JP2002512810A - ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のメチル化のアッセイ - Google Patents
ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のメチル化のアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内での部位でのシトシンの異常なメチル化により特徴づけられる疾患又は病状のための診断又は予後のアッセイが開示されている。アッセイは、（i）上記被験者よりDNAを単離すること、及び（ii）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内での部位での異常なシトシンメチル化の存在を決定すること（例えば選択的ＰＣＲ増幅により）。
Description
【０００１】
本発明は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び
／又はその調節フランキング配列内での部位でのシトシンの異常なメチル化によ
り特徴づけられる疾患又は病状の診断又は予後のアッセイに関する。１つの特定
の適用において、本発明は前立腺ガンの診断又は予後のアッセイを提供する。
／又はその調節フランキング配列内での部位でのシトシンの異常なメチル化によ
り特徴づけられる疾患又は病状の診断又は予後のアッセイに関する。１つの特定
の適用において、本発明は前立腺ガンの診断又は予後のアッセイを提供する。
【０００２】
哺乳動物ゲノムにおけるＤＮＡメチル化 高等動物及び植物ゲノムにおけるＤＮＡの合成後修飾のうちただ１つ確立され
たものは、シトシンの５‘位置のメチル化である。メチル化されるシトシンの割
合は、ある動物のゲノムの数パーセント（１）からある植物のゲノムの３０％（
２）まで変化し得る。このメチル化の多くは、各鎖に対称的に位置するシトシン
がメチル化される、ＣｐＧ部位に見出される。植物のゲノムにおいて、同様の、
ＣｐＮｐＧ（Ｎはいかなる塩基でも良い）でのシトシンの対称的メチル化もまた
共通である（３）。メチル化のそのような部位も、哺乳動物ＤＮＡ（４）におい
て低い頻度で同定されている。
たものは、シトシンの５‘位置のメチル化である。メチル化されるシトシンの割
合は、ある動物のゲノムの数パーセント（１）からある植物のゲノムの３０％（
２）まで変化し得る。このメチル化の多くは、各鎖に対称的に位置するシトシン
がメチル化される、ＣｐＧ部位に見出される。植物のゲノムにおいて、同様の、
ＣｐＮｐＧ（Ｎはいかなる塩基でも良い）でのシトシンの対称的メチル化もまた
共通である（３）。メチル化のそのような部位も、哺乳動物ＤＮＡ（４）におい
て低い頻度で同定されている。
【０００３】 メチラーゼ酵素が、基質として、一方の鎖でＣｐＧジヌクレオチドがメチル化
されているが、他方の鎖の対応するＣが非メチル化である部位を認識し、それの
メチル化をすすめるので、メチル化のパターンは、遺伝性である（５，６）。十
分に非メチル化である部位は、通常、酵素の基質として作用せず、それに続く細
胞分裂の間、非メチル化のまま残る。こうしてエラー又は特異的に介入する出来
事なしに、メチラーゼ酵素はメチル化パターンの安定な遺伝性を可能にする。
されているが、他方の鎖の対応するＣが非メチル化である部位を認識し、それの
メチル化をすすめるので、メチル化のパターンは、遺伝性である（５，６）。十
分に非メチル化である部位は、通常、酵素の基質として作用せず、それに続く細
胞分裂の間、非メチル化のまま残る。こうしてエラー又は特異的に介入する出来
事なしに、メチラーゼ酵素はメチル化パターンの安定な遺伝性を可能にする。
【０００４】 脊椎動物の遺伝子発現の詳細な研究により、遺伝子の制御領域のメチル化とそ
の発現欠損との強い相関性が示されてきた（７）。そのような研究の多くは、標
的の部位がメチル化されるときに切断できない酵素を用いて制限酵素部位の限定
された数だけを調べている。ゲノム配列方法を用いて、すべてのシトシン塩基に
おいて、より限定された数が調べられている（８，９）。
の発現欠損との強い相関性が示されてきた（７）。そのような研究の多くは、標
的の部位がメチル化されるときに切断できない酵素を用いて制限酵素部位の限定
された数だけを調べている。ゲノム配列方法を用いて、すべてのシトシン塩基に
おいて、より限定された数が調べられている（８，９）。
【０００５】 ＤＮＡの重亜硫酸転換 高濃度重亜硫酸による一本鎖ＤＮＡの処理と、その後のアルカリによる処理は
、シトシンの選択的な脱アミノ化をおこし、それがウラシルに変換される（１０
，１１）。これと対照的に、５−メチルシトシン（５ｍｅＣ）は、この化学的脱
アミノ化に対して耐性である。重亜硫酸処理ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼにより
複製するときに、ウラシルは、チミンであるように読まれ、アデニンヌクレオチ
ドが取り込まれるが、５ｍｅＣはシトシンとして読まれる（Ｇが反対に取り込ま
れる）。こうして、配列の領域がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され
た後、元のＤＮＡでメチル化された配列中のシトシンはシトシンとして読まれる
であろうが、非メチル化シトシンはチミンとして読まれるであろう（１２，１３
）。
、シトシンの選択的な脱アミノ化をおこし、それがウラシルに変換される（１０
，１１）。これと対照的に、５−メチルシトシン（５ｍｅＣ）は、この化学的脱
アミノ化に対して耐性である。重亜硫酸処理ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼにより
複製するときに、ウラシルは、チミンであるように読まれ、アデニンヌクレオチ
ドが取り込まれるが、５ｍｅＣはシトシンとして読まれる（Ｇが反対に取り込ま
れる）。こうして、配列の領域がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され
た後、元のＤＮＡでメチル化された配列中のシトシンはシトシンとして読まれる
であろうが、非メチル化シトシンはチミンとして読まれるであろう（１２，１３
）。
【０００６】 メチル化及び非メチル化ＤＮＡのＰＣＲ増幅 重亜硫酸処理ＤＮＡを増幅させるために、ＤＮＡの重亜硫酸処理の後に生産さ
れる配列にアニールするプライマーを設計した。シトシンはウラシルに転換され
るために、アニールするプライマー中の塩基は、非転換シトシンについては、グ
アニンでなくアデニンとなる。同様に、対の他のプライマーについては、チミン
はシトシンを置換する。標的ＤＮＡ中のメチル化のレベルの定量を可能にするた
めに、プライマーは通常、メチル化されるかもしれない、またはされないかもし
れない部位（特にＣｐＧ部位）、及び重亜硫酸処理の後、５ｍｅＣ又はウラシル
を含むかもしれない部位を避けるように選ばれる。そのような非選択的プライマ
ーの使用は、メチル化及び非メチルＤＮＡの両方が、ＰＣＲで増幅されることを
可能にし、出発ＤＮＡ集団のメチル化のレベルの定量化を提供する。ＰＣＲ増幅
ＤＮＡは、有益な制限酵素で切断することができ、直接配列決定して、いかなる
位置又は分子でも、メチル化の割合の平均決定がクローン化及びは配列決定でき
ること（各クローンは、最初のＤＮＡでの個々の鎖の増幅から発生するものであ
ろう）を提供できる。そのような研究は、分子の集団がメチル化の全体のパター
ンと一致するであろうが、すべての分子が、同一ではないであろうし、メチル化
が、いくつかの部位の分子の画分にのみ見出されるかもしれないことを示してい
る（１３，１６）。
れる配列にアニールするプライマーを設計した。シトシンはウラシルに転換され
るために、アニールするプライマー中の塩基は、非転換シトシンについては、グ
アニンでなくアデニンとなる。同様に、対の他のプライマーについては、チミン
はシトシンを置換する。標的ＤＮＡ中のメチル化のレベルの定量を可能にするた
めに、プライマーは通常、メチル化されるかもしれない、またはされないかもし
れない部位（特にＣｐＧ部位）、及び重亜硫酸処理の後、５ｍｅＣ又はウラシル
を含むかもしれない部位を避けるように選ばれる。そのような非選択的プライマ
ーの使用は、メチル化及び非メチルＤＮＡの両方が、ＰＣＲで増幅されることを
可能にし、出発ＤＮＡ集団のメチル化のレベルの定量化を提供する。ＰＣＲ増幅
ＤＮＡは、有益な制限酵素で切断することができ、直接配列決定して、いかなる
位置又は分子でも、メチル化の割合の平均決定がクローン化及びは配列決定でき
ること（各クローンは、最初のＤＮＡでの個々の鎖の増幅から発生するものであ
ろう）を提供できる。そのような研究は、分子の集団がメチル化の全体のパター
ンと一致するであろうが、すべての分子が、同一ではないであろうし、メチル化
が、いくつかの部位の分子の画分にのみ見出されるかもしれないことを示してい
る（１３，１６）。
【０００７】 メチル化ＤＮＡの選択的増幅 最近、Hermanら（１４）は、メチル化ＤＮＡだけの増幅を選択的にするような
重亜硫酸配列方法の変法を記載している。この研究で、メチル化と非メチル化標
的ＤＮＡの重亜硫酸処理の後生産される配列の間を識別するように設計されたＰ
ＣＲプライマーが用いられた。こうして、ＣｐＧ部位の一部を形成したシトシン
は、重亜硫酸転換されず、メチル化ＤＮＡ中にシトシンとして残るであろうが、
非メチル化標的ＤＮＡではウラシルに転換されるであろう。これらの相違を利用
するプライマーは、４つの腫瘍サプレッサー遺伝子、ｐ１６、ｐ１５、Ｅ−カド
ヘリン、フォン・ヒッペル−リンダウからメチル化ＤＮＡ配列の増幅のために設
計し、用いた。
重亜硫酸配列方法の変法を記載している。この研究で、メチル化と非メチル化標
的ＤＮＡの重亜硫酸処理の後生産される配列の間を識別するように設計されたＰ
ＣＲプライマーが用いられた。こうして、ＣｐＧ部位の一部を形成したシトシン
は、重亜硫酸転換されず、メチル化ＤＮＡ中にシトシンとして残るであろうが、
非メチル化標的ＤＮＡではウラシルに転換されるであろう。これらの相違を利用
するプライマーは、４つの腫瘍サプレッサー遺伝子、ｐ１６、ｐ１５、Ｅ−カド
ヘリン、フォン・ヒッペル−リンダウからメチル化ＤＮＡ配列の増幅のために設
計し、用いた。
【０００８】 前立腺ガンでのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＰｉ遺伝子のメチル化 Leeら（１５）（米国特許第５，５５２，２７７号及び国際特許出願No.PCT/US
95/09050）は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子の
発現が、前立腺ガンのほとんどすべてのケースで失われていることを示した。彼
らはさらに調べた２０のケースで、サザンブロッティングを用いて、この発現欠
損に、遺伝子のプロモーター領域中の特異的制限酵素部位（BssHII）のメチル化
が伴っていたことを示した。このメチル化は、通常の前立腺組織あるいは調べた
多くの他の正常組織では見られなかった。ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子が不活性化されて
いる前立腺ガン細胞系の研究において、彼らは、遺伝子のプロモーター領域の２
つの他の制限酵素部位、NotI及びSacIIでのメチル化の同定もした。細胞系DNAの
酵素MspI及びHpaIIでの消化は、ＤＮＡメチル化と発現欠損との相関性が、転写
開始部位の下流に多くが位置しているこれらの部位で、保持されなかったことを
を示した。このデータの本質は、ここのMspI/HpaII部位のメチル化状態に関する
結論に到達することを困難にしている。しかしながら、Leeら（１８）は、HpaII
消化（これはすべての非メチル化HpaII部位を切断するであろう）の後、１２のH
paII認識部位を含有するＤＮＡの領域が、腫瘍ＤＮＡからＰＣＲにより増幅され
たであろうが、正常前立腺又は白血球ＤＮＡからは増幅されないことを示すこと
ができた。このことは、前立腺ガンのいくつかのＤＮＡ分子が、すべてのこれら
のHpaII部位でメチル化されているが、正常前立腺からのＤＮＡ及び白血球ＤＮ
Ａは、これらの非メチル化された部位が少なくとも１つは含んでいるに違いない
ことを示す（1回の切断がその領域をＰＣＲで増幅しなくするため）。
95/09050）は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子の
発現が、前立腺ガンのほとんどすべてのケースで失われていることを示した。彼
らはさらに調べた２０のケースで、サザンブロッティングを用いて、この発現欠
損に、遺伝子のプロモーター領域中の特異的制限酵素部位（BssHII）のメチル化
が伴っていたことを示した。このメチル化は、通常の前立腺組織あるいは調べた
多くの他の正常組織では見られなかった。ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子が不活性化されて
いる前立腺ガン細胞系の研究において、彼らは、遺伝子のプロモーター領域の２
つの他の制限酵素部位、NotI及びSacIIでのメチル化の同定もした。細胞系DNAの
酵素MspI及びHpaIIでの消化は、ＤＮＡメチル化と発現欠損との相関性が、転写
開始部位の下流に多くが位置しているこれらの部位で、保持されなかったことを
を示した。このデータの本質は、ここのMspI/HpaII部位のメチル化状態に関する
結論に到達することを困難にしている。しかしながら、Leeら（１８）は、HpaII
消化（これはすべての非メチル化HpaII部位を切断するであろう）の後、１２のH
paII認識部位を含有するＤＮＡの領域が、腫瘍ＤＮＡからＰＣＲにより増幅され
たであろうが、正常前立腺又は白血球ＤＮＡからは増幅されないことを示すこと
ができた。このことは、前立腺ガンのいくつかのＤＮＡ分子が、すべてのこれら
のHpaII部位でメチル化されているが、正常前立腺からのＤＮＡ及び白血球ＤＮ
Ａは、これらの非メチル化された部位が少なくとも１つは含んでいるに違いない
ことを示す（1回の切断がその領域をＰＣＲで増幅しなくするため）。
【０００９】
本発明者らは、前立腺ガン組織からのＤＮＡ中に存在するが、正常組織からの
ＤＮＡには存在しない、メチル化部位を検出するための代替法を同定し開発した
。この方法は、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の標的領域の選択的増幅に基づくものである
が、従来の有用な制限酵素での制限を必要としない。
ＤＮＡには存在しない、メチル化部位を検出するための代替法を同定し開発した
。この方法は、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の標的領域の選択的増幅に基づくものである
が、従来の有用な制限酵素での制限を必要としない。
【００１０】
このようにして、第１の態様において、本発明は、被験者の疾患又は病状の、
診断又は予後のアッセイであって、疾患又は病状は、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の部
位におけるシトシンの異常なメチル化により特徴づけられ、上記アッセイは以下
の工程： （i）上記被験者からＤＮＡを単離すること、 （ii） 疾患又は病状に特徴的な、異常なシトシンメチル化がおこる部位を含む
、GST-Pi遺伝子及び／又はその調節フランキング配列の標的となる領域の増幅の
ための反応物と条件に、上記単離されたＤＮＡをさらすこと、ここで増幅は、異
常なシトシンメチル化がおこる上記部位がメチル化されるときに標的領域のみ増
幅させるような選択的なものである、 （iii） 増幅ＤＮＡの存在を決定すること を含むものであるアッセイを提供する。
診断又は予後のアッセイであって、疾患又は病状は、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の部
位におけるシトシンの異常なメチル化により特徴づけられ、上記アッセイは以下
の工程： （i）上記被験者からＤＮＡを単離すること、 （ii） 疾患又は病状に特徴的な、異常なシトシンメチル化がおこる部位を含む
、GST-Pi遺伝子及び／又はその調節フランキング配列の標的となる領域の増幅の
ための反応物と条件に、上記単離されたＤＮＡをさらすこと、ここで増幅は、異
常なシトシンメチル化がおこる上記部位がメチル化されるときに標的領域のみ増
幅させるような選択的なものである、 （iii） 増幅ＤＮＡの存在を決定すること を含むものであるアッセイを提供する。
【００１１】 増幅は、異常なシトシンメチル化（すなわち、アッセイされる疾患又は病状を
もたない被験者からのＤＮＡの対応する部位と比較して）が起こる上記部位がメ
チル化されるとき標的領域の増幅だけするように設計されるので、増幅されるＤ
ＮＡの存在は、そこから単離されるＤＮＡを得た被験者での疾患又は病状を示唆
するものであろう。アッセイはこうして被験者における疾患又は病状の診断又は
予後の手段を提供する。
もたない被験者からのＤＮＡの対応する部位と比較して）が起こる上記部位がメ
チル化されるとき標的領域の増幅だけするように設計されるので、増幅されるＤ
ＮＡの存在は、そこから単離されるＤＮＡを得た被験者での疾患又は病状を示唆
するものであろう。アッセイはこうして被験者における疾患又は病状の診断又は
予後の手段を提供する。
【００１２】 ＤＮＡを単離する工程は、標準のプロトコールに従って、実施することができ
る。ＤＮＡはいかなる適当な体の試料、例えば組織（新鮮又は固定化試料）から
の細胞、血液（血清及び血漿を含む）、精液、尿、リンパ、又は骨髄からの細胞
から単離されることができる。いくつかのタイプの体の試料、特に血液、精液、
尿及びリンパなどの液体試料のためには、最初に試料をある細胞系（例えば、前
立腺細胞）の濃度を富化する工程に供することが好ましいかもしれない。富化の
ための１つの適当な工程は、磁気ビーズへ結合する細胞特異的抗体と磁気細胞分
離装置の使用による、必要な細胞の分離を含むものである。
る。ＤＮＡはいかなる適当な体の試料、例えば組織（新鮮又は固定化試料）から
の細胞、血液（血清及び血漿を含む）、精液、尿、リンパ、又は骨髄からの細胞
から単離されることができる。いくつかのタイプの体の試料、特に血液、精液、
尿及びリンパなどの液体試料のためには、最初に試料をある細胞系（例えば、前
立腺細胞）の濃度を富化する工程に供することが好ましいかもしれない。富化の
ための１つの適当な工程は、磁気ビーズへ結合する細胞特異的抗体と磁気細胞分
離装置の使用による、必要な細胞の分離を含むものである。
【００１３】 増幅工程の前に、非メチル化シトシンが、ウラシル、又はアデニンと塩基対を
形成することができる他のヌクレオチドに転換され、かつメチル化シトシンが変
