JP6479474B2 - 核酸ハイブリダイゼーションプローブ - Google Patents
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Description
本出願は、「NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION PROBES」と題する2011年12月30日出願の米国特許仮出願第61/582,135号の優先権を主張する、Russell et al.への「NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION PROBES」と題する2012年12月27日出願の米国特許仮出願第13/728,975号の35 U.S.C.119の下での優先権を主張するものであり、各々の出願の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
図1Aを参照すると、構造100を有する核酸ハイブリダイゼーションプローブは好ましい実施形態である。構造100は、ハイブリダイゼーションドメインH(101)、アダプターA(102)、リンカーL(103)およびシグナル伝達ドメインS(104)を含む。ハイブリダイゼーションドメインHは、所望標的部位にハイブリダイズする核酸配列である。アダプターAは、ハイブリダイゼーションドメインHの末端に共有結合的に連結されている人工核酸配列である。リンカーLは、伸長DNAポリメラーゼによる伸長を終結させるまたはブロックする働きをする部分である。シグナル伝達ドメインSは、標識を含む、または標識を含む別の核酸にハイブリダイズする核酸配列である。
本明細書で使用される場合、「標識」は、ある部分の固有の化学特性または別の分子と反応するこの部分の能力に基づき、検出可能なシグナルを生成することができる任意の部分を指す。標識の例には、放射性、蛍光または化学発光分子または酵素が含まれる。標識には、ビオチン−アビジン系および抗原−抗体系などの、容易に検出可能な他の分子に対して親和性を有する分子も含まれる。
特定の実施形態では、エレメント101、102、103および104を有する構造100は以下の方法で調製される(図6参照)。エレメント101の配列を含む核酸試料を断片化する。核酸を断片化する当分野で公知の任意の手段を用いることができる。核酸を断片化する好ましい手段には、超音波処理および制限酵素消化が含まれる。超音波処理は核酸を断片化するための最も好ましい手段である。超音波処理手順を核酸試料で実施し、約50ヌクレオチドから約5,000ヌクレオチドの長さを有する核酸フラグメントの群を得る。核酸フラグメントの好ましい長さは、約150ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの範囲にわたる。核酸フラグメントの極めて好ましい長さは、約200ヌクレオチドから約350ヌクレオチドの範囲にわたる。
前述した核酸ハイブリダイゼーションプローブは、核酸ハイブリダイゼーションプローブの使用によって達成されるすべての形態の核酸検出において使用するための汎用性を有する。前記核酸ハイブリダイゼーションプローブは、溶液中のまたは固定化された支持体に結合した核酸配列標的を検出するために使用できる。本発明の組成物および方法が溶液中の核酸配列標的を検出するために使用できる適用の例には、PCR、リアルタイムPCR、定量PCR、PNAクランプ媒介PCRおよびデジタルPCRが含まれる。本発明の組成物および方法が固体支持体に固定化された核酸配列標的を検出するために使用できる適用の例には、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、マイクロアレイ、粒子ベースのアッセイおよびFISHアッセイが含まれる。このような適用は、医療診断、分子医学、法科学、標本および生物目録作成ならびに微生物病原体疫学を含む数多くの分野に適している。核酸ハイブリダイゼーションプローブの有用性の詳細な説明を、FISH適用に関して以下に示す。
核酸オリゴヌクレオチド試薬
この実施例のために使用するオリゴヌクレオチドを表1に示す。
標識された配列番号:1および2の調製
A.配列番号:1および2のアミノ化
配列番号:1および2(1000μM)の個々の40μL水溶液に、アミノ化試薬(水500μL、TFA 300μL、エチレンジアミン174μLおよびNa2S2O3 95mg)160μLを添加した。生じた混合物をボルテックスし、80℃の水浴中に40分間入れて、次いで水中に脱塩した。生成物をイソプロパノールと酢酸ナトリウムで沈殿させ、水100μLに再懸濁して、配列番号:1−AMおよび配列番号:2−AMを得た。配列番号:1−AMおよび配列番号:2−AMの濃度を、260nmでの分光測光法によりそれぞれ9818μg/mLおよび7409μg/mLと決定した。
1M NaOHの2μL容量を、配列番号:1−AMまたは配列番号:2−AMを含む個々の50μL水性試料に添加した。1分後、DMSO/TMEDA/NaCl溶液の混合物(DMSO 50μL、500mMテトラメチルエチレンジアミンおよびpH9.1の2M NaClの混合物50μL)50μLを前記溶液に添加した。それぞれの混合物をボルテックスし、DMSO溶液中の100mM TAMRA(5−(および−6)−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル(Spectrum Orange[SO]としても知られる。)(Life Technologies(商標),Grand Island,NY))3μLを各混合物に添加した。混合物をボルテックスし、60℃のオーブンに75分間入れた。生成物をエタノールと酢酸ナトリウムで沈殿させた。沈殿物を85%エタノールで洗浄し、乾燥して、水に再懸濁し、水に脱塩して、標識されたSO部分を含む配列番号:1−SOおよび配列番号:2−SOの各々500μLを得た。各オリゴヌクレオチドに組み込まれた標識の量を、260nmおよび560nmでの吸光係数データを用いて分光測光法で決定した。標識された配列番号:1−SOは、各オリゴヌクレオチドにつき約7.1色素分子で、341μgの収量を有していた。標識された配列番号:2−SOは、各オリゴヌクレオチドにつき約7.7色素分子で、285μgの収量を有していた。
標識された配列番号:5および6(シグナル伝達物質)の調製
A.配列番号:5および6のアミノ化
水中10mg/mLの配列番号:5または6の20μL容量に、アミノ化試薬(水1.0mL、TFA 600μL、エチレンジアミン348μLおよびNa2S2O3 190mg)の180μL容量を添加した。各々の溶液を65℃の水浴中に30分間入れて、水中に脱塩し、限外ろ過によって120μLの最終容量に濃縮した。配列番号:5−AMおよび配列番号:6−AMの濃度を分光測光法で決定した。配列番号:5−AMおよび配列番号:6−AMの濃度は、それぞれ840μg/mLおよび1329μg/mLであった。
