
した。
ラムダ標的DNA混合物を以下のように調製した:1×Rec
A反応緩衝液、0.2Mの貯蔵酢酸Mgの１対10希釈、およびA
pa I消化されたラムダDNA。20マイクロリットルの上記
標的DNA混合物を20μｌの各プローブ反応混合物に添加
した。これら反応物を37℃で60分間インキュベートとし
た。上記40μｌの反応物を除タンパク質化し、二つの等
量のアリコートに分け、その二つのアリコートを0.7％
アガロースゲルの隣接ウェルに充填し、そして電気泳動
により、その成分を分画した（上記のように）。
上記32Pラベル鎖を含有する全ての反応物（１、２お
よび４）の最初の比活性は同一であった。臭化エチジウ
ム染色された各反応の隣接した二重のレーンを図８に示
す。各反応の内容を図８中に要約する。
10.1kbのラムダ標的DNAに対応する、上記ゲル各レー
ンの部分（図８）をゲルから切り取った。各切り取られ
たフラグメントを微量遠心チューブに入れドライアイス
を使用して急速に凍結した。各ゲルフラグメント中に含
まれたDNAは、上記凍結ゲルを折り畳んだパラフィルム
の間で、もはや液体が排出しなくなるまで絞り出すこと
によって回収した。このDNAを含有する液体を次いで注
意深く「EPPENDORF」マイクロピペットで除去した。
B.捕捉／検出アッセイ 同一の標的分子上の二種のプローブ鎖（一方はビオチ
ンラベル、他方は32Pラベル）の存在を、ストレプトア
ビジンでコートされた常磁性ビーズ（Dynal、Oslo、Nor
way）上に、ビオチン含有プローブ：標的ハイブリッド
を捕捉することによりアッセイした。製造業者のビーズ
貯蔵緩衝液は、使用前に除去した。上記ビーズを、１×
RecA反応緩衝液、そして10×RecA反応緩衝液、そして最
後に１×RecA反応緩衝液で洗浄した。DNA捕捉前に、洗
浄されたビーズと等量のアリコートを個々の1.5mlの微
量遠心チューブに添加し、そして上記最後の洗浄緩衝液
を除去した。上記ビーズ混合物を含有する微量遠心チュ
ーブを磁性分離ラック（Promega、Madison WI）中に置
くことにより、全てのビーズ懸濁液から液体を除去し
た。
上記のDNAを含有する反応サンプルを、各々、上記の
洗浄した常磁性ビーズのアリコートを含有する微量遠心
チューブに添加した。上記サンプルを混合し、そして室
温で15分間インキュベートした。ビーズは、時間ととも
に沈降するので、ビオチン：ストレプトアビジンの効果
的な暴露を確実にするため、この混合物をインキュベー
ション中に、数度振とうした。捕捉反応後、すなわち、
ストレプトアビジンとビオチンとの結合後、各反応中の
上記常磁性ビーズを磁石で寄せ集め、そして反応液を除
去した。
各サンプルのビーズは、１×RecA反応緩衝液で３回洗
浄した。32Pでラベルされたプローブ鎖の存在は、液体
シンチレーション計測蛍光剤（fluor）をビーズに添加
し、そして各ビーズ反応により捕捉された、DNAの放射
活性を計測することにより評価した。これらのデータを
表２に示す。
＋ DNA中の放射活性32Pの計測値は、バックグラウンドD
NA計測値（すなわち、ビオチン捕捉プローブなしの反応
２での計測値）である非特異的なビーズ捕捉に対して補
正される。
表２中のパーセンテージは、各捕捉反応の、１×酢酸
反応緩衝液を用いて３回洗浄した後、Dynal社製ストレ
プトアビジンでコートされたビーズに残存する、32Pで
放射ラベルされた１分間あたりDNA計測数から計算し
た。ビオチン捕捉プローブのみ含有する、反応３には、
32PでラベルされたDNAが添加されておらず、ビオチン捕
捉プローブのみを有する：この反応については、放射活
性DNA計測数は全然予測されない。表２の「全予測計測
数」は以下のように測定した。同一の反応を上記のよう
に実施し、そしてアガロースゲル電気泳動により生成物
を分離した。10.1kb標的DNAに対応する、ゲルフラグメ
ントを、ゲルから切り取り、刻み、そして「AQUASOL」
に移した。サンプル中に存在する、32PでラベルされたD
NAの量を液体シンチレーション計測により測定した。
本結果は、二種の相補的で異ってラベルされたプロー
ブを含有する、ハイブリダイゼーション生成物が、スト
レプトアビジンとビオチンラベルされたプローブ鎖との
相互作用を用いて捕捉され得、そして続いて相補的なプ
ローブ鎖中のラベルにより検出し得ることを示してい
る。
安定なプローブ：標的ハイブリッドのこのビーズ捕捉
は、RecAタンパク質により触媒された、相同プローブ：
標的複合体が、実際に、同一二本鎖標的分子上に二種の
相同なプローブ鎖を含有したことを支持する。
実施例８ 標的DNAの変性が不要な、RecA＋で促進されたDNA増幅 RecAタンパク質で促進されたDNA増幅の反応条件は、
本明細書に参照によって、取り込まれた、同時係属で同
時所有の第07/520,321号「核酸ハイブリダイゼーション
および増幅のための方法」、1990年５月７日出願、に記
載されている。
DL801/2およびDL803/4（表１）に対応する二本鎖プロ
ーブ／プライマーのペアを、上記のように変性し、そし
てRecAタンパク質でコートした。DNAプライマーの伸張
が所望の方向にのみ起きることを確実にするため、適切
なプライマーの３′末端を２′,3′−ジデオキシヌクレ
オチドにより終結させ得る。ジデオキシヌクレオチド
は、従来のdNTPsに存在する３′−ヒドロキシル基が欠
けている。ヒドロキシル基の欠如は、ジデオキシヌクレ
オチドおよび後に続く従来のdNTP間のホスホジエステル
結合の形成を防止することにより伸張を阻害する。プラ
イマーへの上記ジデオキシヌクレオチドの添加は、酵素
ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ
（Pharmacia、Piscataway、NH）の使用により達成され
得る。
上記プローブを、次いで上記のように標的DNAと反応
させる。ダブルＤループの２つのセットから成る、上記
反応の生成物を、次いで代表的なDNA増幅反応中で基質