化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成することができるヌクレオチドに転
換されるように、単離されたＤＮＡを処理することが好ましい。この処理は、異
常なシトシンメチル化が起こる上記部位がメチル化されるときに標的領域の選択
的増幅を可能にするプライマーの設計を可能にする。
形成することができる他のヌクレオチドに転換され、かつメチル化シトシンが変
化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成することができるヌクレオチドに転
換されるように、単離されたＤＮＡを処理することが好ましい。この処理は、異
常なシトシンメチル化が起こる上記部位がメチル化されるときに標的領域の選択
的増幅を可能にするプライマーの設計を可能にする。
【００１４】 好ましくは、単離されたＤＮＡの処理及び増幅の後、非メチル化シトシンが効
率的にウラシル又ははアデニンと塩基対を形成することができる他のヌクレオチ
ドに転換されたこと、及びメチル化シトシンが変化しないかあるいはグアニンと
塩基対を形成することができるヌクレオチドに転換されたことを証明する試験を
実施する。
率的にウラシル又ははアデニンと塩基対を形成することができる他のヌクレオチ
ドに転換されたこと、及びメチル化シトシンが変化しないかあるいはグアニンと
塩基対を形成することができるヌクレオチドに転換されたことを証明する試験を
実施する。
【００１５】 好ましくは、単離されたＤＮＡの処理は、標準的なプロトコールにしたがって
重亜硫酸と単離されたＤＮＡを反応させることを含む。重亜硫酸の上記議論から
明らかになるように、非メチル化シトシンは、ウラシルに転換されるであろうが
、メチル化シトシンは変化しないであろう。非メチル化シトシンがウラシルに転
換され、メチル化シトシンが変化せずに残ったたという証明は （ｉ） 処理され増幅されたＤＮＡのアリコートを、重亜硫酸処理より又は耐性
な生成される制限部位を認識する適当な制限酵素で制限すること、及び （ii）電気泳動により制限断片パターンを評価すること。 あるいは、非メチル化シトシンがウラシルへ転換され、メチル化シトシンが変
化しないまま残ったであろう標的ＤＮＡの領域を標的化した特定のオリゴヌクレ
オチドを用いたディファレンシャル・ハイブリダイゼーションにより、評価を行
なうことができる。
重亜硫酸と単離されたＤＮＡを反応させることを含む。重亜硫酸の上記議論から
明らかになるように、非メチル化シトシンは、ウラシルに転換されるであろうが
、メチル化シトシンは変化しないであろう。非メチル化シトシンがウラシルに転
換され、メチル化シトシンが変化せずに残ったたという証明は （ｉ） 処理され増幅されたＤＮＡのアリコートを、重亜硫酸処理より又は耐性
な生成される制限部位を認識する適当な制限酵素で制限すること、及び （ii）電気泳動により制限断片パターンを評価すること。 あるいは、非メチル化シトシンがウラシルへ転換され、メチル化シトシンが変
化しないまま残ったであろう標的ＤＮＡの領域を標的化した特定のオリゴヌクレ
オチドを用いたディファレンシャル・ハイブリダイゼーションにより、評価を行
なうことができる。
【００１６】 増幅工程は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ鎖反応増幅（２０
）及び他のもの（２１）を含むこともできる。 好ましくは、増幅工程は、ＰＣＲ増幅のための標準的プロトコールに従って行
い、この場合、反応物は、典型的には、適当なプライマー、ｄＮＴＰｓ及び熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼとなるであろうし、条件は、二重鎖の変化する変成、プ
ライマーのアニール（例えば高いストリンジェントな条件下）及びその後のＤＮ
Ａの合成に影響を与える、変化する温度と期間のサイクルとなろう。
）及び他のもの（２１）を含むこともできる。 好ましくは、増幅工程は、ＰＣＲ増幅のための標準的プロトコールに従って行
い、この場合、反応物は、典型的には、適当なプライマー、ｄＮＴＰｓ及び熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼとなるであろうし、条件は、二重鎖の変化する変成、プ
ライマーのアニール（例えば高いストリンジェントな条件下）及びその後のＤＮ
Ａの合成に影響を与える、変化する温度と期間のサイクルとなろう。
【００１７】 重亜硫酸処理ＤＮＡを用いた選択的ＰＣＲ増幅を達成するために、プライマー
と条件は、異常なシトシンメチル化部位を含む標的領域と、異常シトシンメチル
化の部位が存在しない標的領域の間を識別するために用いることができる。こう
して、異常なシトシンメチル化がおこる上記部位がメチル化されるただ１つの標
的領域の増幅のために、重亜硫酸処理ＤＮＡ（すなわち逆方向プライマー）にア
ニールするために用いられたプライマーは、それがメチル化シトシンと塩基対を
形成するであろう部位にグアニンヌクレオチドを含むであろう。そのようなプラ
イマーは、単離されたＤＮＡ中の標的領域が非メチル化シトシンヌクレオチド（
それは重亜硫酸処理によってウラシルに転換されたであろう）を異常シトシンメ
チル化が起こる部位に有するときに、ミスマッチを形成するであろう。対立鎖へ
のアニールのために用いるプライマー（すなわち正方向プライマー）は、重亜硫
酸処理のＤＮＡでのメチル化シトシンの部位に対応するいかなる部位でのシトシ
ンヌクレオチドを含むであろう。
と条件は、異常なシトシンメチル化部位を含む標的領域と、異常シトシンメチル
化の部位が存在しない標的領域の間を識別するために用いることができる。こう
して、異常なシトシンメチル化がおこる上記部位がメチル化されるただ１つの標
的領域の増幅のために、重亜硫酸処理ＤＮＡ（すなわち逆方向プライマー）にア
ニールするために用いられたプライマーは、それがメチル化シトシンと塩基対を
形成するであろう部位にグアニンヌクレオチドを含むであろう。そのようなプラ
イマーは、単離されたＤＮＡ中の標的領域が非メチル化シトシンヌクレオチド（
それは重亜硫酸処理によってウラシルに転換されたであろう）を異常シトシンメ
チル化が起こる部位に有するときに、ミスマッチを形成するであろう。対立鎖へ
のアニールのために用いるプライマー（すなわち正方向プライマー）は、重亜硫
酸処理のＤＮＡでのメチル化シトシンの部位に対応するいかなる部位でのシトシ
ンヌクレオチドを含むであろう。
【００１８】 好ましくは、ＰＣＲ増幅のために用いるプライマーは、１２から３０ヌクレオ
チドの長さで、アッセイされる疾患又は病状を有する被験者のＤＮＡ中に異常に
メチル化された２から４のシトシンヌクレオチドを含む標的領域の内の配列にア
ニールするように設計される。さらに、プライマーは好ましくは、シトシンヌク
レオチド（逆方向プライマー）と、またはグアニンヌクレオチド対立（opposite
）（正方向プライマー）と塩基対を形成するであろう末端のヌクレオチドを含み
、これはアッセイされる疾患又は病状を有する被験者のＤＮＡ中で異常にメチル
化される。
チドの長さで、アッセイされる疾患又は病状を有する被験者のＤＮＡ中に異常に
メチル化された２から４のシトシンヌクレオチドを含む標的領域の内の配列にア
ニールするように設計される。さらに、プライマーは好ましくは、シトシンヌク
レオチド（逆方向プライマー）と、またはグアニンヌクレオチド対立（opposite
）（正方向プライマー）と塩基対を形成するであろう末端のヌクレオチドを含み
、これはアッセイされる疾患又は病状を有する被験者のＤＮＡ中で異常にメチル
化される。
【００１９】 増幅の工程は、GST-Pi遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の標的領
域を増幅するために用いられる。調節フランキング配列は、単独又は他の要素と
の組み合わせで、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の発現を制御する要素を含むＧＳＴ−Ｐｉ
遺伝子のフランキング配列５’及び３’とみなされることができる。好ましくは
、調節フランキング配列は、転写開始部位の５’すぐの４００ヌクレオチド配列
及び転写停止部位の３’すぐの１００ヌクレオチド配列からなる。
域を増幅するために用いられる。調節フランキング配列は、単独又は他の要素と
の組み合わせで、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の発現を制御する要素を含むＧＳＴ−Ｐｉ
遺伝子のフランキング配列５’及び３’とみなされることができる。好ましくは
、調節フランキング配列は、転写開始部位の５’すぐの４００ヌクレオチド配列
及び転写停止部位の３’すぐの１００ヌクレオチド配列からなる。
【００２０】 より好ましくは、増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋５５（ここで、ＣｐＧ
部位の番号付けは転写開始部位に対するものである）により定義される（および
その包括の）GST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列内の標的領域を増幅す
るために用いられる。ＣｐＧの番号付けと位置は図１に示す。
部位の番号付けは転写開始部位に対するものである）により定義される（および
その包括の）GST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列内の標的領域を増幅す
るために用いられる。ＣｐＧの番号付けと位置は図１に示す。
【００２１】 増幅されたＤＮＡを存在を決定する工程は、標準的プロトコールに従って行う
ことができる。１つの便利な方法は、ゲル電気泳動の後の増幅化ＤＮＡに対応す
るバンドの可視化を含む。 好ましくは、アッセイされる疾患又は病状は前立腺ガン、乳ガン、頚部ガン、
及び肝臓ガンから選ばれる。
ことができる。１つの便利な方法は、ゲル電気泳動の後の増幅化ＤＮＡに対応す
るバンドの可視化を含む。 好ましくは、アッセイされる疾患又は病状は前立腺ガン、乳ガン、頚部ガン、
及び肝臓ガンから選ばれる。
【００２２】 前立腺ガンの診断又は予後のために、増幅工程は、好ましくは、ＣｐＧ部位−
４３から＋５５、より好ましくは−４３から＋１０により定義される（およびそ
の包括の）GST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列内の標的領域を増幅する
。しかしながら、これらの標的領域内には、前立腺ガンのメチル化状態における
変動を示すあるいは他の組織でメチル化されるＣｐＧ部位があると考えられる。
したがって、ＣｐＧ部位−４３から＋５５により定義される（およびその包括の
）標的領域のためには、増幅のために用いられるプライマーが、ＣｐＧ部位−３
６、−３２、−２３、−２０、−１４及び多形領域転換部位−３３の影響を最小
化する（すなわち重複するプライマーの使用により又は部位の排除により）よう
に設計されることが好ましい。さらに、前立腺以外の細胞（例えば血液）から単
離されるＤＮＡのために、用いられるプライマーは、ＧｐＧ部位−７から＋７、
より好ましくは−１３から＋８、により定義される（およびその包括の）GST-Pi
遺伝子及びその調節フランキング配列の領域を含まない標的領域を増幅するよう
に設計されることが好ましい。なぜならこれは偽の陽性を導くかもしれないから
である。さらに好ましい標的領域は、したがって、ＧｐＧ部位−４３から−１４
、−４３から−８．＋９から＋５３及び＋１から＋５３により定義される（およ
びその包括の）GST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列の領域内である。
４３から＋５５、より好ましくは−４３から＋１０により定義される（およびそ
の包括の）GST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列内の標的領域を増幅する
。しかしながら、これらの標的領域内には、前立腺ガンのメチル化状態における
変動を示すあるいは他の組織でメチル化されるＣｐＧ部位があると考えられる。
したがって、ＣｐＧ部位−４３から＋５５により定義される（およびその包括の
）標的領域のためには、増幅のために用いられるプライマーが、ＣｐＧ部位−３
６、−３２、−２３、−２０、−１４及び多形領域転換部位−３３の影響を最小
化する（すなわち重複するプライマーの使用により又は部位の排除により）よう
に設計されることが好ましい。さらに、前立腺以外の細胞（例えば血液）から単
離されるＤＮＡのために、用いられるプライマーは、ＧｐＧ部位−７から＋７、
より好ましくは−１３から＋８、により定義される（およびその包括の）GST-Pi
遺伝子及びその調節フランキング配列の領域を含まない標的領域を増幅するよう
に設計されることが好ましい。なぜならこれは偽の陽性を導くかもしれないから
である。さらに好ましい標的領域は、したがって、ＧｐＧ部位−４３から−１４
、−４３から−８．＋９から＋５３及び＋１から＋５３により定義される（およ
びその包括の）GST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列の領域内である。
【００２３】 前立腺ガンの診断又は予後のために適当なプライマー対は、以下の群の各々よ
り選ばれる正方向及び逆方向プライマーからなるプライマー対を含む。
り選ばれる正方向及び逆方向プライマーからなるプライマー対を含む。
【００２４】 正方向プライマー（すなわち標的領域の５’末端とアニールする） [配列１１]
【００２５】 逆方向プライマー（正方向プライマーの延長とアニールする） [配列１２] （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、ＲはＡ，Ｇ，またはそれ
らの混合物である）。
らの混合物である）。
【００２６】 肝臓ガンの診断又は予後のために、増幅工程は、GST-Pi遺伝子及び／又はＣｐ
Ｇ部位−４３から−１４及び／又は＋９から＋５３により定義される（およびそ
の包括の）その調節フランキング配列内の標的領域を増幅する。しかしながら、
これらの標的領域内には、肝臓ガンのメチル化状態における変動を示すあるいは
他の組織でメチル化されるＣｐＧ部位があると考えられる。したがって、ＣｐＧ
部位−４３から−１４により定義される（およびその包括の）標的領域のために
は、増幅のために用いられるプライマーが、ＣｐＧ部位−３６、−３２、−２３
、−２０、−１４及び多形領域転換部位−３３の影響を最小化する（すなわち重
複するプライマーの使用により又は部位の排除により）ように設計されることが
好ましい。
Ｇ部位−４３から−１４及び／又は＋９から＋５３により定義される（およびそ
の包括の）その調節フランキング配列内の標的領域を増幅する。しかしながら、
これらの標的領域内には、肝臓ガンのメチル化状態における変動を示すあるいは
他の組織でメチル化されるＣｐＧ部位があると考えられる。したがって、ＣｐＧ
部位−４３から−１４により定義される（およびその包括の）標的領域のために
は、増幅のために用いられるプライマーが、ＣｐＧ部位−３６、−３２、−２３
、−２０、−１４及び多形領域転換部位−３３の影響を最小化する（すなわち重
複するプライマーの使用により又は部位の排除により）ように設計されることが
好ましい。
【００２７】 当業者によって、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列の
上記同定された標的領域内の異常なシトシンメチル化の部位が、選択的増幅を含
まない方法により疾患又は病状（特に、前立腺ガン及び／又は肝臓ガン）の診断
又は予後の目的のために検出されるであろうことが、理解されるであろう。例え
ば、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド・プローブは、ストリンジェントの
適当な条件下で、シトシンの異常なメチル化を部位を含むＤＮＡにだけ選択的に
ハイブリダイズする重亜硫酸処理ＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション研究（
例えばサザンブロッティング）の使用のために設計することができる。その代わ
りに、適当に選択された有用な制限酵素は、シトシンの異常なメチル化を部位を
含むものと含まないものをＤＮＡと区別する制限断片パターンを生産するために
用いられることができよう。
上記同定された標的領域内の異常なシトシンメチル化の部位が、選択的増幅を含
まない方法により疾患又は病状（特に、前立腺ガン及び／又は肝臓ガン）の診断
又は予後の目的のために検出されるであろうことが、理解されるであろう。例え
ば、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド・プローブは、ストリンジェントの
適当な条件下で、シトシンの異常なメチル化を部位を含むＤＮＡにだけ選択的に
ハイブリダイズする重亜硫酸処理ＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション研究（
例えばサザンブロッティング）の使用のために設計することができる。その代わ
りに、適当に選択された有用な制限酵素は、シトシンの異常なメチル化を部位を
含むものと含まないものをＤＮＡと区別する制限断片パターンを生産するために
用いられることができよう。
【００２８】 こうして、第２の態様では、本発明は、疾患又は病状がグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内
での部位でのシトシンの異常なメチル化により特徴づけられ、以下の工程 （i）上記被験者よりDNAを単離すること （ii） ＣｐＧ部位−４３から＋５５により定義される（およびその包括の）GS
T-Pi遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の部位における異常なシトシ
ンメチル化の存在を決定すること。 を含む、被験者の疾患の又は状態の診断又は予後のアッセイを提供する。
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内
での部位でのシトシンの異常なメチル化により特徴づけられ、以下の工程 （i）上記被験者よりDNAを単離すること （ii） ＣｐＧ部位−４３から＋５５により定義される（およびその包括の）GS
T-Pi遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の部位における異常なシトシ
ンメチル化の存在を決定すること。 を含む、被験者の疾患の又は状態の診断又は予後のアッセイを提供する。
【００２９】 ＤＮＡを単離する工程は第１の態様のアッセイで上述したように実施すること