配列番号:5−AMおよび配列番号:6−AMを活性化標識5(6)−SFX(6−(フルオレセイン−5−(および−6)−カルボキサミド)ヘキサン酸スクシンイミジルエステル)(Spectrum Green[SG]としても知られる。)および5(6)−TAMRA,SE(5−(および−6)−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル(Spectrum Orange[SO]としても知られる)(Life Technologies(商標),Grand Island,NY)に結合した。DMSO/TMEDA/NaCl(DMSO 60μL、500mMテトラメチルエチレンジアミンおよびpH9.1の2M NaClの混合物60μL)の30μL容量を、各々の配列番号:5−AMまたは配列番号:6−AMの30μL容量に添加した。各混合物をボルテックスし、DMSO中100mMで活性標識の2μL容量を添加した。混合物を再びボルテックスし、56℃に2時間置いた。標識生成物をエタノール沈殿によって単離し、Sephadex G25クロマトグラフィによって脱塩して、各標識生成物300μLを得た。分光測定は、8−9%の標識組込みまたは195塩基オリゴヌクレオチドにつき約16の発蛍光団を示した。
アダプター含有フラグメントライブラリの調製
BAC(細菌人工染色体)を含む、ヒトゲノムの9p21遺伝子座に対応する212kbpのDNAを有するE.コリ(E.coli)クローンを培養し、当分野で公知の方法によって前記DNAを単離した。
アダプター含有フラグメントライブラリのサイズ選択
アダプターを含有する9p21およびEGFRv3フラグメントライブラリを、適切なDNAサイズマーカーと共に、電気泳動によって3%アガロースゲル上で分離した。臭化エチジウムを使用してゲル中のDNAを視覚化した。120bp、150bp、180bpおよび200bpを中心とするフラグメントサイズに対応するゲル切片をゲルから取り、〜10容量の水中で加熱して、フラグメントを放出させた(「ゲル溶解容量」)。
iSp9結合部分を担持するプライマーによるフラグメントライブラリのDNA増幅
2×PCRマスターミックス(K1071;Fermentas Inc.(Glen Burnie,MD))25μL、配列番号:1および2の各々0.5μMおよび各々のゲル溶解容量3μLを含む水性混合物50μLを調製した。これらの混合物を以下のプログラムでサーモサイクラー上に置いた:(a)95℃、4分、(b)25サイクル(95℃、30秒、60℃、30秒、72℃、120秒)および(c)72℃、5分。DNA増幅後の電気泳動は、予想されたサイズに対応するPCR産物を示した。2つの狭い間隔のバンドが各反応について認められた:1つのバンドは二本鎖産物に対応し、わずかに高い分子量で出現するもう1つのバンドはアダプター末端においてのみ二本鎖の産物に対応した。
選択した9p21およびEGFRv3サイズ画分の分取PCR
2×PCRマスターミックス25μl、2μM最終濃度の各々の配列番号:1−SOおよび配列番号:2−SOならびに実施例6から得た鋳型(1pmole)2μLを含む、個々の100μL水性反応混合物を調製した。反応混合物を以下のサーモサイクリングプログラムでサーモサイクラーセットに入れた:15サイクル(95℃、30秒、60℃、30秒、72℃、3分)。サーモサイクリングの完了後、反応産物を、ポリエチレングリコールを用いた沈殿によって単離し、TE緩衝液に再懸濁して、濃度を分光測光法によって測定した。
間接FISHのための標的化試薬の調製
配列番号:11と12は、リン酸化平滑末端を含む相補対を形成する。配列番号:11と12をアニーリングさせた場合、生じたアダプターadH1を別の平滑末端DNA配列に連結することができる。配列番号:14および15を有するオリゴヌクレオチドは、異なる配列を有する類似のアダプター(adH2)を形成する。配列番号:13および16を有するオリゴヌクレオチドは、5’TET発蛍光団の存在においてのみ配列番号:14および15と異なる。配列番号:13および16はアダプターを作製するために使用できるが、これらのオリゴヌクレオチドは、主として、5’−TET発蛍光団標識を有するPCR産物を生成するための予備PCRにおけるプライマーとしての役割を果たす。5’−TET発蛍光団標識の目的は、増幅産物の生成後の制限消化の進行を観測することである。生じたPCR産物がHinfI制限酵素に暴露されることにより、アダプター中に設計されたHinfl部位が切断され、5’−TET発蛍光団を放出して、増幅産物上にHinfI適合性突出部を生成する。
EGFRv3 DNAを、当分野で公知の手段によってプラスミド供給源から調製した。このDNAを超音波処理し、約100bpから約600bpの範囲にわたるフラグメントを得て、次に製造者の指示に従ってHinfI制限酵素(New England Biolabs Inc.(Ipswich,MA))で処理した。Quick Blunting(商標)キット(New England Biolabs Inc.(Ipswich MA))を使用して、超音波処理したDNAの20μg試料の末端を平滑化した。
9p21 DNAの試料を当分野で公知の手段によって超音波処理し、約80bpから約500bpの範囲にわたるフラグメントの分布を得た。超音波処理した物質の100μg試料をポリエチレングリコールで分画し、より高い分子量の画分(9SH)とより低い分子量の画分(9SL)を得た。これらの画分をTE緩衝液20μLに個別に再懸濁した。濃度を分光測光法で測定した;9SH画分および9SL画分は、それぞれ2975μg/mLおよび815μg/mLの濃度を有していた。電気泳動試験は、9SH画分が120bp−500bpの範囲にわたるサイズクラスを有し、9SL画分が80bp−150bpの範囲にわたるサイズクラスを有することを示した。
2本のチューブの各々の水400μLに、1μLの以下の鋳型の1つを添加した:アダプター含有EGFRv3 DNAフラグメント(EM)またはアダプター含有9p21 DNAフラグメント(9SLA)。配列番号:3(1000μM)の8μL容量をEMチューブに添加した。配列番号:4(1000μM)の8μL容量を9SLAチューブに添加した。2×PCRマスターミックス(Fermentas Inc.(Glen Burnie,MD))の400μL容量を両方のチューブに添加した。試料を25サイクル(95℃、30秒、53℃、30秒、73℃、60秒)のサーモサイクリングプログラムセットによる増幅に供した。10kDaのカットオフ値を有する限外ろ過ユニット(Nanosep(登録商標);Pall Corp.(Ann Arbor,MI))を使用してPCR増幅後の試料を濃縮した。PCR産物を洗浄し、水(200μL)に再懸濁して、等容量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールで抽出した。水相をエタノール沈殿に供し、収集したDNA沈殿物を水(200μL)に再懸濁した。生じた標識プローブ、EGFRv3−b1および9p21−b2を、それぞれ929μg/mLおよび724μg/mLの濃度で得た。