として使用する。上記DNA反応は、200〜750μＭのdNTPs
およびDNAポリメラーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ
の存在しないDNAポリメラーゼＩ、クレノウ、またはT7D
NAポリメラーゼ）が添加された、10mMのトリス−HCl（p
H7.5）、８〜12mMのMgCl2、および50mMのNaClを含有す
る緩衝液中で実行し得る。さらに、特異的な増幅反応生
成物の形成を促進し得る、他の酵素またはタンパク質
（例えば、DNAヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、DNAリガ
ーゼおよび一本鎖結合性タンパク質（SSB））を、上記
反応に添加し得る。上記反応は、必要な間は37℃で進行
させる。完了時に、サンプルは、除タンパク質化（SD
S、プロテイナーゼＫおよび／またはフェノール抽出）
し得、そしてゲル電気泳動により分析し得た。電気泳動
の後、得られた増幅DNAを、ゲル中のDNAの臭化エチジウ
ム染色または標的特異的DNAプローブとのDNAハイブリダ
イゼーションのいずれかにより可視化し得る。あるい
は、増幅DNAプローブをビオチン化し得、そして新たな
合成DNAが適切な手段で捕捉され、次いでレポートさ
れ、前記のように検出され得る。
１〜２ユニットの、エキソヌクレアーゼの存在しない
大腸菌DNAポリメラーゼＩ（U.S.Biochemicals）および7
50μＭの各dNTPの添加により、DNA合成反応を開始す
る。上記反応を、37℃で維持する。
最初のポリメラーゼの添加に続いて、上記反応に、例
えば、クレノウの１ユニットおよび／または追加のdNTP
を、反応の時間経過中特定の間隔で添加し得る。
サンプルを、電気泳動分離のために充填される前に、
プロテイナーゼＫで処理する。電気泳動分離の後、得ら
れた増幅DNAフラグメントを、ゲルの臭化エチジウム染
色または標的特異的プローブとのハイブリダイゼーショ
ンのいずれかにより可視化し得る。
ハイブリダイゼーション分析のために、上記ゲルを標
準プロトコール（Maniatisら）により、ハイブリダイゼ
ーション転移膜（Hybond-N、Amersham）上に転移し得
る。上記DNAをUVで膜に架橋する（Stratolinker、Strat
agene）。上記UVで処理した転移膜を、末端ラベルされ
た（Boehringer Mannheim）プローブPCR03A（表１）で
ハイブリダイズする:PCR03A（ネイティブのラムダゲノ
ムの7351から7390ヌクレオチド）は、上記増幅反応の標
的である、500塩基対のラムダ鋳型の内部DNA配列に対応
する40マーである。上記膜は、オートラジオグラフィー
に供する。
実施例９ ダブルＤループ反応を使用するインサイチューDNA検出 A.プローブ複合体の調製 ビオチン化染色体ＸアルファサテライトDNAプローブ
は、ONCOR（Gaithersburg,MD）から入手される。その代
わりとしては、標準のニックトランスレーション法によ
り、または、ポリメラーゼ連鎖反応（Weierら,1990）に
より、プローブをビオチン化し得る。
無菌のddH2Oで変性の前に所望の濃度に希釈した二本
鎖プローブを、0.5ml容量のミクロ遠心管内で100℃の熱
ブロック中５分間で変性させる。直ちにその管を氷水浴
中に１から２分間置き、次いで“TOMY"ミクロ遠心機を
用いて４−６℃で簡単な遠心分離を行い、そして、再び
管を氷水浴に戻した。変性したDNAプローブをハイブリ
ダイゼーション混合物に添加する約５分前に、上記プロ
ーブが入った管を−20℃のフリーザーの氷中に置く。こ
のプローブハイブリダイゼーション混合物は、広範囲の
濃度で次の成分を含み、そして、記載された順に混合さ
れる:10×RecA反応緩衝液１μｌ［10×RecA反応緩衝液:
100mM酢酸トリス（This acetate）（pH7.5,37℃）、20m
M酢酸マグネシウム、500mM酢酸ナトリウム、10mM DTT、
および50％グリセリン（Chengら,1988）］;16.2mMスト
ック（Pharmacia）由来のATPγS 1.5μｌ［GTPγS,（単
独またはrATP再生系の存在下の）rATP,dATP,ATPγＳとr
ATPとの混合物，あるいはATPγＳとADPとの混合物も、
いくつかの反応中で用い得る］;20mM酢酸マグネシウム
0.75μl;無菌水中の変性されたプローブ4-60ng（また
は、いくつかの反応中ではそれ以上）;0.137mMストック
RecAタンパク質（Pharmaciaから購入した時）1.25μｌ
［他の供給源から入手した時あるいは研究室で調製した
時は、ストックの濃度に従って多様な量（μｌの量）で
加える］。
この混合物を37℃で10分間インキュベートし、次いで
200mM酢酸マグネシウムを反応物あたり0.5μｌ添加す
る。反応成分の最終濃度は以下のとおりである:4.0mMか
ら10mM酢酸トリス、2.0mMから15mM酢酸マグネシウム、2
0.0mMから50mM酢酸ナトリウム、0.4mMから1.0mM DTT、
２％から５％グリセリン、1mMから2.5mM ATPγＳ、0.00
5mMから0.02mM RecAタンパク質。
B. HEp-2固定細胞核の調製 HEp-2細胞は、もとはヒト（男性）咽頭表皮性（epide
rmoid）癌腫組織に由来する。HEp-2は、染色体倍数性可
変細胞系（Chen）である。
これらの細胞を、10％FBS、ピルビン酸ナトリウム、
およびペニシリン／ストレプトマイシンの混合抗生物質
を補った37℃の標準条件下のDMEM培地（Whittakerまた
はGibco-BRL）に接種した後、24時間培養する。細胞を
低速の遠心分離によってペレット化し、このペレット
を、所望の量の核膨潤が起こるように、37℃の水浴中で
５から15分の間75mM KClで再懸濁し、次いで、3:1の氷
冷メタノール：酢酸の添加および６℃での遠心分離によ
る細胞の固定を行う。
