JP4265028B2 - 二本鎖ｄｎａの特異的切断方法およびそのためのキット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖ＤＮＡの特異的切断方法および該切断方法に使用するためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
二本鎖ＤＮＡの特異的切断は、組換えＤＮＡ実験やヒトゲノムプロジェクトをはじめとする生物体ゲノムプロジェクトにおける遺伝子の解析において欠くことのできない手段である。このような特異的切断の有力なツールとしては、特定位置で二本鎖ＤＮＡを切断するクラスＩＩ制限酵素が挙げられる。これらの酵素としては、個々にＤＮＡ上の約６０種を超える特異的塩基（またはヌクレオチド）配列を切断するものが知られている。特定位置でＤＮＡを切断する制限酵素はある面では上記組換えＤＮＡ実験やゲノムプロジェクトにおいて有利に使用できるが、特定位置をもたないＤＮＡは切断できず、逆に特定位置を複数もつＤＮＡは一箇所のみで切断することが困難である。
【０００３】
たとえば、上記のようなゲノムプロジェクトから得られる遺伝子情報をより有効に活用するためには、所望の位置で二本鎖ＤＮＡを特異的に切断する技法を確立する必要がある。このような技法として、三重鎖ＤＮＡの形成を介する化学的方法（S. A. Strobel et al., Science, ２４９，７３−７５（１９９０））、および同様に三重鎖ＤＮＡの形成を介する酵素法が提案されている。後者の酵素法のうち興味深いものとしては、切断すべき箇所を相同組換え反応に関与するｒｅｃＡタンパク質および二本鎖ＤＮＡと相同な配列を有する一本鎖ＤＮＡを用いる三重鎖形成により保護し、三重鎖以外の二重鎖ＤＮＡをメチラーゼで処理し次いで、三重鎖解離後にこの部分だけを制限酵素で１箇所切断しようとするものが挙げられる（L. J. Ferrin, et al., Science, ２５４，１４９４−１４９７（１９９１））。さらに、三重鎖形成の別法としては、ポリプリン・ポリピリミジン配列を有する二本鎖ＤＮＡとポリピリミジンの一本鎖ＤＮＡとの間でフーグスティーン（Hoogsteen）または逆フーグスティーン構造の三重鎖を形成する方法も知られている。
【０００４】
しかし、化学的方法はＤＮＡの特異的切断方法としてはすぐれているものの、一般に切断効率が低く、一方、上記酵素法はＤＮＡを１箇所のみ切断するとの観点ではすぐれているものの特定位置を切断する制限酵素を使用するためメチラーゼ処理を必要とすると同時に、そのような制限酵素が切断できる特定位置を有するＤＮＡにしか適用できない点で、適用範囲が限定される。
【０００５】
したがって、ヌクレオチド配列に関係なく所望の位置を特異的に簡易かつ効率よく切断しうる技法の開発が待たれていた。
【０００６】
【発明の構成】
本発明者は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡとから形成された三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡが、メチラーゼ処理を要することなく、直接一定のヌクレアーゼにより該二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかの位置またはそれに隣接する位置におけるホスホジエステル結合を特異的に切断できることを見いだした。また逆に、二本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡ部分は、三重鎖ＤＮＡの形成を促進しうる相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の共存下では、ヌクレアーゼによる切断に対する耐性が増強されることも見いだした。すなわち、本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００７】
したがって、本発明は、酸素を使用する二本鎖ＤＮＡの特異的切断方法であって、
（Ａ） 切断すべき二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含むＰＮＡとの三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成し、
（Ｂ） こうして得られた複合体を、該二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼにより切断し、そして
（Ｃ） 必要により、該ヌクレアーゼを不活化する、
工程を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【０００８】
本発明の好適な態様としては、上記二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ分子との三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体の形成工程は、相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の共存下で実施される。
【０００９】
別の態様の本発明は、二本鎖ＤＮＡ含有組成物中に相同的組換えタンパク質およびヌクレオチド三リン酸を共存させることを特徴とする二本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼによる切断に対する耐性の増強方法に関する。
【００１０】
また別の態様の本発明は、酵素を使用する二本鎖ＤＮＡの特異的切断用のキットであって、
（ａ） 二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含むＰＮＡとから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を該二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼ、
（ｂ） 相同的組換えタンパク質、
（ｃ） ヌクレオシド三リン酸またはその類似体、および
（ｄ） 場合により、緩衝剤
の組み合わせを含んでなるキットに関する。
【００１１】
なお、本明細書において、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヌクレオチドおよびその他の化合物もしくは試薬について略号を用いて記載している場合は、当該技術分野で慣用されている様式に従っている。
【００１２】
本発明に従い切断できる二本鎖ＤＮＡは、その中にポリプリン・ポリピリミジン配列、具体的にはポリアデニンとポリチミンの間、ポリグアニンとポリシトシンの間の結合により二本鎖を形成しているか、あるいはクラスＩＩ制限酵素による切断部位を有するか否かにかかわりなく、如何なる種類の配列を有するものであってもよい。また、二本鎖ＤＮＡは直鎖状および環状のいずれの形状をしているものであってもよく、さらに、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。すなわち、本発明に従って、一本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡと三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうるのに必要な最低鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであれば、３０００Ｍｂｐといわれるヒトゲノムの全長をもつものであっても、本発明の特異的切断方法の対象とすることができる。勿論、上記最低鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであればゲノムＤＮＡクローンから取得されるもの、全もしくは半化学合成的に生成されたものであるか否かを問うことなく、すべて上記の対象となりうる。