FISHハイブリダイゼーション条件
標的化プローブを当分野で公知の方法によって顕微鏡のスライドガラスに結合したリンパ球中のヒト染色体DNAにハイブリダイズした。典型的な実験では、試薬混合物は、LSI/WCPハイブリダイゼーション緩衝液(Abbott Molecular(Des Plaines,IL))7μLおよび超音波処理したヒト胎盤DNA2000ngを含む水3μL、Cot−1 DNA(Life Technologies(商標)(Grand Island,NY))500ngならびにEGFRv3−b1および9p21−b2の各々100ngから成る。
以下の成分を含むハイブリダイゼーション試薬Aを調製した:超音波処理したヒト胎盤DNA 16μg、Cot−1 DNA(Life Technologies(商標)(Grand Island,NY))4.0μg、CEP7−SG(Abbott Molecular(Des Plaines,IL))0.8μg、水24μL中のEGFRv3−b1および9p21−b2の各々0.8μg、ならびにLSI/WCPハイブリダイゼーション緩衝液(Abbott Molecular(Des Plaines,IL))56μL。
間接FISHのために以下のシグナル伝達試薬を調製した:10%デキストランスルフェート中の10nM 配列番号:5−SOおよび10nM 配列番号:6−SG、1×SSC、0.2%NP40。
生じたハイブリダイゼーションパターンの蛍光顕微鏡検査
スライドガラスをDAPI−IIで処理し、22×50mmスリップで覆って、DAPI、フルオレセイン(緑色)およびTAMRA(橙色)シグナルを同時視覚化できるフィルタを備えた蛍光顕微鏡下で観察した。写真は、CEP7について予想されたのと一致する中期染色体上の予想された緑色シグナルを示した。EGFRについての遺伝子座でのハイブリダイゼーションに一致する小さな橙色シグナルがこれらの1つに直接隣接していた。加えて、9p21遺伝子座でのハイブリダイゼーション(およびこれが通常、隣接して並んだ染色体上に一対のシグナルとして出現すること)と一致する緑色シグナルが中期スプレッド中に存在した。すぐ近くの核は、近接して位置するEGFRについての橙色シグナルに関連したCEP7−SGについての2つのシグナルを示した。9p21遺伝子座へのハイブリダイゼーションに一致する1つの付加的な緑色シグナルだけが部分的画像で認められた。
本発明を、これについての詳細な説明と共に述べたが、前記説明は例示のためであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によって定義されることが理解される。他の態様、利点および変更は以下の特許請求の範囲内である。本発明の様々な実施形態を述べたが、他の実施形態および実行が本発明の範囲内で可能であることは当業者に明らかである。従って、本発明は、付属の特許請求の範囲およびこれらの等価物を考慮すること以外には限定されない。
Claims (109)
- 核酸標的配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、下記の構造(I):
5’−S−L−A−H−3’ (I)
[式中、
Hは、ハイブリダイゼーションドメインであり、
Aは、アダプターであり、
Lは、リンカーであり、および
Sは、シグナル伝達ドメインである。]
からなり、
前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記核酸標的配列に相補性を有する核酸配列を含み、
前記アダプターが、核酸配列を含み、
前記リンカーが、少なくとも1つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分が、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックし、
前記シグナル伝達ドメインが、少なくとも1つの標識を有する核酸からなり、
構造(I)に存在する追加の標識が、前記シグナル伝達ドメインに存在し、
前記少なくとも1つの標識は、蛍光部分、化学発光部分、酵素、酵素に対する基質および抗体に対する抗原からなる群から選択される成員からなる、核酸ハイブリダイゼーションプローブ。 - リンカーが、iSpC3、iSp9およびiSp18から成る群より選択される少なくとも1つの成員またはこれらの組合せを含む、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- リンカーがiSp9またはiSp18を含む、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- リンカーがiSp9を含む、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- シグナル伝達ドメインが複数の標識をさらに含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、3−12ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項5に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、6ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項5に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、別々の光学特性または分光特性を有する2つ以上の標識を含む、請求項5に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 少なくとも1つの標識が蛍光部分または化学発光部分を含む、請求項1〜8のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 少なくとも1つの標識が蛍光部分を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- ハイブリダイゼーションドメインが、反復配列エレメントを欠く核酸配列を含む、請求項1〜10のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- シグナル伝達ドメインが複数の核酸結合ドメインをさらに含み、各々の核酸結合ドメインが、少なくとも1つの付加的な核酸に結合するために利用可能である、請求項1または2に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 請求項1または2に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、少なくとも1つの付加的な核酸が、
別のハイブリダイゼーションドメイン、
別のアダプター、
別のリンカー、および
標識核酸
を含み、