ペレット化した細胞と共に液体1mlが管に残り、さら
に氷冷メタノール：酢酸を加え、管を緩やかに混合する
ことにより細胞を混合し、次いで遠心分離する。繰り返
し、メタノール−酢酸を添加して、細胞質を分解する
（HEp-2および他の細胞タイプは、いくつかの細胞質を
分解しない代わりの方法で固定し得る）。
単離された核の調製は、3:1のメタノール：酢酸中に
〜２×106/mlの濃度に再懸濁することにより固定し、後
の使用のために、−20℃に保たれたきれいなスライドガ
ラス上に10μｌアリコートをピペットで滴下するか、ま
たは、懸濁した核を−20℃に保存する。
C.固定された調製物のハイブリダイゼーション反応 実施例9A由来のプローブ混合物／反応物10μｌを、ス
ライドガラス上の固定された調製物に加える。カバーガ
ラスをハイブリダイゼーション領域の上に置き、ゴム状
（rubber）セメントでシールし、そして反応物を、37℃
のCO2インキュベーター内の湿潤コンテナ内で１−４時
間のインキュベートする。
インキュベートした後、上記ゴム状セメントを手で取
り除き、このスライドをコプリン容器（coplin jar）内
で３回洗浄する。各洗浄は、37℃の水浴中にある２×SS
C（20×SSC:3M NaCl,0.3Mクエン酸ナトリウム,pH7.0
が、これらのアッセイにおける調製物を含む全てのSSC
に用いられている）中で10分間行う。他の洗浄条件も用
いられ得る。
このスライドを、室温（RT）で25分間、前ブロック溶
液［４×SSC,0.1％“TRITON X-100",5％カーネーショ
ン（Carnation）脱脂粉乳,2％標準ヤギ血清（Gibco）,
0.02％アジ化ナトリウム,pH7.0］に置き、次いで前ブロ
ック溶液中の５μg/ml FITC−アビジンDCS、セルソータ
ーグレード（Vector,A-2011）に、室温（RT）で25分間
浸漬する。このスライドを、それぞれ室温（RT）で10分
間、４×SSC、４×SSCおよび0.1％“TRITON X-100"、
４×SSCで続けて洗浄し、次いで２重に蒸留された水で
短時間すすぐ。その後、このスライドを乾燥する。
抗退色溶液［10mlリン酸緩衝生理食塩水中の100mg p
−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（Sigma P151
9）を、0.5M炭酸−重炭酸緩衝液（NaOHでpH9に調整され
た0.42g NaHCO3（10ml ddH2O中））を用いてpH8に調整
し、90mlのグリセロールに添加し、0.22μｍで濾過され
た］を上記スライドに加え、この調製物の上にカバーガ
ラスを置く。ヨウ化プロピジウムまたはDAPI溶液のよう
なカウンター染色を含有する抗退色溶液を、抗退色溶液
単独の代わりに用い得る。
必要に応じて、シグナル増幅を次のようにして行う：
スライドを、カバーガラスおよび抗退色剤を除去するた
めに、RTで5-10分間、４×SSCおよび0.1％“TRITON X-
100"で洗浄し、次いで20分までの間、前ブロック溶液内
でインキュベートする。その後、これらのスライドを、
前ブロック溶液で希釈した５μg/mlの濃度のビオチン化
ヤギ抗アビジン抗体（Vector BA-0300）を用いて37℃で
30分間インキュベートする。このスライドを、それぞれ
RTで10分間、４×SSC、４×SSCおよび0.1％“TRITON X
-100"、４×SSCで続けて洗浄し、次いで、RTで20分間、
前ブロック溶液内に浸漬し、そして、５μg/ml FITC−
アビジンを加えた前ブロック溶液に、RTで20分間浸漬す
る。このスライドを、再び、４×SSCシリーズで洗浄
し、ddH2O中で簡単にすすぎ、そして、このスライド上
に、抗退色溶液またはカウンター染色液を加えた抗退色
溶液をのせる。
特定のシグナルを標準の蛍光顕微鏡観察手段を用いて
検出する。
D.固定された核および細胞全体中の特定の染色体配列の
検出 ハイブリダイゼーション混合物は、記載した順に混合
される:1μl 10×RecA反応緩衝液、1.5μ ATPγＳ（16.
2mMストック,Pharmacia）、0.75μｌ酢酸マグネシウム
（20mMストック）、12μｌ（ddH2O中の変性したプロー
ブを20から60ng含有した実施例8Aのもの）、RecA（0.13
7mMストック,Pharmacia）。この混合物を37℃の水浴中
で10分間インキュベートし、次いで0.5μl 200mM酢酸マ
グネシウムを添加する。
上記のように調製し、固定したHEp-2細胞の核または
細胞全体を、3:1のメタノール：酢酸（または他の適切
な固定化溶液）中、−20℃、約２−３×106/mlの濃度
で、固定した状態で保存する。約１−1.5×106の核の懸
濁した核（または細胞全体）約0.5mlを、0.5または1.5m
lのミクロ遠心管内で、“T0MY"遠心分離機セットを用い
て、３から６回遠心分離を行う。この核または細胞全体
を、階段的に200μｌから1mlの70％、85％、および100
％の氷冷EtOHに再懸濁する。最終の遠心分離および100
％EtOH上澄を除去した後、0.5mlのミクロ遠心管内で、
ペレットを、室温で、200-500μl 1×RecA反応緩衝液で
再懸濁し、そして遠心分離する。
上記完全なプローブ混合物を、このペレットと混合
し、そして、この遠心管を1.5-2.5時間、37℃の水浴中
に保持した。37℃で、２×SSC 250μｌの添加によりイ
ンキュベーションを停止し、次いで遠心分離する。この
ペレットを37℃の２×SSC 250μｌで再懸濁し、そして
５分間、37℃でインキュベートする。次いで遠心分離の
後、このペレットを、室温で20分間、ブロッキング溶液
500μｌで再懸濁し、そして、遠心分離し、20分間、室
温のブロッキング溶液100μｌ中の10ug/ml FITC−アビ
ジンで再懸濁する。この遠心管を、遠心分離し、４×SS
C 250μｌとこのペレットとを混合し、再び遠心分離