ができる。 好ましくは、部位でのメチル化シトシンの存在がその内部に決定される、GST-
Pi遺伝子及びその調節フランキング配列が、ＣｐＧ部位−４３から＋５３、−４
３から＋１０、−４３から−１４、＋９から＋５３、＋１から＋５３により定義
される（およびその包括の）領域から選ばれる。しかしながら、これらの領域内
で、アッセイの目的のために、シトシンの異常なメチル化が決定される部位とし
て、ある部位（すなわちＣｐＧ部位、−３６、−３３、−３２、−２３、−２０
、−１７及び−１４）が排除されることが好ましい。
ができる。 好ましくは、部位でのメチル化シトシンの存在がその内部に決定される、GST-
Pi遺伝子及びその調節フランキング配列が、ＣｐＧ部位−４３から＋５３、−４
３から＋１０、−４３から−１４、＋９から＋５３、＋１から＋５３により定義
される（およびその包括の）領域から選ばれる。しかしながら、これらの領域内
で、アッセイの目的のために、シトシンの異常なメチル化が決定される部位とし
て、ある部位（すなわちＣｐＧ部位、−３６、−３３、−３２、−２３、−２０
、−１７及び−１４）が排除されることが好ましい。
【００３０】 決定工程がオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド／ペプチド−核酸（ＰＮＡ
）プローブの選択的ハイブリダイゼーションを含むものであるとき、決定工程の
前に、単離されたＤＮＡは好ましくは非メチル化シトシンがウラシル又はアデニ
ンと塩基対を形成することができる他のヌクレオチド転換され、かつメチル化シ
トシンが変化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成することができるヌクレ
オチドに転換されるように処理される（例えば重亜硫酸で）。この処理は、異常
なシトシンメチル化の部位を含む標的領域の選択的増幅を可能にするプライマー
の設計を可能にする。
）プローブの選択的ハイブリダイゼーションを含むものであるとき、決定工程の
前に、単離されたＤＮＡは好ましくは非メチル化シトシンがウラシル又はアデニ
ンと塩基対を形成することができる他のヌクレオチド転換され、かつメチル化シ
トシンが変化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成することができるヌクレ
オチドに転換されるように処理される（例えば重亜硫酸で）。この処理は、異常
なシトシンメチル化の部位を含む標的領域の選択的増幅を可能にするプライマー
の設計を可能にする。
【００３１】 第３の態様において、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列
を含む本発明はプライマー又はプローブ（５’から３’方向に示された配列）を
提供する：
を含む本発明はプライマー又はプローブ（５’から３’方向に示された配列）を
提供する：
【００３２】 [配列１３] （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、ＲはＡ，Ｇ，またはそれら
の混合物である）。
の混合物である）。
【００３３】 明細書を通して、用いられている「含む」「含んでいる」という用語は、述べ
られた成分、成分の特徴又は工程又は群、さらなる成分を含むときと含まないと
きの特徴又は工程、成分、特徴又は工程の特徴又は工程又は群の含有を指すこと
を意図したものである。
られた成分、成分の特徴又は工程又は群、さらなる成分を含むときと含まないと
きの特徴又は工程、成分、特徴又は工程の特徴又は工程又は群の含有を指すこと
を意図したものである。
【００３４】
本発明は以下図面と以下の非制限的実施例を参照してさらに説明する。 一般的な方法と戦略 （１） ＤＮＡの重亜硫酸処理 アッセイするＤＮＡは、標準プロトコールにより適当な入手源から単離し、周
知の方法により重亜硫酸で処理した。
知の方法により重亜硫酸で処理した。
【００３５】 （２） ＤＮＡ中の個々の部位のメチル化の特徴づけ 標的及び非標的ＤＮＡｓ中の個々のシトシンヌクレオチドのメチル化部位を決
定し、それらの間の差異を同定するために、重亜硫酸修飾ＤＮＡを、特定のＣｐ
Ｇ部位のメチル化状態がプライマーアニーリングとその後の増幅に影響を与える
であろう可能性を最小化するように設計したプライマーを用いたＰＣＲにより増
幅した（１２、１３、１６）。
定し、それらの間の差異を同定するために、重亜硫酸修飾ＤＮＡを、特定のＣｐ
Ｇ部位のメチル化状態がプライマーアニーリングとその後の増幅に影響を与える
であろう可能性を最小化するように設計したプライマーを用いたＰＣＲにより増
幅した（１２、１３、１６）。
【００３６】 （３）選択的プライマーの設計 配列の情報に基づいて、アッセイでの使用のためのプライマーを、特定のＣｐ
Ｇ部位のメチル化状態がプライマーアニーリングとその後の増幅に影響を与える
であろう可能性を最大化するように設計した。特に、従った設計方針（プライマ
ーが、重亜硫酸処理ＤＮＡで起こるであろうものと同じＣからＴ（又はＵ）転換
を含む“正方向”ＰＣＲプライマーについて記載された）は、以下の（ａ）から
（ｄ）である。
Ｇ部位のメチル化状態がプライマーアニーリングとその後の増幅に影響を与える
であろう可能性を最大化するように設計した。特に、従った設計方針（プライマ
ーが、重亜硫酸処理ＤＮＡで起こるであろうものと同じＣからＴ（又はＵ）転換
を含む“正方向”ＰＣＲプライマーについて記載された）は、以下の（ａ）から
（ｄ）である。
【００３７】 （ａ）プライマーは、多くのＣ’ｓを含む配列領域をカバーするべきであること
。非メチル化Ｃ’ｓからＵ’ｓへの転換は、効率的な重亜硫酸転換をうけた分子
と、Ｃ’ｓが反応しなかった分子（例えば完全に溶解していなかったか、あるい
は２次構造の領域を含んでいるため）との間の識別を提供する。
。非メチル化Ｃ’ｓからＵ’ｓへの転換は、効率的な重亜硫酸転換をうけた分子
と、Ｃ’ｓが反応しなかった分子（例えば完全に溶解していなかったか、あるい
は２次構造の領域を含んでいるため）との間の識別を提供する。
【００３８】 （ｂ）領域中に、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２から４のＣ‘’ｓ
が、検出されるＤＮＡ（すなわち標的ＤＮＡ）の高い割合でメチル化されている
ことが知られているＣ’ｓ（一般的にＣｐＧ部位で）であるべきこと。したがっ
て、これらのＣ’ｓは、標的ＤＮＡ中にＣ’のまま残り、非標的ＤＮＡ中ではＵ
’ｓに転換されるであろう。重亜硫酸転換メチル化ＤＮＡと正確に等量であるよ
うに設計されたプライマーは、非メチル化ＤＮＡ中でＵに転換された非メチル化
Ｃの位置の各々でミスマッチを含むであろう。より多くのミスマッチが存在すれ
ば、プライマーのデファレンシャル・ハイブリダイゼーションの安定性が高まり
、そしてＰＣＲの選択的差異が高まるであろう。
が、検出されるＤＮＡ（すなわち標的ＤＮＡ）の高い割合でメチル化されている
ことが知られているＣ’ｓ（一般的にＣｐＧ部位で）であるべきこと。したがっ
て、これらのＣ’ｓは、標的ＤＮＡ中にＣ’のまま残り、非標的ＤＮＡ中ではＵ
’ｓに転換されるであろう。重亜硫酸転換メチル化ＤＮＡと正確に等量であるよ
うに設計されたプライマーは、非メチル化ＤＮＡ中でＵに転換された非メチル化
Ｃの位置の各々でミスマッチを含むであろう。より多くのミスマッチが存在すれ
ば、プライマーのデファレンシャル・ハイブリダイゼーションの安定性が高まり
、そしてＰＣＲの選択的差異が高まるであろう。
【００３９】 （ｃ）プライマーの３’末端塩基は、好ましくは標的ＤＮＡ（通常ＣｐＧジヌク
レオチドの一部）中でメチル化されることが知られているＣに対応するＣである
べきこと。プライマーの末端塩基との正しいペアリングは、Ｃ：Ａミスマッチを
形成するであろう非メチル化バックグラウンド配列と比較して、標的配列の高い
選択的プライミングを提供するであろう。
レオチドの一部）中でメチル化されることが知られているＣに対応するＣである
べきこと。プライマーの末端塩基との正しいペアリングは、Ｃ：Ａミスマッチを
形成するであろう非メチル化バックグラウンド配列と比較して、標的配列の高い
選択的プライミングを提供するであろう。
【００４０】 （ｄ）メチル化標的ＤＮＡの分子の１つの分画だけにメチル化がおこることが知
られている位置において、あるいは標的ＤＮＡｓ間で（例えば異なる腫瘍試料で
）変動することが知られている位置において、標的ＤＮＡからＣ又はＴのいずれ
かの増幅を可能にするために、プライマーに重複が取り込まれることができる。
この同じアプローチは、プライマー領域に多形が存在することが知られている場
合に、用いることができる。 転換鎖にアニールする“逆方向”プライマーとして、転換されたＣ’ｓに対立
する位置で、Ａ’ｓはＧ’ｓを置換する。
られている位置において、あるいは標的ＤＮＡｓ間で（例えば異なる腫瘍試料で
）変動することが知られている位置において、標的ＤＮＡからＣ又はＴのいずれ
かの増幅を可能にするために、プライマーに重複が取り込まれることができる。
この同じアプローチは、プライマー領域に多形が存在することが知られている場
合に、用いることができる。 転換鎖にアニールする“逆方向”プライマーとして、転換されたＣ’ｓに対立
する位置で、Ａ’ｓはＧ’ｓを置換する。
【００４１】 （４） 選択的標的配列増幅の証明 増幅されたＰＣＲバンドは、十分重亜硫酸転換された（すなわち元のＤＮＡ中
でメチル化されていないＣ’ｓがＵ’ｓに転換され、Ｔ’ｓとして増幅された）
ＤＮＡから由来したことを証明するために、及び、増幅されたＤＮＡが特異的標
的ＤＮＡ配列から由来し、期待されたメチル化プロフィールを有している（すな
わちＴ’ｓに転換されていない５ｍｅＣ’ｓ）ことをさらに証明するために、分
析することができる。これらの証明を実施するための方法は以下のものを含む：
でメチル化されていないＣ’ｓがＵ’ｓに転換され、Ｔ’ｓとして増幅された）
ＤＮＡから由来したことを証明するために、及び、増幅されたＤＮＡが特異的標
的ＤＮＡ配列から由来し、期待されたメチル化プロフィールを有している（すな
わちＴ’ｓに転換されていない５ｍｅＣ’ｓ）ことをさらに証明するために、分
析することができる。これらの証明を実施するための方法は以下のものを含む：
【００４２】 （ａ）制限酵素消化を用いる 完全転換を証明するために、特定の制限酵素を用いてＤＮＡを切断することが
できる。配列認識部位は、それがＣ’ｓを含まず、重亜硫酸処理の後には増幅さ
れた鎖の配列に存在するが、その前には存在しないという特性を有するべきであ
る。こうして、ＰＣＲ産物中の、１つ又は好ましくは２つ以上のＣ’ｓからＵ’
ｓへの転換とそれらのＴ’ｓとしての増幅は、新しい制限部位を生成するべきで
ある。有用な酵素は以下の表１でイタリックで示す。
できる。配列認識部位は、それがＣ’ｓを含まず、重亜硫酸処理の後には増幅さ
れた鎖の配列に存在するが、その前には存在しないという特性を有するべきであ
る。こうして、ＰＣＲ産物中の、１つ又は好ましくは２つ以上のＣ’ｓからＵ’
ｓへの転換とそれらのＴ’ｓとしての増幅は、新しい制限部位を生成するべきで
ある。有用な酵素は以下の表１でイタリックで示す。
【００４３】 増幅された標的ＤＮＡ配列が特異的にメチル化されたことを、証明するために
、ＣｐＧジヌクレオチドとしてＣヌクレオチドだけが見出され、配列がメチル化
されたときＣｐＧ’ｓとしてＰＣＲ産物中に残る制限酵素部位を使用することが
できる。そのような酵素の例を以下の表１で太字で示す。非対称配列GAGACGを切
断する、BsmBI、もまた使用することが可能である。
、ＣｐＧジヌクレオチドとしてＣヌクレオチドだけが見出され、配列がメチル化
されたときＣｐＧ’ｓとしてＰＣＲ産物中に残る制限酵素部位を使用することが
できる。そのような酵素の例を以下の表１で太字で示す。非対称配列GAGACGを切
断する、BsmBI、もまた使用することが可能である。
【００４４】 ある例において、認識配列の外側の塩基としてＣを含む酵素は、メチル化の証
明のために用いることができる：例えば、GAATTCG配列のために、EcoRI（GAATTC
）又はGATCG配列のためにSau3AI（GATC）（表１において太字及び下線）。もし
、上記のうちの１つ等の部位が予測されるメチル化、十分重亜硫酸転換されたDN
Aに存在するとき、酵素はＤＮＡを、元のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化され
たときだけ、切断し、ＤＮＡのメチル化領域の増幅を確認するであろう。いくつ
かの酵素（表１で太字及び下線）は、効率的転換及びＣｐＧメチル化の両方のモ
ニターのための使用の可能性を有している。
明のために用いることができる：例えば、GAATTCG配列のために、EcoRI（GAATTC
）又はGATCG配列のためにSau3AI（GATC）（表１において太字及び下線）。もし
、上記のうちの１つ等の部位が予測されるメチル化、十分重亜硫酸転換されたDN
Aに存在するとき、酵素はＤＮＡを、元のＣｐＧジヌクレオチドがメチル化され
たときだけ、切断し、ＤＮＡのメチル化領域の増幅を確認するであろう。いくつ
かの酵素（表１で太字及び下線）は、効率的転換及びＣｐＧメチル化の両方のモ
ニターのための使用の可能性を有している。
【００４５】 （ｂ）特異的オリゴヌクレオチドに対するデファレンシャル・ハイブリダイゼー
ション 特異的オリゴヌクレオチドに対するデファレンシャル・ハイブリダイゼーショ
ンを、増幅されたＤＮＡが重亜硫酸と十分反応し、期待されたメチル化プロフィ
ールを有していることを識別するために用いることができる。完全な転換を示す
ために、増幅配列内に同じ領域に対応するオリゴヌクレオチドの対を調製する。
１つのオリゴヌクレオチドは、重亜硫酸により転換されるべきすべてのＣ’ｓで
Ｔ’ｓを含むが、他方はそれらの位置でＣ’ｓを含む。オリゴヌクレオチドは、
少なくとも２つ又は３つのそのような識別的Ｃ’ｓを含むべきであり、その標的
配列に対する各々の選択的ハイブリダイゼーションを提供する条件は決定される
。ＣｐＧ部位においてＣ又はＴを有し、すべての非ＣｐＧのＣ’ｓを置換するＴ
’ｓを有する同様のオリゴヌクレオチドは、特異的ＣｐＧ部位がメチル化されて
いるかどうかを決定するために用いられることができる。識別的Ｃ’ｓを含まな
い付加的な対照オリゴヌクレオチド、すなわち、Ｃ’ｓがＹ’ｓ（Ｃ及びＴの混
合物）に置換されてＣ’ｓがないか、最小の数であるかのいずれかであるものは
、試料中にＰＣＲ産物の量をモニターするために用いられる。オリゴヌクレオチ
ドは増幅化配列の直接ハイブリダイゼーション検出ために用いることができ、あ
るいは他の検出方法のために標的分子をＰＣＲ−増幅ＤＮＡ集団から選択するた
めに用いることができる。ＤＮＡ配列チップ上のそのようなオリゴヌクレオチド
の列は、配列領域にわたって増幅されたＤＮＡの配列を確立するために用いるこ
とができる。
ション 特異的オリゴヌクレオチドに対するデファレンシャル・ハイブリダイゼーショ
ンを、増幅されたＤＮＡが重亜硫酸と十分反応し、期待されたメチル化プロフィ
ールを有していることを識別するために用いることができる。完全な転換を示す
ために、増幅配列内に同じ領域に対応するオリゴヌクレオチドの対を調製する。
１つのオリゴヌクレオチドは、重亜硫酸により転換されるべきすべてのＣ’ｓで
Ｔ’ｓを含むが、他方はそれらの位置でＣ’ｓを含む。オリゴヌクレオチドは、
少なくとも２つ又は３つのそのような識別的Ｃ’ｓを含むべきであり、その標的
配列に対する各々の選択的ハイブリダイゼーションを提供する条件は決定される
。ＣｐＧ部位においてＣ又はＴを有し、すべての非ＣｐＧのＣ’ｓを置換するＴ
’ｓを有する同様のオリゴヌクレオチドは、特異的ＣｐＧ部位がメチル化されて
いるかどうかを決定するために用いられることができる。識別的Ｃ’ｓを含まな
い付加的な対照オリゴヌクレオチド、すなわち、Ｃ’ｓがＹ’ｓ（Ｃ及びＴの混
合物）に置換されてＣ’ｓがないか、最小の数であるかのいずれかであるものは
、試料中にＰＣＲ産物の量をモニターするために用いられる。オリゴヌクレオチ
ドは増幅化配列の直接ハイブリダイゼーション検出ために用いることができ、あ
るいは他の検出方法のために標的分子をＰＣＲ−増幅ＤＮＡ集団から選択するた
めに用いることができる。ＤＮＡ配列チップ上のそのようなオリゴヌクレオチド
の列は、配列領域にわたって増幅されたＤＮＡの配列を確立するために用いるこ
とができる。
【００４６】 （ｃ）単一ヌクレオチドプライマー延長（ＳＮｕＰＥ） 単一ヌクレオチドプライマー延長の技術は、増幅された配列内に特異的な部位
がＣ又はＴ塩基を含むかどうかを決定するために、ＰＣＲ産物に適用することが
できる。この方法で、対象の位置に隣接するプライマーは、ＰＣＲ産物にアニー
ルされ、ｄＣＴＰだけあるいはｄＴＴＰだけのいずれかを用いてプライマー延長
反応が行われる。産物はゲル電気泳動により単離し、その位置の集団中の各ヌク
レオチドの比率を決定のために定量化することができる。プライマーは、ＣｐＧ
部位でのＣ’ｓの転換を定量し、メチル化されるべきでないＣ’ｓを制御するよ
うに設計するべきである。１つより多いプライマーは、それらの大きさが明確に
区別できる限り、同じゲルトラックに単一反応及び／又はランに含まれることが
できる。
がＣ又はＴ塩基を含むかどうかを決定するために、ＰＣＲ産物に適用することが
できる。この方法で、対象の位置に隣接するプライマーは、ＰＣＲ産物にアニー
ルされ、ｄＣＴＰだけあるいはｄＴＴＰだけのいずれかを用いてプライマー延長
反応が行われる。産物はゲル電気泳動により単離し、その位置の集団中の各ヌク
レオチドの比率を決定のために定量化することができる。プライマーは、ＣｐＧ
部位でのＣ’ｓの転換を定量し、メチル化されるべきでないＣ’ｓを制御するよ
うに設計するべきである。１つより多いプライマーは、それらの大きさが明確に
区別できる限り、同じゲルトラックに単一反応及び／又はランに含まれることが
できる。
【００４７】 （ｄ）ＰＣＲの蛍光リアルタイムモニター 増幅領域の内部のオリゴヌクレオチドは、増幅反応を、正しい配列の増幅を示
すのと同時に、モニターし定量化するために用いることができる。蛍光５’ヌク
レアーゼＰＣＲアッセイ（１９）において、増幅反応は、増幅配列内に最初に結
合し、蛍光レポーターおよびクレンチャーの両方を含むプライマーを用いてモニ
ターされる。このプローブがその標的ＤＮＡに結合するとき、それはＴａｑポリ
メラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により開裂されることができ、レポーターとク
エンチャーを単離する。アッセイにおいて十分に重亜硫酸転換された配列（及び
／又はそのメチル化状態）において選択性のオリゴヌクレオチドを利用すること
により、増幅のレベルとその特異性の両方を1回の反応でモニターすることがで