前記別のハイブリダイゼーションドメインが、シグナル伝達ドメイン内の少なくとも1つの核酸配列に相補性を有する核酸配列を含み、
前記別のアダプターが核酸配列を含み、ならびに
前記別のリンカーが少なくとも1つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分が、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックする、
核酸ハイブリダイゼーションプローブ。 - 請求項12に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、少なくとも1つの付加的な核酸が、
別のハイブリダイゼーションドメイン、
別のアダプター、
別のリンカー、および
標識核酸
を含み、
前記別のハイブリダイゼーションドメインが、シグナル伝達ドメイン内の少なくとも1つの核酸配列に相補性を有する核酸配列を含み、
前記別のアダプターが核酸配列を含み、ならびに
前記別のリンカーが少なくとも1つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分が、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックする、
核酸ハイブリダイゼーションプローブ。 - 別のリンカーが、iSpC3、iSp9およびiSp18から成る群より選択される少なくとも1つの成員またはこれらの組合せを含む、請求項14に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 別のリンカーがiSp9またはiSp18を含む、請求項14に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 別のリンカーがiSp9を含む、請求項14に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 標識核酸が、複数の標識を有する核酸を含む、請求項15〜17のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 標識核酸が、複数の標識を有する二本鎖分子を含む、請求項15〜17のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、3−12ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項18または19に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、6ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項18または19に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、別々の光学特性または分光特性を有する2つ以上の標識を含む、請求項18または19に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、放射性部分、蛍光部分、化学発光部分、酵素、酵素に対する基質、抗体に対する抗原、または少なくとも1つのリガンド結合分子に対するリガンドを含む、請求項18または19に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が蛍光部分または化学発光部分を含む、請求項18または19に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が蛍光部分を含む、請求項18または19に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 核酸標的配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、
シグナル伝達ドメイン、リンカー、アダプター、およびハイブリダイゼーションドメインを、5’から3’方向にこの順で含み、
前記ハイブリダイゼーションドメインが核酸標的配列に相補性を有する核酸配列を含み、
前記アダプターが核酸配列を含み、
前記リンカーが少なくとも1つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分が、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックし、ならびに
前記シグナル伝達ドメインが標識核酸を含む、
核酸ハイブリダイゼーションプローブ。 - リンカーが、iSpC3、iSp9およびiSp18から成る群より選択される少なくとも1つの成員またはこれらの組合せを含む、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- リンカーがiSp9またはiSp18を含む、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- リンカーがiSp9を含む、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 標識核酸が、複数の標識を有する核酸を含む、請求項27〜29のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 標識核酸が、複数の標識を有する二本鎖分子を含む、請求項27〜29のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、3−12ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項31に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、6ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項31に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、別々の光学特性または分光特性を有する2つ以上の標識を含む、請求項31〜33のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が、放射性部分、蛍光部分、化学発光部分、酵素、酵素に対する基質、抗体に対する抗原、または少なくとも1つのリガンド結合分子に対するリガンドを含む、請求項31〜34のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が蛍光部分または化学発光部分を含む、請求項31〜34のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 複数の標識が蛍光部分を含む、請求項31〜34のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- ハイブリダイゼーションドメインが、反復配列エレメントを欠く核酸配列を含む、請求項31〜37のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