し、そして、0.1％“TRITON X-100"を加えた４×SSC 25
0μｌとこのペレットを混合し、そして、再び４×SSC 2
50μｌとともに遠心分離する（これらすべてを室温で行
う）。いくつかの例では、異なる濃度の、および／また
は、異なる洗浄の、成分を用いる。最終の遠心分離の
後、このペレットを抗退色溶液約20μｌと混合する。調
製された核をスライド上に載せ、特定シグナルを標準の
蛍光顕微鏡観察手段を用いて検出する。
実施例10 種々のコファクターを用いるRecA介在 ダブルＤループハイブリダイゼーション反応 この実施例では、RecAタンパク質コーティング反応に
対して異なる多数のコファクターを用いるダブルＤルー
プ複合体の形成を記述する。
ダブルＤループ反応は、１×Ｄループ緩衝液（10×緩
衝液:100mM酢酸トリス（pH7.5,37℃）、20mM酢酸マグネ
シウム、500mM酢酸ナトリウム、10mM DTT、50％グリセ
リン（Chengら,1988））の中で、38ngのプローブを用
い、ATPγＳ（Pharmacia）、rATP（Pharmacia）、dATP
（USB）、またはGTPγＳ（Pharmacia）を含有させ、1.2
mMの濃度で行われた。この反応物は、再生系を用いてま
たは用いずに確立され、そして、λ/Apa I標的DNA消化
物（New England Biolabs,Beverly MA）1.2μｇを含有
した。このプローブは、32Pで末端ラベルされたラムダ2
80−マー（表１）（Ausubelら）であった。ラムダ標的
フラグメント（すなわちプローブと相同の配列を含有す
るApa Iフラグメント）は、図16中に矢印で示した小さ
い方の10.1kbフラグメントである。RecAを含有する全て
の反応物中のRecAの最終濃度は、12.3μＭであった。代
表的には、最終酢酸マグネシウム濃度は、それぞれの反
応物（実施例４）につき、約12mMであった。
ダブルＤループ形成反応物は、10mg/mlプロテナーゼ
Ｋおよび0.5％ SDSを用いて、除タンパク質化された。
この除タンパク質化RecA介在ダブルＤループハイブリダ
イゼーション反応物（熱変性された280−マープローブ
および上記のようなコファクターを含有する）を、アガ
ロースゲル上に電気泳動により分離した。このゲルを臭
化エチジウム（Maniatisら）により染色した。このゲル
の写真を、図16に示す。このゲルを乾燥し、Ｘ線フィル
ムに感光させた。
図17は、図16に示した乾燥ゲルのオートラジオグラフ
である。図17中のレーンは、次の反応条件に対応する。
RecAに関して：レーン２はRecAなし；レーン１、３−７
は、＋RecA。コファクターに関して:ATPγＳはレーン１
および2;rATPはレーン３および4;dATPはレーン５および
6;GTPγＳはレーン７。レーン３および５は、ATP再生系
［6mMクレアチンリン酸、10U/mlホスホクレアチンキナ
ーゼ（Sigma,St.Louis MO）、および100mg/ml BSA（Pro
mega,Madison WI）］もまた含有する。全反応条件は上
記の通りであった。
この試料の起点を、図16および図17に示す。図17に示
された結果から見られ得るように、安定なダブルＤルー
プ複合体は、10.1kbラムダ標的フラグメントの位置に対
応するラベルされたバンド（矢印）により示されるよう
に、各コファクターの存在下で形成された。
実施例11 ATPγＳまたはATPγＳおよびrATPの混合物を含有するRe
cA介在ダブルＤループハイブリダイゼーション反応 この実施例では、RecAタンパク質コーティング反応に
対するコファクターとしてATPγＳまたはATPγS/rATPの
混合物を用いるダブルＤループ複合体の形成を記述す
る。
この反応条件は実施例10で記載した通りであった。図
18に、電気泳動により分離した除タンパク質化RecA介在
ダブルＤループハイブリダイゼーション反応物の成分
（熱変性された500−マープローブ（表１）20ngを用い
た）が載った、臭化エチジウム染色アガロースゲルの写
真を示す。このプローブを32Pで末端ラベルした。この
ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに感光させた。
図19に、図18中の乾燥ゲルのオートラジオグラフを示
す。図19中のレーンは、次の反応条件に対応する。レー
ン１、３、および５−−ATPγＳコファクター（1.2m
M）；レーン２、４、および６−−ATPγＳコファクター
とrATPコファクターとの組み合せ（それぞれ、0.73mMお
よび0.5mM）。レーン１、２および３、４−−反応はλ/
Apa I標的DNA消化物（New England Biolabs）の２種の
異なるロットを用いて行った。レーン５および６の反応
はλ/Dra I標的DNA消化物を用いた。全反応物は、標的D
NA混合物1.5μｇを含有した。全反応物中のRecA濃度は
6.85μＭであった。全濃度は、最終容量20μｌを基準に
したものである。全反応条件は上記の通りであった。
この試料の起点を、図18および図19に示す。図19に示
された結果から見られ得るように、安定なダブルＤルー
プ複合体は、10.1kbおよび8.4kbラムダ標的フラグメン
トの位置に対応するラベルされたバンド（矢印）により
示されるように、それぞれのコファクターの存在下で形
成された。
本発明は、特定の方法および具体例に関ぇて記載して
いるが、本発明から逸脱することなく、多様な修飾およ
び改変がなされ得る。
実施例12 均一診断アッセイ A.ラムダDNA標的のラベルリング キャプチャー反応の評価を促進するために、ラムダDN
A（BRL）（５分間65℃で加熱された）を、クレノウ充填
反応を用いて32Pで末端ラベルした。このラベルされた
反応物は、10μl 10×クレノウ緩衝液（50mMトリスHCl
（pH7.5）、5mM MgCl2、10mM β−メルカプトエタノー
ル）、８μl 1.25mM dNTP混合物、５μｌ［α−32P］−