きる。ＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションにより同様に検出する他の関連する
システムも用いることができる。
すのと同時に、モニターし定量化するために用いることができる。蛍光５’ヌク
レアーゼＰＣＲアッセイ（１９）において、増幅反応は、増幅配列内に最初に結
合し、蛍光レポーターおよびクレンチャーの両方を含むプライマーを用いてモニ
ターされる。このプローブがその標的ＤＮＡに結合するとき、それはＴａｑポリ
メラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により開裂されることができ、レポーターとク
エンチャーを単離する。アッセイにおいて十分に重亜硫酸転換された配列（及び
／又はそのメチル化状態）において選択性のオリゴヌクレオチドを利用すること
により、増幅のレベルとその特異性の両方を1回の反応でモニターすることがで
きる。ＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションにより同様に検出する他の関連する
システムも用いることができる。
【００４８】 実施例１：標的及び非標的ＧＳＴ−ＰｉＤＮＡのメチル化配列プロフィール 材料と方法 図１は、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の構成と、前立腺ガン組織又は細胞系及び正常前
立腺又は他の組織から単離されたＤＮＡのメチル化状態を決定するためにゲノム
配列が用いられる領域を示す。図１においてヌクレオチド配列番号付けは、Ｇｅ
ｎｂａｎｋ 受託番号Ｎｏ．Ｍ２４４８５のＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子配列に従ってい
る。ボックスの中に、各増幅領域の配列を示し、すべてのＣｐＧ部位が、転写開
始部位に位置に対して、示され番号が付されている。配列分析は、発表されてい
る配列からは予測できない付加的なＣｐＧジヌクレオチド（＋９）があったこと
を示した。さらに配列決定された領域で、研究した試料の重要な分画に存在する
多形が同定された。多形の対立遺伝子は、ＣｐＧ部位−３３を含まない。付加的
なＣｐＧジヌクレオチドと高いの両方を図２に示す。図２のヌクレオチド・コー
ディネートを、転写開始部位に対して示す；示されている第１の塩基は−４３４
で、Genbank配列の塩基７８１に対応し、最後は＋９０でGenbank配列の塩基１３
１３に対応する。
立腺又は他の組織から単離されたＤＮＡのメチル化状態を決定するためにゲノム
配列が用いられる領域を示す。図１においてヌクレオチド配列番号付けは、Ｇｅ
ｎｂａｎｋ 受託番号Ｎｏ．Ｍ２４４８５のＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子配列に従ってい
る。ボックスの中に、各増幅領域の配列を示し、すべてのＣｐＧ部位が、転写開
始部位に位置に対して、示され番号が付されている。配列分析は、発表されてい
る配列からは予測できない付加的なＣｐＧジヌクレオチド（＋９）があったこと
を示した。さらに配列決定された領域で、研究した試料の重要な分画に存在する
多形が同定された。多形の対立遺伝子は、ＣｐＧ部位−３３を含まない。付加的
なＣｐＧジヌクレオチドと高いの両方を図２に示す。図２のヌクレオチド・コー
ディネートを、転写開始部位に対して示す；示されている第１の塩基は−４３４
で、Genbank配列の塩基７８１に対応し、最後は＋９０でGenbank配列の塩基１３
１３に対応する。
【００４９】 表２及び３は、重亜硫酸処理ＤＮＡの増幅（表２）及び直接配列決定（表３）
に用いられる非選択的プライマーを配列と位置を挙げたものである。 正常前立腺組織、前立腺ガン組織、前立腺ガン由来細胞系、及び他の組織から
単離されたＤＮＡを重亜硫酸処理し、標準的方法によりＰＣＲ反応を行った（１
３）。ＰＣＲ産物は、有用な制限酵素で消化し、直接配列決定するか（１７）、
あるいは個々の分子を標準的方法によりクローン化し、配列決定した。
に用いられる非選択的プライマーを配列と位置を挙げたものである。 正常前立腺組織、前立腺ガン組織、前立腺ガン由来細胞系、及び他の組織から
単離されたＤＮＡを重亜硫酸処理し、標準的方法によりＰＣＲ反応を行った（１
３）。ＰＣＲ産物は、有用な制限酵素で消化し、直接配列決定するか（１７）、
あるいは個々の分子を標準的方法によりクローン化し、配列決定した。
【００５０】 結果 図３において、前立腺ガン細胞系、前立腺ガン組織試料及びマッチする正常前
立腺組織からのＤＮＡ中の部位のメチル化状態を、コアプロモーター領域から遺
伝子の３‘末端まで（ＣｐＧ部位−２８から１０３までをカバーする）について
示す。正常前立腺組織において、コアプロモーター領域はすべての部位で非メチ
ル化されていること、及びこのメチル化の欠損はプロモーター側面の領域からＣ
ｐＧ部位＋３３にわたって延長することが見られる。重亜硫酸処理、ＰＣＲ−増
幅ＤＮＡの制限酵素消化の結果は、メチル化のこの欠損がＣｐＧ部位＋５２及び
＋３を含むことを示す。しかしながら、分析されたさらに下流の領域において、
ＣｐＧ部位＋６８から＋７４及び＋９６から＋１０３、正常前立腺組織からのＤ
ＮＡが非常にメチル化されていた。前立腺ガン細胞系ＬＮＣａＰ及び前立腺ガン
組織試料の分析は、コアプロモーター領域の広範囲のメチル化を示す；メチル化
の全体のレベルのバリエーションは、おそらく腫瘍試料内の異なるレベルの正常
細胞の存在を反映している。１つのガン試料（２ＡＣ）からのＤＮＡが、完全に
非メチル化されていることが見出され、他の腫瘍試料と反対に、この腫瘍は免疫
組織化学によりいまだにＧＳＴ−Ｐｉを発現していることが見出された。ＬＮＣ
ａＰ細胞系及び腫瘍ＤＮＡｓ中のコアプロモータの側面の領域の配列決定は、メ
チル化がＣｐＧ部位＋３３まで延長したことを示し、さらなる制限酵素分析はメ
チル化が、ＣｐＧ部位＋５２と＋５３を含むことを示した。１つの腫瘍試料、Ｄ
Ｃについて、メチル化はコアプロモーター領域及びＣｐＧ部位＋１３から＋３３
を超えて延長せず、ＣｐＧ部位＋５３と＋５３も非メチル化であることが見出さ
れた。この腫瘍がグリーソン分類２＋２、分析したものの中で最低のガン分類で
あったことは、特記すべきである。すべての腫瘍ＤＮＡ試料について、正常ＤＮ
Ａと同様に、遺伝子の下流領域、部位６８から７４までと９６から１０３まで、
非常にメチル化されていた。ガンでメチル化されるが、正常ではメチル化されな
かったプロモーター領域の内部に、非メチル化あるいは周囲のメチル化部位に比
べて非常低い程度にメチル化されている、組織特異的個々の部位が明白であった
。これらは、部位−２２及び−２３（ＸＣ）、−２０（ＰＣ３系、ＸＣ及びＷＣ
）、−１４（ＰＣ３、ＸＣ及びＷＣ）、 ＋２４（ＰＣ３−Ｍ及びＭＭ２，ＣＣ
）、＋２５（ＬＮＣａＰ、ＰＣ３−ＭＭ２、ＣＣ）を含む。
立腺組織からのＤＮＡ中の部位のメチル化状態を、コアプロモーター領域から遺
伝子の３‘末端まで（ＣｐＧ部位−２８から１０３までをカバーする）について
示す。正常前立腺組織において、コアプロモーター領域はすべての部位で非メチ
ル化されていること、及びこのメチル化の欠損はプロモーター側面の領域からＣ
ｐＧ部位＋３３にわたって延長することが見られる。重亜硫酸処理、ＰＣＲ−増
幅ＤＮＡの制限酵素消化の結果は、メチル化のこの欠損がＣｐＧ部位＋５２及び
＋３を含むことを示す。しかしながら、分析されたさらに下流の領域において、
ＣｐＧ部位＋６８から＋７４及び＋９６から＋１０３、正常前立腺組織からのＤ
ＮＡが非常にメチル化されていた。前立腺ガン細胞系ＬＮＣａＰ及び前立腺ガン
組織試料の分析は、コアプロモーター領域の広範囲のメチル化を示す；メチル化
の全体のレベルのバリエーションは、おそらく腫瘍試料内の異なるレベルの正常
細胞の存在を反映している。１つのガン試料（２ＡＣ）からのＤＮＡが、完全に
非メチル化されていることが見出され、他の腫瘍試料と反対に、この腫瘍は免疫
組織化学によりいまだにＧＳＴ−Ｐｉを発現していることが見出された。ＬＮＣ
ａＰ細胞系及び腫瘍ＤＮＡｓ中のコアプロモータの側面の領域の配列決定は、メ
チル化がＣｐＧ部位＋３３まで延長したことを示し、さらなる制限酵素分析はメ
チル化が、ＣｐＧ部位＋５２と＋５３を含むことを示した。１つの腫瘍試料、Ｄ
Ｃについて、メチル化はコアプロモーター領域及びＣｐＧ部位＋１３から＋３３
を超えて延長せず、ＣｐＧ部位＋５３と＋５３も非メチル化であることが見出さ
れた。この腫瘍がグリーソン分類２＋２、分析したものの中で最低のガン分類で
あったことは、特記すべきである。すべての腫瘍ＤＮＡ試料について、正常ＤＮ
Ａと同様に、遺伝子の下流領域、部位６８から７４までと９６から１０３まで、
非常にメチル化されていた。ガンでメチル化されるが、正常ではメチル化されな
かったプロモーター領域の内部に、非メチル化あるいは周囲のメチル化部位に比
べて非常低い程度にメチル化されている、組織特異的個々の部位が明白であった
。これらは、部位−２２及び−２３（ＸＣ）、−２０（ＰＣ３系、ＸＣ及びＷＣ
）、−１４（ＰＣ３、ＸＣ及びＷＣ）、 ＋２４（ＰＣ３−Ｍ及びＭＭ２，ＣＣ
）、＋２５（ＬＮＣａＰ、ＰＣ３−ＭＭ２、ＣＣ）を含む。
【００５１】 図４に示された結果は、正常前立腺組織からと多くの他の正常組織からの、単
離されたＤＮＡ中のコアプロモーター領域とコアプロモーター領域の上流の配列
メチル化部位の比較を提供する。コアプロモーター上流のＰＣＲ断片からの配列
を、直接シークエンスがし難い領域であったので、クローン化して配列決定する
ことにより、決定した。ガン試料について、示されたメチル化のレベルは、メチ
ル化されたこれらのクローンの比率のようであった（両ケースで全クローンの約
５０％）。正常前立腺組織とすべての他の正常組織で、ＡＴ−リッチ反復の上流
のＣｇＰ部位の広範囲のメチル化がある。反復の下流（ＣｐＧ部位―４３から）
で、正常肝臓組織、ここではＣｐＧ部位―７から＋７までに非常にメチル化され
ている、を除くすべての正常組織において最小のメチル化がみられた。コアプロ
モーター上流の配列は、前立腺ガンＤＮＡで非常にメチル化されていることが見
出されが、やはり特異的部位は低くメチル化されていた：ガンＢとＤで部位−３
２、ガンＢで部位−３６。
離されたＤＮＡ中のコアプロモーター領域とコアプロモーター領域の上流の配列
メチル化部位の比較を提供する。コアプロモーター上流のＰＣＲ断片からの配列
を、直接シークエンスがし難い領域であったので、クローン化して配列決定する
ことにより、決定した。ガン試料について、示されたメチル化のレベルは、メチ
ル化されたこれらのクローンの比率のようであった（両ケースで全クローンの約
５０％）。正常前立腺組織とすべての他の正常組織で、ＡＴ−リッチ反復の上流
のＣｇＰ部位の広範囲のメチル化がある。反復の下流（ＣｐＧ部位―４３から）
で、正常肝臓組織、ここではＣｐＧ部位―７から＋７までに非常にメチル化され
ている、を除くすべての正常組織において最小のメチル化がみられた。コアプロ
モーター上流の配列は、前立腺ガンＤＮＡで非常にメチル化されていることが見
出されが、やはり特異的部位は低くメチル化されていた：ガンＢとＤで部位−３
２、ガンＢで部位−３６。
【００５２】 したがってこの結果、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子とその調節フランキング配列の領域
の同定が可能であり、多形反復領域の３‘’（ＣｐＧ部位−４３）から、部位＋
５２と＋５３へ伸びており、これは正常前立腺組織でメチル化されないが、前立
腺ガンでは通常高くメチル化される。１つのガン試料（Ｄ，グリーソン分類が最
低のガン）で、ＣｐＧ部位からの領域＋１３から＋５３はメチル化されなかった
。ＣｇＰ部位―４３から＋１０に伸びているより多く制限された領域は、プロモ
ーターメチル化を示したすべての前立腺ガンＤＮＡでメチル化された。プロモー
ター領域の一部のメチル化（ＣｐＧ部位−７から＋７）も、調べた１つの正常組
織（肝臓）でみられた。正常肝臓ＤＮＡのさらなる試料の分析は、メチル化のレ
ベルが変動し、ＣｐＧ部位−１３から＋８を含むことができることを示した。
の同定が可能であり、多形反復領域の３‘’（ＣｐＧ部位−４３）から、部位＋
５２と＋５３へ伸びており、これは正常前立腺組織でメチル化されないが、前立
腺ガンでは通常高くメチル化される。１つのガン試料（Ｄ，グリーソン分類が最
低のガン）で、ＣｐＧ部位からの領域＋１３から＋５３はメチル化されなかった
。ＣｇＰ部位―４３から＋１０に伸びているより多く制限された領域は、プロモ
ーターメチル化を示したすべての前立腺ガンＤＮＡでメチル化された。プロモー
ター領域の一部のメチル化（ＣｐＧ部位−７から＋７）も、調べた１つの正常組
織（肝臓）でみられた。正常肝臓ＤＮＡのさらなる試料の分析は、メチル化のレ
ベルが変動し、ＣｐＧ部位−１３から＋８を含むことができることを示した。
【００５３】 考察 上記結果は、前立腺ガン細胞の選択的検出のためのアッセイの開発に用いるこ
とができる、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の領域
を同定することにおいて、重大である。こうして、正常前立腺組織においてメチ
ル化されている領域の境界内にあるＣｐＧ部位−４３から＋５３までの領域を、
前立腺組織試料中のガン特異的メチル化を検出するためのプライマーの設計のた
めに用いることが可能である。ＣｐＧ部位−４３から＋１０までの領域が、ガン
の高い割合の検出のために好ましい。 ＣｐＧ部位＋１３から＋５３までの領域
が、ガンの検出のために用いられるが、後期（メチル化ガン）から初期（非メチ
ル化）ガンを区別するためにも用いることができる。血液などの他の試料を用い
たアッセイにおいて、ＣｐＧ部位−７から＋７、より好ましくは部位−１３から
＋８を排除するように選ばれる領域を制限することが好ましい。例えば、肝臓ガ
ンは、肝臓病を患う被験者から取られた血液中に存在するかもしれず、その場合
、もしガン特異的メチル化の検出のために選ばれた領域がＣｐＧ部位―１３から
＋８を含むなら、偽陽性の結果が得られるかもしれない。
とができる、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の領域
を同定することにおいて、重大である。こうして、正常前立腺組織においてメチ
ル化されている領域の境界内にあるＣｐＧ部位−４３から＋５３までの領域を、
前立腺組織試料中のガン特異的メチル化を検出するためのプライマーの設計のた
めに用いることが可能である。ＣｐＧ部位−４３から＋１０までの領域が、ガン
の高い割合の検出のために好ましい。 ＣｐＧ部位＋１３から＋５３までの領域
が、ガンの検出のために用いられるが、後期（メチル化ガン）から初期（非メチ
ル化）ガンを区別するためにも用いることができる。血液などの他の試料を用い
たアッセイにおいて、ＣｐＧ部位−７から＋７、より好ましくは部位−１３から
＋８を排除するように選ばれる領域を制限することが好ましい。例えば、肝臓ガ
ンは、肝臓病を患う被験者から取られた血液中に存在するかもしれず、その場合
、もしガン特異的メチル化の検出のために選ばれた領域がＣｐＧ部位―１３から
＋８を含むなら、偽陽性の結果が得られるかもしれない。
【００５４】 実施例２；メチル化ＧＳＴ−ＰｉＤＮＡの検出のための選択的プライマーの設計
と使用 材料及び方法 ３つの領域からのメチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列検出のための配列プライマーを以
下の表４に示す：すなわちコアプロモーターの上流領域（プライマーＣＧＰＳ−
５から９及びＣＧＰＳ−１１から１３）、コアプロモーターを部分的に包含する
領域（プライマーＣＧＰＳ−１から４）、及びコアプロモーターからはるか下流
の領域（プライマーＣＧＰＳ−２１から２４）。
と使用 材料及び方法 ３つの領域からのメチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列検出のための配列プライマーを以
下の表４に示す：すなわちコアプロモーターの上流領域（プライマーＣＧＰＳ−
５から９及びＣＧＰＳ−１１から１３）、コアプロモーターを部分的に包含する
領域（プライマーＣＧＰＳ−１から４）、及びコアプロモーターからはるか下流
の領域（プライマーＣＧＰＳ−２１から２４）。
【００５５】 上流領域のためのプライマーの配列及び由来を図２に示す（ＣｐＧ部位―４３
からＣｐＧ部位＋１０）。図２はまた、ＣｐＧ部位−３３を包含する共通多形も
示す（上記配列（ｐ）参照）。下に、シトシンからウラシルへの転換の後の誘導
鎖の配列を示す。誘導鎖は、すべてのＣｐＧがメチル化（Ｂ−Ｍ）されているか
、または何もメチル化（Ｂ−Ｕ）されていないものとして示される。この下に、
メチル化配列を特異的に増幅するように設計された特異的プライマーが示される
。すべてのプライマーが、処理された、メチル化テンペレートに完全にマッチす
るように設計されるが、非メチル化ＤＮＡ又は元の非処理ＤＮＡから由来するテ
ンペレートに対してミスマッチを含むことがわかる。プライマーＶＧＰＳ−５，
８，１１，１２，及び１３は、多形領域と、前立腺ガンＤＮＡでより低い頻度の
メチル化を示すＣｐＧ部位を排除するように設計される。正方向プライマーの下
線のＴ’ｓ（及び逆方向プライマーのＡ’ｓ）は、Ｃ’ｓの重亜硫酸転換から由
来し、重亜硫酸処理により効率的に転換されなかったＤＮＡの増幅に対する区別
を提供する。正方向プライマーの太字のＣ’ｓ（及び逆方向プライマーのＧ’ｓ
）は、ＣｐＧ部位の一部であり、メチル化配列から由来するＤＮＡと塩基対を形
成するが、非メチル化配列から由来するＤＮＡに対してミスマッチを形成するで
あろう。重複は、いくつかの位置、正方向プライマーのＹ（＝ＣとＴの混合）及
び逆方向プライマーのＲ（＝ＡとＧの混合）が含まれ、メチル化状態から独立し
てペアリングが可能である。このことは、腫瘍試料内又は間でのメチル化の頻度
が変化する、ある部位で可能にすることができる（例えば部位−１４）。メチル
化ＧＳＴ−Ｐｉ配列のための特異的選択的増幅のための正方向及び逆方向プライ
マーを以下の表４に示す。
からＣｐＧ部位＋１０）。図２はまた、ＣｐＧ部位−３３を包含する共通多形も
示す（上記配列（ｐ）参照）。下に、シトシンからウラシルへの転換の後の誘導
鎖の配列を示す。誘導鎖は、すべてのＣｐＧがメチル化（Ｂ−Ｍ）されているか
、または何もメチル化（Ｂ−Ｕ）されていないものとして示される。この下に、
メチル化配列を特異的に増幅するように設計された特異的プライマーが示される
。すべてのプライマーが、処理された、メチル化テンペレートに完全にマッチす
るように設計されるが、非メチル化ＤＮＡ又は元の非処理ＤＮＡから由来するテ