【００１３】
さらにまた、切断の対象となる二本鎖ＤＮＡは上記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうるものであるかぎり、該部分の二本鎖ＤＮＡ内に１以上の不適正塩基対部位を有しうるものであってもよい。したがって、本発明にいう「三重鎖ＤＮＡ」の語は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡとの間で、必ずしも、ワトソン・クリック型塩基対もしくはフーグスティーン型塩基対のような特定の構造をとっていることを意味するものでなく、三重鎖の形成に関与する二本鎖ＤＮＡにおける塩基配列と一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡにおける塩基配列の間で何等かの特異的な相互作用によって三重鎖が形成されているものを意味する。
【００１４】
本発明に従えば、上記のような二本鎖ＤＮＡ中に切断を起こさせるためには、該二本鎖ＤＮＡと、該二本鎖ＤＮＡ中に切断を起こさせるべき箇所（ホスホジエステル結合部）を包含するかまたはその箇所に隣接するヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を有する一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を有するＰＮＡとの間で三重鎖（triplex）ＤＮＡ部分を有する複合体を形成する必要がある。
【００１５】
そのために、「一本鎖ＤＮＡ分子」は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に実質的に相同なヌクレオチド配列を少なくとも分子中に有するものである。実質的に相同な程度は、相同なヌクレオチド配列の鎖長によって若干変動するが、少なくとも７０％、好ましくは９０％以上のヌクレオチドが対応する二本鎖ＤＮＡのそれらと同一であることが必要である。この相同性は、例えば、Lion，Heidelberg により市販されているプログラム bio SCOUT を用いて決定することもできる。しかし、切断箇所により厳密な特異性をもたせるには、１００％のヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡと同一であることがより好ましい。該一本鎖ＤＮＡ分子は上記相同なヌクレオチド配列部分に加えて、追加のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、さらにはペプチドが付加されていてもよい。ペプチドが付加されている一本鎖ＤＮＡの例としては、所謂、ＰＮＡと称されている、Igloi GL，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．１９９８，９５(１５)：８５６２−７；Kuhn H．et al.，J．Mol．Biol．１９９９．２８６(５)：１３３７−１３４５に記載されているものを挙げることができる。しかし、一本鎖ＤＮＡ分子は、その全体が切断すべき（もしくは標的）二本鎖ＤＮＡの特定領域のヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配列からなるものが好ましい。この相同なヌクレオチド配列部分の鎖長は、４ｍｅｒ以上、好ましくは１５ｍｅｒ以上、さらに好ましくは２０ｍｅｒ以上であり、理論上、上限はないが、好ましくは１５０ｍｅｒ以下である。
【００１６】
また、上述のように、三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体には二本鎖ＤＮＡと、二本鎖ＤＮＡにおける特定のヌクレオチド配列と相同な塩基（すなわち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ））配列をもつペプチド核酸（ＰＮＡ）とによって形成されたものも包含される。ＰＮＡは、核酸を構成するＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの塩基がリン酸結合でなくペプチド結合によって連結された配列を有するものとして、一般的に公知の化合物である。このようなＰＮＡは、塩基の単位を少なくとも４個有するものでも本発明にいう三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成できる。したがって、ＰＮＡは比較的短い鎖長の二本鎖ＤＮＡの特定位置（ホスホジエステル結合）を切断するのに好都合であろう。ＰＮＡを用いる三重鎖（Triplex）ＤＮＡの形成については、例えば、Frank-Kamenetskii et al.，の Ann. Rev. Biochem. １９９５，６４：６５−９５参照されたい。
【００１７】
本発明に従えば「三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体」は、本発明の目的に沿うものである限り、如何なる様式もしくは技法によって形成されたものであってもよい。しかし、三重鎖ＤＮＡの形成は、一般的に、三重鎖ＤＮＡの形成を促進することが知られている相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在下で行うのが好ましい。相同的組換えタンパク質（または普遍的組換えに関与する多機能性タンパク質）は、その存在下で上記二本鎖ＤＮＡと上記一本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡが、該タンパク質を介して安定な複合体を形成しうるものであれば、起源を問うことなく、いかなるタンパク質であってもよい。しかし、かようなタンパク質の具体的なものとしては、大腸菌（Escherichia coli）に由来するｒｅｃＡタンパク質、耐熱性細菌（Thermus thermophilus）、他の腸内細菌において、ｒｅｃＡ遺伝子によりコードされている多機能性タンパク質、また、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、メチロフィルス メチロトローファス（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ウスティラゴ メイディス（Ustilago maydis）等に由来する、それ自体既知のｒｅｃＡ類似タンパク質が挙げられる。その他、酵母（Saccharomyces cerevisiae）やヒトに由来するｒｅｃＡ類似タンパク質も、上記相同的組換えタンパク質に包含される。これらのうち、入手容易性、安定性、機能性の観点から、大腸菌に由来するｒｅｃＡタンパク質またはそれに類似する機能を有するタンパク質（例えば、該タンパク質に由来する改変タンパク質もしくはその断片）を使用することが好ましい。改変タンパク質としては、ｒｅｃＡ遺伝子の部位特異的変異誘発等により作出されたｒｅｃＡ遺伝子産物であって、ｒｅｃＡタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｒｅｃＡタンパク質と同様に上記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうる機能を有するものを挙げることができる。数個のアミノ酸が欠失したものには、ｒｅｃＡタンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドが包含される。このようなペプチドの例としては、Voloshin et al., Science, Vol. ２７２，１９９６：８６８−８７２に記載されているものを挙げることができる。なお、以上より理解できるように、本発明にいうタンパク質の語は、ペプチドをも包含する概念で使用している。
【００１８】