dCTP、18.3μl 0.82μg/μｌラムダDNA、２μl 5U/μｌ
クレノウDNAポリメラーゼ（Pharmacia）および56.7μl
ddH2Oを含有した。37℃で30分間インキュベーションし
た後、この反応物を、1mlシリンジ中のSephadex G-50
（Pharmacia）カラムに通し、ラベルしたDNAを0.3M NaO
Acの存在下でエタノールで沈澱させ、20mMトリスHCl pH
7.5、0.1mM EDTA（TE）に再懸濁させ、そして、再びエ
タノールで沈澱させた。この乾燥したDNAペレットを、4
5μl TE緩衝液に再懸濁させた。このDNA濃度を分光光度
計の260nmにおける吸光度により決定した。
B. DNAプローブ合成およびビオチン化 ラムダゲノムの1000bp領域を、熱サイクルPCRの標準
プロトコルを用いて合成した。反応は、２種の化学的に
合成されたプライマー（PCR02およびPCR01000（配列:
5′GCGGCACGGAGTGGAGCAAGCGTGA 3′、ラムダゲノム上の
塩基6631から6655を含有する））、全４種のdNTP前駆体
およびTag DNAポリメラーゼ（Promega）を用いた。合成
された1000−マーDNA（ラムダ塩基6631から7630を含有
する）を、Sephadex G-50（Pharmacia）カラムを通して
遠心分離し、そして、エタノール沈澱（２×）によりDN
Aを回収した。この1000−マーDNAをTE緩衝液に再懸濁さ
せ、そして、この濃度を260nmのOD測定により決定し、
そしてDNA DipstickTM（Invitrogen）を用いて確認し
た。精製された1000−マーを、BRL,Nick Translation S
ystemを用いて、bio-14-dATP（Gibco-BRL）でラベルし
た。BRLプロトコルをわずかに改変し、推奨された量の
２倍量の酵素混合物を加え、１時間15分間、15-16℃で
インキュベートすることにより、300-500塩基の平均サ
イズの一本鎖DNAプローブが得られた。ニックトランス
レート化プローブを0.3M NaOAcエタノール溶液で沈澱さ
せ、TE中に再懸濁させた後、DNA濃度をDNA Dipstic
TM（Invitrogen）を用いて決定した。
C.プローブのRecA−コート化およびプローブ：標的ハイ
ブリダイゼーション 上記一本鎖のニックトランスレート化プローブを、10
×酢酸反応緩衝液（Chengら、1988）１μｌ、3.24mM AT
PγＳ（Sigma）1.5μｌ、RecA（2.76μg/μｌ）0.6μ
ｌ、無菌ddH2O 4.4μｌ、および熱変性DNAプローブ（15
ng/μｌ）２μｌを含有する反応混合溶液中で、RecAタ
ンパク質を用いてコートした。このDNAプローブを、５
分間100℃で熱変性させ、氷水浴中で急冷し、Tomyミク
ロ遠心分離機を用いて４℃で20秒間液体を集めるために
遠心分離し、その後、これを適切に分割したアリコート
を、他の反応成分を含有する混合物に直ちに加えた。プ
ローブを加えた後のRecAでコーティングされた反応混合
物の総容量は、10μｌであった。このプローブ混合物を
15分間37℃でインキュベートし、次いで10×酢酸反応緩
衝液４μｌ、0.2M Mg(OAc)2 4μｌ、32Pでラベルした全
二重鎖ラムダDNA（280ng/μl;あらかじめ５分間65℃で
加熱した）４μｌ、およびddH2O 28μｌを含有するラム
ダ標的DNA混合物10μｌを加えた。このRecA介在ハイブ
リダイゼーション反応物を60分間37℃でインキュベート
し、そして300mM EDTA（pH8.0）1.3μｌを最終濃度が〜
20mMになるように加えた。次いで、これに、最終塩濃度
が0.5Mとなるように、1M NaClを有する20mMトリス酢酸
緩衝液pH7.5を21μｌ加えた。３つのコントロール反応
物をラムダプローブを含有する上記RecA反応物と共に反
応させた。第１のコントロール反応物は、RecAタンパク
質を含有せず、その代わりにRecA保存緩衝液を等量加え
る以外は、RecA反応物と同様に行った。他の２つのコン
トロール反応物は、ラムダプローブを等量のラベルして
いないニックトランスレート化φX174DNA RFI DNA（NEB
iolabs）と置換する以外は、ラムダプローブを含有する
実験と同様に行った。使用の約５分前、Dynabeads （D
ynal）300mlを20mMトリス酢酸pH7.5、1M NaClで３回洗
浄した。上記ビーズを磁気分離ラック（Promega）内で
収集することにより洗浄緩衝液を除去し、そして、それ
ぞれのハイブリダイゼーション反応物（0.5M NaCl中
の）を、洗浄したビーズのアリコート（100μｌ）に、
ミクロ遠心管の中で加え、このビーズを反応液体中で再
懸濁させるために時おりやさしくこの管を振とうしなが
ら、30分間室温でこのビーズをインキュベートした。捕
捉後、この液体を除去し、このビーズを、100μｌの20m
Mトリス酢酸pH7.5、1M NaClで３回洗浄した。
Packard ScintillationカウンターのSafety-Solve（R
PI Corp.）中でカウントすることにより、ビーズ上のお
よび洗浄液中の放射活性を測定した。これらの実験の結
果を、表３に示す。
表３の説明：ビオチン化（bio-14-dATPでニックトラ
ンスレートした）ラムダDNAプローブ、または非ラベル
化（dATPでニックトランスレートした）φX174 RFIプロ
ーブ、および、32Pでラベルした全ラムダゲノムDNA標的
物を用いた、RecA介在ダブルＤループ反応を実施した。
ニックトランスレーションにより得られた一本鎖プロー
ブは、平均して300-500塩基サイズであり、ラムダDNAプ
ローブは、全てラムダウィルスゲノムの隣接1000bp領域
に相同であった。RecAでコートされたssプローブを、37
℃で１時間、ラムダ標的DNAと反応させ、20mM EDTAおよ
び0.5M NaClで処理し、新しく洗浄されたストレプトア
