JP3522690B2 - ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のメチル化のアッセイ - Google Patents
ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のメチル化のアッセイInfo
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又は
その調節フランキング配列内での部位でのシトシンの異
常なメチル化により特徴づけられる疾患又は病状の診断
又は予後のアッセイに関する。１つの特定の適用におい
て、本発明は前立腺ガンの診断又は予後のアッセイを提
供する。
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又は
その調節フランキング配列内での部位でのシトシンの異
常なメチル化により特徴づけられる疾患又は病状の診断
又は予後のアッセイに関する。１つの特定の適用におい
て、本発明は前立腺ガンの診断又は予後のアッセイを提
供する。
【０００２】
【従来の技術】哺乳動物ゲノムにおけるＤＮＡメチル化
高等動物及び植物ゲノムにおけるＤＮＡの合成後修飾の
うちただ１つ確立されたものは、シトシンの５‘位置の
メチル化である。メチル化されるシトシンの割合は、あ
る動物のゲノムの数パーセント（１）からある植物のゲ
ノムの３０％（２）まで変化し得る。このメチル化の多
くは、各鎖に対称的に位置するシトシンがメチル化され
る、ＣｐＧ部位に見出される。植物のゲノムにおいて、
同様の、ＣｐＮｐＧ（Ｎはいかなる塩基でも良い）での
シトシンの対称的メチル化もまた共通である（３）。メ
チル化のそのような部位も、哺乳動物ＤＮＡ（４）にお
いて低い頻度で同定されている。
うちただ１つ確立されたものは、シトシンの５‘位置の
メチル化である。メチル化されるシトシンの割合は、あ
る動物のゲノムの数パーセント（１）からある植物のゲ
ノムの３０％（２）まで変化し得る。このメチル化の多
くは、各鎖に対称的に位置するシトシンがメチル化され
る、ＣｐＧ部位に見出される。植物のゲノムにおいて、
同様の、ＣｐＮｐＧ（Ｎはいかなる塩基でも良い）での
シトシンの対称的メチル化もまた共通である（３）。メ
チル化のそのような部位も、哺乳動物ＤＮＡ（４）にお
いて低い頻度で同定されている。
【０００３】メチラーゼ酵素が、基質として、一方の鎖
でＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されているが、他方
の鎖の対応するＣが非メチル化である部位を認識し、そ
れのメチル化をすすめるので、メチル化のパターンは、
遺伝性である（５，６）。十分に非メチル化である部位
は、通常、酵素の基質として作用せず、それに続く細胞
分裂の間、非メチル化のまま残る。こうしてエラー又は
特異的に介入する出来事なしに、メチラーゼ酵素はメチ
ル化パターンの安定な遺伝性を可能にする。
でＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されているが、他方
の鎖の対応するＣが非メチル化である部位を認識し、そ
れのメチル化をすすめるので、メチル化のパターンは、
遺伝性である（５，６）。十分に非メチル化である部位
は、通常、酵素の基質として作用せず、それに続く細胞
分裂の間、非メチル化のまま残る。こうしてエラー又は
特異的に介入する出来事なしに、メチラーゼ酵素はメチ
ル化パターンの安定な遺伝性を可能にする。
【０００４】脊椎動物の遺伝子発現の詳細な研究によ
り、遺伝子の制御領域のメチル化とその発現欠損との強
い相関性が示されてきた（７）。そのような研究の多く
は、標的の部位がメチル化されるときに切断できない酵
素を用いて制限酵素部位の限定された数だけを調べてい
る。ゲノム配列方法を用いて、すべてのシトシン塩基に
おいて、より限定された数が調べられている（８，
９）。
り、遺伝子の制御領域のメチル化とその発現欠損との強
い相関性が示されてきた（７）。そのような研究の多く
は、標的の部位がメチル化されるときに切断できない酵
素を用いて制限酵素部位の限定された数だけを調べてい
る。ゲノム配列方法を用いて、すべてのシトシン塩基に
おいて、より限定された数が調べられている（８，
９）。
【０００５】ＤＮＡの重亜硫酸転換
高濃度重亜硫酸による一本鎖ＤＮＡの処理と、その後の
アルカリによる処理は、シトシンの選択的な脱アミノ化
をおこし、それがウラシルに変換される（１０，１
１）。これと対照的に、５−メチルシトシン（５ｍｅ
Ｃ）は、この化学的脱アミノ化に対して耐性である。重
亜硫酸処理ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼにより複製する
ときに、ウラシルは、チミンであるように読まれ、アデ
ニンヌクレオチドが取り込まれるが、５ｍｅＣはシトシ
ンとして読まれる（Ｇが反対に取り込まれる）。こうし
て、配列の領域がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により
増幅された後、元のＤＮＡでメチル化された配列中のシ
トシンはシトシンとして読まれるであろうが、非メチル
化シトシンはチミンとして読まれるであろう（１２，１
３）。
アルカリによる処理は、シトシンの選択的な脱アミノ化
をおこし、それがウラシルに変換される（１０，１
１）。これと対照的に、５−メチルシトシン（５ｍｅ
Ｃ）は、この化学的脱アミノ化に対して耐性である。重
亜硫酸処理ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼにより複製する
ときに、ウラシルは、チミンであるように読まれ、アデ
ニンヌクレオチドが取り込まれるが、５ｍｅＣはシトシ
ンとして読まれる（Ｇが反対に取り込まれる）。こうし
て、配列の領域がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により
増幅された後、元のＤＮＡでメチル化された配列中のシ
トシンはシトシンとして読まれるであろうが、非メチル
化シトシンはチミンとして読まれるであろう（１２，１
３）。
【０００６】メチル化及び非メチル化ＤＮＡのＰＣＲ増
幅 重亜硫酸処理ＤＮＡを増幅させるために、ＤＮＡの重亜
硫酸処理の後に生産される配列にアニールするプライマ
ーを設計した。シトシンはウラシルに転換されるため
に、アニールするプライマー中の塩基は、非転換シトシ
ンについては、グアニンでなくアデニンとなる。同様
に、対の他のプライマーについては、チミンはシトシン
を置換する。標的ＤＮＡ中のメチル化のレベルの定量を
可能にするために、プライマーは通常、メチル化される
かもしれない、またはされないかもしれない部位（特に
ＣｐＧ部位）、及び重亜硫酸処理の後、５ｍｅＣ又はウ
ラシルを含むかもしれない部位を避けるように選ばれ
る。そのような非選択的プライマーの使用は、メチル化
及び非メチルＤＮＡの両方が、ＰＣＲで増幅されること
を可能にし、出発ＤＮＡ集団のメチル化のレベルの定量
化を提供する。ＰＣＲ増幅ＤＮＡは、有益な制限酵素で
切断することができ、直接配列決定して、いかなる位置
又は分子でも、メチル化の割合の平均決定がクローン化
及びは配列決定できること（各クローンは、最初のＤＮ
Ａでの個々の鎖の増幅から発生するものであろう）を提
供できる。そのような研究は、分子の集団がメチル化の
全体のパターンと一致するであろうが、すべての分子
が、同一ではないであろうし、メチル化が、いくつかの
部位の分子の画分にのみ見出されるかもしれないことを
示している（１３，１６）。
幅 重亜硫酸処理ＤＮＡを増幅させるために、ＤＮＡの重亜
硫酸処理の後に生産される配列にアニールするプライマ
ーを設計した。シトシンはウラシルに転換されるため
に、アニールするプライマー中の塩基は、非転換シトシ
ンについては、グアニンでなくアデニンとなる。同様
に、対の他のプライマーについては、チミンはシトシン
を置換する。標的ＤＮＡ中のメチル化のレベルの定量を
可能にするために、プライマーは通常、メチル化される
かもしれない、またはされないかもしれない部位（特に
ＣｐＧ部位）、及び重亜硫酸処理の後、５ｍｅＣ又はウ
ラシルを含むかもしれない部位を避けるように選ばれ
る。そのような非選択的プライマーの使用は、メチル化
及び非メチルＤＮＡの両方が、ＰＣＲで増幅されること
を可能にし、出発ＤＮＡ集団のメチル化のレベルの定量
化を提供する。ＰＣＲ増幅ＤＮＡは、有益な制限酵素で
切断することができ、直接配列決定して、いかなる位置
又は分子でも、メチル化の割合の平均決定がクローン化
及びは配列決定できること（各クローンは、最初のＤＮ
Ａでの個々の鎖の増幅から発生するものであろう）を提
供できる。そのような研究は、分子の集団がメチル化の
全体のパターンと一致するであろうが、すべての分子
が、同一ではないであろうし、メチル化が、いくつかの
部位の分子の画分にのみ見出されるかもしれないことを
示している（１３，１６）。
【０００７】メチル化ＤＮＡの選択的増幅
最近、Hermanら（１４）は、メチル化ＤＮＡだけの増幅
を選択的にするような重亜硫酸配列方法の変法を記載し
ている。この研究で、メチル化と非メチル化標的ＤＮＡ
の重亜硫酸処理の後生産される配列の間を識別するよう
に設計されたＰＣＲプライマーが用いられた。こうし
て、ＣｐＧ部位の一部を形成したシトシンは、重亜硫酸
転換されず、メチル化ＤＮＡ中にシトシンとして残るで
あろうが、非メチル化標的ＤＮＡではウラシルに転換さ
れるであろう。これらの相違を利用するプライマーは、
４つの腫瘍サプレッサー遺伝子、ｐ１６、ｐ１５、Ｅ−
カドヘリン、フォン・ヒッペル−リンダウからメチル化
ＤＮＡ配列の増幅のために設計し、用いた。
を選択的にするような重亜硫酸配列方法の変法を記載し
ている。この研究で、メチル化と非メチル化標的ＤＮＡ
の重亜硫酸処理の後生産される配列の間を識別するよう
に設計されたＰＣＲプライマーが用いられた。こうし
て、ＣｐＧ部位の一部を形成したシトシンは、重亜硫酸
転換されず、メチル化ＤＮＡ中にシトシンとして残るで
あろうが、非メチル化標的ＤＮＡではウラシルに転換さ
れるであろう。これらの相違を利用するプライマーは、
４つの腫瘍サプレッサー遺伝子、ｐ１６、ｐ１５、Ｅ−
カドヘリン、フォン・ヒッペル−リンダウからメチル化
ＤＮＡ配列の増幅のために設計し、用いた。
【０００８】前立腺ガンでのグルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼＰｉ遺伝子のメチル化 Leeら（１５）（米国特許第５，５５２，２７７号及び
国際特許出願No.PCT/US95/09050）は、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子の発現
が、前立腺ガンのほとんどすべてのケースで失われてい
ることを示した。彼らはさらに調べた２０のケースで、
サザンブロッティングを用いて、この発現欠損に、遺伝
子のプロモーター領域中の特異的制限酵素部位（BssHI
I）のメチル化が伴っていたことを示した。このメチル
化は、通常の前立腺組織あるいは調べた多くの他の正常
組織では見られなかった。ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子が不活性
化されている前立腺ガン細胞系の研究において、彼ら
は、遺伝子のプロモーター領域の２つの他の制限酵素部
位、NotI及びSacIIでのメチル化の同定もした。細胞系D
NAの酵素MspI及びHpaIIでの消化は、ＤＮＡメチル化と
発現欠損との相関性が、転写開始部位の下流に多くが位
置しているこれらの部位で、保持されなかったことをを
示した。このデータの本質は、ここのMspI/HpaII部位の
メチル化状態に関する結論に到達することを困難にして
いる。しかしながら、Leeら（１８）は、HpaII消化（こ
れはすべての非メチル化HpaII部位を切断するであろ
う）の後、１２のHpaII認識部位を含有するＤＮＡの領
域が、腫瘍ＤＮＡからＰＣＲにより増幅されたであろう
が、正常前立腺又は白血球ＤＮＡからは増幅されないこ
とを示すことができた。このことは、前立腺ガンのいく
つかのＤＮＡ分子が、すべてのこれらのHpaII部位でメ
チル化されているが、正常前立腺からのＤＮＡ及び白血
球ＤＮＡは、これらの非メチル化された部位が少なくと
も１つは含んでいるに違いないことを示す（1回の切断
がその領域をＰＣＲで増幅しなくするため）。
スフェラーゼＰｉ遺伝子のメチル化 Leeら（１５）（米国特許第５，５５２，２７７号及び
国際特許出願No.PCT/US95/09050）は、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子の発現
が、前立腺ガンのほとんどすべてのケースで失われてい
ることを示した。彼らはさらに調べた２０のケースで、
サザンブロッティングを用いて、この発現欠損に、遺伝
子のプロモーター領域中の特異的制限酵素部位（BssHI
I）のメチル化が伴っていたことを示した。このメチル
化は、通常の前立腺組織あるいは調べた多くの他の正常
組織では見られなかった。ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子が不活性
化されている前立腺ガン細胞系の研究において、彼ら
は、遺伝子のプロモーター領域の２つの他の制限酵素部
位、NotI及びSacIIでのメチル化の同定もした。細胞系D
NAの酵素MspI及びHpaIIでの消化は、ＤＮＡメチル化と
発現欠損との相関性が、転写開始部位の下流に多くが位
置しているこれらの部位で、保持されなかったことをを
示した。このデータの本質は、ここのMspI/HpaII部位の
メチル化状態に関する結論に到達することを困難にして
いる。しかしながら、Leeら（１８）は、HpaII消化（こ
れはすべての非メチル化HpaII部位を切断するであろ
う）の後、１２のHpaII認識部位を含有するＤＮＡの領
域が、腫瘍ＤＮＡからＰＣＲにより増幅されたであろう
が、正常前立腺又は白血球ＤＮＡからは増幅されないこ
とを示すことができた。このことは、前立腺ガンのいく
つかのＤＮＡ分子が、すべてのこれらのHpaII部位でメ
チル化されているが、正常前立腺からのＤＮＡ及び白血
球ＤＮＡは、これらの非メチル化された部位が少なくと
も１つは含んでいるに違いないことを示す（1回の切断
がその領域をＰＣＲで増幅しなくするため）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題及び手段】本発明者ら
は、前立腺ガン組織からのＤＮＡ中に存在するが、正常
組織からのＤＮＡには存在しない、メチル化部位を検出
するための代替法を同定し開発した。この方法は、ＧＳ
Ｔ−Ｐｉ遺伝子の標的領域の選択的増幅に基づくもので
あるが、従来の有用な制限酵素での制限を必要としな
い。
は、前立腺ガン組織からのＤＮＡ中に存在するが、正常
組織からのＤＮＡには存在しない、メチル化部位を検出
するための代替法を同定し開発した。この方法は、ＧＳ
Ｔ−Ｐｉ遺伝子の標的領域の選択的増幅に基づくもので
あるが、従来の有用な制限酵素での制限を必要としな
い。
【００１０】
【発明の実施の形態】このようにして、第１の態様にお
いて、本発明は、被験者の疾患又は病状の、診断又は予
後のアッセイであって、疾患又は病状は、グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／
又はその調節フランキング配列内の部位におけるシトシ
ンの異常なメチル化により特徴づけられ、上記アッセイ
は以下の工程：（i）上記被験者からＤＮＡを単離する
こと、（ii） 疾患又は病状に特徴的な、異常なシトシ
ンメチル化がおこる部位を含む、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及
び／又はその調節フランキング配列の標的となる領域の
増幅のための反応物と条件に、上記単離されたＤＮＡを
さらすこと、ここで増幅は、異常なシトシンメチル化が
おこる上記部位がメチル化されるときにのみ標的領域を
増幅させるような選択的なものである、（iii） 増幅Ｄ
ＮＡの存在を決定することを含むものであり、増幅工程
が、ＣｐＧ部位−４３から＋５５までにより定義される
ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の
標的領域を増幅するために用いられるものである、アッ
セイを提供する。
いて、本発明は、被験者の疾患又は病状の、診断又は予
後のアッセイであって、疾患又は病状は、グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／
又はその調節フランキング配列内の部位におけるシトシ
ンの異常なメチル化により特徴づけられ、上記アッセイ
は以下の工程：（i）上記被験者からＤＮＡを単離する
こと、（ii） 疾患又は病状に特徴的な、異常なシトシ
ンメチル化がおこる部位を含む、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及
び／又はその調節フランキング配列の標的となる領域の
増幅のための反応物と条件に、上記単離されたＤＮＡを
さらすこと、ここで増幅は、異常なシトシンメチル化が
おこる上記部位がメチル化されるときにのみ標的領域を
増幅させるような選択的なものである、（iii） 増幅Ｄ
ＮＡの存在を決定することを含むものであり、増幅工程
が、ＣｐＧ部位−４３から＋５５までにより定義される
ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング配列内の
標的領域を増幅するために用いられるものである、アッ
セイを提供する。
【００１１】増幅は、異常なシトシンメチル化（すなわ
ち、アッセイされる疾患又は病状をもたない被験者から
のＤＮＡの対応する部位と比較して）が起こる上記部位
がメチル化されるときのみ標的領域を増幅するように設
計されるので、増幅されるＤＮＡの存在は、そこから単
離されるＤＮＡを得た被験者での疾患又は病状を示唆す
るものであろう。アッセイはこうして被験者における疾
患又は病状の診断又は予後の手段を提供する。
ち、アッセイされる疾患又は病状をもたない被験者から
のＤＮＡの対応する部位と比較して）が起こる上記部位
がメチル化されるときのみ標的領域を増幅するように設
計されるので、増幅されるＤＮＡの存在は、そこから単
離されるＤＮＡを得た被験者での疾患又は病状を示唆す
るものであろう。アッセイはこうして被験者における疾
患又は病状の診断又は予後の手段を提供する。
【００１２】ＤＮＡを単離する工程は、標準のプロトコ
ールに従って、実施することができる。ＤＮＡはいかな
る適当な体の試料、例えば組織（新鮮又は固定化試料）
からの細胞、血液（血清及び血漿を含む）、精液、尿、
リンパ、又は骨髄からの細胞から単離されることができ
る。いくつかのタイプの体の試料、特に血液、精液、尿