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としては、アデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）またはその類似体、例えばアデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ＡＴＰ−γＳ）、あるいはｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ｄＵＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰまたはＧＴＰなどを挙げることができる。これらは、さらにヌクレオシド二リン酸（例えば、ＡＤＰ）と組み合わせて使用することもできる。なお、上記複合体を形成する系において、ＡＴＰが生物学的な分解を伴うような場合には、ヌクレオシド三リン酸の類似体（例えば、ＡＴＰ−γＳ）を使用するのが好ましい。
【００１９】
上記のような二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡとの間における三重鎖形成反応条件について、本発明の好ましい態様である大腸菌由来のｒｅｃＡタンパク質とＡＴＰ−γＳを使用する場合を例に説明する。この反応は、適当な緩衝剤によって緩衝化されていてもよい水溶液中で行う。緩衝剤を使用する場合は、例えばトリス［すなわち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］と適当な酸（例えば酢酸、塩酸、等）とによりｐＨを６.５〜７.５、好ましくは約７.２に調節したトリス系の緩衝液を使用する。緩衝剤は一般に１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭで使用する。
【００２０】
このような緩衝液中に二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡを溶解する。これらの核酸類を溶解する濃度は、それらが十分に溶解するものであればよく、当業者であれば後述する実施例に従って小実験を行うことにより最適濃度を決定できるであろう。二本鎖ＤＮＡに対する一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡの使用割合は、約２〜１０倍モルとするのがよい。ｒｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡの塩基３単位当たりｒｅｃＡ １分子に相当するように加え、またＡＴＰ−γＳはｒｅｃＡ反応緩衝液に０.５ｍＭ〜５ｍＭになるように加える。ｒｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡと複合体を形成するのに必要な割合以上で使用されるのが好ましい。過剰なｒｅｃＡタンパク質は三重鎖の形成に関与しない二本鎖ＤＮＡ部分をヌクレアーゼの攻撃に対して耐性にすることができる。こうして調製した反応液を、４〜５４℃、好ましくは約３７℃において５分以上、一般に約３０分インキュベートすることにより、目的とする三重鎖ＤＮＡの複合体を形成することができる。
【００２１】
本願発明によれば、上記のように形成された複合体が、二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼによる切断反応に供される。上記三重鎖ＤＮＡ部分を認識するとは、ヌクレアーゼが選択的に三重鎖ＤＮＡ部分に基づき作用しうることを意味する。こうして、本発明で使用するヌクレアーゼは、三重鎖ＤＮＡ部分の５′末端側に隣接するもしくはその近傍の二本鎖ＤＮＡにおけるホスホジエステル結合を優先的に切断し、また、場合によって、三重鎖ＤＮＡ部分の３′末端側に隣接するもしくはその近傍の二本鎖ＤＮＡにおけるホスホジエステル結合もしくは三重鎖ＤＮＡ部分の二本鎖ＤＮＡ内のいずれかのホスホジエステル結合をも切断することができるものである。
【００２２】
本発明で使用するヌクレアーゼには上記の機能を有するヌクレアーゼのすべてが包含される。かりに、ヌクレアーゼが上記機能以外に三重鎖以外の二本鎖ＤＮＡ部分を切断する能力を有する場合には、上述したように、ｒｅｃＡタンパク質をはじめとする相同的組換えタンパク質を一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡとの複合体を形成するのに必要とされる以上の量存在させ、そして、必要によりヌクレオシド三リン酸またはその類似体を共存させることにより、ヌクレアーゼの攻撃から二本鎖ＤＮＡ部分を防ぐことができるので、かようなヌクレアーゼも本発明にいうヌクレアーゼに包含される。限定されるものでないが、ヌクレアーゼとしてはアスペルギルス オリーゼ（Aspergillus oryzae）を起源とするヌクレアーゼＳ１、Mung bean sprouts を起源とするマングビーンヌクレアーゼ、アルテロモナス エスペジアナ（Alteromonas espejiana）ＢＡＬ３１を起源とするＢＡＬ３１ヌクレアーゼを挙げることができる。
【００２３】
以上のようなエンドヌクレアーゼによる二本鎖ＤＮＡの切断反応は、使用する酵素の種類に応じて最適条件が変動するが、例示したヌクレアーゼはいずれも市販されており、各種研究で使用されているので、本発明においてもそれらに準じた条件下または改善した条件下で使用することができる。参考までに、ヌクレアーゼＳ１を使用する場合について、説明を加える。先行する三重鎖ＤＮＡを形成した反応液を、例えば酢酸を加えて、ｐＨを４.０〜４.６に調節した後、ヌクレアーゼＳ１を添加するか、あるいはヌクレアーゼＳ１を含む溶液を別途調製しておき、これに上記反応液を加えて、必要により、ｐＨを４.０〜４.６に調節する。さらにこれらの混合液には、適当濃度のＮａＣｌ水溶液およびＺｎＳＯ4水溶液を加え、次いで２５℃〜８５℃、好ましくは４５℃以上、より好ましくは約５５℃において混合液をインキュベートする。インキュベートする時間は、上記条件下で６０分以上を選ぶことにより、二本鎖ＤＮＡの上述したホスホジエステル結合を少なくとも４０％、さらには約８０％もしくはそれ以上切断することができる。
【００２４】
必要により、この混合液におけるヌクレアーゼを不活化するには、混合液を適当な緩衝剤でｐＨ８.８付近に高めるか、該混合液にキレート剤（例、エチレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えるか、またはタンパク質分解酵素（例、プロティナーゼＫ）を加え、あるいはこれらの処置を組み合わせて行った後、例えば、３７℃で１０分以上インキュベートすればよい。こうして得られる反応混合から切断された二本鎖ＤＮＡの回収は、それ自体公知の溶媒（例、フェノール、クロロホルム等）抽出により除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマトグラフィーを使用して行うことができる。
【００２５】
上述したように、部分的に三重鎖ＤＮＡ構造を有する二本鎖ＤＮＡの二本鎖部分は、ヌクレアーゼによる処理に際して、相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の共存下が該酵素による作用を実質的に受けなくなる。このことは、本発明に従う、二本鎖ＤＮＡの切断の特異性を高めるのに寄与する。本発明者は、このような相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸の奏する効果が、三重鎖ＤＮＡ部分の有無にかかわりなく、広く二本鎖ＤＮＡにおいて達成され、また、エンドヌクレアーゼのみならず、エキソヌクレアーゼに対しても発揮されることを見い出した。
【００２６】