- 核酸配列標的を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブを調製する方法であって、
前記核酸配列標的を含む核酸を断片化し、二本鎖フラグメントの群を生成する段階;
前記二本鎖フラグメントの群の末端を平滑化し、平滑末端フラグメントの群を生成する段階;
アダプターを含む配列を前記平滑末端フラグメントの群の各成員に連結し、末端アダプター配列を含むフラグメントの群を生成する段階;
任意選択により、ゲル電気泳動によって前記群をサイズ分画し、所望のサイズ範囲に限定された鋳型ライブラリを得る段階;
前記末端アダプター配列を含むフラグメントの群をプライマーによるDNA増幅に供し、5’一本鎖末端を有する二本鎖分子の群を生成する段階;および
前記5’一本鎖末端を有する二本鎖分子の群を変性させ、前記核酸ハイブリダイゼーションプローブを含む群を生成する段階
を含み、前記プライマーが、以下の構造:
5’−S−L−A−3’
[式中、
Sは、シグナル伝達ドメインを含み、前記シグナル伝達ドメインは、蛍光部分、化学発光部分、酵素、酵素に対する基質および抗体に対する抗原からなる群から選択される成員からなる少なくとも1つの標識を有する核酸を含み;
Lは、リンカーを含み、前記リンカーは、少なくとも1つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分は、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックし;ならびに
Aは、前記末端アダプター配列を含むフラグメントの群の各成員の末端の前記アダプター配列に対応する核酸配列であって、およびDNA増幅を用いた前記末端アダプター配列を含むフラグメントの群でのプライマー伸長を許容する適切な鎖極性を有する核酸配列を含む。]
を有する一本鎖分子からなる、調製方法。 - リンカーが、iSpC3、iSp9およびiSp18から成る群より選択される少なくとも1つの成員またはこれらの組合せを含む、請求項39に記載の方法。
- リンカーがiSp9またはiSp18を含む、請求項39に記載の方法。
- リンカーがiSp9を含む、請求項39に記載の方法。
- シグナル伝達ドメインが複数の標識をさらに含む、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の標識が、3−12ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項43に記載の方法。
- 複数の標識が、6ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項43に記載の方法。
- 複数の標識が、別々の光学特性または分光特性を有する2つ以上の標識を含む、請求項43〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 標識が蛍光部分または化学発光部分を含む、請求項44〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 標識が蛍光部分を含む、請求項44〜46のいずれか一項に記載の方法。
- シグナル伝達ドメインが複数の核酸結合ドメインをさらに含み、各々の核酸結合ドメインが、少なくとも1つの付加的な核酸に結合するために利用可能である、請求項39〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸配列標的が、ゲノムDNA、cDNAまたはRNAを含む、請求項39〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸配列標的が、反復配列エレメントを欠く核酸配列を含む、請求項39〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の核酸配列標的を検出する方法であって、
前記核酸配列標的を含有する前記試料を得る段階;
前記試料を核酸ハイブリダイゼーションプローブと接触させる段階;および
ハイブリダイゼーションシグナルを視覚化する段階
を含み、前記核酸ハイブリダイゼーションプローブが、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される、方法。 - 請求項52に記載の方法であって、
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて核酸標的配列に関してDNA増幅を実施する段階、および
定量PCR、リアルタイムPCR、PNAクランプ媒介PCRまたはデジタルPCRによってハイブリダイゼーションシグナルを視覚化する段階
をさらに含む、方法。 - 核酸配列標的が、反復配列エレメントを欠く核酸配列を含む、請求項52または53に記載の方法。
- 試料を基質上に固定化する段階をさらに含み、基質が、粒子、膜、マイクロアレイ基質またはFISHアッセイ基質を含む、請求項52〜54のいずれか一項に記載の方法。
- 癌細胞の存在に関して試料をスクリーニングする方法であって、
染色体プローブのセットを、複数の細胞を含有する試料にハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、1つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階;および
前記試料中の前記複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記試料中の癌細胞の存在を示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも1つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記染色体プローブのセットが、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、方法。 - 癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜(子宮)癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項56に記載の方法。
- 試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項56または57に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項56〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項56〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項56〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項61に記載の方法。