及びリンパなどの液体試料のためには、最初に試料をあ
る細胞系（例えば、前立腺細胞）の濃度を富化する工程
に供することが好ましいかもしれない。富化のための１
つの適当な工程は、磁気ビーズへ結合する細胞特異的抗
体と磁気細胞分離装置の使用による、必要な細胞の分離
を含むものである。
ールに従って、実施することができる。ＤＮＡはいかな
る適当な体の試料、例えば組織（新鮮又は固定化試料）
からの細胞、血液（血清及び血漿を含む）、精液、尿、
リンパ、又は骨髄からの細胞から単離されることができ
る。いくつかのタイプの体の試料、特に血液、精液、尿
及びリンパなどの液体試料のためには、最初に試料をあ
る細胞系（例えば、前立腺細胞）の濃度を富化する工程
に供することが好ましいかもしれない。富化のための１
つの適当な工程は、磁気ビーズへ結合する細胞特異的抗
体と磁気細胞分離装置の使用による、必要な細胞の分離
を含むものである。
【００１３】増幅工程の前に、非メチル化シトシンが、
ウラシル、又はアデニンと塩基対を形成することができ
る他のヌクレオチドに転換され、かつメチル化シトシン
が変化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成するこ
とができるヌクレオチドに転換されるように、単離され
たＤＮＡを処理することが好ましい。この処理は、異常
なシトシンメチル化が起こる上記部位がメチル化される
ときに標的領域の選択的増幅を可能にするプライマーの
設計を可能にする。
ウラシル、又はアデニンと塩基対を形成することができ
る他のヌクレオチドに転換され、かつメチル化シトシン
が変化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成するこ
とができるヌクレオチドに転換されるように、単離され
たＤＮＡを処理することが好ましい。この処理は、異常
なシトシンメチル化が起こる上記部位がメチル化される
ときに標的領域の選択的増幅を可能にするプライマーの
設計を可能にする。
【００１４】好ましくは、単離されたＤＮＡの処理及び
増幅の後、非メチル化シトシンが効率的にウラシル又は
アデニンと塩基対を形成することができる他のヌクレオ
チドに転換されたこと、及びメチル化シトシンが変化し
ないかあるいはグアニンと塩基対を形成することができ
るヌクレオチドに転換されたことを証明する試験を実施
する。
増幅の後、非メチル化シトシンが効率的にウラシル又は
アデニンと塩基対を形成することができる他のヌクレオ
チドに転換されたこと、及びメチル化シトシンが変化し
ないかあるいはグアニンと塩基対を形成することができ
るヌクレオチドに転換されたことを証明する試験を実施
する。
【００１５】好ましくは、単離されたＤＮＡの処理は、
標準的なプロトコールにしたがって重亜硫酸と単離され
たＤＮＡを反応させることを含む。重亜硫酸の上記議論
から明らかになるように、非メチル化シトシンは、ウラ
シルに転換されるであろうが、メチル化シトシンは変化
しないであろう。非メチル化シトシンがウラシルに転換
され、メチル化シトシンが変化せずに残ったたという証
明は （ｉ） 処理され増幅されたＤＮＡのアリコートを、重
亜硫酸処理より又は耐性な生成される制限部位を認識す
る適当な制限酵素で制限すること、及び （ii）電気泳動により制限断片パターンを評価することにより行なうことができる。 あるいは、非メチル化シト
シンがウラシルへ転換され、メチル化シトシンが変化し
ないまま残ったであろう標的ＤＮＡの領域を標的化した
特異的オリゴヌクレオチドを用いたディファレンシャル
・ハイブリダイゼーションにより、評価を行なうことが
できる。
標準的なプロトコールにしたがって重亜硫酸と単離され
たＤＮＡを反応させることを含む。重亜硫酸の上記議論
から明らかになるように、非メチル化シトシンは、ウラ
シルに転換されるであろうが、メチル化シトシンは変化
しないであろう。非メチル化シトシンがウラシルに転換
され、メチル化シトシンが変化せずに残ったたという証
明は （ｉ） 処理され増幅されたＤＮＡのアリコートを、重
亜硫酸処理より又は耐性な生成される制限部位を認識す
る適当な制限酵素で制限すること、及び （ii）電気泳動により制限断片パターンを評価することにより行なうことができる。 あるいは、非メチル化シト
シンがウラシルへ転換され、メチル化シトシンが変化し
ないまま残ったであろう標的ＤＮＡの領域を標的化した
特異的オリゴヌクレオチドを用いたディファレンシャル
・ハイブリダイゼーションにより、評価を行なうことが
できる。
【００１６】増幅工程は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ
Ｒ）増幅、リガーゼ鎖反応増幅（２０）及び他のもの
（２１）を含むこともできる。好ましくは、増幅工程
は、ＰＣＲ増幅のための標準的プロトコールに従って行
い、この場合、反応物は、典型的には、適当なプライマ
ー、ｄＮＴＰｓ及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとなる
であろうし、条件は、二重鎖の変化する変成、プライマ
ーのアニール（例えば高いストリンジェントな条件下）
及びその後のＤＮＡの合成に影響を与える、変化する温
度と期間のサイクルとなろう。
Ｒ）増幅、リガーゼ鎖反応増幅（２０）及び他のもの
（２１）を含むこともできる。好ましくは、増幅工程
は、ＰＣＲ増幅のための標準的プロトコールに従って行
い、この場合、反応物は、典型的には、適当なプライマ
ー、ｄＮＴＰｓ及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとなる
であろうし、条件は、二重鎖の変化する変成、プライマ
ーのアニール（例えば高いストリンジェントな条件下）
及びその後のＤＮＡの合成に影響を与える、変化する温
度と期間のサイクルとなろう。
【００１７】重亜硫酸処理ＤＮＡを用いた選択的ＰＣＲ
増幅を達成するために、プライマーと条件は、異常なシ
トシンメチル化部位を含む標的領域と、異常シトシンメ
チル化の部位が存在しない標的領域の間を識別するため
に用いることができる。こうして、異常なシトシンメチ
ル化がおこる上記部位がメチル化される標的領域のみ増
幅するために、重亜硫酸処理ＤＮＡ（すなわち逆方向プ
ライマー）にアニールするために用いられたプライマー
は、それがメチル化シトシンと塩基対を形成するであろ
う部位にグアニンヌクレオチドを含むであろう。そのよ
うなプライマーは、単離されたＤＮＡ中の標的領域が非
メチル化シトシンヌクレオチド（それは重亜硫酸処理に
よってウラシルに転換されたであろう）を異常シトシン
メチル化が起こる部位に有するときに、ミスマッチを形
成するであろう。対立鎖へのアニールのために用いるプ
ライマー（すなわち正方向プライマー）は、重亜硫酸処
理のＤＮＡでのメチル化シトシンの部位に対応するいか
なる部位でのシトシンヌクレオチドを含むであろう。
増幅を達成するために、プライマーと条件は、異常なシ
トシンメチル化部位を含む標的領域と、異常シトシンメ
チル化の部位が存在しない標的領域の間を識別するため
に用いることができる。こうして、異常なシトシンメチ
ル化がおこる上記部位がメチル化される標的領域のみ増
幅するために、重亜硫酸処理ＤＮＡ（すなわち逆方向プ
ライマー）にアニールするために用いられたプライマー
は、それがメチル化シトシンと塩基対を形成するであろ
う部位にグアニンヌクレオチドを含むであろう。そのよ
うなプライマーは、単離されたＤＮＡ中の標的領域が非
メチル化シトシンヌクレオチド（それは重亜硫酸処理に
よってウラシルに転換されたであろう）を異常シトシン
メチル化が起こる部位に有するときに、ミスマッチを形
成するであろう。対立鎖へのアニールのために用いるプ
ライマー（すなわち正方向プライマー）は、重亜硫酸処
理のＤＮＡでのメチル化シトシンの部位に対応するいか
なる部位でのシトシンヌクレオチドを含むであろう。
【００１８】好ましくは、ＰＣＲ増幅のために用いるプ
ライマーは、１２から３０ヌクレオチドの長さで、アッ
セイされる疾患又は病状を有する被験者のＤＮＡ中に異
常にメチル化された２から４のシトシンヌクレオチドを
含む標的領域の内の配列にアニールするように設計され
る。さらに、プライマーは好ましくは、シトシンヌクレ
オチド（逆方向プライマー）と、またはグアニンヌクレ
オチド対立（opposite）（正方向プライマー）と塩基対
を形成するであろう末端のヌクレオチドを含み、これは
アッセイされる疾患又は病状を有する被験者のＤＮＡ中
で異常にメチル化される。
ライマーは、１２から３０ヌクレオチドの長さで、アッ
セイされる疾患又は病状を有する被験者のＤＮＡ中に異
常にメチル化された２から４のシトシンヌクレオチドを
含む標的領域の内の配列にアニールするように設計され
る。さらに、プライマーは好ましくは、シトシンヌクレ
オチド（逆方向プライマー）と、またはグアニンヌクレ
オチド対立（opposite）（正方向プライマー）と塩基対
を形成するであろう末端のヌクレオチドを含み、これは
アッセイされる疾患又は病状を有する被験者のＤＮＡ中
で異常にメチル化される。
【００１９】増幅の工程は、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／
又はその調節フランキング配列内の標的領域を増幅する
ために用いられる。調節フランキング配列は、単独又は
他の要素との組み合わせで、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の発現
を制御する要素を含むＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のフランキン
グ配列５’及び３’とみなされることができる。
又はその調節フランキング配列内の標的領域を増幅する
ために用いられる。調節フランキング配列は、単独又は
他の要素との組み合わせで、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の発現
を制御する要素を含むＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のフランキン
グ配列５’及び３’とみなされることができる。
【００２０】特に、増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から
＋５５（ここで、ＣｐＧ部位の番号付けは転写開始部位
に対するものである）までにより定義されるGST-Pi遺伝
子及びその調節フランキング配列内の標的領域を増幅す
るために用いられる。ＣｐＧの番号付けと位置は図１に
示す。
＋５５（ここで、ＣｐＧ部位の番号付けは転写開始部位
に対するものである）までにより定義されるGST-Pi遺伝
子及びその調節フランキング配列内の標的領域を増幅す
るために用いられる。ＣｐＧの番号付けと位置は図１に
示す。
【００２１】増幅されたＤＮＡを存在を決定する工程
は、標準的プロトコールに従って行うことができる。１
つの便利な方法は、ゲル電気泳動の後の増幅化ＤＮＡに
対応するバンドの可視化を含む。好ましくは、アッセイ
される疾患又は病状は前立腺ガン、乳ガン、頚部ガン、
及び肝臓ガンから選ばれる。
は、標準的プロトコールに従って行うことができる。１
つの便利な方法は、ゲル電気泳動の後の増幅化ＤＮＡに
対応するバンドの可視化を含む。好ましくは、アッセイ
される疾患又は病状は前立腺ガン、乳ガン、頚部ガン、
及び肝臓ガンから選ばれる。
【００２２】前立腺ガンの診断又は予後のために、増幅
工程は、好ましくは、ＣｐＧ部位−４３から＋５５ま
で、より好ましくは−４３から＋１０までにより定義さ
れるGST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列内の標
的領域を増幅する。しかしながら、これらの標的領域内
には、前立腺ガンのメチル化状態における変動を示すあ
るいは他の組織でメチル化されるＣｐＧ部位があると考
えられる。したがって、ＣｐＧ部位−４３から＋１０ま
でにより定義される標的領域のためには、増幅のために
用いられるプライマーが、ＣｐＧ部位−３６、−３２、
−２３、−２０、−１４及び多形領域転換部位−３３の
影響を最小化する（すなわち重複するプライマーの使用
により又は部位の排除により）ように設計されることが
好ましい。さらに、前立腺以外の細胞（例えば血液）か
ら単離されるＤＮＡのために、用いられるプライマー
は、ＧｐＧ部位−７から＋７まで、より好ましくは−１
３から＋８までにより定義されるGST-Pi遺伝子及びその
調節フランキング配列の領域を含まない標的領域を増幅
するように設計されることが好ましい。なぜならこれは
偽の陽性を導くかもしれないからである。さらに好まし
い標的領域は、したがって、ＧｐＧ部位−４３から−１
４まで、−４３から−８まで、＋９から＋５３まで及び
＋１から＋５３までにより定義されるGST-Pi遺伝子及び
その調節フランキング配列の領域内である。
工程は、好ましくは、ＣｐＧ部位−４３から＋５５ま
で、より好ましくは−４３から＋１０までにより定義さ
れるGST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列内の標
的領域を増幅する。しかしながら、これらの標的領域内
には、前立腺ガンのメチル化状態における変動を示すあ
るいは他の組織でメチル化されるＣｐＧ部位があると考
えられる。したがって、ＣｐＧ部位−４３から＋１０ま
でにより定義される標的領域のためには、増幅のために
用いられるプライマーが、ＣｐＧ部位−３６、−３２、
−２３、−２０、−１４及び多形領域転換部位−３３の
影響を最小化する（すなわち重複するプライマーの使用
により又は部位の排除により）ように設計されることが
好ましい。さらに、前立腺以外の細胞（例えば血液）か
ら単離されるＤＮＡのために、用いられるプライマー
は、ＧｐＧ部位−７から＋７まで、より好ましくは−１
３から＋８までにより定義されるGST-Pi遺伝子及びその
調節フランキング配列の領域を含まない標的領域を増幅
するように設計されることが好ましい。なぜならこれは
偽の陽性を導くかもしれないからである。さらに好まし
い標的領域は、したがって、ＧｐＧ部位−４３から−１
４まで、−４３から−８まで、＋９から＋５３まで及び
＋１から＋５３までにより定義されるGST-Pi遺伝子及び
その調節フランキング配列の領域内である。
【００２３】前立腺ガンの診断又は予後のために適当な
プライマー対は、以下の群の各々より選ばれる正方向及
び逆方向プライマーからなるプライマー対を含む。
プライマー対は、以下の群の各々より選ばれる正方向及
び逆方向プライマーからなるプライマー対を含む。
【００２４】正方向プライマー（すなわち標的領域の
５’末端とアニールする） [配列１１]
５’末端とアニールする） [配列１１]
【００２５】逆方向プライマー（正方向プライマーの延
長とアニールする） [配列１２］ （ここで、ＹはＣ、Ｔまたは好ましくはそれらの混合物
であり、ＲはＡ，Ｇ，または好ましくはそれらの混合物
である）。
長とアニールする） [配列１２］ （ここで、ＹはＣ、Ｔまたは好ましくはそれらの混合物
であり、ＲはＡ，Ｇ，または好ましくはそれらの混合物
である）。
【００２６】肝臓ガンの診断又は予後のために、増幅工
程は、ＣｐＧ部位−４３から−１４まで及び／又は＋９
から＋５３までにより定義されるGST-Pi遺伝子及び／又
はその調節フランキング配列内の標的領域を増幅する。
しかしながら、これらの標的領域内には、肝臓ガンのメ
チル化状態における変動を示すあるいは他の組織でメチ
ル化されるＣｐＧ部位があると考えられる。したがっ
て、ＣｐＧ部位−４３から−１４までにより定義される
標的領域のためには、増幅のために用いられるプライマ
ーが、ＣｐＧ部位−３６、−３２、−２３、−２０、−
１４及び多形領域転換部位−３３の影響を最小化する
（すなわち重複するプライマーの使用により又は部位の
排除により）ように設計されることが好ましい。
程は、ＣｐＧ部位−４３から−１４まで及び／又は＋９
から＋５３までにより定義されるGST-Pi遺伝子及び／又
はその調節フランキング配列内の標的領域を増幅する。
しかしながら、これらの標的領域内には、肝臓ガンのメ
チル化状態における変動を示すあるいは他の組織でメチ
ル化されるＣｐＧ部位があると考えられる。したがっ
て、ＣｐＧ部位−４３から−１４までにより定義される
標的領域のためには、増幅のために用いられるプライマ
ーが、ＣｐＧ部位−３６、−３２、−２３、−２０、−
１４及び多形領域転換部位−３３の影響を最小化する
（すなわち重複するプライマーの使用により又は部位の
排除により）ように設計されることが好ましい。
【００２７】当業者によって、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び
／又はその調節フランキング配列の上記同定された標的
領域内の異常なシトシンメチル化の部位が、選択的増幅
を含まない方法により疾患又は病状（特に、前立腺ガン
及び／又は肝臓ガン）の診断又は予後の目的のために検
出されるであろうことが、理解されるであろう。例え
ば、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド・プローブ
は、ストリンジェントの適当な条件下で、シトシンの異
常なメチル化を部位を含むＤＮＡにだけ選択的にハイブ
リダイズする重亜硫酸処理ＤＮＡを用いたハイブリダイ
ゼーション研究（例えばサザンブロッティング）の使用
のために設計することができる。その代わりに、適当に
選択された有用な制限酵素は、シトシンの異常なメチル
化を部位を含むものと含まないものをＤＮＡと区別する
制限断片パターンを生産するために用いられることがで
きよう。
／又はその調節フランキング配列の上記同定された標的
領域内の異常なシトシンメチル化の部位が、選択的増幅
を含まない方法により疾患又は病状（特に、前立腺ガン
及び／又は肝臓ガン）の診断又は予後の目的のために検
出されるであろうことが、理解されるであろう。例え
ば、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド・プローブ
は、ストリンジェントの適当な条件下で、シトシンの異
常なメチル化を部位を含むＤＮＡにだけ選択的にハイブ
リダイズする重亜硫酸処理ＤＮＡを用いたハイブリダイ
ゼーション研究（例えばサザンブロッティング）の使用
のために設計することができる。その代わりに、適当に
選択された有用な制限酵素は、シトシンの異常なメチル
化を部位を含むものと含まないものをＤＮＡと区別する
制限断片パターンを生産するために用いられることがで
きよう。
【００２８】こうして、第２の態様では、本発明は、疾
患又は病状がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング
配列内での部位でのシトシンの異常なメチル化により特
徴づけられ、以下の工程 （i）上記被験者よりDNAを単離すること （ii） ＣｐＧ部位−４３から＋５５までにより定義さ