したがって、別の態様の本発明として、二本鎖ＤＮＡ含有組成物中に相同的組換えタンパク質およびヌクレオチド三リン酸またはその類似体を共存させることを特徴とする二本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼによる切断に対する耐性の増強方法が提供される。ここにいう相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の具体例な説明は上記に同じである。
【００２７】
また、別の態様の本発明として、上記二本鎖ＤＮＡの特異的切断に使用することのできる試薬類の組み合わせからなるキットも提供される。かかるキットは、
（ａ）二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含むＰＮＡから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を該二本鎖ＤＮＡにおける該三重鎖ＤＮＡ部分を認定しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分もしくは近傍のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼ、
（ｂ）相同的組換えタンパク質、
（ｃ）ヌクレオシド三リン酸またはその類似体、および
（ｄ）場合により、緩衝剤
の組み合わせを含んでなる。
【００２８】
ここに記載されているエンドヌクレアーゼ、相同的組換えタンパク質、ヌクレオシド三リン酸は、前述の二本鎖ＤＮＡの特異的切断について説明したとおりである。また、「組み合わせ」とは、上記の各試薬類が同一の場所で組み合わされるか、または異なる場所（例えば、試薬の一部がある供給業者から、そして他の試薬が別の供給業者から）提供され、使用者の実験室等で組み合わされる場合をも包含される概念として使用されている。さらに、本発明に従うキットには、二本鎖ＤＮＡの特異的切断方法についての説明書、該方法を実施するための実験器具等（例えば、除タンパク質のクロマトグラフィー用カラム、タンパク質吸着フィルター付きチューブ）を含めることができる。
【００２９】
本発明によれば、如何なるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡであっても、その特定のホスホジエステル結合を１箇所、所望により複数箇所切断することができ、また、二本鎖ＤＮＡの鎖長は、理論上、無限大のものであっても特異的に切断できる。したがって、本発明は、遺伝子組換え実験、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ断片の調製、ゲノムからの目的とするエキソン部位の切り出しとその部位のクローニング、ゲノムライブラリーの解析、等の技術分野において有用である。
【００３０】
【実施例】
以下、具体例を挙げて本発明をさらに説明するが、これらの具体例の提示は本発明の範囲をこれらに限定することを意図するものでない。
【００３１】
実施例１：反応の酵素依存性
プローブとして、長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ−具体的な配列については、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＢＲ３２２”、ＪＯＵＲＮＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４３Ｐｔ １，７７−９０（１９７９）参照−を制限酵素ＥａｇＩで直鎖状にしたもの）との間でｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行った。
オリゴヌクレオチド１：
5′-actcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtg -3′
その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク（エピセンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での、反応液量は２０μｌである。次にその全量を、１０００ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。
【００３２】
その後、その反応液に、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫをこの順に加え、３７℃で１０分間インキュベートし、Ｓ１ヌクレアーゼを失活させた。さらに、フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出をI回行うことにより、除タンパク質処理を行った。
【００３３】
その反応液全量に対し、１／１０倍量３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍量のエタノールを加え、冷却・遠心を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した後、ＤＮＡ沈殿を１０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶かし、その全量について、１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。
【００３４】
その結果を図１のレーン１に示す。レーンＭはサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン２は、ｒｅｃＡタンパクを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、オリゴヌクレオチドを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン５は、オリゴヌクレオチド２（配列番号：２；６０Ｃ−ＭＢｔ2）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
オリゴヌクレオチド２：
5′-gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct caaagcctct- 3′
レーン６は、オリゴヌクレオチド２を用いて、標的ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｃｌｌで切断したＭ１３ｍｐ１８ＲＦに代えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦの塩基配列に関する情報は、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３３（１），１０３−１１９（１９８５）参照。
【００３５】
図１によれば、全ての反応成分が加えてあるときのみ、標的ＤＮＡが切断されることがわかる。
【００３６】
実施例２：反応に必要なオリゴヌクレオチドの長さ
図２を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、１００−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド３（配列番号：３；１００−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、８０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド４（配列番号：４；８０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、６０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド５（配列番号：５；６０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、４０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド６（配列番号：６；４０-ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン５は、３０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド７（配列番号：７；３０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン６は、２０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド８（配列番号：８；２０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