ンペレートに対してミスマッチを含むことがわかる。プライマーＶＧＰＳ−５，
８，１１，１２，及び１３は、多形領域と、前立腺ガンＤＮＡでより低い頻度の
メチル化を示すＣｐＧ部位を排除するように設計される。正方向プライマーの下
線のＴ’ｓ（及び逆方向プライマーのＡ’ｓ）は、Ｃ’ｓの重亜硫酸転換から由
来し、重亜硫酸処理により効率的に転換されなかったＤＮＡの増幅に対する区別
を提供する。正方向プライマーの太字のＣ’ｓ（及び逆方向プライマーのＧ’ｓ
）は、ＣｐＧ部位の一部であり、メチル化配列から由来するＤＮＡと塩基対を形
成するが、非メチル化配列から由来するＤＮＡに対してミスマッチを形成するで
あろう。重複は、いくつかの位置、正方向プライマーのＹ（＝ＣとＴの混合）及
び逆方向プライマーのＲ（＝ＡとＧの混合）が含まれ、メチル化状態から独立し
てペアリングが可能である。このことは、腫瘍試料内又は間でのメチル化の頻度
が変化する、ある部位で可能にすることができる（例えば部位−１４）。メチル
化ＧＳＴ−Ｐｉ配列のための特異的選択的増幅のための正方向及び逆方向プライ
マーを以下の表４に示す。
【００５６】 この実施例で実施される増幅は、種々の組織からの重亜硫酸処理ＤＮＡを利用
し、ＰＣＲプライマーの２セットを用いた。特に、図５パネルＡに示す増幅反応
のために（転写開始部位をカバーする領域）、ＣＧＰＳ−１と３が外側プライマ
ーとして、ＣＧＰＳ２と４が内側プライマーとして用いられた。図５パネルＢと
図６及び７で示す増幅反応のために、増幅の第１ラウンドでは、ＣｐＧ部位−３
９から−１６からの領域を包含する外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８を用
い、 それに続く増幅の第２ラウンドではＣＧＰＳ−６及び７を用いＣＰＧ部位
−３６から−２３をカバーする１４０ｂｐ断片を増幅した。図８から１１に示す
増幅反応では、上流領域のために用いられるプライマーセットは、第１ラウンド
増幅では外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及びＣＧＰＳ−８、第２ラウンド増幅
では、内側のプライマー対としてＣＧＰＳ−１１及びＣＧＰＳ−１２を用い、結
果としてＣｐＧ部位―３８から−２３をカバーする１６７ｂｐ断片を増幅した。
し、ＰＣＲプライマーの２セットを用いた。特に、図５パネルＡに示す増幅反応
のために（転写開始部位をカバーする領域）、ＣＧＰＳ−１と３が外側プライマ
ーとして、ＣＧＰＳ２と４が内側プライマーとして用いられた。図５パネルＢと
図６及び７で示す増幅反応のために、増幅の第１ラウンドでは、ＣｐＧ部位−３
９から−１６からの領域を包含する外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８を用
い、 それに続く増幅の第２ラウンドではＣＧＰＳ−６及び７を用いＣＰＧ部位
−３６から−２３をカバーする１４０ｂｐ断片を増幅した。図８から１１に示す
増幅反応では、上流領域のために用いられるプライマーセットは、第１ラウンド
増幅では外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及びＣＧＰＳ−８、第２ラウンド増幅
では、内側のプライマー対としてＣＧＰＳ−１１及びＣＧＰＳ−１２を用い、結
果としてＣｐＧ部位―３８から−２３をカバーする１６７ｂｐ断片を増幅した。
【００５７】 プライマーのすべてのセットについて、ＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス／
ＨＣｌ ｐＨ8.8、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ）中に調製された、６７ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、１．７ｍｇ／ｍｌＢＳＡ及び１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、からなるバッファー中で、ＰＣＲ増幅を行った。反応混合物（５０
μｌ）は、各２００ｍＭの４つのｄＮＴＰｓ、６ｎｇ／ｍｌの各プライマー、２
ユニットのAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）含んでいた。プライ
マーＣＧＰＳ−５と８について（第１ラウンド増幅）、ＰＣＲサイクル条件は、
６０℃１分、７２℃２分、及び９５℃１分の５サイクル、その後、６５℃１分、
７２℃１．５分、及び９５℃１分の３０サイクルであった。プライマーＣＧＰＳ
−６と７のための増幅条件は（第２ラウンド増幅）は、６０℃１分、７２℃２分
、及び９５℃１分の５サイクル、その後、６５℃１分、７２℃１．５分、及び９
５℃１分の３０サイクルであった。プライマーＣＧＰＳ−１１と１２については
、増幅条件は、アニーリング温度を６５℃から７０℃に上げた以外は、ＣＧＰＳ
−６と７と同じであった。第１ラウンド増幅反応物の２μｌを、第２ラウンド増
幅反応物５０μｌに用いた。同様の効率及び特異性を達成するために、他のバッ
ファー又はＰＣＲ増幅条件もまた使用可能である。
ＨＣｌ ｐＨ8.8、0.1ｍＭ ＥＤＴＡ）中に調製された、６７ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、１．７ｍｇ／ｍｌＢＳＡ及び１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、からなるバッファー中で、ＰＣＲ増幅を行った。反応混合物（５０
μｌ）は、各２００ｍＭの４つのｄＮＴＰｓ、６ｎｇ／ｍｌの各プライマー、２
ユニットのAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）含んでいた。プライ
マーＣＧＰＳ−５と８について（第１ラウンド増幅）、ＰＣＲサイクル条件は、
６０℃１分、７２℃２分、及び９５℃１分の５サイクル、その後、６５℃１分、
７２℃１．５分、及び９５℃１分の３０サイクルであった。プライマーＣＧＰＳ
−６と７のための増幅条件は（第２ラウンド増幅）は、６０℃１分、７２℃２分
、及び９５℃１分の５サイクル、その後、６５℃１分、７２℃１．５分、及び９
５℃１分の３０サイクルであった。プライマーＣＧＰＳ−１１と１２については
、増幅条件は、アニーリング温度を６５℃から７０℃に上げた以外は、ＣＧＰＳ
−６と７と同じであった。第１ラウンド増幅反応物の２μｌを、第２ラウンド増
幅反応物５０μｌに用いた。同様の効率及び特異性を達成するために、他のバッ
ファー又はＰＣＲ増幅条件もまた使用可能である。
【００５８】 結果及び考察 コアプロモーター領域をカバーするプライマーについて（図５パネルＡ参照）
、陽性対照ＤＮＡ（ガンＢ）から増幅ＤＮＡ（矢印のバンド参照）を得たが、前
立腺ガンと診断されていなかった２人の被験者からの前立腺組織試料ＤＮＡから
も得た。増幅されたＤＮＡのバンドは、骨髄及び血液試料から単離されたＤＮＡ
からも、前立腺ガンと知られていない被験者からの肝臓組織試料から単離された
ＤＮＡからも見られた。
、陽性対照ＤＮＡ（ガンＢ）から増幅ＤＮＡ（矢印のバンド参照）を得たが、前
立腺ガンと診断されていなかった２人の被験者からの前立腺組織試料ＤＮＡから
も得た。増幅されたＤＮＡのバンドは、骨髄及び血液試料から単離されたＤＮＡ
からも、前立腺ガンと知られていない被験者からの肝臓組織試料から単離された
ＤＮＡからも見られた。
【００５９】 上流の増幅について（図５パネルＢ参照）、健常な組織試料の範囲から単離さ
れたＤＮＡで、あるいは前立腺ガンとされていない被験者の血液試料単離された
ＤＮＡから、実施された増幅反応からは増幅されたＤＮＡは得られなかった。増
幅されたＤＮＡのバンドは、陽性対照ＤＮＡ（ガンＢ）から生成した。しかしな
がら、１つの正常前立腺組織試料から単離されたＤＮＡで実施された増幅反応は
、ＤＮＡ増幅が起こらず、増幅されたＤＮＡは、前立腺ガンとされていない８２
歳の被験者の前立腺組織試料から単離されたＤＮＡで実施された同じ増幅反応か
ら起こった。この被験者は診断されていない前立腺ガンを有していた可能性があ
る。前立腺ガンとされていない被験者からの正常前立腺組織の５つの他の試料か
ら単離されたＤＮＡは、増幅ＤＮＡ産物をもたらさなかった（図７パネルＢ参照
）。
れたＤＮＡで、あるいは前立腺ガンとされていない被験者の血液試料単離された
ＤＮＡから、実施された増幅反応からは増幅されたＤＮＡは得られなかった。増
幅されたＤＮＡのバンドは、陽性対照ＤＮＡ（ガンＢ）から生成した。しかしな
がら、１つの正常前立腺組織試料から単離されたＤＮＡで実施された増幅反応は
、ＤＮＡ増幅が起こらず、増幅されたＤＮＡは、前立腺ガンとされていない８２
歳の被験者の前立腺組織試料から単離されたＤＮＡで実施された同じ増幅反応か
ら起こった。この被験者は診断されていない前立腺ガンを有していた可能性があ
る。前立腺ガンとされていない被験者からの正常前立腺組織の５つの他の試料か
ら単離されたＤＮＡは、増幅ＤＮＡ産物をもたらさなかった（図７パネルＢ参照
）。
【００６０】 図６で、ＰＣＲ増幅反応の結果は前立腺ガンを有する患者からの組織試料を示
す。各試料について、ＤＮＡは、ガンを含むとして同定された領域から、及び非
常に正常であると同定された他の領域から単離した。すべてのケースで、増幅さ
れたＤＮＡの明確なバンドが、前立腺ガンＤＮＡで実施された増幅反応から生成
した。これらのうちの２つは、メチル化ＤＮＡの割合が、メチル化及び非メチル
化ＤＮＡで等量で開始するように設計されたプライマーを用いて検出されるため
には不十分なケースであった。非常に正常な組織から単離されたＤＮＡについて
、増幅されたＤＮＡのバンドがないかあるいは実質上より低い量で存在していた
。ある“正常”試料でのバンドの存在は、試料中の低いレベルのガン細胞から由
来する可能性があった。
す。各試料について、ＤＮＡは、ガンを含むとして同定された領域から、及び非
常に正常であると同定された他の領域から単離した。すべてのケースで、増幅さ
れたＤＮＡの明確なバンドが、前立腺ガンＤＮＡで実施された増幅反応から生成
した。これらのうちの２つは、メチル化ＤＮＡの割合が、メチル化及び非メチル
化ＤＮＡで等量で開始するように設計されたプライマーを用いて検出されるため
には不十分なケースであった。非常に正常な組織から単離されたＤＮＡについて
、増幅されたＤＮＡのバンドがないかあるいは実質上より低い量で存在していた
。ある“正常”試料でのバンドの存在は、試料中の低いレベルのガン細胞から由
来する可能性があった。
【００６１】 手術の間、腹腔から得られる血液の試料からのＤＮＡの増幅は、それらの多く
の中のメチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列を検出される可能性があったことを示した。転
移性の疾患であることがわかっている３人の患者から単離される末梢血液の試料
（図７パネルＢ参照）は増幅可能な、メチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列の存在を示した
。
の中のメチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列を検出される可能性があったことを示した。転
移性の疾患であることがわかっている３人の患者から単離される末梢血液の試料
（図７パネルＢ参照）は増幅可能な、メチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列の存在を示した
。
【００６２】 増幅されたＤＮＡ産物は、ＬＮＣａＰ及びＤＵ１４５前立腺ガン細胞系から単
離されたＤＮＡの増幅からも生産されたが、細胞系のＰＣ−３シリーズからは生
産されなかった。この後者の結果は、ＰＣ−３細胞での上流プロモーター領域の
低いレベルのメチル化のためであり得るが、主に寄与している要素は、おそらく
、ＰＣ−３がＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の変種対立遺伝子だけを含むために、ＣＧＰＳ
−６プライマーによるプライミングが欠如していることであろう。メチル化ＧＳ
Ｔ−Ｐｉ配列もまた、非前立腺由来のいくつかの腫瘍由来細胞系から単離された
ＤＮＡ中に検出された：ＨｅＬａ、頚部ガン、及びＨｅｐＧ２、肝臓ガン（図７
パネルＢ参照）。
離されたＤＮＡの増幅からも生産されたが、細胞系のＰＣ−３シリーズからは生
産されなかった。この後者の結果は、ＰＣ−３細胞での上流プロモーター領域の
低いレベルのメチル化のためであり得るが、主に寄与している要素は、おそらく
、ＰＣ−３がＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の変種対立遺伝子だけを含むために、ＣＧＰＳ
−６プライマーによるプライミングが欠如していることであろう。メチル化ＧＳ
Ｔ−Ｐｉ配列もまた、非前立腺由来のいくつかの腫瘍由来細胞系から単離された
ＤＮＡ中に検出された：ＨｅＬａ、頚部ガン、及びＨｅｐＧ２、肝臓ガン（図７
パネルＢ参照）。
【００６３】 ＤＮＡを３人の前立腺ガン患者（Ｃ）の、及び５人の前立腺ガンとされていな
い被験者（Ｎ）の、精液から単離し（図８参照）、重亜硫酸で処理し、プライマ
ーＣＧＰＳ−５と８、その後ＣＧＰＳ−６と７を用いて増幅させた。増幅された
ＤＮＡ産物は、すべての３つのガンＤＮＡから得た。前立腺ガンと診断されてい
ない被験者からの５つの試料のうちの１つも、増幅ＤＮＡ産物の結果を得たが、
これが偽陽性を表すのか、あるいは特定の被験者における未診断の前立腺ガンの
ケースであるのか明白でない。
い被験者（Ｎ）の、精液から単離し（図８参照）、重亜硫酸で処理し、プライマ
ーＣＧＰＳ−５と８、その後ＣＧＰＳ−６と７を用いて増幅させた。増幅された
ＤＮＡ産物は、すべての３つのガンＤＮＡから得た。前立腺ガンと診断されてい
ない被験者からの５つの試料のうちの１つも、増幅ＤＮＡ産物の結果を得たが、
これが偽陽性を表すのか、あるいは特定の被験者における未診断の前立腺ガンの
ケースであるのか明白でない。
【００６４】 プライマーＣＧＰＳ−１１の使用はＣｐＧ部位−３３での多形配列を横切って
のアニーリングを排除し、外側プライマーとしてＣＧＰＳ−５と８とその後の内
側プライマーとしてＣＧＰＳ−１１と１２の組み合わせは、前立腺ガンＤＮＡの
効率的な増幅を与えることが見出された。第１の実験で（図９参照）、ＤＮＡは
、ガンか良性過形成（ＢＰＨ）と診断されていたかのいずれかとして同定されて
いた固定化組織切片の領域から抽出された。ＤＮＡを、７Ｍ塩酸グアニジン、５
ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ６．４、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００、５０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ及び１００ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ
の４００μｌ中で切屑化材料とインキュベートすることにより単離した。均質化
の後、試料を４８時間５５℃インキュベートし、ついでドライアイス５分／９５
℃５分の凍結／融解サイクルを５回行った。ボルテックスと２分間の微小遠心管
での遠心分離の後、上清をついで３倍に希釈し、フェノール／クロロフォルムで
抽出し、エタノール沈澱を行った。６人のガン患者と４人のＢＰＨからの試料か
ら単離されたＤＮＡを、コアプロモーター領域のための非選択的プライマー（す
なわちＧＳＴ−９と１０、その後ＧＳＴ−１１と１２での対照ＰＣＲ増幅）か、
あるいはＣＧ選択的プライマー（すなわちＣＨＰＳ−５と８、その後ＣＧＰＳ−
１１と１２での選択的ＰＣＲ増幅）で増幅した。対照ＰＣＲ増幅は、すべての試
料において増幅可能なＤＮＡの存在を示した。ＣＧ選択的プライマーを使用して
、増幅されたＤＮＡ産物は、ガンＤＮＡからのみ得た。これらの患者のＰＳＡ（
前立腺特異的抗原）レベルは、４から１４５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。ＢＰＨ
患者については、ＰＳＡレベルは２．３から２５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。
のアニーリングを排除し、外側プライマーとしてＣＧＰＳ−５と８とその後の内
側プライマーとしてＣＧＰＳ−１１と１２の組み合わせは、前立腺ガンＤＮＡの
効率的な増幅を与えることが見出された。第１の実験で（図９参照）、ＤＮＡは
、ガンか良性過形成（ＢＰＨ）と診断されていたかのいずれかとして同定されて
いた固定化組織切片の領域から抽出された。ＤＮＡを、７Ｍ塩酸グアニジン、５
ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ６．４、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ
１００、５０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ及び１００ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ
の４００μｌ中で切屑化材料とインキュベートすることにより単離した。均質化
の後、試料を４８時間５５℃インキュベートし、ついでドライアイス５分／９５
℃５分の凍結／融解サイクルを５回行った。ボルテックスと２分間の微小遠心管
での遠心分離の後、上清をついで３倍に希釈し、フェノール／クロロフォルムで
抽出し、エタノール沈澱を行った。６人のガン患者と４人のＢＰＨからの試料か
ら単離されたＤＮＡを、コアプロモーター領域のための非選択的プライマー（す
なわちＧＳＴ−９と１０、その後ＧＳＴ−１１と１２での対照ＰＣＲ増幅）か、
あるいはＣＧ選択的プライマー（すなわちＣＨＰＳ−５と８、その後ＣＧＰＳ−
１１と１２での選択的ＰＣＲ増幅）で増幅した。対照ＰＣＲ増幅は、すべての試
料において増幅可能なＤＮＡの存在を示した。ＣＧ選択的プライマーを使用して
、増幅されたＤＮＡ産物は、ガンＤＮＡからのみ得た。これらの患者のＰＳＡ（
前立腺特異的抗原）レベルは、４から１４５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。ＢＰＨ
患者については、ＰＳＡレベルは２．３から２５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。
【００６５】 さらなる実験において、前立腺ガン細胞は最初に血液試料から磁気ビーズに結
合した抗体を用い、ついでＤＮＡ単離、重亜硫酸修飾及びＰＣＲ増幅によって濃
縮された。細胞分離はDynabeads anti-Epithelial Cell（Dynal生産番号No.112.