れるGST-Pi遺伝子及び／又はその調節フランキング配列
内の部位における異常なシトシンメチル化の存在を決定
すること を 含む、被験者の疾患の又は状態の診断又は予後のアッ
セイを提供する。
患又は病状がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキング
配列内での部位でのシトシンの異常なメチル化により特
徴づけられ、以下の工程 （i）上記被験者よりDNAを単離すること （ii） ＣｐＧ部位−４３から＋５５までにより定義さ
れるGST-Pi遺伝子及び／又はその調節フランキング配列
内の部位における異常なシトシンメチル化の存在を決定
すること を 含む、被験者の疾患の又は状態の診断又は予後のアッ
セイを提供する。
【００２９】ＤＮＡを単離する工程は第１の態様のアッ
セイで上述したように実施することができる。好ましく
は、部位でのメチル化シトシンの存在がその内部に決定
される、GST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列
が、ＣｐＧ部位−４３から＋５３まで、−４３から＋１
０まで、−４３から−１４まで、＋９から＋５３まで、
＋１から＋５３までにより定義される領域から選ばれ
る。しかしながら、これらの領域内で、アッセイの目的
のために、シトシンの異常なメチル化が決定される部位
として、ある部位（すなわちＣｐＧ部位、−３６、−３
３、−３２、−２３、−２０、−１７及び−１４）が排
除されることが好ましい。
セイで上述したように実施することができる。好ましく
は、部位でのメチル化シトシンの存在がその内部に決定
される、GST-Pi遺伝子及びその調節フランキング配列
が、ＣｐＧ部位−４３から＋５３まで、−４３から＋１
０まで、−４３から−１４まで、＋９から＋５３まで、
＋１から＋５３までにより定義される領域から選ばれ
る。しかしながら、これらの領域内で、アッセイの目的
のために、シトシンの異常なメチル化が決定される部位
として、ある部位（すなわちＣｐＧ部位、−３６、−３
３、−３２、−２３、−２０、−１７及び−１４）が排
除されることが好ましい。
【００３０】決定工程がオリゴヌクレオチド／ポリヌク
レオチド／ペプチド−核酸（ＰＮＡ）プローブの選択的
ハイブリダイゼーションを含むものであるとき、決定工
程の前に、単離されたＤＮＡは好ましくは非メチル化シ
トシンがウラシル又はアデニンと塩基対を形成すること
ができる他のヌクレオチド転換され、かつメチル化シト
シンが変化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成す
ることができるヌクレオチドに転換されるように処理さ
れる（例えば重亜硫酸で）。この処理は、異常なシトシ
ンメチル化の部位を含む標的領域の選択的増幅を可能に
するプライマーの設計を可能にする。
レオチド／ペプチド−核酸（ＰＮＡ）プローブの選択的
ハイブリダイゼーションを含むものであるとき、決定工
程の前に、単離されたＤＮＡは好ましくは非メチル化シ
トシンがウラシル又はアデニンと塩基対を形成すること
ができる他のヌクレオチド転換され、かつメチル化シト
シンが変化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成す
ることができるヌクレオチドに転換されるように処理さ
れる（例えば重亜硫酸で）。この処理は、異常なシトシ
ンメチル化の部位を含む標的領域の選択的増幅を可能に
するプライマーの設計を可能にする。
【００３１】第３の態様において、以下のものからなる
群から選択されるヌクレオチド配列を含む本発明はプラ
イマー又はプローブ（５’から３’方向に示された配
列）を提供する：
群から選択されるヌクレオチド配列を含む本発明はプラ
イマー又はプローブ（５’から３’方向に示された配
列）を提供する：
【００３２】[配列１３]
（ここで、ＹはＣ、Ｔまたは好ましくはそれらの混合物
であり、ＲはＡ，Ｇ，または好ましくはそれらの混合物
である）。
であり、ＲはＡ，Ｇ，または好ましくはそれらの混合物
である）。
【００３３】明細書を通して、用いられている「含む」
「含んでいる」という用語は、述べられた成分、成分の
特徴又は工程又は群、さらなる成分を含むときと含まな
いときの特徴又は工程、成分、特徴又は工程の特徴又は
工程又は群の含有を指すことを意図したものである。
「含んでいる」という用語は、述べられた成分、成分の
特徴又は工程又は群、さらなる成分を含むときと含まな
いときの特徴又は工程、成分、特徴又は工程の特徴又は
工程又は群の含有を指すことを意図したものである。
【００３４】
【実施例】本発明は以下図面と以下の非制限的実施例を
参照してさらに説明する。 一般的な方法と戦略（１） ＤＮＡの重亜硫酸処理 アッ
セイするＤＮＡは、標準プロトコールにより適当な入手
源から単離し、周知の方法により重亜硫酸で処理した
（１２、１３、１６）。
参照してさらに説明する。 一般的な方法と戦略（１） ＤＮＡの重亜硫酸処理 アッ
セイするＤＮＡは、標準プロトコールにより適当な入手
源から単離し、周知の方法により重亜硫酸で処理した
（１２、１３、１６）。
【００３５】（２） ＤＮＡ中の個々の部位のメチル化
の特徴づけ 標的及び非標的ＤＮＡｓ中の個々のシトシンヌクレオチ
ドのメチル化部位を決定し、それらの間の差異を同定す
るために、重亜硫酸修飾ＤＮＡを、特定のＣｐＧ部位の
メチル化状態がプライマーアニーリングとその後の増幅
に影響を与えるであろう可能性を最小化するように設計
したプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した（１２、
１３、１６）。
の特徴づけ 標的及び非標的ＤＮＡｓ中の個々のシトシンヌクレオチ
ドのメチル化部位を決定し、それらの間の差異を同定す
るために、重亜硫酸修飾ＤＮＡを、特定のＣｐＧ部位の
メチル化状態がプライマーアニーリングとその後の増幅
に影響を与えるであろう可能性を最小化するように設計
したプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した（１２、
１３、１６）。
【００３６】（３）選択的プライマーの設計
配列の情報に基づいて、アッセイでの使用のためのプラ
イマーを、特定のＣｐＧ部位のメチル化状態がプライマ
ーアニーリングとその後の増幅に影響を与えるであろう
可能性を最大化するように設計した。特に、従った設計
方針（プライマーが、重亜硫酸処理ＤＮＡで起こるであ
ろうものと同じＣからＴ（又はＵ）転換を含む“正方
向”ＰＣＲプライマーについて記載された）は、以下の
（ａ）から（ｄ）である。
イマーを、特定のＣｐＧ部位のメチル化状態がプライマ
ーアニーリングとその後の増幅に影響を与えるであろう
可能性を最大化するように設計した。特に、従った設計
方針（プライマーが、重亜硫酸処理ＤＮＡで起こるであ
ろうものと同じＣからＴ（又はＵ）転換を含む“正方
向”ＰＣＲプライマーについて記載された）は、以下の
（ａ）から（ｄ）である。
【００３７】（ａ）プライマーは、多くのＣ’ｓを含む
配列領域をカバーするべきであること。非メチル化Ｃ’
ｓからＵ’ｓへの転換は、効率的な重亜硫酸転換をうけ
た分子と、Ｃ’ｓが反応しなかった分子（例えば完全に
溶解していなかったか、あるいは２次構造の領域を含ん
でいるため）との間の識別を提供する。
配列領域をカバーするべきであること。非メチル化Ｃ’
ｓからＵ’ｓへの転換は、効率的な重亜硫酸転換をうけ
た分子と、Ｃ’ｓが反応しなかった分子（例えば完全に
溶解していなかったか、あるいは２次構造の領域を含ん
でいるため）との間の識別を提供する。
【００３８】（ｂ）領域中に、少なくとも１つの、好ま
しくは少なくとも２から４のＣ'ｓが、検出されるＤＮ
Ａ（すなわち標的ＤＮＡ）に高い割合でメチル化されて
いることが知られているＣ'ｓ（一般的にＣｐＧ部位
で）であるべきこと。したがって、これらのＣ'ｓは、
標的ＤＮＡ中にＣ'ｓのまま残り、非標的ＤＮＡ中では
Ｕ'ｓに転換されるであろう。重亜硫酸転換メチル化Ｄ
ＮＡと正確に等量であるように設計されたプライマー
は、非メチル化ＤＮＡ中でＵに転換された非メチル化Ｃ
の位置の各々でミスマッチを含むであろう。より多くの
ミスマッチが存在すれば、プライマーのデファレンシャ
ル・ハイブリダイゼーションの安定性が高まり、そして
ＰＣＲの選択的差異が高まるであろう。
しくは少なくとも２から４のＣ'ｓが、検出されるＤＮ
Ａ（すなわち標的ＤＮＡ）に高い割合でメチル化されて
いることが知られているＣ'ｓ（一般的にＣｐＧ部位
で）であるべきこと。したがって、これらのＣ'ｓは、
標的ＤＮＡ中にＣ'ｓのまま残り、非標的ＤＮＡ中では
Ｕ'ｓに転換されるであろう。重亜硫酸転換メチル化Ｄ
ＮＡと正確に等量であるように設計されたプライマー
は、非メチル化ＤＮＡ中でＵに転換された非メチル化Ｃ
の位置の各々でミスマッチを含むであろう。より多くの
ミスマッチが存在すれば、プライマーのデファレンシャ
ル・ハイブリダイゼーションの安定性が高まり、そして
ＰＣＲの選択的差異が高まるであろう。
【００３９】（ｃ）プライマーの３’末端塩基は、好ま
しくは標的ＤＮＡ（通常ＣｐＧジヌクレオチドの一部）
中でメチル化されることが知られているＣに対応するＣ
であるべきこと。プライマーの末端塩基との正しいペア
リングは、Ｃ：Ａミスマッチを形成するであろう非メチ
ル化バックグラウンド配列と比較して、標的配列の高い
選択的プライミングを提供するであろう。
しくは標的ＤＮＡ（通常ＣｐＧジヌクレオチドの一部）
中でメチル化されることが知られているＣに対応するＣ
であるべきこと。プライマーの末端塩基との正しいペア
リングは、Ｃ：Ａミスマッチを形成するであろう非メチ
ル化バックグラウンド配列と比較して、標的配列の高い
選択的プライミングを提供するであろう。
【００４０】（ｄ）メチル化標的ＤＮＡの分子の１つの
分画だけにメチル化がおこることが知られている位置に
おいて、あるいは標的ＤＮＡｓ間で（例えば異なる腫瘍
試料で）変動することが知られている位置において、標
的ＤＮＡからＣ又はＴのいずれかの増幅を可能にするた
めに、プライマーに重複が取り込まれることができる。
この同じアプローチは、プライマー領域に多形が存在す
ることが知られている場合に、用いることができる。転
換鎖にアニールする“逆方向”プライマーとして、転換
されたＣ’ｓに対立する位置で、Ａ’ｓはＧ’ｓを置換
する。
分画だけにメチル化がおこることが知られている位置に
おいて、あるいは標的ＤＮＡｓ間で（例えば異なる腫瘍
試料で）変動することが知られている位置において、標
的ＤＮＡからＣ又はＴのいずれかの増幅を可能にするた
めに、プライマーに重複が取り込まれることができる。
この同じアプローチは、プライマー領域に多形が存在す
ることが知られている場合に、用いることができる。転
換鎖にアニールする“逆方向”プライマーとして、転換
されたＣ’ｓに対立する位置で、Ａ’ｓはＧ’ｓを置換
する。
【００４１】（４） 選択的標的配列増幅の証明
増幅されたＰＣＲバンドは、十分重亜硫酸転換された
（すなわち元のＤＮＡ中でメチル化されていないＣ’ｓ
がＵ’ｓに転換され、Ｔ’ｓとして増幅された）ＤＮＡ
から由来したことを証明するために、及び、増幅された
ＤＮＡが特異的標的ＤＮＡ配列から由来し、期待された
メチル化プロフィールを有している（すなわちＴ’ｓに
転換されていない５ｍｅＣ’ｓ）ことをさらに証明する
ために、分析することができる。これらの証明を実施す
るための方法は以下のものを含む：
（すなわち元のＤＮＡ中でメチル化されていないＣ’ｓ
がＵ’ｓに転換され、Ｔ’ｓとして増幅された）ＤＮＡ
から由来したことを証明するために、及び、増幅された
ＤＮＡが特異的標的ＤＮＡ配列から由来し、期待された
メチル化プロフィールを有している（すなわちＴ’ｓに
転換されていない５ｍｅＣ’ｓ）ことをさらに証明する
ために、分析することができる。これらの証明を実施す
るための方法は以下のものを含む：
【００４２】（ａ）制限酵素消化を用いる
完全転換を証明するために、特定の制限酵素を用いてＤ
ＮＡを切断することができる。配列認識部位は、それが
Ｃ’ｓを含まず、重亜硫酸処理の後には増幅された鎖の
配列に存在するが、その前には存在しないという特性を
有するべきである。こうして、ＰＣＲ産物中の、１つ又
は好ましくは２つ以上のＣ’ｓからＵ’ｓへの転換とそ
れらのＴ’ｓとしての増幅は、新しい制限部位を生成す
るべきである。有用な酵素は以下の表１でイタリックで
示す。
ＮＡを切断することができる。配列認識部位は、それが
Ｃ’ｓを含まず、重亜硫酸処理の後には増幅された鎖の
配列に存在するが、その前には存在しないという特性を
有するべきである。こうして、ＰＣＲ産物中の、１つ又
は好ましくは２つ以上のＣ’ｓからＵ’ｓへの転換とそ
れらのＴ’ｓとしての増幅は、新しい制限部位を生成す
るべきである。有用な酵素は以下の表１でイタリックで
示す。
【００４３】増幅された標的ＤＮＡ配列が特異的にメチ
ル化されたことを、証明するために、ＣｐＧジヌクレオ
チドとしてＣヌクレオチドだけが見出され、配列がメチ
ル化されたときＣｐＧ’ｓとしてＰＣＲ産物中に残る制
限酵素部位を使用することができる。そのような酵素の
例を以下の表１で太字で示す。非対称配列GAGACGを切断
する、BsmBI、もまた使用することが可能である。
ル化されたことを、証明するために、ＣｐＧジヌクレオ
チドとしてＣヌクレオチドだけが見出され、配列がメチ
ル化されたときＣｐＧ’ｓとしてＰＣＲ産物中に残る制
限酵素部位を使用することができる。そのような酵素の
例を以下の表１で太字で示す。非対称配列GAGACGを切断
する、BsmBI、もまた使用することが可能である。
【００４４】ある例において、認識配列の外側の塩基と
してＣを含む酵素は、メチル化の証明のために用いるこ
とができる：例えば、GAATTCG配列のために、EcoRI（GA
ATTC）又はGATCG配列のためにSau3AI（GATC）（表１に
おいて太字及び下線）。もし、上記のうちの１つ等の部
位が予測されるメチル化、十分重亜硫酸転換されたDNA
に存在するとき、酵素はＤＮＡを、元のＣｐＧジヌクレ
オチドがメチル化されたときだけ、切断し、ＤＮＡのメ
チル化領域の増幅を確認するであろう。いくつかの酵素
（表１で太字及び下線）は、効率的転換及びＣｐＧメチ
ル化の両方のモニターのための使用の可能性を有してい
る。
してＣを含む酵素は、メチル化の証明のために用いるこ
とができる：例えば、GAATTCG配列のために、EcoRI（GA
ATTC）又はGATCG配列のためにSau3AI（GATC）（表１に
おいて太字及び下線）。もし、上記のうちの１つ等の部
位が予測されるメチル化、十分重亜硫酸転換されたDNA
に存在するとき、酵素はＤＮＡを、元のＣｐＧジヌクレ
オチドがメチル化されたときだけ、切断し、ＤＮＡのメ
チル化領域の増幅を確認するであろう。いくつかの酵素
（表１で太字及び下線）は、効率的転換及びＣｐＧメチ
ル化の両方のモニターのための使用の可能性を有してい
る。
【００４５】（ｂ）特異的オリゴヌクレオチドに対する
デファレンシャル・ハイブリダイゼーション 特異的オリゴヌクレオチドに対するデファレンシャル・
ハイブリダイゼーションを、増幅されたＤＮＡが重亜硫
酸と十分反応し、期待されたメチル化プロフィールを有
していることを識別するために用いることができる。完
全な転換を示すために、増幅配列内に同じ領域に対応す
るオリゴヌクレオチドの対を調製する。１つのオリゴヌ
クレオチドは、重亜硫酸により転換されるべきすべての
Ｃ’ｓでＴ’ｓを含むが、他方はそれらの位置でＣ’ｓ
を含む。オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つ又は３
つのそのような識別的Ｃ’ｓを含むべきであり、その標
的配列に対する各々の選択的ハイブリダイゼーションを
提供する条件は決定される。ＣｐＧ部位においてＣ又は
Ｔを有し、すべての非ＣｐＧのＣ’ｓを置換するＴ’ｓ
を有する同様のオリゴヌクレオチドは、特異的ＣｐＧ部
位がメチル化されているかどうかを決定するために用い
られることができる。識別的Ｃ’ｓを含まない付加的な
対照オリゴヌクレオチド、すなわち、Ｃ’ｓがＹ’ｓ
（Ｃ及びＴの混合物）に置換されてＣ’ｓがないか、最
小の数であるかのいずれかであるものは、試料中にＰＣ
Ｒ産物の量をモニターするために用いられる。オリゴヌ
クレオチドは増幅化配列の直接ハイブリダイゼーション
検出ために用いることができ、あるいは他の検出方法の
ために標的分子をＰＣＲ−増幅ＤＮＡ集団から選択する
ために用いることができる。ＤＮＡ配列チップ上のその
ようなオリゴヌクレオチドの列は、配列領域にわたって
増幅されたＤＮＡの配列を確立するために用いることが
できる。
デファレンシャル・ハイブリダイゼーション 特異的オリゴヌクレオチドに対するデファレンシャル・
ハイブリダイゼーションを、増幅されたＤＮＡが重亜硫
酸と十分反応し、期待されたメチル化プロフィールを有
していることを識別するために用いることができる。完
全な転換を示すために、増幅配列内に同じ領域に対応す
るオリゴヌクレオチドの対を調製する。１つのオリゴヌ
クレオチドは、重亜硫酸により転換されるべきすべての
Ｃ’ｓでＴ’ｓを含むが、他方はそれらの位置でＣ’ｓ
を含む。オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つ又は３
つのそのような識別的Ｃ’ｓを含むべきであり、その標
的配列に対する各々の選択的ハイブリダイゼーションを
提供する条件は決定される。ＣｐＧ部位においてＣ又は
Ｔを有し、すべての非ＣｐＧのＣ’ｓを置換するＴ’ｓ
を有する同様のオリゴヌクレオチドは、特異的ＣｐＧ部
位がメチル化されているかどうかを決定するために用い
られることができる。識別的Ｃ’ｓを含まない付加的な
対照オリゴヌクレオチド、すなわち、Ｃ’ｓがＹ’ｓ
（Ｃ及びＴの混合物）に置換されてＣ’ｓがないか、最
小の数であるかのいずれかであるものは、試料中にＰＣ
Ｒ産物の量をモニターするために用いられる。オリゴヌ
クレオチドは増幅化配列の直接ハイブリダイゼーション
検出ために用いることができ、あるいは他の検出方法の
ために標的分子をＰＣＲ−増幅ＤＮＡ集団から選択する
ために用いることができる。ＤＮＡ配列チップ上のその
ようなオリゴヌクレオチドの列は、配列領域にわたって
増幅されたＤＮＡの配列を確立するために用いることが
できる。
【００４６】（ｃ）単一ヌクレオチドプライマー延長
（ＳＮｕＰＥ） 単一ヌクレオチドプライマー延長の技術は、増幅された
配列内に特異的な部位がＣ又はＴ塩基を含むかどうかを
決定するために、ＰＣＲ産物に適用することができる。
この方法で、対象の位置に隣接するプライマーは、ＰＣ
Ｒ産物にアニールされ、ｄＣＴＰだけあるいはｄＴＴＰ
だけのいずれかを用いてプライマー延長反応が行われ
る。産物はゲル電気泳動により単離し、その位置の集団
中の各ヌクレオチドの比率を決定のために定量化するこ