オリゴヌクレオチド３：
5′-gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct-3′
オリゴヌクレオチド４：
5′-cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa-3′
オリゴヌクレオチド５：
5′-tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt- 3′
オリゴヌクレオチド６：
5′-ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat-3′
オリゴヌクレオチド７：
5′-ctccg gttcccaacg atcaaggcga gttac-3′
オリゴヌクレオチド８：
5′-gttcccaacg atcaaggcga-3′
これらの結果によれば、切断に必要なオリゴヌクレオチドの長さは、２０−ｍｅｒ以上が好ましく、６０−ｍｅｒ以上がより好ましいことがわかる。
【００３７】
実施例３：反応に必要なｒｅｃＡタンパク濃度
図３を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は８μｇのｒｅｃＡタンパク質を、レーン２は６μｇのｒｅｃＡタンパク質を、レーン３は４μｇのｒｅｃＡタンパク質を、そしてレーン４は２μｇのｒｅｃＡタンパク質を、それぞれ用いて図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン５はｒｅｃＡタンパク質を用いないで同様の反応を行った結果を示す。この結果によれば、切断に必要なｒｅｃＡタンパク質濃度は、２０μｌの三本鎖形成反応液量当たり、４μｇ以上のｒｅｃＡタンパク量が望ましいことがわかる。
【００３８】
実施例４：反応に必要なＳ１ヌクレアーゼ濃度
図４を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は１０００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン２は８００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン３は６００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン４は４００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、そしてレーン５は２００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、それぞれ用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン６はＳ１ヌクレアーゼを用いないで同様の反応を行った結果を示す。
【００３９】
これらの結果によれば、切断に必要なＳ１ヌクレアーゼ濃度は、１２０μｌのＳ１ヌクレアーゼ反応液量当たり、好ましくは、６００ユニット以上であることがわかる。
【００４０】
実施例５：切断に必要なＳ１ヌクレアーゼ反応温度
図５を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は３７℃で、レーン２は４５℃で、レーン３は５５℃で、レーン４は６５℃で、そしてレーン５は７５℃で、それぞれ図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００４１】
これらの結果によれば、切断に必要なＳ１ヌクレアーゼ反応温度は、好ましくは４５℃以上であることがわかる。
【００４２】
実施例６：変異を入れたオリゴヌクレオチドの使用
図６を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、図１のレーン１はオリゴヌクレオチド５を、レーン２は、変異が１個入ったオリゴヌクレオチド９（配列番号：９）を、レーン３は変異が３個入ったオリゴヌクレオチド１０（配列番号：１０）を、レーン４は変異が５個入ったオリゴヌクレオチド１１（配列番号：１１）を、そしてレーン５は変異が７個入ったオリゴヌクレオチド１２（配列番号：１２）を、それぞれ用いて図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
オリゴヌクレオチド９：
5′-tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg gtcaaggcga gttacatgat cccccatgtt- 3′
オリゴヌクレオチド１０：
5′-tatggcttca ttcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga attacatgat cccccatgtt- 3′
オリゴヌクレオチド１１：
5′-tatggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga attacatgat accccatgtt- 3′
オリゴヌクレオチド１２：
5′-catggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga attacatgat accccatgtg- 3′
これらの結果によれば、オリゴヌクレオチド中の５個以内の変異では、切断が可能であることがわかる。
【００４３】
実施例７：ｒｅｃＡタンパク質の、ターゲットＤＮＡブロッキング効果
標的ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｃ ＩＩで直鎖状にしたもの）を、ｒｅｃＡタンパク質で覆う反応を行った。その反応は、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での、反応液量は２０μｌである。次に、その全量を、１０００ユニットＳ１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。その後、その反応液に、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートし、Ｓ１ヌクレアーゼを失活させた。さらに、フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行うことにより、除タンパク質処理を行った。その反応液全量に対し、１／１０倍量５Ｍ酢酸ナトリウム、２倍量のエタノールを加え、冷却・遠心を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した後、ＤＮＡ沈殿を１０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かし、その全量について、１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。
【００４４】