07）を用いて、実質的には生産者の記載のように、行った。磁気ビーズは、抗上
皮抗体mAb Ber-EP4で被覆した（２２）。あるいは、前立腺特異的膜抗原（２３
）の細胞外ドメインに特異的な抗体に結合した磁気ビーズを用いることもできた
。血液全体を、１０ｍM EDTAを含むDulbecco’sリン酸緩衝化食塩水（PBS）で１
：１に希釈し、４０μｌの前洗浄磁気ビーズを添加した。細胞は４℃で回転プラ
ットフォーム上で３０分間インキュベートし、ついで磁気細胞分離装置を4分間
用いてビーズをチューブの側面に採集した。上清をついで注意深く吸引し、ビー
ズを洗浄溶液（０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。ビ
ーズはついで再び磁石を用いてチューブの側面に採集し、上清を注意深く吸引し
、磁気分離装置中に残るチューブでさらなる洗浄を行い、上清を吸引した。ビー
ズはついで、ＤＮＡ単離バッファー（１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ８、２５
ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Sarkosyl、２００ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）中に再懸
濁し、少なくとも２時間３７℃でインキュベートし、ＤＮＡをフェノール／クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱により回収した。ＤＮＡをついで最後に重亜硫酸
処理とＰＣＲ増幅に供した。
合した抗体を用い、ついでＤＮＡ単離、重亜硫酸修飾及びＰＣＲ増幅によって濃
縮された。細胞分離はDynabeads anti-Epithelial Cell（Dynal生産番号No.112.
07）を用いて、実質的には生産者の記載のように、行った。磁気ビーズは、抗上
皮抗体mAb Ber-EP4で被覆した（２２）。あるいは、前立腺特異的膜抗原（２３
）の細胞外ドメインに特異的な抗体に結合した磁気ビーズを用いることもできた
。血液全体を、１０ｍM EDTAを含むDulbecco’sリン酸緩衝化食塩水（PBS）で１
：１に希釈し、４０μｌの前洗浄磁気ビーズを添加した。細胞は４℃で回転プラ
ットフォーム上で３０分間インキュベートし、ついで磁気細胞分離装置を4分間
用いてビーズをチューブの側面に採集した。上清をついで注意深く吸引し、ビー
ズを洗浄溶液（０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。ビ
ーズはついで再び磁石を用いてチューブの側面に採集し、上清を注意深く吸引し
、磁気分離装置中に残るチューブでさらなる洗浄を行い、上清を吸引した。ビー
ズはついで、ＤＮＡ単離バッファー（１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ８、２５
ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Sarkosyl、２００ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）中に再懸
濁し、少なくとも２時間３７℃でインキュベートし、ＤＮＡをフェノール／クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱により回収した。ＤＮＡをついで最後に重亜硫酸
処理とＰＣＲ増幅に供した。
【００６６】 この方法の感受性は、前立腺ガン細胞系、ＬＮＣａＰのさまざまな数の細胞を
正常血液中に植えることにより、試験した。図１０Ａで示すように、０．５ｍｌ
の血液中に２０細胞以上の存在が信頼性をもって検出できた。図１０Ｂに示され
た実験は、ＬＮＣａＰ細胞を含む血液試料が、室温であるいは４℃で２４時間ま
で感受性を失わずに貯蔵できたことを示した。
正常血液中に植えることにより、試験した。図１０Ａで示すように、０．５ｍｌ
の血液中に２０細胞以上の存在が信頼性をもって検出できた。図１０Ｂに示され
た実験は、ＬＮＣａＰ細胞を含む血液試料が、室温であるいは４℃で２４時間ま
で感受性を失わずに貯蔵できたことを示した。
【００６７】 磁気ビーズ捕捉と、重亜硫酸処理、感受性ＰＣＲ増幅を用いて、患者の血液試
料も分析し、これらのセットからの結果を図１１に示す。これらは、前立腺に問
題が知られていない正常被験者からの、前立腺の良性過形成の患者からの、組織
学的に前立腺ガンと確認された患者からの血液試料を含む。対照ＰＣＲ増幅（上
のパネル）は、メチル化と非メチル化のＧＳＴ−Ｐｉ配列の両方を増幅するプラ
イマーを用いた。ＣＧ−選択性プライマーを用いる増幅を下のパネルに示す。陽
性対照増幅（ＬＮＣａＰ（Ｌ）とＰＣ３（Ｐ））は、ガンパネルに示され、陰性
対照増幅は正常とガンパネルに示される。
料も分析し、これらのセットからの結果を図１１に示す。これらは、前立腺に問
題が知られていない正常被験者からの、前立腺の良性過形成の患者からの、組織
学的に前立腺ガンと確認された患者からの血液試料を含む。対照ＰＣＲ増幅（上
のパネル）は、メチル化と非メチル化のＧＳＴ−Ｐｉ配列の両方を増幅するプラ
イマーを用いた。ＣＧ−選択性プライマーを用いる増幅を下のパネルに示す。陽
性対照増幅（ＬＮＣａＰ（Ｌ）とＰＣ３（Ｐ））は、ガンパネルに示され、陰性
対照増幅は正常とガンパネルに示される。
【００６８】 以下の表５は、磁気ビーズ／ＣＧ選択性ＰＣＲ増幅プロトコールを用いた患者
血液試料からのＤＮＡをテストした結果をまとめたものである。増幅されたＤＮ
Ａ産物は、正常対照被験者から単離されたＤＮＡからは得られず、組織学的にＢ
ＰＨを有していると診断された１８人の患者のうちの１人から単離されたＤＮＡ
だけ、増幅ＤＮＡ産物を生産した（この患者は血液ＰＳＡレベル１７ｎｇ／ｍｌ
であった）。前立腺ガンであると確認された患者のうち、２４中１７（７０％）
の単離されたＤＮＡがＰＣＲ陽性（すなわち増幅ＤＮＡの生産を得た）であり、
血中の前立腺ガン細胞の存在を示した。臨床的にステージＡとＢの患者について
（すなわち前立腺に限られた疾患）、ガン細胞は血中に１０ケースのうち６で、
検出された。局所的湿潤（ステージＣ）又は転移（ステージＤ）疾患を有する９
人の患者について、ガン細胞は、すべてのケースで血中に検出された。
血液試料からのＤＮＡをテストした結果をまとめたものである。増幅されたＤＮ
Ａ産物は、正常対照被験者から単離されたＤＮＡからは得られず、組織学的にＢ
ＰＨを有していると診断された１８人の患者のうちの１人から単離されたＤＮＡ
だけ、増幅ＤＮＡ産物を生産した（この患者は血液ＰＳＡレベル１７ｎｇ／ｍｌ
であった）。前立腺ガンであると確認された患者のうち、２４中１７（７０％）
の単離されたＤＮＡがＰＣＲ陽性（すなわち増幅ＤＮＡの生産を得た）であり、
血中の前立腺ガン細胞の存在を示した。臨床的にステージＡとＢの患者について
（すなわち前立腺に限られた疾患）、ガン細胞は血中に１０ケースのうち６で、
検出された。局所的湿潤（ステージＣ）又は転移（ステージＤ）疾患を有する９
人の患者について、ガン細胞は、すべてのケースで血中に検出された。
【００６９】 ＨｅｐＧ２肝臓ガン細胞系がメチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列を含んでいたことが見
出されたため、肝臓ガン組織からのＤＮＡの試料も調べた。２０の肝臓ガン試料
から単離したＤＮＡを重亜硫酸処理し、ＣＧＰＳ−５と８及びＣＧＰＳ−１１と
１２プライマー対を用いて増幅した（図１２参照）。２０の試料のうち１４がＰ
ＣＲ陽性であった。他方、肝臓ガンでない２人の患者から単離されたＤＮＡから
は増幅ＤＮＡ産物は生産されなかった（図５ないし図７参照、データは示さず）
。正常肝臓組織から単離されたＤＮＡは、転写開始部位の領域で部分的にメチル
化されていることが示された（ＣｐＧ部位―７から＋７、図４参照）。正常肝臓
ＤＮＡのさらなる試料の分析は、メチル化のレベルが変動し得るもので、−１３
から＋８のＣｐＧ部位を含むことができることを示した。ここで用いられるプラ
イマー対は、ＣｐＧ部位−３９から−１６、正常肝臓ＤＮＡでみられるメチル化
の領域の上流を包含する。
出されたため、肝臓ガン組織からのＤＮＡの試料も調べた。２０の肝臓ガン試料
から単離したＤＮＡを重亜硫酸処理し、ＣＧＰＳ−５と８及びＣＧＰＳ−１１と
１２プライマー対を用いて増幅した（図１２参照）。２０の試料のうち１４がＰ
ＣＲ陽性であった。他方、肝臓ガンでない２人の患者から単離されたＤＮＡから
は増幅ＤＮＡ産物は生産されなかった（図５ないし図７参照、データは示さず）
。正常肝臓組織から単離されたＤＮＡは、転写開始部位の領域で部分的にメチル
化されていることが示された（ＣｐＧ部位―７から＋７、図４参照）。正常肝臓
ＤＮＡのさらなる試料の分析は、メチル化のレベルが変動し得るもので、−１３
から＋８のＣｐＧ部位を含むことができることを示した。ここで用いられるプラ
イマー対は、ＣｐＧ部位−３９から−１６、正常肝臓ＤＮＡでみられるメチル化
の領域の上流を包含する。
【００７０】 上述の結果は、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のコアプロモーター又はコアプロモーター
の上流領域にハイブリダイズするように設計された異なるセットのプライマーが
、信頼性をもって、前立腺ガン細胞から単離された重亜硫酸処理ＤＮＡを増幅で
きることを示す。しかしながら、コアプロモーターにハイブリダイズするように
設計されたプライマーは選択性がより低く、多くの正常組織試料から単離された
ＤＮＡｓはＤＮＡ増幅産物を得る。このように、正常組織からＤＮＡ中に非メチ
ル化されていることが見出される領域にハイブリダイズするように設計されたプ
ライマー、すなわちＣｐＧ部位−４５から−８を包含する上流領域とＣｐＧ部位
＋８から＋５３を包含するプロモーターの下流領域は、前立腺ガンの診断又は予
後のアッセイに好ましい。さらに、この後者の領域にハイブリダイズするように
設計されたプライマーは、初期と後期の前立腺ガンを区別するためにも有用かも
しれない。
の上流領域にハイブリダイズするように設計された異なるセットのプライマーが
、信頼性をもって、前立腺ガン細胞から単離された重亜硫酸処理ＤＮＡを増幅で
きることを示す。しかしながら、コアプロモーターにハイブリダイズするように
設計されたプライマーは選択性がより低く、多くの正常組織試料から単離された
ＤＮＡｓはＤＮＡ増幅産物を得る。このように、正常組織からＤＮＡ中に非メチ
ル化されていることが見出される領域にハイブリダイズするように設計されたプ
ライマー、すなわちＣｐＧ部位−４５から−８を包含する上流領域とＣｐＧ部位
＋８から＋５３を包含するプロモーターの下流領域は、前立腺ガンの診断又は予
後のアッセイに好ましい。さらに、この後者の領域にハイブリダイズするように
設計されたプライマーは、初期と後期の前立腺ガンを区別するためにも有用かも
しれない。
【００７１】 実施例３：正しい増幅の確認 下記の特異的オリゴヌクレオチドプローブを、アッセイの増幅工程から得られ
る増幅ＤＮＡ産物が、すべての非メチル化シトシンがウラシルに転換されたＤＮ
Ａによるものであることを確認するために用いることができる。上流ＰＣＲ領域
のそれらは、ＣＧＰＳ−５，６，１１，７から９、１2及び１３正方向及び逆方
向プライマーのすべての組み合わせから増幅されたＤＮＡ産物とともに用いるこ
とができる。下流ＰＣＲ領域のそれらは、ＣＧＰＳ−２１から２４プライマーの
増幅されたＤＮＡ産物とともに用いることができる。転換特異的オリゴヌクレオ
チドのビオチニル化バージョンは、これらのプライマー対を用いて生成される増
幅ＤＮＡ産物の溶液からの選択的及び特異的捕捉にも用いることができ、あるい
は適当に標識されたオリゴヌクレオチドは、特異的ＰＣＲ断片増幅のリアルタイ
ムモニターに用いることができる。重亜硫酸処理ＤＮＡのＰＣＲ増幅からの増幅
されたＤＮＡ産物は、日常的に、非常に高い割合のチミンヌクレオチドを含む１
つの鎖と、非常に高い割合のアデニンヌクレオチドを含む他方の鎖を有する。こ
のために、オリゴｄＴ（又はオリゴｄＡ）を包括的な転換特異的オリゴヌクレオ
チドとして使用することが可能であり、アニーリング条件は各ＰＣＲ断片につい
て転換及び非転換ＤＮＡの区別の最適化のために変化する。
る増幅ＤＮＡ産物が、すべての非メチル化シトシンがウラシルに転換されたＤＮ
Ａによるものであることを確認するために用いることができる。上流ＰＣＲ領域
のそれらは、ＣＧＰＳ−５，６，１１，７から９、１2及び１３正方向及び逆方
向プライマーのすべての組み合わせから増幅されたＤＮＡ産物とともに用いるこ
とができる。下流ＰＣＲ領域のそれらは、ＣＧＰＳ−２１から２４プライマーの
増幅されたＤＮＡ産物とともに用いることができる。転換特異的オリゴヌクレオ
チドのビオチニル化バージョンは、これらのプライマー対を用いて生成される増
幅ＤＮＡ産物の溶液からの選択的及び特異的捕捉にも用いることができ、あるい
は適当に標識されたオリゴヌクレオチドは、特異的ＰＣＲ断片増幅のリアルタイ
ムモニターに用いることができる。重亜硫酸処理ＤＮＡのＰＣＲ増幅からの増幅
されたＤＮＡ産物は、日常的に、非常に高い割合のチミンヌクレオチドを含む１
つの鎖と、非常に高い割合のアデニンヌクレオチドを含む他方の鎖を有する。こ
のために、オリゴｄＴ（又はオリゴｄＡ）を包括的な転換特異的オリゴヌクレオ
チドとして使用することが可能であり、アニーリング条件は各ＰＣＲ断片につい
て転換及び非転換ＤＮＡの区別の最適化のために変化する。
【００７２】 上流ＰＣＲ領域： 転換オリゴヌクレオチド [配列１４]
【００７３】 非転換オリゴヌクレオチド [配列１５]
【００７４】 転換中性オリゴヌクレオチド [配列１６]
【００７５】 下流ＰＣＲ領域： 転換オリゴヌクレオチド [配列１７]
【００７６】 非転換オリゴヌクレオチド [配列１８]
【００７７】 転換中性オリゴヌクレオチド [配列１９]
【００７８】 そのようなハイブリダイゼーションの選択性を示すために、一連のＤＮＡｓを
ナイロン膜上にスポットし、上流ＰＣＲ領域のための転換及び非転換特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブ、及び対照オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。
ＤＮＡｓは以下のものを含むものであった： （i） プローブと相補する領域内に異なる数の転換シトシンを含む、
上流領域の増幅からの個々のクローン化ＰＣＲ産物（図１３参照、ここで、１０
のうちの、転換シトシンの数を示す（カラム１及びカラム２の上の２つのスポッ
ト）。隣接する１０／１０転換塩基末端を含むが対照オリゴヌクレオチドを相補
する配列は含まない２つのクローンに注目）；及び （ii） ＣＧ選択的プライマー（ＣＧＰＳ−５と８、その後ＣＧＰＳ１
１と１２）を用いて、重亜硫酸処理ＤＮＡから増幅された、ガン患者及び良性過
形成の患者からのＰＣＲ産物（図１３参照、ここでこれらはガン試料１から４（
カラム２の下の部分）及びＢＰＨ試料１から４（カラム３）として標識化されて
いる）。
ナイロン膜上にスポットし、上流ＰＣＲ領域のための転換及び非転換特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブ、及び対照オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。
ＤＮＡｓは以下のものを含むものであった： （i） プローブと相補する領域内に異なる数の転換シトシンを含む、
上流領域の増幅からの個々のクローン化ＰＣＲ産物（図１３参照、ここで、１０
のうちの、転換シトシンの数を示す（カラム１及びカラム２の上の２つのスポッ
ト）。隣接する１０／１０転換塩基末端を含むが対照オリゴヌクレオチドを相補
する配列は含まない２つのクローンに注目）；及び （ii） ＣＧ選択的プライマー（ＣＧＰＳ−５と８、その後ＣＧＰＳ１
１と１２）を用いて、重亜硫酸処理ＤＮＡから増幅された、ガン患者及び良性過
形成の患者からのＰＣＲ産物（図１３参照、ここでこれらはガン試料１から４（
カラム２の下の部分）及びＢＰＨ試料１から４（カラム３）として標識化されて
いる）。
【００７９】 キナーゼ化オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションをExpres
s-Hybバッファー（Clontech）中で４５℃２時間実施し、その後２XＳＳＣ、０．
１％ ＳＤＳで４５℃２０分間の洗浄を４回、ついでリン酸イメージ（phosphori
mage）分析を実施した。
s-Hybバッファー（Clontech）中で４５℃２時間実施し、その後２XＳＳＣ、０．
１％ ＳＤＳで４５℃２０分間の洗浄を４回、ついでリン酸イメージ（phosphori
mage）分析を実施した。
【００８０】 対照オリゴヌクレオチドプローブのとのハイブリダイゼーションは、試料中の
ＤＮＡの量の評価を提供する。予想したように、ＢＰＨ試料のＰＣＲ増幅はどれ
も多く検出できる産物を生産しなかったが、４つのガン試料のうちの３は強いシ
グナル、１つは非常に弱いシグナルを与えた。
ＤＮＡの量の評価を提供する。予想したように、ＢＰＨ試料のＰＣＲ増幅はどれ
も多く検出できる産物を生産しなかったが、４つのガン試料のうちの３は強いシ
グナル、１つは非常に弱いシグナルを与えた。
【００８１】 転換特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、プローブと完全にマッチ
するプラスミドＤＮＡについて、及び対照オリゴヌクレオチドプローブとより強
いハイブリダイゼーションを示した３つのガン試料について、明白なシグナルを
示した。対照オリゴヌクレオチドプローブと非常に弱いシグナルを示した第４の
ガン試料は、転換特異的プローブではほとんど検出されなかった。このことは、
ＤＮＡの低いレベル、又はおそらく、部分的に転換されたＤＮＡ分子の存在のた
めであろう。転換特異的プローブとミスマッチを有していたプラスミドクローン
はどれもたいしたシグナルを与えなかった。非転換ＤＮＡプローブは、０、１、
又は２塩基が転換したプラスミドＤＮＡｓと明白にハイブリダイズしたが、８又
は１０の塩基が転換した試料とはハイブリダイズしなかった。ハイブリダイゼー
ションはまた、２つのＢＰＨと１つのガン試料で、非転換ＤＮＡの低いレベルの
増幅があったことを示した（この後者のケースでは、十分に転換されたＤＮＡに
ついてプローブから強いシグナルがあり、ＰＣＲ産物が適切に転換されたＤＮＡ
から優勢に生成されたことを示していた）。
するプラスミドＤＮＡについて、及び対照オリゴヌクレオチドプローブとより強
いハイブリダイゼーションを示した３つのガン試料について、明白なシグナルを