とができる。プライマーは、ＣｐＧ部位でのＣ’ｓの転
換を定量し、メチル化されるべきでないＣ’ｓを制御す
るように設計するべきである。１つより多いプライマー
は、それらの大きさが明確に区別できる限り、同じゲル
トラックに単一反応及び／又はランに含まれることがで
きる。
（ＳＮｕＰＥ） 単一ヌクレオチドプライマー延長の技術は、増幅された
配列内に特異的な部位がＣ又はＴ塩基を含むかどうかを
決定するために、ＰＣＲ産物に適用することができる。
この方法で、対象の位置に隣接するプライマーは、ＰＣ
Ｒ産物にアニールされ、ｄＣＴＰだけあるいはｄＴＴＰ
だけのいずれかを用いてプライマー延長反応が行われ
る。産物はゲル電気泳動により単離し、その位置の集団
中の各ヌクレオチドの比率を決定のために定量化するこ
とができる。プライマーは、ＣｐＧ部位でのＣ’ｓの転
換を定量し、メチル化されるべきでないＣ’ｓを制御す
るように設計するべきである。１つより多いプライマー
は、それらの大きさが明確に区別できる限り、同じゲル
トラックに単一反応及び／又はランに含まれることがで
きる。
【００４７】（ｄ）ＰＣＲの蛍光リアルタイムモニター
増幅領域の内部のオリゴヌクレオチドは、増幅反応
を、正しい配列の増幅を示すのと同時に、モニターし定
量化するために用いることができる。蛍光５'ヌクレア
ーゼＰＣＲアッセイ（１９）において、増幅反応は、増
幅配列内に最初に結合し、蛍光レポーターおよびクエン
チャーの両方を含むプライマーを用いてモニターされ
る。このプローブがその標的ＤＮＡに結合するとき、そ
れはＴａｑポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性により
開裂されることができ、レポーターとクエンチャーを単
離する。アッセイにおいて十分に重亜硫酸転換された配
列（及び／又はそのメチル化状態）において選択性のオ
リゴヌクレオチドを利用することにより、増幅のレベル
とその特異性の両方を1回の反応でモニターすることが
できる。ＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションにより同
様に検出する他の関連するシステムも用いることができ
る。
増幅領域の内部のオリゴヌクレオチドは、増幅反応
を、正しい配列の増幅を示すのと同時に、モニターし定
量化するために用いることができる。蛍光５'ヌクレア
ーゼＰＣＲアッセイ（１９）において、増幅反応は、増
幅配列内に最初に結合し、蛍光レポーターおよびクエン
チャーの両方を含むプライマーを用いてモニターされ
る。このプローブがその標的ＤＮＡに結合するとき、そ
れはＴａｑポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性により
開裂されることができ、レポーターとクエンチャーを単
離する。アッセイにおいて十分に重亜硫酸転換された配
列（及び／又はそのメチル化状態）において選択性のオ
リゴヌクレオチドを利用することにより、増幅のレベル
とその特異性の両方を1回の反応でモニターすることが
できる。ＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションにより同
様に検出する他の関連するシステムも用いることができ
る。
【００４８】実施例１：標的及び非標的ＧＳＴ−ＰｉＤ
ＮＡのメチル化配列プロフィール材料と方法 図１は、
ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の構成と、前立腺ガン組織又は細胞
系及び正常前立腺又は他の組織から単離されたＤＮＡの
メチル化状態を決定するためにゲノム配列が用いられる
領域を示す。図１においてヌクレオチド配列番号付け
は、Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｎｏ．Ｍ２４４８５のＧ
ＳＴ−Ｐｉ遺伝子配列に従っている。ボックスの中に、
各増幅領域の配列を示し、すべてのＣｐＧ部位が、転写
開始部位に位置に対して、示され番号が付されている。
配列分析は、発表されている配列からは予測できない付
加的なＣｐＧジヌクレオチド（＋９）があったことを示
した。さらに配列決定された領域で、研究した試料の重
要な分画に存在する多形が同定された。多形の対立遺伝
子は、ＣｐＧ部位−３３を含まない。付加的なＣｐＧジ
ヌクレオチドと多形の両方を図２に示す。図２のヌクレ
オチド・コーディネートを、転写開始部位に対して示
す；示されている第１の塩基は−４３４で、Genbank配
列の塩基７８１に対応し、最後は＋９０でGenbank配列
の塩基１３１３に対応する。
ＮＡのメチル化配列プロフィール材料と方法 図１は、
ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の構成と、前立腺ガン組織又は細胞
系及び正常前立腺又は他の組織から単離されたＤＮＡの
メチル化状態を決定するためにゲノム配列が用いられる
領域を示す。図１においてヌクレオチド配列番号付け
は、Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｎｏ．Ｍ２４４８５のＧ
ＳＴ−Ｐｉ遺伝子配列に従っている。ボックスの中に、
各増幅領域の配列を示し、すべてのＣｐＧ部位が、転写
開始部位に位置に対して、示され番号が付されている。
配列分析は、発表されている配列からは予測できない付
加的なＣｐＧジヌクレオチド（＋９）があったことを示
した。さらに配列決定された領域で、研究した試料の重
要な分画に存在する多形が同定された。多形の対立遺伝
子は、ＣｐＧ部位−３３を含まない。付加的なＣｐＧジ
ヌクレオチドと多形の両方を図２に示す。図２のヌクレ
オチド・コーディネートを、転写開始部位に対して示
す；示されている第１の塩基は−４３４で、Genbank配
列の塩基７８１に対応し、最後は＋９０でGenbank配列
の塩基１３１３に対応する。
【００４９】表２及び３は、重亜硫酸処理ＤＮＡの増幅
（表２）及び直接配列決定（表３）に用いられる非選択
的プライマーを配列と位置を挙げたものである。正常前
立腺組織、前立腺ガン組織、前立腺ガン由来細胞系、及
び他の組織から単離されたＤＮＡを重亜硫酸処理し、標
準的方法によりＰＣＲ反応を行った（１３）。ＰＣＲ産
物は、有用な制限酵素で消化し、直接配列決定するか
（１７）、あるいは個々の分子を標準的方法によりクロ
ーン化し、配列決定した。
（表２）及び直接配列決定（表３）に用いられる非選択
的プライマーを配列と位置を挙げたものである。正常前
立腺組織、前立腺ガン組織、前立腺ガン由来細胞系、及
び他の組織から単離されたＤＮＡを重亜硫酸処理し、標
準的方法によりＰＣＲ反応を行った（１３）。ＰＣＲ産
物は、有用な制限酵素で消化し、直接配列決定するか
（１７）、あるいは個々の分子を標準的方法によりクロ
ーン化し、配列決定した。
【００５０】結果
図３において、前立腺ガン細胞系、前立腺ガン組織試料
及びマッチする正常前立腺組織からのＤＮＡ中の部位の
メチル化状態を、コアプロモーター領域から遺伝子の３
‘末端まで（ＣｐＧ部位−２８から１０３までをカバー
する）について示す。正常前立腺組織において、コアプ
ロモーター領域はすべての部位で非メチル化されている
こと、及びこのメチル化の欠損はプロモーター側面の領
域からＣｐＧ部位＋３３にわたって延長することが見ら
れる。重亜硫酸処理、ＰＣＲ−増幅ＤＮＡの制限酵素消
化の結果は、メチル化のこの欠損がＣｐＧ部位＋５２及
び＋３を含むことを示す。しかしながら、分析されたさ
らに下流の領域において、ＣｐＧ部位＋６８から＋７４
及び＋９６から＋１０３、正常前立腺組織からのＤＮＡ
が非常にメチル化されていた。前立腺ガン細胞系ＬＮＣ
ａＰ及び前立腺ガン組織試料の分析は、コアプロモータ
ー領域の広範囲のメチル化を示す；メチル化の全体のレ
ベルのバリエーションは、おそらく腫瘍試料内の異なる
レベルの正常細胞の存在を反映している。１つのガン試
料（２ＡＣ）からのＤＮＡが、完全に非メチル化されて
いることが見出され、他の腫瘍試料と反対に、この腫瘍
は免疫組織化学によりいまだにＧＳＴ−Ｐｉを発現して
いることが見出された。ＬＮＣａＰ細胞系及び腫瘍ＤＮ
Ａｓ中のコアプロモータの側面の領域の配列決定は、メ
チル化がＣｐＧ部位＋３３まで延長したことを示し、さ
らなる制限酵素分析はメチル化が、ＣｐＧ部位＋５２と
＋５３を含むことを示した。１つの腫瘍試料、ＤＣにつ
いて、メチル化はコアプロモーター領域及びＣｐＧ部位
＋１３から＋３３を超えて延長せず、ＣｐＧ部位＋５３
と＋５３も非メチル化であることが見出された。この腫
瘍がグリーソン分類２＋２、分析したものの中で最低の
ガン分類であったことは、特記すべきである。すべての
腫瘍ＤＮＡ試料について、正常ＤＮＡと同様に、遺伝子
の下流領域、部位６８から７４までと９６から１０３ま
で、非常にメチル化されていた。ガンでメチル化される
が、正常ではメチル化されなかったプロモーター領域の
内部に、非メチル化あるいは周囲のメチル化部位に比べ
て非常低い程度にメチル化されている、組織特異的個々
の部位が明白であった。これらは、部位−２２及び−２
３（ＸＣ）、−２０（ＰＣ３系、ＸＣ及びＷＣ）、−１
４（ＰＣ３、ＸＣ及びＷＣ）、 ＋２４（ＰＣ３−Ｍ及
びＭＭ２，ＣＣ）、＋２５（ＬＮＣａＰ、ＰＣ３−ＭＭ
２、ＣＣ）を含む。
及びマッチする正常前立腺組織からのＤＮＡ中の部位の
メチル化状態を、コアプロモーター領域から遺伝子の３
‘末端まで（ＣｐＧ部位−２８から１０３までをカバー
する）について示す。正常前立腺組織において、コアプ
ロモーター領域はすべての部位で非メチル化されている
こと、及びこのメチル化の欠損はプロモーター側面の領
域からＣｐＧ部位＋３３にわたって延長することが見ら
れる。重亜硫酸処理、ＰＣＲ−増幅ＤＮＡの制限酵素消
化の結果は、メチル化のこの欠損がＣｐＧ部位＋５２及
び＋３を含むことを示す。しかしながら、分析されたさ
らに下流の領域において、ＣｐＧ部位＋６８から＋７４
及び＋９６から＋１０３、正常前立腺組織からのＤＮＡ
が非常にメチル化されていた。前立腺ガン細胞系ＬＮＣ
ａＰ及び前立腺ガン組織試料の分析は、コアプロモータ
ー領域の広範囲のメチル化を示す；メチル化の全体のレ
ベルのバリエーションは、おそらく腫瘍試料内の異なる
レベルの正常細胞の存在を反映している。１つのガン試
料（２ＡＣ）からのＤＮＡが、完全に非メチル化されて
いることが見出され、他の腫瘍試料と反対に、この腫瘍
は免疫組織化学によりいまだにＧＳＴ−Ｐｉを発現して
いることが見出された。ＬＮＣａＰ細胞系及び腫瘍ＤＮ
Ａｓ中のコアプロモータの側面の領域の配列決定は、メ
チル化がＣｐＧ部位＋３３まで延長したことを示し、さ
らなる制限酵素分析はメチル化が、ＣｐＧ部位＋５２と
＋５３を含むことを示した。１つの腫瘍試料、ＤＣにつ
いて、メチル化はコアプロモーター領域及びＣｐＧ部位
＋１３から＋３３を超えて延長せず、ＣｐＧ部位＋５３
と＋５３も非メチル化であることが見出された。この腫
瘍がグリーソン分類２＋２、分析したものの中で最低の
ガン分類であったことは、特記すべきである。すべての
腫瘍ＤＮＡ試料について、正常ＤＮＡと同様に、遺伝子
の下流領域、部位６８から７４までと９６から１０３ま
で、非常にメチル化されていた。ガンでメチル化される
が、正常ではメチル化されなかったプロモーター領域の
内部に、非メチル化あるいは周囲のメチル化部位に比べ
て非常低い程度にメチル化されている、組織特異的個々
の部位が明白であった。これらは、部位−２２及び−２
３（ＸＣ）、−２０（ＰＣ３系、ＸＣ及びＷＣ）、−１
４（ＰＣ３、ＸＣ及びＷＣ）、 ＋２４（ＰＣ３−Ｍ及
びＭＭ２，ＣＣ）、＋２５（ＬＮＣａＰ、ＰＣ３−ＭＭ
２、ＣＣ）を含む。
【００５１】図４に示された結果は、正常前立腺組織か
らと多くの他の正常組織からの、単離されたＤＮＡ中の
コアプロモーター領域とコアプロモーター領域の上流の
配列メチル化部位の比較を提供する。コアプロモーター
上流のＰＣＲ断片からの配列を、直接シークエンスがし
難い領域であったので、クローン化して配列決定するこ
とにより、決定した。ガン試料について、示されたメチ
ル化のレベルは、メチル化されたこれらのクローンの比
率のようであった（両ケースで全クローンの約５０
％）。正常前立腺組織とすべての他の正常組織で、ＡＴ
−リッチ反復の上流のＣｇＰ部位の広範囲のメチル化が
ある。反復の下流（ＣｐＧ部位―４３から）で、正常肝
臓組織、ここではＣｐＧ部位―７から＋７までに非常に
メチル化されている、を除くすべての正常組織において
最小のメチル化がみられた。コアプロモーター上流の配
列は、前立腺ガンＤＮＡで非常にメチル化されているこ
とが見出されが、やはり特異的部位は低くメチル化され
ていた：ガンＢとＤで部位−３２、ガンＢで部位−３
６。
らと多くの他の正常組織からの、単離されたＤＮＡ中の
コアプロモーター領域とコアプロモーター領域の上流の
配列メチル化部位の比較を提供する。コアプロモーター
上流のＰＣＲ断片からの配列を、直接シークエンスがし
難い領域であったので、クローン化して配列決定するこ
とにより、決定した。ガン試料について、示されたメチ
ル化のレベルは、メチル化されたこれらのクローンの比
率のようであった（両ケースで全クローンの約５０
％）。正常前立腺組織とすべての他の正常組織で、ＡＴ
−リッチ反復の上流のＣｇＰ部位の広範囲のメチル化が
ある。反復の下流（ＣｐＧ部位―４３から）で、正常肝
臓組織、ここではＣｐＧ部位―７から＋７までに非常に
メチル化されている、を除くすべての正常組織において
最小のメチル化がみられた。コアプロモーター上流の配
列は、前立腺ガンＤＮＡで非常にメチル化されているこ
とが見出されが、やはり特異的部位は低くメチル化され
ていた：ガンＢとＤで部位−３２、ガンＢで部位−３
６。
【００５２】したがってこの結果、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子
とその調節フランキング配列の領域の同定が可能であ
り、多形反復領域の３‘’（ＣｐＧ部位−４３）から、
部位＋５２と＋５３へ伸びており、これは正常前立腺組
織でメチル化されないが、前立腺ガンでは通常高くメチ
ル化される。１つのガン試料（Ｄ，グリーソン分類が最
低のガン）で、ＣｐＧ部位からの領域＋１３から＋５３
はメチル化されなかった。ＣｇＰ部位―４３から＋１０
に伸びているより多く制限された領域は、プロモーター
メチル化を示したすべての前立腺ガンＤＮＡでメチル化
された。プロモーター領域の一部のメチル化（ＣｐＧ部
位−７から＋７）も、調べた１つの正常組織（肝臓）で
みられた。正常肝臓ＤＮＡのさらなる試料の分析は、メ
チル化のレベルが変動し、ＣｐＧ部位−１３から＋８を
含むことができることを示した。
とその調節フランキング配列の領域の同定が可能であ
り、多形反復領域の３‘’（ＣｐＧ部位−４３）から、
部位＋５２と＋５３へ伸びており、これは正常前立腺組
織でメチル化されないが、前立腺ガンでは通常高くメチ
ル化される。１つのガン試料（Ｄ，グリーソン分類が最
低のガン）で、ＣｐＧ部位からの領域＋１３から＋５３
はメチル化されなかった。ＣｇＰ部位―４３から＋１０
に伸びているより多く制限された領域は、プロモーター
メチル化を示したすべての前立腺ガンＤＮＡでメチル化
された。プロモーター領域の一部のメチル化（ＣｐＧ部
位−７から＋７）も、調べた１つの正常組織（肝臓）で
みられた。正常肝臓ＤＮＡのさらなる試料の分析は、メ
チル化のレベルが変動し、ＣｐＧ部位−１３から＋８を
含むことができることを示した。
【００５３】考察
上記結果は、前立腺ガン細胞の選択的検出のためのアッ
セイの開発に用いることができる、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子
及び／又はその調節フランキング配列内の領域を同定す
ることにおいて、重大である。こうして、正常前立腺組
織においてメチル化されている領域の境界内にあるＣｐ
Ｇ部位−４３から＋５３までの領域を、前立腺組織試料
中のガン特異的メチル化を検出するためのプライマーの
設計のために用いることが可能である。ＣｐＧ部位−４
３から＋１０までの領域が、ガンの高い割合の検出のた
めに好ましい。 ＣｐＧ部位＋１３から＋５３までの領
域が、ガンの検出のために用いられるが、後期（メチル
化ガン）から初期（非メチル化）ガンを区別するために
も用いることができる。血液などの他の試料を用いたア
ッセイにおいて、ＣｐＧ部位−７から＋７、より好まし
くは部位−１３から＋８を排除するように選ばれる領域
を制限することが好ましい。例えば、肝臓ガンは、肝臓
病を患う被験者から取られた血液中に存在するかもしれ
ず、その場合、もしガン特異的メチル化の検出のために
選ばれた領域がＣｐＧ部位―１３から＋８を含むなら、
偽陽性の結果が得られるかもしれない。
セイの開発に用いることができる、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子
及び／又はその調節フランキング配列内の領域を同定す
ることにおいて、重大である。こうして、正常前立腺組
織においてメチル化されている領域の境界内にあるＣｐ
Ｇ部位−４３から＋５３までの領域を、前立腺組織試料
中のガン特異的メチル化を検出するためのプライマーの
設計のために用いることが可能である。ＣｐＧ部位−４
３から＋１０までの領域が、ガンの高い割合の検出のた
めに好ましい。 ＣｐＧ部位＋１３から＋５３までの領
域が、ガンの検出のために用いられるが、後期（メチル
化ガン）から初期（非メチル化）ガンを区別するために
も用いることができる。血液などの他の試料を用いたア
ッセイにおいて、ＣｐＧ部位−７から＋７、より好まし
くは部位−１３から＋８を排除するように選ばれる領域
を制限することが好ましい。例えば、肝臓ガンは、肝臓
病を患う被験者から取られた血液中に存在するかもしれ
ず、その場合、もしガン特異的メチル化の検出のために
選ばれた領域がＣｐＧ部位―１３から＋８を含むなら、
偽陽性の結果が得られるかもしれない。
【００５４】実施例２；メチル化ＧＳＴ−ＰｉＤＮＡの
検出のための選択的プライマーの設計と使用 材料及び方法 ３つの領域からのメチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列検出のため
の配列プライマーを以下の表４に示す：すなわちコアプ
ロモーターの上流領域（プライマーＣＧＰＳ−５から９
及びＣＧＰＳ−１１から１３）、コアプロモーターを部
分的に包含する領域（プライマーＣＧＰＳ−１から
４）、及びコアプロモーターからはるか下流の領域（プ
ライマーＣＧＰＳ−２１から２４）。
検出のための選択的プライマーの設計と使用 材料及び方法 ３つの領域からのメチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列検出のため
の配列プライマーを以下の表４に示す：すなわちコアプ
ロモーターの上流領域（プライマーＣＧＰＳ−５から９
及びＣＧＰＳ−１１から１３）、コアプロモーターを部