その結果を図７のレーン１に示す。レーン２は、標的ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にした、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、ＡＴＰ−γＳを入れないで、レーン２と同じ反応を行った結果を示す。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。
【００４５】
これらの結果によれば、活性型、つまり、ＤＮＡに結合能のあるｒｅｃＡタンパク質が、標的ＤＮＡを、ヌクレアーゼによる非特異的な切断から保護していることがわかる。
【００４６】
実施例８：オリゴヌクレオチドの末端塩基による、切断の影響
図８を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、５′末端がＡである、オリゴヌクレオチド１３（配列番号：１３）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、５′末端がＧである、オリゴヌクレオチド１４（配列番号：１４）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、５′末端Ｃである、オリゴヌクレオチド１５（配列番号：１５）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、５′末端がＴである、オリゴヌクレオチド１６（配列番号：１６）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
オリゴヌクレオチド１３：
5′-agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg- 3′
オリゴヌクレオチド１４：
5′-gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc- 3′
オリゴヌクレオチド１５：
5′-ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca- 3′
オリゴヌクレオチド１６：
5′-tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctgcaggcat- 3′
これらの結果によれば、標的ＤＮＡの切断は、オリゴヌクレオチドの末端塩基に影響されないことがわかる。
【００４７】
実施例９：ＡＴＰ−γＳに代え、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液の使用
図９を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、図１のレーン１と同じ結果を示す。レーン２は、ＡＴＰ−γＳのかわりに、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液（濃度比：１：３）を用いて、レーン１と同じ実験を行った結果を示す。
【００４８】
これらの結果によれば、ＡＴＰ−γＳのかわりに、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液を用いることで、切断が可能である。また、その効率は、ＡＴＰ−γＳのみで反応させる場合にくらべて、多少高い効率が得られる傾向にある。
【００４９】
実施例１０：良好なＤＮＡ切断効率が得られる、反応条件
図１０を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、Ｓ１ヌクレアーゼを加えないで、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、以下の反応条件により、標的ＤＮＡを切断した結果を示す。プローブとして、長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にしたもの）との間でｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行った。その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での反応液量は２０μｌである。次にその全量を、１０００ユニットＳ１ヌクレアーゼ（ＭＢl Fermentas 社）、４０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ４.６）、３３８ｍＭ ＮａＣｌ、１.３５ｍＭ ＺｎＳＯ4、６.８％グリセロールを含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。その後の実験操作は、図１のレーン１と同じである。
【００５０】
これらの結果によれば、反応に用いるＳ１ヌクレアーゼの購入先、または、Ｓ１ヌクレアーゼの反応液組成を至適化することで、標的ＤＮＡの切断効率８０％以上を達成することができることがわかる。
【００５１】
実施例１１：中性付近で作用する、ヌクレアーゼによる切断
図１１を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、ヌクレアーゼを加えないで、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、反応の至適ｐＨが中性付近である、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼを用いて下記に示す反応を行った結果を示す。プローブとして、長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にしたもの）との間でｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行った。その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での、反応液量は２０μｌである。次にその全量を、２５ユニットＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＮＣｌ（ｐＨ８.０）、６００ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ ＣａＣｌ2、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、を含むＢＡＬ３１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。その後の実験操作は、図１のレーン１と同じである。
【００５２】
これらの結果によれば、ｒｅｃＡ反応液のｐＨと同じｐＨに至適反応条件をもつ、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼでも二本鎖ＤＮＡが切断が可能であることがわかる。このことより、三本鎖形成とヌクレアーゼの反応を同時に行うことも可能であり、それにより、切断の効率も向上させることができる。また、この実験データでは、標的ＤＮＡの切断効率は若干低いが、用いるＢＡＬ３１ヌクレアーゼの量を増やすことで、Ｓ１ヌクレアーゼと同程度の切断効率を得ることができる。
【００５３】
実施例１２：標的ＤＮＡの切断箇所の検討１