示した。対照オリゴヌクレオチドプローブと非常に弱いシグナルを示した第４の
ガン試料は、転換特異的プローブではほとんど検出されなかった。このことは、
ＤＮＡの低いレベル、又はおそらく、部分的に転換されたＤＮＡ分子の存在のた
めであろう。転換特異的プローブとミスマッチを有していたプラスミドクローン
はどれもたいしたシグナルを与えなかった。非転換ＤＮＡプローブは、０、１、
又は２塩基が転換したプラスミドＤＮＡｓと明白にハイブリダイズしたが、８又
は１０の塩基が転換した試料とはハイブリダイズしなかった。ハイブリダイゼー
ションはまた、２つのＢＰＨと１つのガン試料で、非転換ＤＮＡの低いレベルの
増幅があったことを示した（この後者のケースでは、十分に転換されたＤＮＡに
ついてプローブから強いシグナルがあり、ＰＣＲ産物が適切に転換されたＤＮＡ
から優勢に生成されたことを示していた）。
【００８２】 結果は、ここで用いられたタイプのオリゴヌクレオチドが、重亜硫酸で効率的
に転換された分子とされなかった分子の間を区別できることを示す。それらは、
ＰＣＲ産物の検出のための、あるいはＰＣＲ又は効率的に標的領域の転換分子を
全ＤＮＡ集団から選別するための他の検出方法の前の、多くのフォーマットで用
いることができる。同じアプローチは、非メチル化ＤＮＡｓ（Ｕ’ｓ、又はＴ’
ｓを含むそれらの誘導体を含む）から区別可能なＣｐＧメチル化ＤＮＡｓ（又は
Ｃ’ｓを含むそれらの誘導体）プライマーで用いることができる。
に転換された分子とされなかった分子の間を区別できることを示す。それらは、
ＰＣＲ産物の検出のための、あるいはＰＣＲ又は効率的に標的領域の転換分子を
全ＤＮＡ集団から選別するための他の検出方法の前の、多くのフォーマットで用
いることができる。同じアプローチは、非メチル化ＤＮＡｓ（Ｕ’ｓ、又はＴ’
ｓを含むそれらの誘導体を含む）から区別可能なＣｐＧメチル化ＤＮＡｓ（又は
Ｃ’ｓを含むそれらの誘導体）プライマーで用いることができる。
【００８３】
【参考文献】
【００８４】
【表１】
【００８５】
【表２】
【他／】
【００８６】
【表３】
【００８７】
【表４】
【００８８】
【表５】
【００８９】 当業者であれば、広く記載された本発明の思想又は範囲からはずれずに、特定
の実施態様で示した本発明に対して多くの変形及び／又は修飾が可能であること
が理解されるであろう。したがって、本実施態様はいかなる面でも例示的かつ非
制限的であるとして理解される。
の実施態様で示した本発明に対して多くの変形及び／又は修飾が可能であること
が理解されるであろう。したがって、本実施態様はいかなる面でも例示的かつ非
制限的であるとして理解される。
【配列表】
【図１】 図１はヒトＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の構成とヌクレオチド配列を示す
。ＣｐＧ部位は、転写開始部位に対して番号が付されている。ヌクレオチド配列
番号付けは、Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｎｏ．Ｍ２４４８５のＧＳＴ−Ｐｉ遺伝
子配列に従っている。
。ＣｐＧ部位は、転写開始部位に対して番号が付されている。ヌクレオチド配列
番号付けは、Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｎｏ．Ｍ２４４８５のＧＳＴ−Ｐｉ遺伝
子配列に従っている。
【図２】 図２は、前立腺ガンのデファレンシャル・メチル化を示すＧＳＴ
−Ｐｉ遺伝子の領域を示す。図面はさらに、上流領域（ＣｐＧ部位−４３から＋
１０）のプライマーの配列及び由来及び、ＣｐＧ部位−３３（上記配列（ｐ））
を包含する共通の多形を示す。ＧＳＴ−Ｐｉ配列の下に、シトシンからウラシル
への転換の後の誘導鎖の配列を示す。誘導鎖は、すべてのＣｐＧがメチル化（Ｂ
−Ｍ）され、または非メチル化（Ｂ−Ｕ）であるものとして示される。この下に
、メチル化配列を特異的に増幅するように設計された特異的プライマーが示され
る。
−Ｐｉ遺伝子の領域を示す。図面はさらに、上流領域（ＣｐＧ部位−４３から＋
１０）のプライマーの配列及び由来及び、ＣｐＧ部位−３３（上記配列（ｐ））
を包含する共通の多形を示す。ＧＳＴ−Ｐｉ配列の下に、シトシンからウラシル
への転換の後の誘導鎖の配列を示す。誘導鎖は、すべてのＣｐＧがメチル化（Ｂ
−Ｍ）され、または非メチル化（Ｂ−Ｕ）であるものとして示される。この下に
、メチル化配列を特異的に増幅するように設計された特異的プライマーが示され
る。
【図３】 単離ＤＮＡ中の各ＣｐＧ部位のメチル化状態を示す。 Ａ−ＬＮＣａＰ（ＬＮ）細胞系、ＤＵ１４５（ＤＵ）細胞系、ＰＣ３細胞系、
ＰＣ３−Ｍ細胞系及びＰＣ３−ＭＭ細胞系のコアプロモーター領域からＧＳＴ−
Ｐｉ遺伝子の３‘’末端までについて、前立腺ガン患者（２ＡＮ、ＢＮ、ＣＮ）
から正常組織試料から単離されたＤＮＡについて、前立腺腫瘍組織（ＢＣ、ＣＣ
、ＤＣ、ＸＣ、ＷＣ及び２ＡＣ）について、及び前立腺ガンでない人からの正常
前立腺組織（Ｐｒ）について。
ＰＣ３−Ｍ細胞系及びＰＣ３−ＭＭ細胞系のコアプロモーター領域からＧＳＴ−
Ｐｉ遺伝子の３‘’末端までについて、前立腺ガン患者（２ＡＮ、ＢＮ、ＣＮ）
から正常組織試料から単離されたＤＮＡについて、前立腺腫瘍組織（ＢＣ、ＣＣ
、ＤＣ、ＸＣ、ＷＣ及び２ＡＣ）について、及び前立腺ガンでない人からの正常
前立腺組織（Ｐｒ）について。
【図４】 単離ＤＮＡ中の各ＣｐＧ部位のメチル化状態を示す。 Ｂ−（前立腺ガンでない人からの）正常前立腺組織からの、３つの前立腺ガン
試料からの（ＢＣ，ＣＣ及びＤＣ）、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のコアプロモーター領
域及び上流配列について、及び多くの他の組織について。患者Ｂ及びＤは、Ｃｐ
Ｇ部位−３３で多形であり、角型かっこで示されるメチル化のレベルは、ＣｐＧ
を含む対立遺伝子のメチル化を反映する。ＣｐＧ部位−２８から＋１０において
、メチル化のレベルは、ＰＣＲ分子の集団の直接配列分析により決定される（１
７）。上流のＣｐＧ部位、−５６から−３０では、ＰＣＲ産物はクローン化され
、多くの個々のクローンが配列決定された（試料名の下に角型カッコで示された
番号）。正常組織において、各部位でのメチル化のレベルは、その位置にＣを含
むすべてのクローンの画分として決定された。ガン試料ＢＣ、ＣＣ及びＤＣにお
いて、示されるメチル化のレベルは、ＣｐＧ部位−４３から−３０までの領域内
にＤＮＡメチル化を示したクローンの中である（各ケースの約半分のクローン）
。 図３と図４の両方で、ブラックボックスは部位がアッセイされていなかったこ
とを示し、“Ｂ”は部位の状態が決定できなかったことを示す（例えば、配列遮
断のために、または配列ランの範囲を超えていた）。各部位で検出されるメチル
化のレベルは、なし（−）、２５％まで（＋）、２６−５０％（＋＋）、５１−
７５％（＋＋＋）、及び７６−１００％（＋＋＋＋）で示される。腫瘍試料のグ
リーソンの分類も示される。
試料からの（ＢＣ，ＣＣ及びＤＣ）、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のコアプロモーター領
域及び上流配列について、及び多くの他の組織について。患者Ｂ及びＤは、Ｃｐ
Ｇ部位−３３で多形であり、角型かっこで示されるメチル化のレベルは、ＣｐＧ
を含む対立遺伝子のメチル化を反映する。ＣｐＧ部位−２８から＋１０において
、メチル化のレベルは、ＰＣＲ分子の集団の直接配列分析により決定される（１
７）。上流のＣｐＧ部位、−５６から−３０では、ＰＣＲ産物はクローン化され
、多くの個々のクローンが配列決定された（試料名の下に角型カッコで示された
番号）。正常組織において、各部位でのメチル化のレベルは、その位置にＣを含
むすべてのクローンの画分として決定された。ガン試料ＢＣ、ＣＣ及びＤＣにお
いて、示されるメチル化のレベルは、ＣｐＧ部位−４３から−３０までの領域内
にＤＮＡメチル化を示したクローンの中である（各ケースの約半分のクローン）
。 図３と図４の両方で、ブラックボックスは部位がアッセイされていなかったこ
とを示し、“Ｂ”は部位の状態が決定できなかったことを示す（例えば、配列遮
断のために、または配列ランの範囲を超えていた）。各部位で検出されるメチル
化のレベルは、なし（−）、２５％まで（＋）、２６−５０％（＋＋）、５１−
７５％（＋＋＋）、及び７６−１００％（＋＋＋＋）で示される。腫瘍試料のグ
リーソンの分類も示される。
【図５】 図５は種々の組織からの重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の結果を提
供する。 Ａ−パネルＡ（転写開始部位をカバーする領域）はＣＧＰＳ−１及び３を外側の
プライマーとして、ＣＧＰＳ−２及び４は内側のプライマーとして用いた。パネ
ルＢは、増幅の第１ラウンドでは、ＣｐＧ部位−３９から−１６からの領域を包
含する外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８を用い、 それに続く増幅の第２
ラウンドではＣＧＰＳ−６及び７を用いＣＰＧ部位−３６から−２３をカバーす
る１４０ｂｐ断片を増幅した。レーンは、１．脳、２．肺、３．骨格筋、４．脾
臓、５、膵臓、６．“正常”前立腺、８５歳、７．“正常”前立腺、６２歳、８
．心臓、９．骨髄、１０．血液−１、１１．血液−２、１２．血液−３、１３．
肝臓−１、１４．肝臓−２：
供する。 Ａ−パネルＡ（転写開始部位をカバーする領域）はＣＧＰＳ−１及び３を外側の
プライマーとして、ＣＧＰＳ−２及び４は内側のプライマーとして用いた。パネ
ルＢは、増幅の第１ラウンドでは、ＣｐＧ部位−３９から−１６からの領域を包
含する外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８を用い、 それに続く増幅の第２
ラウンドではＣＧＰＳ−６及び７を用いＣＰＧ部位−３６から−２３をカバーす
る１４０ｂｐ断片を増幅した。レーンは、１．脳、２．肺、３．骨格筋、４．脾
臓、５、膵臓、６．“正常”前立腺、８５歳、７．“正常”前立腺、６２歳、８
．心臓、９．骨髄、１０．血液−１、１１．血液−２、１２．血液−３、１３．
肝臓−１、１４．肝臓−２：
【図６】 図６は種々の組織からの重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の結果を提
供する。 Ｂ−図５パネルＢで示された、１０の前立腺ガン組織試料（ｃ）及び同じ前立腺
のマッチした正常（ｎ）組織試料からのＤＮＡを用いた増幅のそれが同じプライ
マー対を用いられた（陽性対照（＋）ＬＮＣａＰＤＮＡ及び陰性対照（−）も示
す）。下には、グリーソンの分類及び非選択プライマーでみられる試料のメチル
化のレベルである。
供する。 Ｂ−図５パネルＢで示された、１０の前立腺ガン組織試料（ｃ）及び同じ前立腺
のマッチした正常（ｎ）組織試料からのＤＮＡを用いた増幅のそれが同じプライ
マー対を用いられた（陽性対照（＋）ＬＮＣａＰＤＮＡ及び陰性対照（−）も示
す）。下には、グリーソンの分類及び非選択プライマーでみられる試料のメチル
化のレベルである。
【図７】 図７は種々の組織からの重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の結果を提
供する。 Ｃ−図５パネルＢで示された、健常組織、前立腺ガン患者の血液及び種々の細胞
系の範囲からのＤＮＡを用いた増幅のそれが同じプライマー対を用いた。レーン
は、パネルＡ１−１０ 根治的前立腺切除の間の前立腺ガン患者からの血液試料
；パネルＢ１．正常前立腺−１、２．正常前立腺−２、３．正常前立腺−３、４
．正常前立腺−４、５．正常前立腺−５、６．ＨＰＶ形質転換前立腺細胞系、７
．前立腺患者ＰＡからの血液（ＰＳＡ＝１０００）、８．前立腺患者ＰＢからの
血液（ＰＳＡ＝５６）、９．前立腺患者ＰＣからの血液（ＰＳＡ＝１８）；パネ
ルＣ １．ＬＮＣａＰ細胞系、２．Ｄｕ１４５歳傍系、３．ＰＣ−３細胞系、４
．ＰＣ−３Ｍ細胞系、５．ＰＣ−３ＭＭ細胞系、６．Ｈｅｌａ細胞系、７．白血
病ＤＮＡ、８．ＨｅｐＧ２細胞系、９．ヒト肝臓ＤＮＡ、１０．白血球、１１．
ＭＲＣ−５細胞系。
供する。 Ｃ−図５パネルＢで示された、健常組織、前立腺ガン患者の血液及び種々の細胞
系の範囲からのＤＮＡを用いた増幅のそれが同じプライマー対を用いた。レーン
は、パネルＡ１−１０ 根治的前立腺切除の間の前立腺ガン患者からの血液試料
；パネルＢ１．正常前立腺−１、２．正常前立腺−２、３．正常前立腺−３、４
．正常前立腺−４、５．正常前立腺−５、６．ＨＰＶ形質転換前立腺細胞系、７
．前立腺患者ＰＡからの血液（ＰＳＡ＝１０００）、８．前立腺患者ＰＢからの
血液（ＰＳＡ＝５６）、９．前立腺患者ＰＣからの血液（ＰＳＡ＝１８）；パネ
ルＣ １．ＬＮＣａＰ細胞系、２．Ｄｕ１４５歳傍系、３．ＰＣ−３細胞系、４
．ＰＣ−３Ｍ細胞系、５．ＰＣ−３ＭＭ細胞系、６．Ｈｅｌａ細胞系、７．白血
病ＤＮＡ、８．ＨｅｐＧ２細胞系、９．ヒト肝臓ＤＮＡ、１０．白血球、１１．
ＭＲＣ−５細胞系。
【図８】 図８は、前立腺ガン患者の精液（ｃ）からの、及び前立腺ガンとは
診断されない男性からの（ｎ）、外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８、内側
のプライマー対としてＣＧＰＳ−６及び７を用いた、重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増
幅の結果を提供する。レーンは、１．ＬＮＣａＰ細胞系（陽性対照）、２．Ｄｕ
１４５歳傍系、３．ＰＣ−３細胞系（陰性対照）、Ｍ．分子量マーカー。
診断されない男性からの（ｎ）、外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８、内側
のプライマー対としてＣＧＰＳ−６及び７を用いた、重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増
幅の結果を提供する。レーンは、１．ＬＮＣａＰ細胞系（陽性対照）、２．Ｄｕ
１４５歳傍系、３．ＰＣ−３細胞系（陰性対照）、Ｍ．分子量マーカー。
【図９】 図９は、ＤＮＡが、ガンあるいは良性の過形成を有する疾患（ＢＰ
Ｈ）のいずれかとして同定された前立腺組織切片から単離された、重亜硫酸処理
ＤＮＡｓの増幅の結果を提供する。選択的ＰＣＲ増幅は、外側プライマーＣＧＰ
Ｓ−５及び８と内側プライマーＣＧＰＳ−１１と１２を用いて実施した。
Ｈ）のいずれかとして同定された前立腺組織切片から単離された、重亜硫酸処理
ＤＮＡｓの増幅の結果を提供する。選択的ＰＣＲ増幅は、外側プライマーＣＧＰ
Ｓ−５及び８と内側プライマーＣＧＰＳ−１１と１２を用いて実施した。
【図１０】 図１０は、ＤＮＡが、抗上皮抗体で被覆された磁気ビーズを用い
て血液試料から濃縮された前立腺ガン細胞から単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡ
ｓの増幅の結果を提供する。ＬＮＣａＰ前立腺ガン細胞の異なる番号が、血液試
料（１０Ａ）又はＤＮＡ単離の前に異なる時間に４℃又は室温で保存された添加
されたＬＮＣａＰ細胞を有する血液に加えられた。
て血液試料から濃縮された前立腺ガン細胞から単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡ
ｓの増幅の結果を提供する。ＬＮＣａＰ前立腺ガン細胞の異なる番号が、血液試
料（１０Ａ）又はＤＮＡ単離の前に異なる時間に４℃又は室温で保存された添加
されたＬＮＣａＰ細胞を有する血液に加えられた。
【図１１】 図１１は、前立腺に問題がない正常被験者から、前立腺の良性過
形成（ＢＰＨ）を有する患者から、組織的に前立腺と確認された患者からの血液
試料からＤＮＡが単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の結果を提供する。
形成（ＢＰＨ）を有する患者から、組織的に前立腺と確認された患者からの血液
試料からＤＮＡが単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の結果を提供する。
【図１２】 図１２は、２０の肝臓組織試料から単離された重亜硫酸処理ＤＮ
Ａｓの増幅の結果を提供する。選択的ＰＣＲ増幅は、外側プライマーＣＧＰＳ−
５及び８と内側プライマーＣＧＰＳ−１１と１２を用いて実施した。
Ａｓの増幅の結果を提供する。選択的ＰＣＲ増幅は、外側プライマーＣＧＰＳ−
５及び８と内側プライマーＣＧＰＳ−１１と１２を用いて実施した。
【図１３】 図１３は、いかなる増幅ＤＮＡ生産物も、すべての非メチル化シ
トシンがウラシルに転換された重亜硫酸処理ＤＮＡの増幅から生成することを確
認するために実施された試験の結果を提供する。試験は、転換されたあるいは転
換されていない標的領域とハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオ
チドプローブを用いて実施される。
トシンがウラシルに転換された重亜硫酸処理ＤＮＡの増幅から生成することを確
認するために実施された試験の結果を提供する。試験は、転換されたあるいは転
換されていない標的領域とハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオ
チドプローブを用いて実施される。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月２６日（２０００．６．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】
【発明の実施の形態】 このようにして、第１の態様において、本発明は、被験者の疾患又は病状の、
診断又は予後のアッセイであって、疾患又は病状は、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の部
位におけるシトシンの異常なメチル化により特徴づけられ、上記アッセイは以下
の工程： （i）上記被験者からＤＮＡを単離すること、 （ii） 疾患又は病状に特徴的な、異常なシトシンメチル化がおこる部位を含む
、GST-Pi遺伝子及び／又はその調節フランキング配列の標的となる領域の増幅の
ための反応物と条件に、上記単離されたＤＮＡをさらすこと、ここで増幅は、異
常なシトシンメチル化がおこる上記部位がメチル化されるときに標的領域のみ増
幅させるような選択的なものである、 （iii） 増幅ＤＮＡの存在を決定すること を含むものであり、 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋５５により定義される（およびその包括の
）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の標的領域を増幅
するために用いられるものである、アッセイを提供する。