分的に包含する領域（プライマーＣＧＰＳ−１から
４）、及びコアプロモーターからはるか下流の領域（プ
ライマーＣＧＰＳ−２１から２４）。
【００５５】上流領域のためのプライマーの配列及び由
来を図２に示す（ＣｐＧ部位―４３からＣｐＧ部位＋１
０）。図２はまた、ＣｐＧ部位−３３を包含する共通多
形も示す（上記配列（ｐ）参照）。下に、シトシンから
ウラシルへの転換の後の誘導鎖の配列を示す。誘導鎖
は、すべてのＣｐＧがメチル化（Ｂ−Ｍ）されている
か、または何もメチル化（Ｂ−Ｕ）されていないものと
して示される。この下に、メチル化配列を特異的に増幅
するように設計された特異的プライマーが示される。す
べてのプライマーが、処理された、メチル化テンペレー
トに完全にマッチするように設計されるが、非メチル化
ＤＮＡ又は元の非処理ＤＮＡから由来するテンペレート
に対してミスマッチを含むことがわかる。プライマーＶ
ＧＰＳ−５，８，１１，１２，及び１３は、多形領域
と、前立腺ガンＤＮＡでより低い頻度のメチル化を示す
ＣｐＧ部位を排除するように設計される。正方向プライ
マーの下線のＴ’ｓ（及び逆方向プライマーのＡ’ｓ）
は、Ｃ’ｓの重亜硫酸転換から由来し、重亜硫酸処理に
より効率的に転換されなかったＤＮＡの増幅に対する区
別を提供する。正方向プライマーの太字のＣ’ｓ（及び
逆方向プライマーのＧ’ｓ）は、ＣｐＧ部位の一部であ
り、メチル化配列から由来するＤＮＡと塩基対を形成す
るが、非メチル化配列から由来するＤＮＡに対してミス
マッチを形成するであろう。重複は、いくつかの位置、
正方向プライマーのＹ（＝ＣとＴの混合）及び逆方向プ
ライマーのＲ（＝ＡとＧの混合）が含まれ、メチル化状
態から独立してペアリングが可能である。このことは、
腫瘍試料内又は間でのメチル化の頻度が変化する、ある
部位で可能にすることができる（例えば部位−１４）。
メチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列のための特異的選択的増幅の
ための正方向及び逆方向プライマーを以下の表４に示
す。
来を図２に示す（ＣｐＧ部位―４３からＣｐＧ部位＋１
０）。図２はまた、ＣｐＧ部位−３３を包含する共通多
形も示す（上記配列（ｐ）参照）。下に、シトシンから
ウラシルへの転換の後の誘導鎖の配列を示す。誘導鎖
は、すべてのＣｐＧがメチル化（Ｂ−Ｍ）されている
か、または何もメチル化（Ｂ−Ｕ）されていないものと
して示される。この下に、メチル化配列を特異的に増幅
するように設計された特異的プライマーが示される。す
べてのプライマーが、処理された、メチル化テンペレー
トに完全にマッチするように設計されるが、非メチル化
ＤＮＡ又は元の非処理ＤＮＡから由来するテンペレート
に対してミスマッチを含むことがわかる。プライマーＶ
ＧＰＳ−５，８，１１，１２，及び１３は、多形領域
と、前立腺ガンＤＮＡでより低い頻度のメチル化を示す
ＣｐＧ部位を排除するように設計される。正方向プライ
マーの下線のＴ’ｓ（及び逆方向プライマーのＡ’ｓ）
は、Ｃ’ｓの重亜硫酸転換から由来し、重亜硫酸処理に
より効率的に転換されなかったＤＮＡの増幅に対する区
別を提供する。正方向プライマーの太字のＣ’ｓ（及び
逆方向プライマーのＧ’ｓ）は、ＣｐＧ部位の一部であ
り、メチル化配列から由来するＤＮＡと塩基対を形成す
るが、非メチル化配列から由来するＤＮＡに対してミス
マッチを形成するであろう。重複は、いくつかの位置、
正方向プライマーのＹ（＝ＣとＴの混合）及び逆方向プ
ライマーのＲ（＝ＡとＧの混合）が含まれ、メチル化状
態から独立してペアリングが可能である。このことは、
腫瘍試料内又は間でのメチル化の頻度が変化する、ある
部位で可能にすることができる（例えば部位−１４）。
メチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列のための特異的選択的増幅の
ための正方向及び逆方向プライマーを以下の表４に示
す。
【００５６】この実施例で実施される増幅は、種々の組
織からの重亜硫酸処理ＤＮＡを利用し、ＰＣＲプライマ
ーの２セットを用いた。特に、図５パネルＡに示す増幅
反応のために（転写開始部位をカバーする領域）、ＣＧ
ＰＳ−１と３が外側プライマーとして、ＣＧＰＳ２と４
が内側プライマーとして用いられた。図５パネルＢと図
６及び７で示す増幅反応のために、増幅の第１ラウンド
では、ＣｐＧ部位−３９から−１６からの領域を包含す
る外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８を用い、 そ
れに続く増幅の第２ラウンドではＣＧＰＳ−６及び７を
用いＣＰＧ部位−３６から−２３をカバーする１４０ｂ
ｐ断片を増幅した。図８から１１に示す増幅反応では、
上流領域のために用いられるプライマーセットは、第１
ラウンド増幅では外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び
ＣＧＰＳ−８、第２ラウンド増幅では、内側のプライマ
ー対としてＣＧＰＳ−１１及びＣＧＰＳ−１２を用い、
結果としてＣｐＧ部位―３８から−２３をカバーする１
６７ｂｐ断片を増幅した。
織からの重亜硫酸処理ＤＮＡを利用し、ＰＣＲプライマ
ーの２セットを用いた。特に、図５パネルＡに示す増幅
反応のために（転写開始部位をカバーする領域）、ＣＧ
ＰＳ−１と３が外側プライマーとして、ＣＧＰＳ２と４
が内側プライマーとして用いられた。図５パネルＢと図
６及び７で示す増幅反応のために、増幅の第１ラウンド
では、ＣｐＧ部位−３９から−１６からの領域を包含す
る外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８を用い、 そ
れに続く増幅の第２ラウンドではＣＧＰＳ−６及び７を
用いＣＰＧ部位−３６から−２３をカバーする１４０ｂ
ｐ断片を増幅した。図８から１１に示す増幅反応では、
上流領域のために用いられるプライマーセットは、第１
ラウンド増幅では外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び
ＣＧＰＳ−８、第２ラウンド増幅では、内側のプライマ
ー対としてＣＧＰＳ−１１及びＣＧＰＳ−１２を用い、
結果としてＣｐＧ部位―３８から−２３をカバーする１
６７ｂｐ断片を増幅した。
【００５７】プライマーのすべてのセットについて、Ｔ
Ｅバッファー（１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ8.8、0.1
ｍＭ ＥＤＴＡ）中に調製された、６７ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、１．７ｍｇ／ｍ
ｌＢＳＡ及び１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、からなるバッファ
ー中で、ＰＣＲ増幅を行った。反応混合物（５０μｌ）
は、各２００ｍＭの４つのｄＮＴＰｓ、６ｎｇ／ｍｌの
各プライマー、２ユニットのAmpliTaq ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Perkin Elmer）含んでいた。プライマーＣＧＰＳ
−５と８について（第１ラウンド増幅）、ＰＣＲサイク
ル条件は、６０℃１分、７２℃２分、及び９５℃１分の
５サイクル、その後、６５℃１分、７２℃１．５分、及
び９５℃１分の３０サイクルであった。プライマーＣＧ
ＰＳ−６と７のための増幅条件は（第２ラウンド増幅）
は、６５℃１分、７２℃２分、及び９５℃１分の５サイ
クル、その後、６５℃１分、７２℃１．５分、及び９５
℃１分の３０サイクルであった。プライマーＣＧＰＳ−
１１と１２については、増幅条件は、アニーリング温度
を６５℃から７０℃に上げた以外は、ＣＧＰＳ−６と７
と同じであった。第１ラウンド増幅反応物の２μｌを、
第２ラウンド増幅反応物５０μｌに用いた。同様の効率
及び特異性を達成するために、他のバッファー又はＰＣ
Ｒ増幅条件もまた使用可能である。
Ｅバッファー（１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ8.8、0.1
ｍＭ ＥＤＴＡ）中に調製された、６７ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム、１．７ｍｇ／ｍ
ｌＢＳＡ及び１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、からなるバッファ
ー中で、ＰＣＲ増幅を行った。反応混合物（５０μｌ）
は、各２００ｍＭの４つのｄＮＴＰｓ、６ｎｇ／ｍｌの
各プライマー、２ユニットのAmpliTaq ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Perkin Elmer）含んでいた。プライマーＣＧＰＳ
−５と８について（第１ラウンド増幅）、ＰＣＲサイク
ル条件は、６０℃１分、７２℃２分、及び９５℃１分の
５サイクル、その後、６５℃１分、７２℃１．５分、及
び９５℃１分の３０サイクルであった。プライマーＣＧ
ＰＳ−６と７のための増幅条件は（第２ラウンド増幅）
は、６５℃１分、７２℃２分、及び９５℃１分の５サイ
クル、その後、６５℃１分、７２℃１．５分、及び９５
℃１分の３０サイクルであった。プライマーＣＧＰＳ−
１１と１２については、増幅条件は、アニーリング温度
を６５℃から７０℃に上げた以外は、ＣＧＰＳ−６と７
と同じであった。第１ラウンド増幅反応物の２μｌを、
第２ラウンド増幅反応物５０μｌに用いた。同様の効率
及び特異性を達成するために、他のバッファー又はＰＣ
Ｒ増幅条件もまた使用可能である。
【００５８】結果及び考察
コアプロモーター領域をカバーするプライマーについて
（図５パネルＡ参照）、陽性対照ＤＮＡ（ガンＢ）から
増幅ＤＮＡ（矢印のバンド参照）を得たが、前立腺ガン
と診断されていなかった２人の被験者からの前立腺組織
試料ＤＮＡからも得た。増幅されたＤＮＡのバンドは、
骨髄及び血液試料から単離されたＤＮＡからも、前立腺
ガンと知られていない被験者からの肝臓組織試料から単
離されたＤＮＡからも見られた。
（図５パネルＡ参照）、陽性対照ＤＮＡ（ガンＢ）から
増幅ＤＮＡ（矢印のバンド参照）を得たが、前立腺ガン
と診断されていなかった２人の被験者からの前立腺組織
試料ＤＮＡからも得た。増幅されたＤＮＡのバンドは、
骨髄及び血液試料から単離されたＤＮＡからも、前立腺
ガンと知られていない被験者からの肝臓組織試料から単
離されたＤＮＡからも見られた。
【００５９】上流の増幅について（図５パネルＢ参
照）、健常な組織試料の範囲から単離されたＤＮＡで、
あるいは前立腺ガンとされていない被験者の血液試料単
離されたＤＮＡから、実施された増幅反応からは増幅さ
れたＤＮＡは得られなかった。増幅されたＤＮＡのバン
ドは、陽性対照ＤＮＡ（ガンＢ）から生成した。しかし
ながら、１つの正常前立腺組織試料から単離されたＤＮ
Ａで実施された増幅反応は、ＤＮＡ増幅が起こらず、増
幅されたＤＮＡは、前立腺ガンとされていない８２歳の
被験者の前立腺組織試料から単離されたＤＮＡで実施さ
れた同じ増幅反応から起こった。この被験者は診断され
ていない前立腺ガンを有していた可能性がある。前立腺
ガンとされていない被験者からの正常前立腺組織の５つ
の他の試料から単離されたＤＮＡは、増幅ＤＮＡ産物を
もたらさなかった（図７パネルＢ参照）。
照）、健常な組織試料の範囲から単離されたＤＮＡで、
あるいは前立腺ガンとされていない被験者の血液試料単
離されたＤＮＡから、実施された増幅反応からは増幅さ
れたＤＮＡは得られなかった。増幅されたＤＮＡのバン
ドは、陽性対照ＤＮＡ（ガンＢ）から生成した。しかし
ながら、１つの正常前立腺組織試料から単離されたＤＮ
Ａで実施された増幅反応は、ＤＮＡ増幅が起こらず、増
幅されたＤＮＡは、前立腺ガンとされていない８２歳の
被験者の前立腺組織試料から単離されたＤＮＡで実施さ
れた同じ増幅反応から起こった。この被験者は診断され
ていない前立腺ガンを有していた可能性がある。前立腺
ガンとされていない被験者からの正常前立腺組織の５つ
の他の試料から単離されたＤＮＡは、増幅ＤＮＡ産物を
もたらさなかった（図７パネルＢ参照）。
【００６０】図６で、ＰＣＲ増幅反応の結果は前立腺ガ
ンを有する患者からの組織試料を示す。各試料につい
て、ＤＮＡは、ガンを含むとして同定された領域から、
及び非常に正常であると同定された他の領域から単離し
た。すべてのケースで、増幅されたＤＮＡの明確なバン
ドが、前立腺ガンＤＮＡで実施された増幅反応から生成
した。これらのうちの２つは、メチル化ＤＮＡの割合
が、メチル化及び非メチル化ＤＮＡで等量で開始するよ
うに設計されたプライマーを用いて検出されるためには
不十分なケースであった。非常に正常な組織から単離さ
れたＤＮＡについて、増幅されたＤＮＡのバンドがない
かあるいは実質上より低い量で存在していた。ある“正
常”試料でのバンドの存在は、試料中の低いレベルのガ
ン細胞から由来する可能性があった。
ンを有する患者からの組織試料を示す。各試料につい
て、ＤＮＡは、ガンを含むとして同定された領域から、
及び非常に正常であると同定された他の領域から単離し
た。すべてのケースで、増幅されたＤＮＡの明確なバン
ドが、前立腺ガンＤＮＡで実施された増幅反応から生成
した。これらのうちの２つは、メチル化ＤＮＡの割合
が、メチル化及び非メチル化ＤＮＡで等量で開始するよ
うに設計されたプライマーを用いて検出されるためには
不十分なケースであった。非常に正常な組織から単離さ
れたＤＮＡについて、増幅されたＤＮＡのバンドがない
かあるいは実質上より低い量で存在していた。ある“正
常”試料でのバンドの存在は、試料中の低いレベルのガ
ン細胞から由来する可能性があった。
【００６１】手術の間、腹腔から得られる血液の試料か
らのＤＮＡの増幅は、それらの多くの中のメチル化ＧＳ
Ｔ−Ｐｉ配列を検出される可能性があったことを示し
た。転移性の疾患であることがわかっている３人の患者
から単離される末梢血液の試料（図７パネルＢ参照）は
増幅可能な、メチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列の存在を示し
た。
らのＤＮＡの増幅は、それらの多くの中のメチル化ＧＳ
Ｔ−Ｐｉ配列を検出される可能性があったことを示し
た。転移性の疾患であることがわかっている３人の患者
から単離される末梢血液の試料（図７パネルＢ参照）は
増幅可能な、メチル化ＧＳＴ−Ｐｉ配列の存在を示し
た。
【００６２】増幅されたＤＮＡ産物は、ＬＮＣａＰ及び
ＤＵ１４５前立腺ガン細胞系から単離されたＤＮＡの増
幅からも生産されたが、細胞系のＰＣ−３シリーズから
は生産されなかった。この後者の結果は、ＰＣ−３細胞
での上流プロモーター領域の低いレベルのメチル化のた
めであり得るが、主に寄与している要素は、おそらく、
ＰＣ−３がＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の変種対立遺伝子だけを
含むために、ＣＧＰＳ−６プライマーによるプライミン
グが欠如していることであろう。メチル化ＧＳＴ−Ｐｉ
配列もまた、非前立腺由来のいくつかの腫瘍由来細胞系
から単離されたＤＮＡ中に検出された：ＨｅＬａ、頚部
ガン、及びＨｅｐＧ２、肝臓ガン（図７パネルＢ参
照）。
ＤＵ１４５前立腺ガン細胞系から単離されたＤＮＡの増
幅からも生産されたが、細胞系のＰＣ−３シリーズから
は生産されなかった。この後者の結果は、ＰＣ−３細胞
での上流プロモーター領域の低いレベルのメチル化のた
めであり得るが、主に寄与している要素は、おそらく、
ＰＣ−３がＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の変種対立遺伝子だけを
含むために、ＣＧＰＳ−６プライマーによるプライミン
グが欠如していることであろう。メチル化ＧＳＴ−Ｐｉ
配列もまた、非前立腺由来のいくつかの腫瘍由来細胞系
から単離されたＤＮＡ中に検出された：ＨｅＬａ、頚部
ガン、及びＨｅｐＧ２、肝臓ガン（図７パネルＢ参
照）。
【００６３】ＤＮＡを３人の前立腺ガン患者（Ｃ）の、
及び５人の前立腺ガンとされていない被験者（Ｎ）の、
精液から単離し（図８参照）、重亜硫酸で処理し、プラ
イマーＣＧＰＳ−５と８、その後ＣＧＰＳ−６と７を用
いて増幅させた。増幅されたＤＮＡ産物は、すべての３
つのガンＤＮＡから得た。前立腺ガンと診断されていな
い被験者からの５つの試料のうちの１つも、増幅ＤＮＡ
産物の結果を得たが、これが偽陽性を表すのか、あるい
は特定の被験者における未診断の前立腺ガンのケースで
あるのか明白でない。
及び５人の前立腺ガンとされていない被験者（Ｎ）の、
精液から単離し（図８参照）、重亜硫酸で処理し、プラ
イマーＣＧＰＳ−５と８、その後ＣＧＰＳ−６と７を用
いて増幅させた。増幅されたＤＮＡ産物は、すべての３
つのガンＤＮＡから得た。前立腺ガンと診断されていな
い被験者からの５つの試料のうちの１つも、増幅ＤＮＡ
産物の結果を得たが、これが偽陽性を表すのか、あるい
は特定の被験者における未診断の前立腺ガンのケースで
あるのか明白でない。
【００６４】プライマーＣＧＰＳ−１１の使用はＣｐＧ
部位−３３での多形配列を横切ってのアニーリングを排
除し、外側プライマーとしてＣＧＰＳ−５と８とその後
の内側プライマーとしてＣＧＰＳ−１１と１２の組み合
わせは、前立腺ガンＤＮＡの効率的な増幅を与えること
が見出された。第１の実験で（図９参照）、ＤＮＡは、
ガンか良性過形成（ＢＰＨ）と診断されていたかのいず
れかとして同定されていた固定化組織切片の領域から抽
出された。ＤＮＡを、７Ｍ塩酸グアニジン、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，１００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ６．４、１％
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５０ｍｇ／ｍｌ プロテイナ
ーゼＫ及び１００ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡの４００μｌ
中で切屑化材料とインキュベートすることにより単離し
た。均質化の後、試料を４８時間５５℃インキュベート
し、ついでドライアイス５分／９５℃５分の凍結／融解
サイクルを５回行った。ボルテックスと２分間の微小遠
心管での遠心分離の後、上清をついで３倍に希釈し、フ
ェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノール沈澱を
行った。６人のガン患者と４人のＢＰＨからの試料から
単離されたＤＮＡを、コアプロモーター領域のための非
選択的プライマー（すなわちＧＳＴ−９と１０、その後
ＧＳＴ−１１と１２での対照ＰＣＲ増幅）か、あるいは
ＣＧ選択的プライマー（すなわちＣＨＰＳ−５と８、そ
の後ＣＧＰＳ−１１と１２での選択的ＰＣＲ増幅）で増
幅した。対照ＰＣＲ増幅は、すべての試料において増幅