ビジンでコートされた磁気Dynabeads （Dynal）上でア
フィニティー捕捉を行った。捕捉されなかったDNAを反
応混合物から洗浄により除去した。洗浄後にビーズ上に
残存する32PでラベルしたラムダDNAの％を、シンチレー
ション計測により決定した。RecAタンパク質なしで、お
よび／または、プローブとしてφX174 DNA配列を有する
反応物を、コントロールとした（詳細はテキストおよび
方法を参照）。この結果は、ニックトランスレート化プ
ローブと大きな二本鎖標的DNAとの間に形成されたダブ
ルＤループハイブリッドが特異的に捕捉され、磁気ビー
ズで検出され得ることを示している。
D.シグナル増幅 標的物がラベルされていない時に捕捉された標的DNA
を検出する目的に、および／または、低いコピー数の標
的を検出するためのシグナルを増幅する目的で、付着し
た捕捉されたDNAを有する洗浄されたDynabeads を、１
×T7緩衝液（10×緩衝液:400mMトリスHCl pH7.5、100mM
MgCl2、50mM DTT）で１回洗浄し、そして、ddH2O 31.1
μｌ、10mM dCTP、dGTP、およびdTTPをそれぞれ0.5μ
ｌ、0.53mM bio-14-dATP（BRL）9.4μｌ、および0.8μ
Ｍのポリ（Ａ）プライマー［配列:5′ A15ATACGGCTGAG
GTTTTCAACGGA 3′：ラムダゲノム上の番号8001から8023
の塩基（ポリ（Ａ）テイルなし）を含有する］２μｌを
含有する増幅反応混合物44μｌ中に再懸濁させた。この
プライマー標的DNA混合物を、100℃で５分間加熱し、そ
して、〜10分間で、〜37℃に冷却した。次いで、以下を
添加した;10×T7緩衝液５μｌ、13U/μl T7 Sequenase
Version 2.0（USB）0.5μｌ、および最終容量が50μ
ｌとなる量のddH2O。そして、0.3 M E DTA pH8.0を５μ
ｌ添加して反応を停止させる前に、この反応物を37℃で
１時間インキュベートした。
E.シグナル検出 プライマー合成されたDNAへのbio-14-dATPの取り込み
を、Southern-LightTM（Tropix）化学発光アッセイを用
いて検出した。T7酵素を有するおよび有しない増幅反応
物由来のDNAをTEで適量に希釈し、そして、DNA混合物１
μｌを12.5mM EDTAを有する、200mM NaOH 4μｌに加
え、５から10分間室温でインキュベートし、そして、プ
ラスチックラップ上の乾燥Tropilon-45TMナイロン膜上
に滴下した。DNAのスポットを風乾し、乾燥した膜を3MM
CHR（Whatman）クロマトグラフ紙上に移し、20×SSCを
ナイロン周縁の3MM紙の上に滴下した。DNAドットが濡れ
た時に、“自動”にセットされたStratagene Stratalin
kerを用いて、DNAを膜に架橋した。ナイロン膜を20×SS
Cで充分に濡らし、Southern-LightTM（Tropix）ビオチ
ン化DNA検出手法を、AVIDx−AP（アルカリ性ホスファタ
ーゼ;Tropix）およびAMPPD基質とともに、製造者が推奨
するプロトコールに従って用いた。化学発光を、Camera
Luminometer（Tropix）およびPolaroid 612フィルムを
用いて検出した。T7 Sequenase を有するおよび有しな
い反応物の結果の比較で、ビオチンがDNAに取り込ま
れ、簡単に化学発光アッセイを用いて検出可能であるこ
ととが示された。もし、検出に、間接ラベル検出方法
（すなわち、FITCのような取り込まれたラベルの直接検
出よりむしろ、検出のためにAVIDx-APと反応させたビオ
チンラベル）、および、ビーズ［Dynabeads 、Dynal;
オリゴ（dT）ビーズ、Promega］またはマトリックス
［例えば、オリゴ（dT）セルロース、Stratageneポリ
（Ａ）QuickTM］上で行われる検出工程を用いたなら、
捕捉マトリックスへの検出試薬の非特異性粘着をブロッ
クするために、捕捉マトリックスをいくつかの薬剤とと
もにインキュベートしなければならない（I-Block試薬
混合物（ブロッキング緩衝液:Southern-LightTM（Tropi
x））はこの目的で用いられる）。付着したDNAと共に洗
浄されたビーズ［またはオリゴ（dT）セルロース］を、
ブロッキング緩衝液中で１回洗浄し、次いで10から30分
間ブロッキング緩衝液中でインキュベートし、洗浄およ
びAVIDx-AP（Tropix）の添加を行った。余剰の結合して
いないAVIDx-APを、Tropixプロトコールに従って洗浄す
ることにより除去した。捕捉マトリックスを、基質検出
物に適合する緩衝液を用いて洗浄した（アッセイ緩衝液
（Tropix）が、化学発光による検出のために使用され得
る；あるいは、JBL ScientificのATTOPHOSシステムのよ
うな蛍光による検出のためには、それに適した緩衝液が
使用され得る）。基質を加え、DNA結合APを適切な手法
により検出する。
配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：セナ，エリッサ ピー． カルホウン，コーネリア ジェイ． ザーリング，ディビット エイ． （ii）発明の名称：ダブルＤループ形成の診断応用 （iii）配列数:2 （iv）関連住所 （Ａ）住所人：ロー オフィシズ オブ ピーター デリンジャー （Ｂ）番地：スイート300,ケンブリッジ アベニュー
350 （Ｃ）市：パロ アルト （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:94306 （ｖ）コンピューター読み出し形態 （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC compatible （Ｃ）操作システム:PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース＃1.