- 試料が組織試料を含む、請求項56〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な1つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項56〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子座が、EGFRv3、CDKN2A/p16(9p21)およびp53(17p13.1)から成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、請求項64に記載の方法。
- 患者における癌の状態を予測および観測する方法であって、
患者から得られた複数の細胞を含有する試料に、染色体プローブのセットをハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、1つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階;および
前記試料中の複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記試料中の癌細胞の存在を示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも1つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記試料中の癌細胞の割合の増加が前記患者における癌の進行または再発を示し、
前記試料中の癌細胞の減少が前記患者における癌の減少または寛解を示し、
前記染色体プローブのセットが、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、方法。 - 癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜(子宮)癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項66に記載の方法。
- 試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項66または67に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項66〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項66〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項66〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項71に記載の方法。
- 試料が組織試料を含む、請求項66〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な1つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項66〜73のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子座が、EGFRv3、CDKN2A/p16(9p21)およびp53(17p13.1)から成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、請求項74に記載の方法。
- 患者において癌を治療するための抗癌治療薬の有効性を観測する方法であって、
前記抗癌治療薬により治療する前と、治療した後に患者から得られた複数の細胞を含有する試料に染色体プローブのセットをハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、1つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階;および
前記試料中の前記複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記試料中の癌細胞の存在を示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも1つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記患者を前記抗癌治療薬で治療する前の前記試料中の癌細胞の割合と比較して、前記患者を前記抗癌治療薬で治療した後の前記試料中の癌細胞の割合の増加が、前記抗癌治療薬が無効であることを示し、
前記患者を前記抗癌治療薬で治療する前の前記試料中の癌細胞の割合と比較して、前記患者を前記抗癌治療薬で治療した後の前記試料中の癌細胞の割合の減少が、前記抗癌治療薬が有効であることを示し、
前記染色体プローブのセットが、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、方法。 - 癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜(子宮)癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項76に記載の方法。
- 試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項76または77に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項76〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項76〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項76〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項81に記載の方法。
- 試料が組織試料を含む、請求項76〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な1つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項76〜83のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子座が、EGFRv3、CDKN2A/p16(9p21)およびp53(17p13.1)から成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、請求項84に記載の方法。
- 患者における癌の存在に関して診断を補助する方法であって、