可能なＤＮＡの存在を示した。ＣＧ選択的プライマーを
使用して、増幅されたＤＮＡ産物は、ガンＤＮＡからの
み得た。これらの患者のＰＳＡ（前立腺特異的抗原）レ
ベルは、４から１４５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。ＢＰ
Ｈ患者については、ＰＳＡレベルは２．３から２５ｎｇ
／ｍｌの範囲であった。
部位−３３での多形配列を横切ってのアニーリングを排
除し、外側プライマーとしてＣＧＰＳ−５と８とその後
の内側プライマーとしてＣＧＰＳ−１１と１２の組み合
わせは、前立腺ガンＤＮＡの効率的な増幅を与えること
が見出された。第１の実験で（図９参照）、ＤＮＡは、
ガンか良性過形成（ＢＰＨ）と診断されていたかのいず
れかとして同定されていた固定化組織切片の領域から抽
出された。ＤＮＡを、７Ｍ塩酸グアニジン、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，１００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ６．４、１％
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５０ｍｇ／ｍｌ プロテイナ
ーゼＫ及び１００ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡの４００μｌ
中で切屑化材料とインキュベートすることにより単離し
た。均質化の後、試料を４８時間５５℃インキュベート
し、ついでドライアイス５分／９５℃５分の凍結／融解
サイクルを５回行った。ボルテックスと２分間の微小遠
心管での遠心分離の後、上清をついで３倍に希釈し、フ
ェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノール沈澱を
行った。６人のガン患者と４人のＢＰＨからの試料から
単離されたＤＮＡを、コアプロモーター領域のための非
選択的プライマー（すなわちＧＳＴ−９と１０、その後
ＧＳＴ−１１と１２での対照ＰＣＲ増幅）か、あるいは
ＣＧ選択的プライマー（すなわちＣＨＰＳ−５と８、そ
の後ＣＧＰＳ−１１と１２での選択的ＰＣＲ増幅）で増
幅した。対照ＰＣＲ増幅は、すべての試料において増幅
可能なＤＮＡの存在を示した。ＣＧ選択的プライマーを
使用して、増幅されたＤＮＡ産物は、ガンＤＮＡからの
み得た。これらの患者のＰＳＡ（前立腺特異的抗原）レ
ベルは、４から１４５ｎｇ／ｍｌの範囲であった。ＢＰ
Ｈ患者については、ＰＳＡレベルは２．３から２５ｎｇ
／ｍｌの範囲であった。
【００６５】さらなる実験において、前立腺ガン細胞は
最初に血液試料から磁気ビーズに結合した抗体を用い、
ついでＤＮＡ単離、重亜硫酸修飾及びＰＣＲ増幅によっ
て濃縮された。細胞分離はDynabeads anti-Epithelial
Cell（Dynal生産番号No.112.07）を用いて、実質的には
生産者の記載のように、行った。磁気ビーズは、抗上皮
抗体mAb Ber-EP4で被覆した（２２）。あるいは、前立
腺特異的膜抗原（２３）の細胞外ドメインに特異的な抗
体に結合した磁気ビーズを用いることもできた。血液全
体を、１０ｍM EDTAを含むDulbecco’sリン酸緩衝化食
塩水（PBS）で１：１に希釈し、４０μｌの前洗浄磁気
ビーズを添加した。細胞は４℃で回転プラットフォーム
上で３０分間インキュベートし、ついで磁気細胞分離装
置を4分間用いてビーズをチューブの側面に採集した。
上清をついで注意深く吸引し、ビーズを洗浄溶液（０．
５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中に再懸濁し
た。ビーズはついで再び磁石を用いてチューブの側面に
採集し、上清を注意深く吸引し、磁気分離装置中に残る
チューブでさらなる洗浄を行い、上清を吸引した。ビー
ズはついで、ＤＮＡ単離バッファー（１００ｍＭ トリ
ス／ＨＣｌ ｐＨ８、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Sarkosy
l、２００ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）中に再懸濁
し、少なくとも２時間３７℃でインキュベートし、ＤＮ
Ａをフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱に
より回収した。ＤＮＡをついで最後に重亜硫酸処理とＰ
ＣＲ増幅に供した。
最初に血液試料から磁気ビーズに結合した抗体を用い、
ついでＤＮＡ単離、重亜硫酸修飾及びＰＣＲ増幅によっ
て濃縮された。細胞分離はDynabeads anti-Epithelial
Cell（Dynal生産番号No.112.07）を用いて、実質的には
生産者の記載のように、行った。磁気ビーズは、抗上皮
抗体mAb Ber-EP4で被覆した（２２）。あるいは、前立
腺特異的膜抗原（２３）の細胞外ドメインに特異的な抗
体に結合した磁気ビーズを用いることもできた。血液全
体を、１０ｍM EDTAを含むDulbecco’sリン酸緩衝化食
塩水（PBS）で１：１に希釈し、４０μｌの前洗浄磁気
ビーズを添加した。細胞は４℃で回転プラットフォーム
上で３０分間インキュベートし、ついで磁気細胞分離装
置を4分間用いてビーズをチューブの側面に採集した。
上清をついで注意深く吸引し、ビーズを洗浄溶液（０．
５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中に再懸濁し
た。ビーズはついで再び磁石を用いてチューブの側面に
採集し、上清を注意深く吸引し、磁気分離装置中に残る
チューブでさらなる洗浄を行い、上清を吸引した。ビー
ズはついで、ＤＮＡ単離バッファー（１００ｍＭ トリ
ス／ＨＣｌ ｐＨ８、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Sarkosy
l、２００ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）中に再懸濁
し、少なくとも２時間３７℃でインキュベートし、ＤＮ
Ａをフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱に
より回収した。ＤＮＡをついで最後に重亜硫酸処理とＰ
ＣＲ増幅に供した。
【００６６】この方法の感受性は、前立腺ガン細胞系、
ＬＮＣａＰのさまざまな数の細胞を正常血液中に植える
ことにより、試験した。図１０Ａで示すように、０．５
ｍｌの血液中に２０細胞以上の存在が信頼性をもって検
出できた。図１０Ｂに示された実験は、ＬＮＣａＰ細胞
を含む血液試料が、室温であるいは４℃で２４時間まで
感受性を失わずに貯蔵できたことを示した。
ＬＮＣａＰのさまざまな数の細胞を正常血液中に植える
ことにより、試験した。図１０Ａで示すように、０．５
ｍｌの血液中に２０細胞以上の存在が信頼性をもって検
出できた。図１０Ｂに示された実験は、ＬＮＣａＰ細胞
を含む血液試料が、室温であるいは４℃で２４時間まで
感受性を失わずに貯蔵できたことを示した。
【００６７】磁気ビーズ捕捉と、重亜硫酸処理、感受性
ＰＣＲ増幅を用いて、患者の血液試料も分析し、これら
のセットからの結果を図１１に示す。これらは、前立腺
に問題が知られていない正常被験者からの、前立腺の良
性過形成の患者からの、組織学的に前立腺ガンと確認さ
れた患者からの血液試料を含む。対照ＰＣＲ増幅（上の
パネル）は、メチル化と非メチル化のＧＳＴ−Ｐｉ配列
の両方を増幅するプライマーを用いた。ＣＧ−選択性プ
ライマーを用いる増幅を下のパネルに示す。陽性対照増
幅（ＬＮＣａＰ（Ｌ）とＰＣ３（Ｐ））は、ガンパネル
に示され、陰性対照増幅は正常とガンパネルに示され
る。
ＰＣＲ増幅を用いて、患者の血液試料も分析し、これら
のセットからの結果を図１１に示す。これらは、前立腺
に問題が知られていない正常被験者からの、前立腺の良
性過形成の患者からの、組織学的に前立腺ガンと確認さ
れた患者からの血液試料を含む。対照ＰＣＲ増幅（上の
パネル）は、メチル化と非メチル化のＧＳＴ−Ｐｉ配列
の両方を増幅するプライマーを用いた。ＣＧ−選択性プ
ライマーを用いる増幅を下のパネルに示す。陽性対照増
幅（ＬＮＣａＰ（Ｌ）とＰＣ３（Ｐ））は、ガンパネル
に示され、陰性対照増幅は正常とガンパネルに示され
る。
【００６８】以下の表５は、磁気ビーズ／ＣＧ選択性Ｐ
ＣＲ増幅プロトコールを用いた患者血液試料からのＤＮ
Ａをテストした結果をまとめたものである。増幅された
ＤＮＡ産物は、正常対照被験者から単離されたＤＮＡか
らは得られず、組織学的にＢＰＨを有していると診断さ
れた１８人の患者のうちの１人から単離されたＤＮＡだ
け、増幅ＤＮＡ産物を生産した（この患者は血液ＰＳＡ
レベル１７ｎｇ／ｍｌであった）。前立腺ガンであると
確認された患者のうち、２４中１７（７０％）の単離さ
れたＤＮＡがＰＣＲ陽性（すなわち増幅ＤＮＡの生産を
得た）であり、血中の前立腺ガン細胞の存在を示した。
臨床的にステージＡとＢの患者について（すなわち前立
腺に限られた疾患）、ガン細胞は血中に１０ケースのう
ち６で、検出された。局所的湿潤（ステージＣ）又は転
移（ステージＤ）疾患を有する９人の患者について、ガ
ン細胞は、すべてのケースで血中に検出された。
ＣＲ増幅プロトコールを用いた患者血液試料からのＤＮ
Ａをテストした結果をまとめたものである。増幅された
ＤＮＡ産物は、正常対照被験者から単離されたＤＮＡか
らは得られず、組織学的にＢＰＨを有していると診断さ
れた１８人の患者のうちの１人から単離されたＤＮＡだ
け、増幅ＤＮＡ産物を生産した（この患者は血液ＰＳＡ
レベル１７ｎｇ／ｍｌであった）。前立腺ガンであると
確認された患者のうち、２４中１７（７０％）の単離さ
れたＤＮＡがＰＣＲ陽性（すなわち増幅ＤＮＡの生産を
得た）であり、血中の前立腺ガン細胞の存在を示した。
臨床的にステージＡとＢの患者について（すなわち前立
腺に限られた疾患）、ガン細胞は血中に１０ケースのう
ち６で、検出された。局所的湿潤（ステージＣ）又は転
移（ステージＤ）疾患を有する９人の患者について、ガ
ン細胞は、すべてのケースで血中に検出された。
【００６９】ＨｅｐＧ２肝臓ガン細胞系がメチル化ＧＳ
Ｔ−Ｐｉ配列を含んでいたことが見出されたため、肝臓
ガン組織からのＤＮＡの試料も調べた。２０の肝臓ガン
試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸処理し、ＣＧＰＳ−
５と８及びＣＧＰＳ−１１と１２プライマー対を用いて
増幅した（図１２参照）。２０の試料のうち１４がＰＣ
Ｒ陽性であった。他方、肝臓ガンでない２人の患者から
単離されたＤＮＡからは増幅ＤＮＡ産物は生産されなか
った（図５ないし図７参照、データは示さず）。正常肝
臓組織から単離されたＤＮＡは、転写開始部位の領域で
部分的にメチル化されていることが示された（ＣｐＧ部
位―７から＋７、図４参照）。正常肝臓ＤＮＡのさらな
る試料の分析は、メチル化のレベルが変動し得るもの
で、−１３から＋８のＣｐＧ部位を含むことができるこ
とを示した。ここで用いられるプライマー対は、ＣｐＧ
部位−３９から−１６、正常肝臓ＤＮＡでみられるメチ
ル化の領域の上流を包含する。
Ｔ−Ｐｉ配列を含んでいたことが見出されたため、肝臓
ガン組織からのＤＮＡの試料も調べた。２０の肝臓ガン
試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸処理し、ＣＧＰＳ−
５と８及びＣＧＰＳ−１１と１２プライマー対を用いて
増幅した（図１２参照）。２０の試料のうち１４がＰＣ
Ｒ陽性であった。他方、肝臓ガンでない２人の患者から
単離されたＤＮＡからは増幅ＤＮＡ産物は生産されなか
った（図５ないし図７参照、データは示さず）。正常肝
臓組織から単離されたＤＮＡは、転写開始部位の領域で
部分的にメチル化されていることが示された（ＣｐＧ部
位―７から＋７、図４参照）。正常肝臓ＤＮＡのさらな
る試料の分析は、メチル化のレベルが変動し得るもの
で、−１３から＋８のＣｐＧ部位を含むことができるこ
とを示した。ここで用いられるプライマー対は、ＣｐＧ
部位−３９から−１６、正常肝臓ＤＮＡでみられるメチ
ル化の領域の上流を包含する。
【００７０】上述の結果は、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のコア
プロモーター又はコアプロモーターの上流領域にハイブ
リダイズするように設計された異なるセットのプライマ
ーが、信頼性をもって、前立腺ガン細胞から単離された
重亜硫酸処理ＤＮＡを増幅できることを示す。しかしな
がら、コアプロモーターにハイブリダイズするように設
計されたプライマーは選択性がより低く、多くの正常組
織試料から単離されたＤＮＡｓはＤＮＡ増幅産物を得
る。このように、正常組織からＤＮＡ中に非メチル化さ
れていることが見出される領域にハイブリダイズするよ
うに設計されたプライマー、すなわちＣｐＧ部位−４５
から−８を包含する上流領域とＣｐＧ部位＋８から＋５
３を包含するプロモーターの下流領域は、前立腺ガンの
診断又は予後のアッセイに好ましい。さらに、この後者
の領域にハイブリダイズするように設計されたプライマ
ーは、初期と後期の前立腺ガンを区別するためにも有用
かもしれない。
プロモーター又はコアプロモーターの上流領域にハイブ
リダイズするように設計された異なるセットのプライマ
ーが、信頼性をもって、前立腺ガン細胞から単離された
重亜硫酸処理ＤＮＡを増幅できることを示す。しかしな
がら、コアプロモーターにハイブリダイズするように設
計されたプライマーは選択性がより低く、多くの正常組
織試料から単離されたＤＮＡｓはＤＮＡ増幅産物を得
る。このように、正常組織からＤＮＡ中に非メチル化さ
れていることが見出される領域にハイブリダイズするよ
うに設計されたプライマー、すなわちＣｐＧ部位−４５
から−８を包含する上流領域とＣｐＧ部位＋８から＋５
３を包含するプロモーターの下流領域は、前立腺ガンの
診断又は予後のアッセイに好ましい。さらに、この後者
の領域にハイブリダイズするように設計されたプライマ
ーは、初期と後期の前立腺ガンを区別するためにも有用
かもしれない。
【００７１】実施例３：正しい増幅の確認
下記の特異的オリゴヌクレオチドプローブを、アッセイ
の増幅工程から得られる増幅ＤＮＡ産物が、すべての非
メチル化シトシンがウラシルに転換されたＤＮＡによる
ものであることを確認するために用いることができる。
上流ＰＣＲ領域のそれらは、ＣＧＰＳ−５，６，１１，
７から９、１2及び１３正方向及び逆方向プライマーの
すべての組み合わせから増幅されたＤＮＡ産物とともに
用いることができる。下流ＰＣＲ領域のそれらは、ＣＧ
ＰＳ−２１から２４プライマーの増幅されたＤＮＡ産物
とともに用いることができる。転換特異的オリゴヌクレ
オチドのビオチニル化バージョンは、これらのプライマ
ー対を用いて生成される増幅ＤＮＡ産物の溶液からの選
択的及び特異的捕捉にも用いることができ、あるいは適
当に標識されたオリゴヌクレオチドは、特異的ＰＣＲ断
片増幅のリアルタイムモニターに用いることができる。
重亜硫酸処理ＤＮＡのＰＣＲ増幅からの増幅されたＤＮ
Ａ産物は、日常的に、非常に高い割合のチミンヌクレオ
チドを含む１つの鎖と、非常に高い割合のアデニンヌク
レオチドを含む他方の鎖を有する。このために、オリゴ
ｄＴ（又はオリゴｄＡ）を包括的な転換特異的オリゴヌ
クレオチドとして使用することが可能であり、アニーリ
ング条件は各ＰＣＲ断片について転換及び非転換ＤＮＡ
の区別の最適化のために変化する。
の増幅工程から得られる増幅ＤＮＡ産物が、すべての非
メチル化シトシンがウラシルに転換されたＤＮＡによる
ものであることを確認するために用いることができる。
上流ＰＣＲ領域のそれらは、ＣＧＰＳ−５，６，１１，
７から９、１2及び１３正方向及び逆方向プライマーの
すべての組み合わせから増幅されたＤＮＡ産物とともに
用いることができる。下流ＰＣＲ領域のそれらは、ＣＧ
ＰＳ−２１から２４プライマーの増幅されたＤＮＡ産物
とともに用いることができる。転換特異的オリゴヌクレ
オチドのビオチニル化バージョンは、これらのプライマ
ー対を用いて生成される増幅ＤＮＡ産物の溶液からの選
択的及び特異的捕捉にも用いることができ、あるいは適
当に標識されたオリゴヌクレオチドは、特異的ＰＣＲ断
片増幅のリアルタイムモニターに用いることができる。
重亜硫酸処理ＤＮＡのＰＣＲ増幅からの増幅されたＤＮ
Ａ産物は、日常的に、非常に高い割合のチミンヌクレオ
チドを含む１つの鎖と、非常に高い割合のアデニンヌク
レオチドを含む他方の鎖を有する。このために、オリゴ
ｄＴ（又はオリゴｄＡ）を包括的な転換特異的オリゴヌ
クレオチドとして使用することが可能であり、アニーリ
ング条件は各ＰＣＲ断片について転換及び非転換ＤＮＡ
の区別の最適化のために変化する。
【００７２】上流ＰＣＲ領域：
転換オリゴヌクレオチド
[配列１４]
【００７３】非転換オリゴヌクレオチド
[配列１５]
【００７４】転換中性オリゴヌクレオチド
[配列１６]
【００７５】下流ＰＣＲ領域：
転換オリゴヌクレオチド
[配列１７]
【００７６】非転換オリゴヌクレオチド
[配列１８]
【００７７】転換中性オリゴヌクレオチド
[配列１９]
【００７８】そのようなハイブリダイゼーションの選択
性を示すために、一連のＤＮＡｓをナイロン膜上にスポ
ットし、上流ＰＣＲ領域のための転換及び非転換特異的
オリゴヌクレオチドプローブ、及び対照オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズした。ＤＮＡｓは以下のものを含
むものであった： （i） プローブと相補する領域内に異なる数の
転換シトシンを含む、上流領域の増幅からの個々のクロ
ーン化ＰＣＲ産物（図１３参照、ここで、１０のうち
の、転換シトシンの数を示す（カラム１及びカラム２の
上の２つのスポット）。隣接する１０／１０転換塩基末
端を含むが対照オリゴヌクレオチドを相補する配列は含
まない２つのクローンに注目）；及び （ii） ＣＧ選択的プライマー（ＣＧＰＳ−５と
８、その後ＣＧＰＳ１１と１２）を用いて、重亜硫酸処
理ＤＮＡから増幅された、ガン患者及び良性過形成の患
者からのＰＣＲ産物（図１３参照、ここでこれらはガン
試料１から４（カラム２の下の部分）及びＢＰＨ試料１
から４（カラム３）として標識化されている）。
性を示すために、一連のＤＮＡｓをナイロン膜上にスポ
ットし、上流ＰＣＲ領域のための転換及び非転換特異的
オリゴヌクレオチドプローブ、及び対照オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズした。ＤＮＡｓは以下のものを含
むものであった： （i） プローブと相補する領域内に異なる数の
転換シトシンを含む、上流領域の増幅からの個々のクロ
ーン化ＰＣＲ産物（図１３参照、ここで、１０のうち
の、転換シトシンの数を示す（カラム１及びカラム２の
上の２つのスポット）。隣接する１０／１０転換塩基末