0、 バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）優先権主張の出願データ： （Ａ）出願番号:US 07/520,321 （Ｂ）出願日:1990年５月07日 （Ａ）出願番号:US 07/755,462 （Ｂ）出願日:1991年９月04日 （viii）弁護士／代理人情報： （Ａ）氏名：ファビアン，ゲイリー アール． （Ｂ）登録番号:33,875 （Ｃ）照会／記録番号:4255-0001.32 （ix）電話回線情報 （Ａ）電話：（415）324−0880 （Ｂ）テレファックス：（415）324−0960 （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:500塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （iii）ハイポセティカル:NO （vi）起源： （Ａ）生物名:LAMBDA（ラムダ） （viii）ゲノム内での位置： （Ａ）染色体／セグメント名:500塩基対 （Ｂ）染色体上の位置:7131から7630 （Ｃ）単位:bp （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:4塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （iii）ハイポセティカル:NO （vi）起源： （Ｃ）個体・単離クローン名:Dpn Iの切断部位 （xi）配列：配列番号:2: GATC
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ザーリング，デイビッド エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025，メンロ パーク，ローレライ レーン，32

Claims (59)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第１の内部DNA標的配列を含有する、第一
    鎖および第二鎖を有する直鎖状二重鎖DNA分析物を検出
    する診断方法であって、以下の工程を包含する方法： 第一プローブ鎖および第二プローブ鎖を有する、２種の
    DNAプローブのセットを提供する工程であって、該第一
    プローブ鎖および第二プローブ鎖は、（ｉ）第一標的配
    列鎖および第二標的配列鎖に相補的な配列を含有し、そ
    して（ii）ここで、該相補的な配列は、該プローブ鎖間
    で相補的重複部分をさらに含有する； RecAタンパク質コーティング反応において、RecAタンパ
    ク質により該プローブをコートする工程； 該RecAでコートされたプローブを、該プローブ鎖および
    両方の標的鎖を含有するプローブ：標的複合体が生じる
    条件下で、該標的配列を含有する該直鎖状二重鎖DNAと
    結合させる工程であって、該複合体は除タンパク質化に
    安定である；および 該プローブ：標的複合体中の該DNAプローブの存在を検
    出する工程。
  2. 【請求項２】前記DNAプローブがニックトランスレーシ
    ョンにより調製される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記コーティング反応が、ATPγＳ、rAT
    P、dATP、およびGTPγＳからなる群から選択されるコフ
    ァクターを含有する、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記コファクターがrATPであり、前記反応
    がATP再生系の存在あるいは欠如において実施される、
    請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記コファクターが、ATPγＳおよびrATP
    の混合物、または、ATPγＳおよびADPの混合物である、
    請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記コファクターがATPγＳである、請求
    項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記コファクターがdATPである、請求項３
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記RecAタンパク質が、Escherichia coli
    の野生型タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記RecAタンパク質が、Escherichia coli
    のrecA-803タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記プローブ鎖間の相補的重複部分の領
    域が、少なくとも約78塩基対であり、多くとも約500塩
    基対である、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】プローブ鎖が、どちらかの標的鎖に相補
    的でないDNAの末端伸長を含有する、請求項１に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】それぞれのプローブ鎖が末端DNA伸長を
    含有し、該DNA伸長が互いに相補的である、請求項11に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】プローブ鎖が放射性部分を含有する、請
    求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記検出する工程が、前記プローブ：標
    的複合体の除タンパク質化、次いで遊離のプローブから
    の該プローブ：標的複合体の電気泳動分離により達成さ
    れる、請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記第一プローブ鎖が捕捉部分によりラ
    ベルされ、第二プローブ鎖が検出部分によりラベルされ
    る、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記捕捉部分がビオチンであり、前記プ
    ローブ：標的複合体の捕捉がストレプトアビジンを用い
    て達成される、請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記ストレプトアビジンが固体支持体と
    結合する、請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記第二プローブ鎖が、放射性ラベルお
    よびジゴキシゲニンからなる群から選択される検出部分
    を含有する、請求項16に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記検出部分がジゴキシゲニンであり、
    レセプター部分を含有する抗ジゴキシゲニン抗体を用い
    て該ジゴキシゲニンの存在が検出される、請求項18に記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】制限フラグメント長多形性を検出するた
    めに、 前記両方のプローブ鎖を含有する前記プローブ：標的複
    合体を用いて既知の制限部位を保護する工程、および前
    記標的DNAの制限酵素切断から得られるフラグメント化
    パターンを検査する工程をさらに包含する、請求項１に
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記保護が、プローブ：標的複合体の除
    タンパク質化前の制限酵素による消化により達成され
    る、請求項20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記保護が、RecAタンパク質コーティン
    グ反応において前記２種のプローブ鎖をRecAタンパク質
    でコーティングする前に、該両方のプローブ鎖のメチル
    化により達成される、請求項20に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記検出方法が、一方のまたは両方のプ
    ローブ鎖に、標的DNAを切断し得る部分を付着させて、
    前記プローブ：標的複合体を形成し、そして該切断性部
    分により標的DNAの切断が行われる反応条件を作り出す
    ことにより、該標的DNAの切断が達成される、制限フラ
    グメント長多形性分析をさらに包含する、請求項１に記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】前記切断性部分が鉄FeII分子である、請
    求項23に記載の方法。
  25. 【請求項２５】前記切断性部分が、非特異性ホスホジエ
    ステラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼからなる群か
    ら選択される、請求項23に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記検出方法が、前記プローブ：標的複
    合体を形成し、一方のまたは両方のプローブ鎖に標的DN
    Aを切断し得る部分を付着させ、そして該切断性部分に
    より標的DNAの切断が行われる反応条件を作り出すこと