オリゴヌクレオチド１７（配列番号：１７）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った。次に、電気泳動を行う前のＤＮＡを、制限酵素Ｐｓｔｌで切断することにより小断片化した。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法により、含まれるＤＮＡ分子を濃縮した。常法に従い、［γ−32Ｐ］ＡＴＰによりＤＮＡの５′末端標識反応を行った後、再度、エタノール沈殿法により、含まれるＤＮＡ分子を濃縮した。ＤＮＡ沈殿を１０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした後、その適量について、４.０％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。そのゲルのオートラジオグラフィーの結果を図１２のレーン１に示す。レーン２は、オリゴヌクレオチド１（配列番号：１）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、４０−ｍｅｒの長さをもつ、オリゴヌクレオチド（配列番号：１８）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、４０−ｍｅｒの長さをもつ、オリゴヌクレオチド１９（配列番号：１９）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。
オリゴヌクレオチド１７：
5′-cact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgat- 3′
オリゴヌクレオチド１８：
5′-ttct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtg-3′
オリゴヌクレオチド１９：
5′-cacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaa-3′
これらの結果によれば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いたときは、約２７７ｂｐと２１７ｂｐの長さのシグナルが、４０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いたときは、約２６７ｂｐと２０７ｂｐの長さのシグナルが出現していることから、切断される部位は、オリゴヌクレオチドの５′末端付近であることがわかる。
【００５４】
実施例１３：標的ＤＮＡの切断箇所の検討２
ゲルから切り出し抽出したＤＮＡ断片の解析結果［下線を引いた配列はベクターＤＮＡの配列であり、その後に続く配列は、インサートＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ）の配列である］を示す図１３を参照されたい。図１のレーン１と同じ反応を行い、アガロースゲル電気泳動した後のＤＮＡ切断をゲルから切り出し抽出した。その切り出したＤＮＡ断片を、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ Vector（Promega 社）のＨｉｎｃ ＩＩ部位にサブクローニングした後、断片の含まれるプラスミドＤＮＡに対して、塩基配列の決定を行った。その結果、標的ＤＮＡが切断されている部位は、大部分がオリゴヌクレオチドの５′末端の一カ所、もしくは、５′末端付近であることが判明した。
【００５５】
これらの結果によれば、切断されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した結果、標的ＤＮＡの切断される部位は、１カ所であることがわかる。
【００５６】
実施例１４：２本のオリゴヌクレオチドの使用（その１）
図１４を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、標的ＤＮＡとしてｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａｌで切断したものを用いて、かつ、下記のオリゴヌクレオチドを加えないで、図１のレーン１と同様の反応を行った。レーン２は、オリゴヌクレオチド２０（配列番号：２０，６０−ｐＢＲｔｅｔ１）を加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、オリゴヌクレオチド２１（配列番号：２１，６０−ｐＢＲｔｅｔ２）を加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、オリゴヌクレオチド２０と、オリゴヌクレオチド２１を同時に加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００５７】
オリゴヌクレオチド２０：
5'-atgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg caccgtcacc ctggatgctg taggc -3'
オリゴヌクレオチド２１：
5'-tcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg caacgcgggg aggcagacaa ggta -3'
この結果から、２本のオリゴヌクレオチドを用いることで、標的ＤＮＡを２カ所同時に切断することができることがわかる。
【００５８】
実施例１５：２本のオリゴヌクレオチドの使用（その２）
図１５を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、標的ＤＮＡとして、環状ｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いて、かつ、オリゴヌクレオチドを加えないで、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、オリゴヌクレオチド２１を加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、オリゴヌクレオチド と、オリゴヌクレオチド を同時に加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００５９】
この結果から、プラスミドのような環状ＤＮＡを標的とした場合でも、２本のオリゴヌクレオチドを用いることで、標的ＤＮＡを２カ所同時に切断することができることがわかる。
【００６０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】三重鎖ＤＮＡ形成反応の酵素依存性を調べた実施例１のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】三重鎖ＤＮＡ形成反応に必要なオリゴヌクレオチドの長さを調べた実施例２のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】三重鎖ＤＮＡ形成反応に用いられるｒｅｃＡタンパク質の濃度の影響について調べた実施例３のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断に用いられるヌクレアーゼの濃度の影響について調べた実施例４のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断反応温度について調べた実施例５のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図６】置換変異を有するオリゴヌクレオチドを用いる三重鎖ＤＮＡ形成反応について調べた実施例６のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】ｒｅｃＡタンパク質を用いる二本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼ作用のブロッキング効果について調べた実施例７のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】三重鎖ＤＮＡ形成に用いるオリゴヌクレオチドの両末端の変化が、切断反応に影響を及ぼすか、否かを調べた実施例８のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】三重鎖ＤＮＡ形成反応におけるヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ−γＳ）とヌクレオシド二リン酸（ＡＤＰ）の組み合わせ使用の効果について調べた実施例９のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡのさらなる切断条件について調べた実施例１０のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断反応におけるｐＨの影響を調べた実施例１１のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１２】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断箇所について調べた実施例１２のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１３】三本鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断箇所の塩基配列を調べた実施例１３の塩基配列表の結果を示す図面である。