端を含むが対照オリゴヌクレオチドを相補する配列は含
まない２つのクローンに注目）；及び （ii） ＣＧ選択的プライマー（ＣＧＰＳ−５と
８、その後ＣＧＰＳ１１と１２）を用いて、重亜硫酸処
理ＤＮＡから増幅された、ガン患者及び良性過形成の患
者からのＰＣＲ産物（図１３参照、ここでこれらはガン
試料１から４（カラム２の下の部分）及びＢＰＨ試料１
から４（カラム３）として標識化されている）。
【００７９】キナーゼ化オリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリダイゼーションをExpress-Hybバッファー（C
lontech）中で４５℃２時間実施し、その後２XＳＳＣ、
０．１％ ＳＤＳで４５℃２０分間の洗浄を４回、つい
でリン酸イメージ（phosphorimage）分析を実施した。
のハイブリダイゼーションをExpress-Hybバッファー（C
lontech）中で４５℃２時間実施し、その後２XＳＳＣ、
０．１％ ＳＤＳで４５℃２０分間の洗浄を４回、つい
でリン酸イメージ（phosphorimage）分析を実施した。
【００８０】対照オリゴヌクレオチドプローブのとのハ
イブリダイゼーションは、試料中のＤＮＡの量の評価を
提供する。予想したように、ＢＰＨ試料のＰＣＲ増幅は
どれも多く検出できる産物を生産しなかったが、４つの
ガン試料のうちの３は強いシグナル、１つは非常に弱い
シグナルを与えた。
イブリダイゼーションは、試料中のＤＮＡの量の評価を
提供する。予想したように、ＢＰＨ試料のＰＣＲ増幅は
どれも多く検出できる産物を生産しなかったが、４つの
ガン試料のうちの３は強いシグナル、１つは非常に弱い
シグナルを与えた。
【００８１】転換特異的プローブとのハイブリダイゼー
ションは、プローブと完全にマッチするプラスミドＤＮ
Ａについて、及び対照オリゴヌクレオチドプローブとよ
り強いハイブリダイゼーションを示した３つのガン試料
について、明白なシグナルを示した。対照オリゴヌクレ
オチドプローブと非常に弱いシグナルを示した第４のガ
ン試料は、転換特異的プローブではほとんど検出されな
かった。このことは、ＤＮＡの低いレベル、又はおそら
く、部分的に転換されたＤＮＡ分子の存在のためであろ
う。転換特異的プローブとミスマッチを有していたプラ
スミドクローンはどれもたいしたシグナルを与えなかっ
た。非転換ＤＮＡプローブは、０、１、又は２塩基が転
換したプラスミドＤＮＡｓと明白にハイブリダイズした
が、８又は１０の塩基が転換した試料とはハイブリダイ
ズしなかった。ハイブリダイゼーションはまた、２つの
ＢＰＨと１つのガン試料で、非転換ＤＮＡの低いレベル
の増幅があったことを示した（この後者のケースでは、
十分に転換されたＤＮＡについてプローブから強いシグ
ナルがあり、ＰＣＲ産物が適切に転換されたＤＮＡから
優勢に生成されたことを示していた）。
ションは、プローブと完全にマッチするプラスミドＤＮ
Ａについて、及び対照オリゴヌクレオチドプローブとよ
り強いハイブリダイゼーションを示した３つのガン試料
について、明白なシグナルを示した。対照オリゴヌクレ
オチドプローブと非常に弱いシグナルを示した第４のガ
ン試料は、転換特異的プローブではほとんど検出されな
かった。このことは、ＤＮＡの低いレベル、又はおそら
く、部分的に転換されたＤＮＡ分子の存在のためであろ
う。転換特異的プローブとミスマッチを有していたプラ
スミドクローンはどれもたいしたシグナルを与えなかっ
た。非転換ＤＮＡプローブは、０、１、又は２塩基が転
換したプラスミドＤＮＡｓと明白にハイブリダイズした
が、８又は１０の塩基が転換した試料とはハイブリダイ
ズしなかった。ハイブリダイゼーションはまた、２つの
ＢＰＨと１つのガン試料で、非転換ＤＮＡの低いレベル
の増幅があったことを示した（この後者のケースでは、
十分に転換されたＤＮＡについてプローブから強いシグ
ナルがあり、ＰＣＲ産物が適切に転換されたＤＮＡから
優勢に生成されたことを示していた）。
【００８２】結果は、ここで用いられたタイプのオリゴ
ヌクレオチドが、重亜硫酸で効率的に転換された分子と
されなかった分子の間を区別できることを示す。それら
は、ＰＣＲ産物の検出のための、あるいはＰＣＲ又は効
率的に標的領域の転換分子を全ＤＮＡ集団から選別する
ための他の検出方法の前の、多くのフォーマットで用い
ることができる。同じアプローチは、非メチル化ＤＮＡ
ｓ（Ｕ’ｓ、又はＴ’ｓを含むそれらの誘導体を含む）
から区別可能なＣｐＧメチル化ＤＮＡｓ（又はＣ’ｓを
含むそれらの誘導体）プライマーで用いることができ
る。
ヌクレオチドが、重亜硫酸で効率的に転換された分子と
されなかった分子の間を区別できることを示す。それら
は、ＰＣＲ産物の検出のための、あるいはＰＣＲ又は効
率的に標的領域の転換分子を全ＤＮＡ集団から選別する
ための他の検出方法の前の、多くのフォーマットで用い
ることができる。同じアプローチは、非メチル化ＤＮＡ
ｓ（Ｕ’ｓ、又はＴ’ｓを含むそれらの誘導体を含む）
から区別可能なＣｐＧメチル化ＤＮＡｓ（又はＣ’ｓを
含むそれらの誘導体）プライマーで用いることができ
る。
【００８３】
【参考文献】
【００８４】
【表１】
【００８５】
【表２】
【他／】
【００８６】
【表３】
【００８７】
【表４】
【００８８】
【表５】
【００８９】当業者であれば、広く記載された本発明の
思想又は範囲からはずれずに、特定の実施態様で示した
本発明に対して多くの変形及び／又は修飾が可能である
ことが理解されるであろう。したがって、本実施態様は
いかなる面でも例示的かつ非制限的であるとして理解さ
れる。 ［図面の簡単な説明］
思想又は範囲からはずれずに、特定の実施態様で示した
本発明に対して多くの変形及び／又は修飾が可能である
ことが理解されるであろう。したがって、本実施態様は
いかなる面でも例示的かつ非制限的であるとして理解さ
れる。 ［図面の簡単な説明］
【図１】 図１はヒトＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の構成とヌク
レオチド配列を示す。ＣｐＧ部位は、転写開始部位に対
して番号が付されている。ヌクレオチド配列番号付け
は、Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｎｏ．Ｍ２４４８５のＧ
ＳＴ−Ｐｉ遺伝子配列に従っている。
レオチド配列を示す。ＣｐＧ部位は、転写開始部位に対
して番号が付されている。ヌクレオチド配列番号付け
は、Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号Ｎｏ．Ｍ２４４８５のＧ
ＳＴ−Ｐｉ遺伝子配列に従っている。
【図２】 図２は、前立腺ガンのデファレンシャル・メ
チル化を示すＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の領域を示す。図面は
さらに、上流領域（ＣｐＧ部位−４３から＋１０）のプ
ライマーの配列及び由来及び、ＣｐＧ部位−３３（上記
配列（ｐ））を包含する共通の多形を示す。ＧＳＴ−Ｐ
ｉ配列の下に、シトシンからウラシルへの転換の後の誘
導鎖の配列を示す。誘導鎖は、すべてのＣｐＧがメチル
化（Ｂ−Ｍ）され、または非メチル化（Ｂ−Ｕ）である
ものとして示される。この下に、メチル化配列を特異的
に増幅するように設計された特異的プライマーが示され
る。
チル化を示すＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の領域を示す。図面は
さらに、上流領域（ＣｐＧ部位−４３から＋１０）のプ
ライマーの配列及び由来及び、ＣｐＧ部位−３３（上記
配列（ｐ））を包含する共通の多形を示す。ＧＳＴ−Ｐ
ｉ配列の下に、シトシンからウラシルへの転換の後の誘
導鎖の配列を示す。誘導鎖は、すべてのＣｐＧがメチル
化（Ｂ−Ｍ）され、または非メチル化（Ｂ−Ｕ）である
ものとして示される。この下に、メチル化配列を特異的
に増幅するように設計された特異的プライマーが示され
る。
【図３】 単離ＤＮＡ中の各ＣｐＧ部位のメチル化状態
を示す。Ａ−ＬＮＣａＰ（ＬＮ）細胞系、ＤＵ１４５
（ＤＵ）細胞系、ＰＣ３細胞系、ＰＣ３−Ｍ細胞系及び
ＰＣ３−ＭＭ細胞系のコアプロモーター領域からＧＳＴ
−Ｐｉ遺伝子の３‘’末端までについて、前立腺ガン患
者（２ＡＮ、ＢＮ、ＣＮ）から正常組織試料から単離さ
れたＤＮＡについて、前立腺腫瘍組織（ＢＣ、ＣＣ、Ｄ
Ｃ、ＸＣ、ＷＣ及び２ＡＣ）について、及び前立腺ガン
でない人からの正常前立腺組織（Ｐｒ）について。
を示す。Ａ−ＬＮＣａＰ（ＬＮ）細胞系、ＤＵ１４５
（ＤＵ）細胞系、ＰＣ３細胞系、ＰＣ３−Ｍ細胞系及び
ＰＣ３−ＭＭ細胞系のコアプロモーター領域からＧＳＴ
−Ｐｉ遺伝子の３‘’末端までについて、前立腺ガン患
者（２ＡＮ、ＢＮ、ＣＮ）から正常組織試料から単離さ
れたＤＮＡについて、前立腺腫瘍組織（ＢＣ、ＣＣ、Ｄ
Ｃ、ＸＣ、ＷＣ及び２ＡＣ）について、及び前立腺ガン
でない人からの正常前立腺組織（Ｐｒ）について。
【図４】 単離ＤＮＡ中の各ＣｐＧ部位のメチル化状態
を示す。Ｂ−（前立腺ガンでない人からの）正常前立腺
組織からの、３つの前立腺ガン試料からの（ＢＣ，ＣＣ
及びＤＣ）、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のコアプロモーター領
域及び上流配列について、及び多くの他の組織につい
て。患者Ｂ及びＤは、ＣｐＧ部位−３３で多形であり、
角型かっこで示されるメチル化のレベルは、ＣｐＧを含
む対立遺伝子のメチル化を反映する。ＣｐＧ部位−２８
から＋１０において、メチル化のレベルは、ＰＣＲ分子
の集団の直接配列分析により決定される（１７）。上流
のＣｐＧ部位、−５６から−３０では、ＰＣＲ産物はク
ローン化され、多くの個々のクローンが配列決定された
（試料名の下に角型カッコで示された番号）。正常組織
において、各部位でのメチル化のレベルは、その位置に
Ｃを含むすべてのクローンの画分として決定された。ガ
ン試料ＢＣ、ＣＣ及びＤＣにおいて、示されるメチル化
のレベルは、ＣｐＧ部位−４３から−３０までの領域内
にＤＮＡメチル化を示したクローンの中である（各ケー
スの約半分のクローン）。図３と図４の両方で、ブラッ
クボックスは部位がアッセイされていなかったことを示
し、“Ｂ”は部位の状態が決定できなかったことを示す
（例えば、配列遮断のために、または配列ランの範囲を
超えていた）。各部位で検出されるメチル化のレベル
は、なし（−）、２５％まで（＋）、２６−５０％（＋
＋）、５１−７５％（＋＋＋）、及び７６−１００％
（＋＋＋＋）で示される。腫瘍試料のグリーソンの分類
も示される。
を示す。Ｂ−（前立腺ガンでない人からの）正常前立腺
組織からの、３つの前立腺ガン試料からの（ＢＣ，ＣＣ
及びＤＣ）、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子のコアプロモーター領
域及び上流配列について、及び多くの他の組織につい
て。患者Ｂ及びＤは、ＣｐＧ部位−３３で多形であり、
角型かっこで示されるメチル化のレベルは、ＣｐＧを含
む対立遺伝子のメチル化を反映する。ＣｐＧ部位−２８
から＋１０において、メチル化のレベルは、ＰＣＲ分子
の集団の直接配列分析により決定される（１７）。上流
のＣｐＧ部位、−５６から−３０では、ＰＣＲ産物はク
ローン化され、多くの個々のクローンが配列決定された
（試料名の下に角型カッコで示された番号）。正常組織
において、各部位でのメチル化のレベルは、その位置に
Ｃを含むすべてのクローンの画分として決定された。ガ
ン試料ＢＣ、ＣＣ及びＤＣにおいて、示されるメチル化
のレベルは、ＣｐＧ部位−４３から−３０までの領域内
にＤＮＡメチル化を示したクローンの中である（各ケー
スの約半分のクローン）。図３と図４の両方で、ブラッ
クボックスは部位がアッセイされていなかったことを示
し、“Ｂ”は部位の状態が決定できなかったことを示す
（例えば、配列遮断のために、または配列ランの範囲を
超えていた）。各部位で検出されるメチル化のレベル
は、なし（−）、２５％まで（＋）、２６−５０％（＋
＋）、５１−７５％（＋＋＋）、及び７６−１００％
（＋＋＋＋）で示される。腫瘍試料のグリーソンの分類
も示される。
【図５】 図５は種々の組織からの重亜硫酸処理ＤＮＡ
ｓの増幅の結果を提供する。Ａ−パネルＡ（転写開始部
位をカバーする領域）はＣＧＰＳ−１及び３を外側のプ
ライマーとして、ＣＧＰＳ−２及び４は内側のプライマ
ーとして用いた。パネルＢは、増幅の第１ラウンドで
は、ＣｐＧ部位−３９から−１６からの領域を包含する
外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８を用い、 それ
に続く増幅の第２ラウンドではＣＧＰＳ−６及び７を用
いＣＰＧ部位−３６から−２３をカバーする１４０ｂｐ
断片を増幅した。レーンは、１．脳、２．肺、３．骨格
筋、４．脾臓、５、膵臓、６．“正常”前立腺、８５
歳、７．“正常”前立腺、６２歳、８．心臓、９．骨
髄、１０．血液−１、１１．血液−２、１２．血液−
３、１３．肝臓−１、１４．肝臓−２：
ｓの増幅の結果を提供する。Ａ−パネルＡ（転写開始部
位をカバーする領域）はＣＧＰＳ−１及び３を外側のプ
ライマーとして、ＣＧＰＳ−２及び４は内側のプライマ
ーとして用いた。パネルＢは、増幅の第１ラウンドで
は、ＣｐＧ部位−３９から−１６からの領域を包含する
外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８を用い、 それ
に続く増幅の第２ラウンドではＣＧＰＳ−６及び７を用
いＣＰＧ部位−３６から−２３をカバーする１４０ｂｐ
断片を増幅した。レーンは、１．脳、２．肺、３．骨格
筋、４．脾臓、５、膵臓、６．“正常”前立腺、８５
歳、７．“正常”前立腺、６２歳、８．心臓、９．骨
髄、１０．血液−１、１１．血液−２、１２．血液−
３、１３．肝臓−１、１４．肝臓−２：
【図６】 図６は種々の組織からの重亜硫酸処理ＤＮＡ
ｓの増幅の結果を提供する。Ｂ−図５パネルＢで示され
た、１０の前立腺ガン組織試料（ｃ）及び同じ前立腺の
マッチした正常（ｎ）組織試料からのＤＮＡを用いた増
幅のそれが同じプライマー対を用いられた（陽性対照
（＋）ＬＮＣａＰＤＮＡ及び陰性対照（−）も示す）。
下には、グリーソンの分類及び非選択プライマーでみら
れる試料のメチル化のレベルである。
ｓの増幅の結果を提供する。Ｂ−図５パネルＢで示され
た、１０の前立腺ガン組織試料（ｃ）及び同じ前立腺の
マッチした正常（ｎ）組織試料からのＤＮＡを用いた増
幅のそれが同じプライマー対を用いられた（陽性対照
（＋）ＬＮＣａＰＤＮＡ及び陰性対照（−）も示す）。
下には、グリーソンの分類及び非選択プライマーでみら
れる試料のメチル化のレベルである。
【図７】 図７は種々の組織からの重亜硫酸処理ＤＮＡ
ｓの増幅の結果を提供する。Ｃ−図５パネルＢで示され
た、健常組織、前立腺ガン患者の血液及び種々の細胞系
の範囲からのＤＮＡを用いた増幅のそれが同じプライマ
ー対を用いた。レーンは、パネルＡ１−１０ 根治的前
立腺切除の間の前立腺ガン患者からの血液試料；パネル
Ｂ１．正常前立腺−１、２．正常前立腺−２、３．正常
前立腺−３、４．正常前立腺−４、５．正常前立腺−
５、６．ＨＰＶ形質転換前立腺細胞系、７．前立腺患者
ＰＡからの血液（ＰＳＡ＝１０００）、８．前立腺患者
ＰＢからの血液（ＰＳＡ＝５６）、９．前立腺患者ＰＣ
からの血液（ＰＳＡ＝１８）；パネルＣ １．ＬＮＣａ
Ｐ細胞系、２．Ｄｕ１４５歳傍系、３．ＰＣ−３細胞
系、４．ＰＣ−３Ｍ細胞系、５．ＰＣ−３ＭＭ細胞系、
６．Ｈｅｌａ細胞系、７．白血病ＤＮＡ、８．ＨｅｐＧ
２細胞系、９．ヒト肝臓ＤＮＡ、１０．白血球、１１．
ＭＲＣ−５細胞系。
ｓの増幅の結果を提供する。Ｃ−図５パネルＢで示され
た、健常組織、前立腺ガン患者の血液及び種々の細胞系
の範囲からのＤＮＡを用いた増幅のそれが同じプライマ
ー対を用いた。レーンは、パネルＡ１−１０ 根治的前
立腺切除の間の前立腺ガン患者からの血液試料；パネル
Ｂ１．正常前立腺−１、２．正常前立腺−２、３．正常
前立腺−３、４．正常前立腺−４、５．正常前立腺−
５、６．ＨＰＶ形質転換前立腺細胞系、７．前立腺患者
ＰＡからの血液（ＰＳＡ＝１０００）、８．前立腺患者
ＰＢからの血液（ＰＳＡ＝５６）、９．前立腺患者ＰＣ
からの血液（ＰＳＡ＝１８）；パネルＣ １．ＬＮＣａ
Ｐ細胞系、２．Ｄｕ１４５歳傍系、３．ＰＣ−３細胞
系、４．ＰＣ−３Ｍ細胞系、５．ＰＣ−３ＭＭ細胞系、
６．Ｈｅｌａ細胞系、７．白血病ＤＮＡ、８．ＨｅｐＧ
２細胞系、９．ヒト肝臓ＤＮＡ、１０．白血球、１１．
ＭＲＣ−５細胞系。
【図８】 図８は、前立腺ガン患者の精液（ｃ）から
の、及び前立腺ガンとは診断されない男性からの
（ｎ）、外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８、内側
のプライマー対としてＣＧＰＳ−６及び７を用いた、重
亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の結果を提供する。レーン
は、１．ＬＮＣａＰ細胞系（陽性対照）、２．Ｄｕ１４
５歳傍系、３．ＰＣ−３細胞系（陰性対照）、Ｍ．分子
量マーカー。
の、及び前立腺ガンとは診断されない男性からの
（ｎ）、外側のプライマー対ＣＧＰＳ−５及び８、内側
のプライマー対としてＣＧＰＳ−６及び７を用いた、重
亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の結果を提供する。レーン
は、１．ＬＮＣａＰ細胞系（陽性対照）、２．Ｄｕ１４
５歳傍系、３．ＰＣ−３細胞系（陰性対照）、Ｍ．分子
量マーカー。
【図９】 図９は、ＤＮＡが、ガンあるいは良性の過形
成を有する疾患（ＢＰＨ）のいずれかとして同定された
前立腺組織切片から単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡｓ
の増幅の結果を提供する。選択的ＰＣＲ増幅は、外側プ
ライマーＣＧＰＳ−５及び８と内側プライマーＣＧＰＳ
−１１と１２を用いて実施した。
成を有する疾患（ＢＰＨ）のいずれかとして同定された
前立腺組織切片から単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡｓ
の増幅の結果を提供する。選択的ＰＣＲ増幅は、外側プ
ライマーＣＧＰＳ−５及び８と内側プライマーＣＧＰＳ
−１１と１２を用いて実施した。
【図１０】 図１０は、ＤＮＡが、抗上皮抗体で被覆さ
れた磁気ビーズを用いて血液試料から濃縮された前立腺
ガン細胞から単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅
の結果を提供する。ＬＮＣａＰ前立腺ガン細胞の異なる
番号が、血液試料（１０Ａ）又はＤＮＡ単離の前に異な
る時間に４℃又は室温で保存された添加されたＬＮＣａ
Ｐ細胞を有する血液に加えられた。
れた磁気ビーズを用いて血液試料から濃縮された前立腺