    により、該標的DNAの切断が達成される、制限フラグメ
    ント長多形性分析をさらに包含する、請求項１に記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】前記検出工程が、一方または両方のプロ
    ーブ鎖の３′末端からのDNAポリメラーゼで促進された
    プライマー伸長により達成される、請求項１に記載の方
    法であって、該プライマー伸長が、４種のdNTP全部、お
    よび、検出可能な部分を含有する１種またはそれより多
    いdNTPの存在下でなされる、方法。
  28. 【請求項２８】請求項１に記載の方法であって、 第一プローブ鎖および第二プローブ鎖を有する、第２の
    二重鎖標的配列に相補的な２つのDNAプローブの第２の
    セットを提供する工程をさらに包含する方法であって、
    該第一プローブ鎖が、第２の標的配列の一方の鎖に相補
    的な配列を含有し、該第二プローブ鎖が、第２の標的配
    列の他の鎖に相補的な配列を含有し、（ｉ）該プローブ
    も互いに相補的に重複する領域を有し、そして（ii）該
    第２のプローブのセットが、該第１のプローブのセット
    にハイブリダイズしない、方法。
  29. 【請求項２９】前記DNAプローブがニックトランスレー
    ションにより調製される、請求項28に記載の方法。
  30. 【請求項３０】前記第１のプローブのセットが捕捉部分
    によりラベルされ、第２のプローブのセットが検出部分
    によりラベルされた、請求項28に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記捕捉部分がビオチンまたはジゴキシ
    ゲニンである、請求項30に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記検出部分が、放射性ラベル、ビオチ
    ン、およびジゴキシゲニンからなる群から選択される、
    請求項30に記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記検出工程がさらに、前記プローブ：
    標的複合体をトラップする捕捉系の使用を包含する、請
    求項30に記載の方法。
  34. 【請求項３４】前記捕捉系が一方のプローブのセットの
    ビオチン化を包含し、前記捕捉がストレプトアビジンの
    使用により達成される、請求項33に記載の方法。
  35. 【請求項３５】ストレプトアビジンが固体支持体と結合
    する、請求項34に記載の方法。
  36. 【請求項３６】前記２種のプローブのセットが前記標的
    DNAの内部領域を規定し、それぞれのプローブのセット
    が、前記領域内部の３′末端および該領域外部の３′末
    端を含有する１つの鎖を有する、請求項28に記載の方
    法。
  37. 【請求項３７】前記検出工程が、それぞれのプローブ鎖
    の３′末端からのDNAポリメラーゼで促進されたプライ
    マー伸長により達成される、請求項36に記載の方法であ
    って、該プライマー伸長反応が、４種のdNTP全部、およ
    び、検出可能な部分を含有する１種またはそれより多い
    dNTPの存在下でなされる、方法。
  38. 【請求項３８】前記それぞれのプローブ鎖の外部の３′
    末端が、外部の３′末端からのプライマー伸長が可能で
    はないように阻害される、請求項37に記載の方法。
  39. 【請求項３９】前記プライマー伸長反応が、前記２本の
    標的鎖の熱解離に必要な温度以下でなされ、前記標的配
    列の所望程度の増幅が達成されるまで続けられる、請求
    項38に記載の方法。
  40. 【請求項４０】前記反応工程がDNAポリメラーゼのさら
    なる追加を包含する、請求項39に記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記反応工程がRecAタンパク質でコート
    されたプローブのさらなる追加を包含する、請求項39に
    記載の方法。
  42. 【請求項４２】前記コーティング反応がATPγＳを含
    む、請求項１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】前記DNAプローブがニックトランスレー
    ションにより調製される、請求項42に記載の方法。
  44. 【請求項４４】前記コーティング反応がATPを含有す
    る、請求項１に記載の方法。
  45. 【請求項４５】前記DNAプローブがニックトランスレー
    ションにより調製される、請求項44に記載の方法。
  46. 【請求項４６】第１の内部DNA標的配列を含有する、第
    一鎖および第二鎖を有する直鎖状二重鎖DNA分析物を単
    離する方法であって、該二重鎖DNA分析物が核酸分子の
    混合物中に存在し、以下の工程を包含する方法： 第一プローブ鎖および第二プローブ鎖を有する、２つの
    DNAプローブのセットを提供する工程であって、該第一
    プローブ鎖および第二プローブ鎖は、（ｉ）第一標的配
    列鎖および第二標的配列鎖の相補的配列を含有し、そし
    て（ii）ここで、該相補的な配列は、該プローブ鎖間で
    相補的重複部分をさらに含有する； RecAタンパク質コーティング反応において、RecAタンパ
    ク質により該プローブをコートする工程； 該RecAでコートされたプローブを、該プローブ鎖および
    両方の標的鎖を含有するプローブ：標的複合体が生じる
    条件下で、該標的配列を含有する該直鎖状二重鎖DNAと
    結合させる工程であって、該複合体は除タンパク質化に
    安定である； 該核酸分子の混合物から該プローブ：標的複合体を分離
    する工程；および 該プローブ：標的複合体から、該標的配列を含有する該
    二重鎖DNA分析物を単離する工程。
  47. 【請求項４７】前記DNAプローブがニックトランスレー
    ションにより調製される、請求項46に記載の方法。
  48. 【請求項４８】前記プローブが固体支持体と結合する、
    請求項46に記載の方法。
  49. 【請求項４９】前記プローブが少なくとも１つのビオチ
    ン部分を含有する、請求項46に記載の方法。
  50. 【請求項５０】前記分離工程が、ストレプトアビジンの
    使用により達成される、請求項49に記載の方法。
  51. 【請求項５１】前記ストレプトアビジンが固体支持体と
    結合する、請求項50に記載の方法。
  52. 【請求項５２】前記単離工程が、（ｉ）前記複合体から
    前記標的配列を含有する前記二重鎖DNA分析物を放出さ
    せるに充分な、そして（ii）該標的配列を含有する該二
    重鎖DNA分析物の融解温度より低い温度で、前記プロー
    ブ：標的複合体の熱変性をさらに含有する、請求項46に
    記載の方法。
  53. 【請求項５３】前記二重鎖DNA分析物が一本鎖DNAに変性
    された、請求項52に記載の方法。
  54. 【請求項５４】前記単離工程が、（ｉ）前記複合体から
    前記標的配列を含有する前記二重鎖DNA分析物を放出さ
    せるに充分な、そして（ii）該標的配列を含有する該二
    重鎖DNA分析物の融解温度またはそれ以上の温度で、前
    記プローブ：標的複合体の熱変性をさらに含有する、請
    求項46に記載の方法。
  55. 【請求項５５】第１の内部DNA標的配列を含有する、第
    一鎖および第二鎖を有する直鎖状二重鎖DNA分析物を検
    出する方法であって、該二重鎖DNA分析物が核酸分子の
    混合物中に存在し、請求項46に記載の該直鎖状二重鎖DN
    A分析物を単離する工程であって、該単離工程が、
    （ｉ）前記複合体から前記標的配列を含有する前記二重
    鎖DNA分析物を放出させるに充分な、そして（ii）該標
    的配列を含有する該二重鎖DNA分析物の融解温度または
    それ以上の温度で、前記プローブ：標的複合体の熱変性
    をさらに含有する、工程； 該標的配列に相補的な、５′および３′末端を有する、
    少なくとも１種のDNA合成プライマーを添加する工程で
    あって、該プライマーは前記２種のDNAプローブのどち
    らかにおいて存在する配列を含有しない；を包含し、そ
    して、 該DNA分析物の検出が、該プライマーの３′末端からのD
    NAポリメラーゼで促進されたプライマー伸長により達成
    され、該プライマー伸長が、４種のdNTP全部、および、
    検出可能な部分を含有する少なくとも１種のdNTPの存在
    でなされる、方法。
  56. 【請求項５６】前記DNAプローブがニックトランスレー
    ションにより調製される、請求項55に記載の方法。
  57. 【請求項５７】前記プライマー鎖が、いずれかの標的鎖
    に相補的でないDNAの末端伸長を含有する、請求項55に
    記載の方法。
  58. 【請求項５８】少なくとも１種のDNA合成プライマーが
    捕捉部分を含有する、請求項55に記載の方法。
  59. 【請求項５９】前記検出が、前記捕捉部分および前記検
    出部分を含有する前記プライマー伸長産物の生成をさら
    に包含し、該産物が該捕捉部分を用いて単離される、請
    求項58に記載の方法。
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