診断又は予後のアッセイであって、疾患又は病状は、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の部
位におけるシトシンの異常なメチル化により特徴づけられ、上記アッセイは以下
の工程： （i）上記被験者からＤＮＡを単離すること、 （ii） 疾患又は病状に特徴的な、異常なシトシンメチル化がおこる部位を含む
、GST-Pi遺伝子及び／又はその調節フランキング配列の標的となる領域の増幅の
ための反応物と条件に、上記単離されたＤＮＡをさらすこと、ここで増幅は、異
常なシトシンメチル化がおこる上記部位がメチル化されるときに標的領域のみ増
幅させるような選択的なものである、 （iii） 増幅ＤＮＡの存在を決定すること を含むものであり、 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋５５により定義される（およびその包括の
）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の標的領域を増幅
するために用いられるものである、アッセイを提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】 増幅の工程は、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の
標的領域を増幅するために用いられる。調節フランキング配列は、単独又は他の
要素との組み合わせで、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の発現を制御する要素を含むＧＳＴ
−Ｐｉ遺伝子のフランキング配列５’及び３’とみなされることができる。
標的領域を増幅するために用いられる。調節フランキング配列は、単独又は他の
要素との組み合わせで、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の発現を制御する要素を含むＧＳＴ
−Ｐｉ遺伝子のフランキング配列５’及び３’とみなされることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】 特に、増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋５５（ここで、ＣｐＧ部位の番号
付けは転写開始部位に対するものである）により定義される（およびその包括の
）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の標的領域を増幅するた
めに用いられる。ＣｐＧの番号付けと位置は図１に示す。
付けは転写開始部位に対するものである）により定義される（およびその包括の
）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の標的領域を増幅するた
めに用いられる。ＣｐＧの番号付けと位置は図１に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 スーザン・ジョイ・クラーク オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2067・チャッツウッド・ベルヴ・ス トリート・41 (72)発明者 ダグラス・エス・ミラー オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2137・コンコード・トラファルガ ー・パレード・56 (72)発明者 ピーター・ローレンス・モロイ オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2067・チャッツウッド・ベルヴ・ス トリート・41 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 CA01 CA02 CA09 CA20 DA03 HA08 HA11 HA12 HA14 HA19 4B063 QA01 QA13 QA19 QQ02 QQ03 QQ08 QQ42 QQ44 QQ58 QR08 QR31 QR50 QR55 QR62 QS25 QS34
Claims (46)
- 【請求項１】 被験者の疾患又は病状の、診断又は予後のアッセイであって
、上記疾患又は病状は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ
遺伝子及び／又はその調節フランキング配列内の部位におけるシトシンの異常な
メチル化により特徴づけられ、上記アッセイは以下の工程： （i） 上記被験者からＤＮＡを単離すること、 （ii） 疾患又は病状に特徴的な、異常なシトシンメチル化がおこる部位を含む
、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング配列の標的となる領域の
増幅のための反応物と条件に、上記単離されたＤＮＡをさらすこと、ここで増幅
は、異常なシトシンメチル化がおこる上記部位がメチル化されるときに標的領域
のみ増幅させるような選択的なものである、 （iii） 増幅ＤＮＡの存在を決定すること を含むものであるアッセイ。 - 【請求項２】 増幅工程が、 ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フラ
ンキング配列内の標的領域を増幅するために用いられるものであり、調節フラン
キング配列は ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の転写開始部位の５’直ぐの４００ヌクレオ
チド配列と、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の転写終結部位の３’直ぐの１００ヌクレオチ
ド配列からなる、請求項１記載のアッセイ。 - 【請求項３】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋５５により定義される
（およびその包括の）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の標
的領域を増幅するために用いられるものである、請求項１または２記載のアッセ
イ。 - 【請求項４】 増幅工程の前に、非メチル化シトシンが、ウラシルに、又は
アデニンと塩基対を形成することができる他のヌクレオチドに転換され、メチル
化シトシンは変化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成することができるヌ
クレオチドに転換されるように、単離されたＤＮＡを処理する、請求項１ないし
３のいずれか１項記載のアッセイ。 - 【請求項５】 増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含むもの
である、請求項１ないし４のいずれか１項記載のアッセイ。 - 【請求項６】 上記ＰＣＲ増幅が、少なくとも１つの部位にグアニンを含む
逆方向プライマーを利用するものであって、それにより、処理されたＤＮＡにア
ニ−ルする逆方向プライマー上に、上記グアニンが、存在すればメチル化シトシ
ン（又は、上記処理によってメチル化シトシンが転換された他のヌクレオチド）
塩基対を形成するか、あるいはウラシル（又は、上記処理によって非メチル化シ
トシンが転換された他のヌクレオチド）とミスマッチを形成することになる、請
求項５記載のアッセイ。 - 【請求項７】 上記ＰＣＲ増幅が、少なくとも１つの部位にシトシンを含む
正方向プライマーを利用するものであって、この部位はアッセイされる疾患又は
病状を有する被験者のＤＮＡ中で異常にメチル化されたシトシンヌクレオチドに
対応するものである、請求項６記載のアッセイ。 - 【請求項８】 プライマーが１２から３０のヌクレオチドの長さである、請
求項７記載のアッセイ。 - 【請求項９】 プライマーが、アッセイされる疾患又は病状を有する被験者
の単離されたＤＮＡ中で異常にメチル化された２から４のシトシンヌクレオチド
を含む標的領域内の配列にアニ−ルするように選択されるものである、請求項８
記載のアッセイ。 - 【請求項１０】 単離されたＤＮＡの処理が、単離されたＤＮＡと重亜硫酸
との反応を含むものである、請求項４記載のアッセイ。 - 【請求項１１】 増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含むも
のである、請求項１０記載のアッセイ。 - 【請求項１２】 上記ＰＣＲ増幅が、少なくとも１つの部位にグアニンを含
む逆方向プライマーを利用するものであって、それにより、処理されたＤＮＡに
アニ−ルする逆方向プライマー上に、上記グアニンが、存在すればメチル化シト
シンと塩基対を形成するか、あるいはウラシルとミスマッチを形成することにな
る、請求項１１記載のアッセイ。 - 【請求項１３】 上記ＰＣＲ増幅は、アッセイされる疾患又は病状を有する
被験者の単離されたＤＮＡ中で異常にメチル化されたシトシンヌクレオチドに対
応する少なくとも１つの部位にシトシンを含む正方向プライマーを利用するもの
である、請求項１２記載のアッセイ。 - 【請求項１４】 プライマーが１２から３０のヌクレオチドの長さである、
請求項７記載のアッセイ。 - 【請求項１５】 プライマーが、アッセイされる疾患又は病状を有する被験
者の単離されたＤＮＡ中で異常にメチル化された２から４のシトシンヌクレオチ
ドを含む標的領域内の配列にアニ−ルするように選択されるものである、請求項
１４記載のアッセイ。 - 【請求項１６】 上記ＤＮＡが、組織、血液（血清及び血漿を含む）、精液
、尿、リンパ、又は骨髄からの細胞より単離されるものである、請求項１ないし
１５のいずれか１項記載のアッセイ。 - 【請求項１７】 アッセイされる疾患または状態が、ガンから選ばれる請求
項１ないし１５のいずれか１項記載のアッセイ。 - 【請求項１８】 アッセイされる疾患又は病状が、前立腺ガン、乳ガン、頚
部ガン、及び肝臓ガンから選ばれる請求項１７記載のアッセイ。 - 【請求項１９】 アッセイされる疾患又は病状が、前立腺ガンである請求項
１８記載のアッセイ。 - 【請求項２０】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋５３により定義され
る（およびその包括の）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の
標的領域を増幅するために用いられるものである請求項１９記載のアッセイ。 - 【請求項２１】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋１０により定義され
る（およびその包括の）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の
標的領域を増幅するために用いられるものである請求項１９記載のアッセイ。 - 【請求項２２】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から−１４により定義され
る（およびその包括の）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の
標的領域を増幅するために用いられるものである請求項１９記載のアッセイ。 - 【請求項２３】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から−８により定義される
（およびその包括の）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の標
的領域を増幅するために用いられるものである請求項１９記載のアッセイ。 - 【請求項２４】 増幅工程が、ＣｐＧ部位＋９から＋５３により定義される
（およびその包括の）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の標
的領域を増幅するために用いられるものである請求項１９記載のアッセイ。 - 【請求項２５】 増幅工程が、ＣｐＧ部位＋１から＋５３により定義される
（およびその包括の）ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の標
的領域を増幅するために用いられるものである請求項１９記載のアッセイ。 - 【請求項２６】 増幅工程が、以下の群の各々より選ばれる正方向及び逆方
向プライマーからなるプライマー対を用いるＰＣＲ増幅を含むものである、請求
項１９記載のアッセイ。 正方向プライマー [配列１] 逆方向プライマー [配列２] （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、ＲはＡ，Ｇ，またはそれら
の混合物である） - 【請求項２７】 増幅工程が、以下の群の各々より選ばれる正方向及び逆方
向プライマーからなるプライマー対を用いるＰＣＲ増幅を含むものである、請求
項１９記載のアッセイ。 正方向プライマー [配列３] 逆方向プライマー [配列４] - 【請求項２８】 増幅工程が、以下の群の各々より選ばれる正方向及び逆方
向プライマーからなるプライマー対を用いるＰＣＲ増幅を含むものである、請求
項１９記載のアッセイ。 正方向プライマー [配列５] 逆方向プライマー [配列６] （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、ＲはＡ，Ｇ，またはそれら
の混合物である） - 【請求項２９】 増幅工程が、以下の群の各々より選ばれる正方向及び逆方
向プライマーからなるプライマー対を用いるＰＣＲ増幅を含むものである、請求
項１９記載のアッセイ。 正方向プライマー [配列７] 逆方向プライマー [配列８] （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、ＲはＡ，Ｇ，またはそれら
の混合物である） - 【請求項３０】 アッセイされる疾患又は病状が肝臓ガンである請求項１８
記載のアッセイ。 - 【請求項３１】 増幅工程がＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びＣｐＧ部位−４３から
−１４により定義される（およびその包括の）その調節フランキング配列内の標
的領域を増幅するために用いられるものである請求項３０記載のアッセイ。 - 【請求項３２】 増幅工程がＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びＣｐＧ部位＋９から＋
５３により定義される（およびその包括の）その調節フランキング配列内の標的
領域を増幅するために用いられるものである請求項１９記載のアッセイ。 - 【請求項３３】 被験者の疾患の又は状態の診断又は予後のアッセイであっ
て、疾患又は病状は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺
伝子及び／又はその調節フランキング配列内での部位でのシトシンの異常なメチ
ル化により特徴づけられ、上記アッセイは以下の工程を含むものであるアッセイ
。 （i）上記被験者よりDNAを単離すること （ii） ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はＣｐＧ部位−４３から＋５５により定義
される（およびその包括の）その調節フランキング配列内の部位における異常な
シトシンメチル化の存在を決定すること。 - 【請求項３４】 部位でのメチル化シトシンの存在がその内部に決定される
、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列が、ＣｐＧ部位−４３から
＋５３、−４３から＋１０、−４３から−１４、＋９から＋５３、＋１から＋５
３により定義される（およびその包括の）領域から選ばれるものである請求項３
３記載のアッセイ。 - 【請求項３５】 部位でのメチル化シトシンの存在がその内部に決定される
、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列が、ＣｐＧ部位が＋９から
＋５３により定義される（およびその包括の）領域から選ばれるものである請求
項３３記載のアッセイ。 - 【請求項３６】 部位でのメチル化シトシンの存在がその内部に決定される
、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列が、ＣｐＧ部位＋１から＋
５３により定義される（およびその包括の）領域から選ばれるものである請求項
３３記載のアッセイ。 - 【請求項３７】 決定工程の前に、非メチル化シトシンが、ウラシル、又は
アデニンと塩基対を形成することができる他のヌクレオチドに転換され、かつメ
チル化シトシンが変化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成することができ
るヌクレオチドに転換されるように、単離されたＤＮＡを処理する、請求項１な
いし３のいずれか１項記載のアッセイ。 - 【請求項３８】 単離されたＤＮＡの処理が、単離されたＤＮＡと重亜硫酸
との反応を含むものである、請求項３７記載のアッセイ。 - 【請求項３９】 決定工程が、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド／ペ
プチド−核酸（ＰＮＡ）プローブの選択的ハイブリダイゼーションを含むもので
ある、請求項３３ないし３８のいずれか１項記載のアッセイ。 - 【請求項４０】 上記ＤＮＡが、組織、血液（血清及び血漿を含む）、精液
、尿、リンパ、又は骨髄からの細胞より単離されるものである、請求項３３ない
し３９のいずれか１項記載のアッセイ。 - 【請求項４１】 アッセイされる疾患または状態が、ガンから選ばれる請求
項３３ないし４０のいずれか１項記載のアッセイ。 - 【請求項４２】 アッセイされる疾患又は病状が、前立腺ガン、乳ガン、頚
部ガン、及び肝臓ガンから選ばれる請求項４１記載のアッセイ。 - 【請求項４３】 アッセイされる疾患又は病状が、前立腺ガンである請求項
４２記載のアッセイ。 - 【請求項４４】 アッセイされる疾患又は病状が、肝臓ガンである請求項４
２記載のアッセイ。 - 【請求項４５】 以下のものからなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含
むプライマー又はプローブ。 [配列９] （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、ＲはＡ，Ｇ，またはそれら
の混合物である） - 【請求項４６】 以下のものからなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含
むプライマー又はプローブ。 転換オリゴヌクレオチド [配列１０]
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