ガン細胞から単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅
の結果を提供する。ＬＮＣａＰ前立腺ガン細胞の異なる
番号が、血液試料（１０Ａ）又はＤＮＡ単離の前に異な
る時間に４℃又は室温で保存された添加されたＬＮＣａ
Ｐ細胞を有する血液に加えられた。
【図１１】 図１１は、前立腺に問題がない正常被験者
から、前立腺の良性過形成（ＢＰＨ）を有する患者か
ら、組織的に前立腺と確認された患者からの血液試料か
らＤＮＡが単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の
結果を提供する。
から、前立腺の良性過形成（ＢＰＨ）を有する患者か
ら、組織的に前立腺と確認された患者からの血液試料か
らＤＮＡが単離された、重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の
結果を提供する。
【図１２】 図１２は、２０の肝臓組織試料から単離さ
れた重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の結果を提供する。選
択的ＰＣＲ増幅は、外側プライマーＣＧＰＳ−５及び８
と内側プライマーＣＧＰＳ−１１と１２を用いて実施し
た。
れた重亜硫酸処理ＤＮＡｓの増幅の結果を提供する。選
択的ＰＣＲ増幅は、外側プライマーＣＧＰＳ−５及び８
と内側プライマーＣＧＰＳ−１１と１２を用いて実施し
た。
【図１３】 図１３は、いかなる増幅ＤＮＡ生産物も、
すべての非メチル化シトシンがウラシルに転換された重
亜硫酸処理ＤＮＡの増幅から生成することを確認するた
めに実施された試験の結果を提供する。試験は、転換さ
れたあるいは転換されていない標的領域とハイブリダイ
ズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを
用いて実施される。
すべての非メチル化シトシンがウラシルに転換された重
亜硫酸処理ＤＮＡの増幅から生成することを確認するた
めに実施された試験の結果を提供する。試験は、転換さ
れたあるいは転換されていない標的領域とハイブリダイ
ズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを
用いて実施される。
フロントページの続き
(72)発明者 スーザン・ジョイ・クラーク
オーストラリア・ニュー・サウス・ウェ
ールズ・2067・チャッツウッド・ベル
ヴ・ストリート・41
(72)発明者 ダグラス・エス・ミラー
オーストラリア・ニュー・サウス・ウェ
ールズ・2137・コンコード・トラファル
ガー・パレード・56
(72)発明者 ピーター・ローレンス・モロイ
オーストラリア・ニュー・サウス・ウェ
ールズ・2067・チャッツウッド・ベル
ヴ・ストリート・41
(56)参考文献 国際公開96／002674（ＷＯ，Ａ１)
国際公開97／046705（ＷＯ，Ａ１)
Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｏ
ｇｙ， Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ
Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，1997年，Ｖｏ
ｌ．６，ｐｐ．443−450
Ｃｅｌｌ，1998年 ３月，Ｖｏｌ.
210，ｐｐ．１−７
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/00 - 15/90
C12Q 1/48
Claims (45)
- 【請求項１】 被験者の、前立腺ガン、頚部ガン、及び
肝臓ガンから選ばれる疾患又は病状の検査方法であっ
て、上記疾患又は病状は、グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フ
ランキング配列内の部位におけるシトシンの異常なメチ
ル化により特徴づけられ、上記検査方法は以下の工程： （i） 上記被験者から単離されたＤＮＡを用意するこ
と、 （ii） 疾患又は病状に特徴的な、異常なシトシンメチ
ル化がおこる部位を含む、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又
はその調節フランキング配列の標的となる領域の増幅の
ための反応物と条件に、上記単離されたＤＮＡをさらす
こと、ここで増幅は、異常なシトシンメチル化がおこる
上記部位がメチル化されるときにのみ標的領域を増幅さ
せるような選択的なものである、 （iii） 増幅ＤＮＡの存在を決定することを含むもので
あり、 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋５５までにより定
義されるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節フランキング
配列内の標的領域を増幅するために用いられるものであ
る、検査方法。 - 【請求項２】 増幅工程の前に、非メチル化シトシン
が、ウラシルに、又はアデニンと塩基対を形成すること
ができる他のヌクレオチドに転換され、メチル化シトシ
ンは変化しないかあるいはグアニンと塩基対を形成する
ことができるヌクレオチドに転換されるように、単離さ
れたＤＮＡを処理する、請求項１記載の検査方法。 - 【請求項３】 増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）増幅を含むものである、請求項１又は２記載の検査
方法。 - 【請求項４】 上記ＰＣＲ増幅が、少なくとも１つの部
位にグアニンを含む逆方向プライマーを利用するもので
あって、それにより、処理されたＤＮＡにアニ−ルする
逆方向プライマー上に、上記グアニンが、存在すればメ
チル化シトシン（又は、上記処理によってメチル化シト
シンが転換された他のヌクレオチド）塩基対を形成する
か、あるいはウラシル（又は、上記処理によって非メチ
ル化シトシンが転換された他のヌクレオチド）とミスマ
ッチを形成することになる、請求項３記載の検査方法。 - 【請求項５】 上記ＰＣＲ増幅が、少なくとも１つの部
位にシトシンを含む正方向プライマーを利用するもので
あって、この部位は検査される疾患又は病状を有する被
験者のＤＮＡ中で異常にメチル化されたシトシンヌクレ
オチドに対応するものである、請求項４記載の検査方
法。 - 【請求項６】 プライマーが１９から３０のヌクレオチ
ドの長さである、請求項５記載の検査方法。 - 【請求項７】 プライマーが、検査される疾患又は病状
を有する被験者の単離されたＤＮＡ中で異常にメチル化
された２から４のシトシンヌクレオチドを含む標的領域
内の配列にアニ−ルするように選択されるものである、
請求項６記載の検査方法。 - 【請求項８】 単離されたＤＮＡの処理が、単離された
ＤＮＡと重亜硫酸との反応を含むものである、請求項２
記載の検査方法。 - 【請求項９】 増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）増幅を含むものである、請求項８記載の検査方法。 - 【請求項１０】 上記ＰＣＲ増幅が、少なくとも１つの
部位にグアニンを含む逆方向プライマーを利用するもの
であって、それにより、処理されたＤＮＡにアニールす
る逆方向プライマー上に、上記グアニンが、存在すれば
メチル化シトシンと塩基対を形成するか、あるいはウラ
シルとミスマッチを形成することになる、請求項９記載
の検査方法。 - 【請求項１１】 上記ＰＣＲ増幅は、検査される疾患又
は病状を有する被験者の単離されたＤＮＡ中で異常にメ
チル化されたシトシンヌクレオチドに対応する少なくと
も１つの部位にシトシンを含む正方向プライマーを利用
するものである、請求項１０記載の検査方法。 - 【請求項１２】 プライマーが１９から３０のヌクレオ
チドの長さである、請求項１１記載の検査方法。 - 【請求項１３】 プライマーが、検査される疾患又は病
状を有する被験者の単離されたＤＮＡ中で異常にメチル
化された２から４のシトシンヌクレオチドを含む標的領
域内の配列にアニールするように選択されるものであ
る、請求項１２記載の検査方法。 - 【請求項１４】 上記ＤＮＡが、組織、血液（血清及び
血漿を含む）、精液、尿、リンパ、又は骨髄からの細胞
より単離されるものである、請求項１ないし１３のいず
れか１項記載の検査方法。 - 【請求項１５】 検査される疾患又は病状が、前立腺ガ
ンである請求項１乃至１４のいずれか１項記載の検査方
法。 - 【請求項１６】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋
５３までにより定義されるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその
調節フランキング配列内の標的領域を増幅するために用
いられるものである請求項１５記載の検査方法。 - 【請求項１７】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から＋
１０までにより定義されるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその
調節フランキング配列内の標的領域を増幅するために用
いられるものである請求項１５記載の検査方法。 - 【請求項１８】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から−
１４までにより定義されるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその
調節フランキング配列内の標的領域を増幅するために用
いられるものである請求項１５記載の検査方法。 - 【請求項１９】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から−
８までにより定義されるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調
節フランキング配列内の標的領域を増幅するために用い
られるものである請求項１５記載の検査方法。 - 【請求項２０】 標的領域が、ＣｐＧ部位−３６、−３
２、−２３、−２０、−１９及び−１４のいずれか又は
全てを排除するものである、請求項１ないし１９のいず
れか１項記載の検査方法。 - 【請求項２１】 逆方向又は正方向プライマーの一方又
は両方が、ＣｐＧ部位−３６、−３２、−２３、−２
０、−１９及び−１４のいずれか又は全てを含む標的領
域内の配列にアニールし、ついで上記ＰＣＲ増幅が、Ｃ
ｐＧ部位−３６、−３２、−２３、−２０、−１９及び
−１４のシトシン又はメチル化シトシンに対応するそれ
らの配列内の位置における過剰量のヌクレオチドを含
む、等量の逆方向及び／又は正方向プライマーをさらに
利用するものである、請求項５ないし１９のいずれか１
項記載の検査方法。 - 【請求項２２】 増幅工程が、ＣｐＧ部位＋９から＋５
３までにより定義されるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調
節フランキング配列内の標的領域を増幅するために用い
られるものである請求項１５記載の検査方法。 - 【請求項２３】 増幅工程が、ＣｐＧ部位＋１から＋５
３までにより定義されるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調
節フランキング配列内の標的領域を増幅するために用い
られるものである請求項１５記載の検査方法。 - 【請求項２４】 増幅工程が、以下の群の各々より選ば
れる正方向及び逆方向プライマーからなるプライマー対
を用いるＰＣＲ増幅を含むものである、請求項１５記載
の検査方法。 正方向プライマー ［配列１］ 逆方向プライマー ［配列２］ （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、Ｒ
はＡ，Ｇ，またはそれらの混合物である） - 【請求項２５】 増幅工程が、以下の群の各々より選ば
れる正方向及び逆方向プライマーからなるプライマー対
を用いるＰＣＲ増幅を含むものである、請求項１５記載
の検査方法。 正方向プライマー ［配列３］ 逆方向プライマー ［配列４］ - 【請求項２６】 増幅工程が、以下の群の各々より選ば
れる正方向及び逆方向プライマーからなるプライマー対
を用いるＰＣＲ増幅を含むものである、請求項１５記載
の検査方法。 正方向プライマー ［配列５］ 逆方向プライマー ［配列６］ （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、Ｒ
はＡ，Ｇ，またはそれらの混合物である） - 【請求項２７】 増幅工程が、以下の群の各々より選ば
れる正方向及び逆方向プライマーからなるプライマー対
を用いるＰＣＲ増幅を含むものである、請求項１５記載
の検査方法。 正方向プライマー ［配列７］ 逆方向プライマー ［配列８］ （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、Ｒ
はＡ，Ｇ，またはそれらの混合物である） - 【請求項２８】 検査される疾患又は病状が肝臓ガンで
ある請求項１乃至１４のいずれか１項記載の検査方法。 - 【請求項２９】 増幅工程が、ＣｐＧ部位−４３から−
１４までにより定義されるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその
調節フランキング配列内の標的領域を増幅するために用
いられるものである請求項２８記載の検査方法。 - 【請求項３０】 標的領域が、ＣｐＧ部位−３６、−３
２、−２３、−２０、−１９及び−１４のいずれか又は
全てを排除するものである、請求項２９記載の検査方
法。 - 【請求項３１】 逆方向又は正方向プライマーの一方又
は両方が、ＣｐＧ部位−３６、−３２、−２３、−２
０、−１９及び−１４のいずれか又は全てを含む標的領
域内の配列にアニールするとき、上記ＰＣＲ増幅が、Ｃ
ｐＧ部位−３６、−３２、−２３、−２０、−１９及び
−１４のシトシン又はメチル化シトシンに対応するそれ
らの配列内の位置における過剰量のヌクレオチドを含
む、等量の逆方向及び／又は正方向プライマーをさらに
利用するものである、請求項２８記載の検査方法。 - 【請求項３２】 増幅工程が、ＣｐＧ部位＋９から＋５
３までにより定義されるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調
節フランキング配列内の標的領域を増幅するために用い
られるものである請求項２８記載の検査方法。 - 【請求項３３】 被験者の、前立腺ガン、頚部ガン、及
び肝臓ガンから選ばれる疾患又は病状の検査方法であっ
て、疾患又は病状は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フラン
キング配列内での部位でのシトシンの異常なメチル化に
より特徴づけられ、上記検査方法は以下の工程： （i）上記被験者から単離されたＤＮＡを用意するこ
と、 （ii）非メチル化シトシンが、ウラシル、又はアデニン
と塩基対を形成することができる 他のヌクレオチドに転
換され、かつメチル化シトシンが変化しないかあるいは
グアニンと塩基対を形成することができるヌクレオチド
に転換されるように、単離されたＤＮＡを処理するこ
と、及び （ iii ） ＣｐＧ部位−４３から＋５５までにより定義さ
れるＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節フランキン
グ配列内の部位における異常なシトシンメチル化の存在
を決定することを含むものである検査方法。 - 【請求項３４】 部位でのメチル化シトシンの存在がそ
の内部に決定される、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節
フランキング配列が、ＣｐＧ部位−４３から＋５３ま
で、−４３から＋１０まで、−４３から−１４まで、＋
９から＋５３まで、＋１から＋５３までにより定義され
る領域から選ばれるものである請求項３３記載の検査方
法。 - 【請求項３５】 ＧＳＴ−ｐｉ遺伝子及びその調節フラ
ンキング配列の領域が、ＣｐＧ部位−３６、−３２、−
２３、−２０、−１９及び−１４のいずれか又は全てを
排除するものである、請求項３３又は３４記載の検査方
法。 - 【請求項３６】 部位でのメチル化シトシンの存在がそ
の内部に決定される、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節
フランキング配列が、ＣｐＧ部位が＋９から＋５３まで
により定義される領域から選ばれるものである請求項３
４記載の検査方法。 - 【請求項３７】 部位でのメチル化シトシンの存在がそ
の内部に決定される、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及びその調節
フランキング配列が、ＣｐＧ部位＋１から＋５３までよ
り定義される領域から選ばれるものである請求項３４記
載の検査方法。 - 【請求項３８】 単離されたＤＮＡの処理が、単離され
たＤＮＡと重亜硫酸との反応を含むものである、請求項
３３ないし３７のいずれか１項記載の検査方法。 - 【請求項３９】 決定工程が、オリゴヌクレオチド／ポ
リヌクレオチド／ペプチド−核酸（ＰＮＡ）プローブの
選択的ハイブリダイゼーションを含むものである、請求
項３３ないし３８のいずれか１項記載の検査方法。 - 【請求項４０】 プローブが、ＣｐＧ部位−３６、−３
２、−２３、−２０、−１９及び−１４のいずれか又は
全てを含む標的領域内の配列にハイブリダイズすると
き、上記選択的ハイブリダイゼーションが、ＣｐＧ部位
−３６、−３２、−２３、−２０、−１９及び−１４の
シトシン又はメチル化シトシンに対応するそれらの配列
内の位置における過剰量のヌクレオチドを含む、等量の
プローブをさらに利用するものである、請求項３９記載
の検査方法。 - 【請求項４１】 上記ＤＮＡが、組織、血液（血清及び
血漿を含む）、精液、尿、リンパ、又は骨髄からの細胞
より単離されるものである、請求項３３ないし４０のい
ずれか１項記載の検査方法。 - 【請求項４２】 検査される疾患又は病状が、前立腺ガ
ンである請求項３３ないし４１のいずれか１項記載の検
査方法。 - 【請求項４３】 検査される疾患又は病状が、肝臓ガン
である請求項３３ないし４１のいずれか１項記載の検査
方法。 - 【請求項４４】 以下のものからなる群より選ばれるヌ
クレオチド配列からなるプライマー又はプローブ。 [配列９] （ここで、ＹはＣ、Ｔまたはそれらの混合物であり、Ｒ
はＡ，Ｇ，またはそれらの混合物である） - 【請求項４５】 以下のものからなる群より選ばれるヌ
クレオチド配列を含むプライマー又はプローブ。 転換オリゴヌクレオチド [配列１０]
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