患者から得られた複数の細胞を含有する試料に、染色体プローブのセットをハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、1つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階;および
前記試料中の前記複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記患者に癌が存在することを示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも1つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記染色体プローブのセットが、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、方法。 - 癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜(子宮)癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項86に記載の方法。
- 試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項86または87に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項86〜88のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項86〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項86〜90のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項91に記載の方法。
- 試料が組織試料を含む、請求項86〜92のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な1つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項86〜93のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子座が、EGFRv3、CDKN2A/p16(9p21)およびp53(17p13.1)から成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、請求項94に記載の方法。
- 癌を有することが疑われる患者の予後の情報を提供する方法であって、
患者から得られた複数の細胞を含有する試料に、染色体プローブのセットをハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、1つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階;および
前記試料中の前記複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記患者の予後不良を示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも1つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記染色体プローブのセットは、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、方法。 - 癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜(子宮)癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項96に記載の方法。
- 試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項96または97に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項96〜98のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項96〜99のいずれか一項に記載の方法。
- 試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項96〜99のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項101に記載の方法。
- 試料が組織試料を含む、請求項96〜102のいずれか一項に記載の方法。
- 染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な1つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項96〜103のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子座が、EGFRv3、CDKN2A/p16(9p21)およびp53(17p13.1)から成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、請求項104に記載の方法。
- 染色体プローブのセットならびに、場合により、スライドガラス、リン酸緩衝生理食塩水、ハイブリダイゼーション緩衝液、4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドールジヒドロクロリド、塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム溶液、固定液、エタノール、非イオン性界面活性剤および変性緩衝液から成る群より選択される1つ以上の試薬で構成されるキットであって、
前記染色体プローブのセットが、請求項1に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項26に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも1つの成員を含み、
前記プローブが、各プローブが生物学的試料へのハイブリダイゼーション後に明瞭に視覚化され得るように標識されている、キット。 - 染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な1つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項106に記載のキット。
- 遺伝子座が、EGFRv3、CDKN2A/p16(9p21)およびp53(17p13.1)から成る群より選択される少なくとも1つの成員を含む、請求項107に記載のキット。
- 染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項106〜108のいずれか一項に記載のキット。
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