【図１４】三本鎖ＤＮＡ形成反応によって、二本のオリゴヌクレオチドを用いて直鎖状標的ＤＮＡの任意の部位を切り出した実施例１４のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１５】三本鎖ＤＮＡ形成反応によって、二本のオリゴヌクレオチドを用いて環状標的ＤＮＡの任意の部位を切り出した実施例１５のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖ＤＮＡの特異的切断方法および該切断方法に使用するためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
二本鎖ＤＮＡの特異的切断は、組換えＤＮＡ実験やヒトゲノムプロジェクトをはじめとする生物体ゲノムプロジェクトにおける遺伝子の解析において欠くことのできない手段である。このような特異的切断の有力なツールとしては、特定位置で二本鎖ＤＮＡを切断するクラスＩＩ制限酵素が挙げられる。これらの酵素としては、個々にＤＮＡ上の約６０種を超える特異的塩基（またはヌクレオチド）配列を切断するものが知られている。特定位置でＤＮＡを切断する制限酵素はある面では上記組換えＤＮＡ実験やゲノムプロジェクトにおいて有利に使用できるが、特定位置をもたないＤＮＡは切断できず、逆に特定位置を複数もつＤＮＡは一箇所のみで切断することが困難である。
【０００３】
たとえば、上記のようなゲノムプロジェクトから得られる遺伝子情報をより有効に活用するためには、所望の位置で二本鎖ＤＮＡを特異的に切断する技法を確立する必要がある。このような技法として、三重鎖ＤＮＡの形成を介する化学的方法（S. A. Strobel et al., Science, ２４９，７３−７５（１９９０））、および同様に三重鎖ＤＮＡの形成を介する酵素法が提案されている。後者の酵素法のうち興味深いものとしては、切断すべき箇所を相同組換え反応に関与するｒｅｃＡタンパク質および二本鎖ＤＮＡと相同な配列を有する一本鎖ＤＮＡを用いる三重鎖形成により保護し、三重鎖以外の二重鎖ＤＮＡをメチラーゼで処理し次いで、三重鎖解離後にこの部分だけを制限酵素で１箇所切断しようとするものが挙げられる（L. J. Ferrin, et al., Science, ２５４，１４９４−１４９７（１９９１））。さらに、三重鎖形成の別法としては、ポリプリン・ポリピリミジン配列を有する二本鎖ＤＮＡとポリピリミジンの一本鎖ＤＮＡとの間でフーグスティーン（Hoogsteen）または逆フーグスティーン構造の三重鎖を形成する方法も知られている。
【０００４】
しかし、化学的方法はＤＮＡの特異的切断方法としてはすぐれているものの、一般に切断効率が低く、一方、上記酵素法はＤＮＡを１箇所のみ切断するとの観点ではすぐれているものの特定位置を切断する制限酵素を使用するためメチラーゼ処理を必要とすると同時に、そのような制限酵素が切断できる特定位置を有するＤＮＡにしか適用できない点で、適用範囲が限定される。
【０００５】
したがって、ヌクレオチド配列に関係なく所望の位置を特異的に簡易かつ効率よく切断しうる技法の開発が待たれていた。
【０００６】
【発明の構成】
本発明者は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡとから形成された三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡが、メチラーゼ処理を要することなく、直接一定のヌクレアーゼにより該二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかの位置またはそれに隣接する位置におけるホスホジエステル結合を特異的に切断できることを見いだした。また逆に、二本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡ部分は、三重鎖ＤＮＡの形成を促進しうる相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の共存下では、ヌクレアーゼによる切断に対する耐性が増強されることも見いだした。すなわち、本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００７】
したがって、本発明は、酸素を使用する二本鎖ＤＮＡの特異的切断方法であって、
（Ａ） 切断すべき二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含むＰＮＡとの三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成し、
（Ｂ） こうして得られた複合体を、該二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼにより切断し、そして
（Ｃ） 必要により、該ヌクレアーゼを不活化する、
工程を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【０００８】
本発明の好適な態様としては、上記二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ分子との三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体の形成工程は、相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の共存下で実施される。
【０００９】
別の態様の本発明は、二本鎖ＤＮＡ含有組成物中に相同的組換えタンパク質およびヌクレオチド三リン酸を共存させることを特徴とする二本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼによる切断に対する耐性の増強方法に関する。
【００１０】
また別の態様の本発明は、酵素を使用する二本鎖ＤＮＡの特異的切断用のキットであって、
（ａ） 二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含むＰＮＡとから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を該二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼ、
（ｂ） 相同的組換えタンパク質、
（ｃ） ヌクレオシド三リン酸またはその類似体、および
（ｄ） 場合により、緩衝剤
の組み合わせを含んでなるキットに関する。
【００１１】
なお、本明細書において、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヌクレオチドおよびその他の化合物もしくは試薬について略号を用いて記載している場合は、当該技術分野で慣用されている様式に従っている。
【００１２】
本発明に従い切断できる二本鎖ＤＮＡは、その中にポリプリン・ポリピリミジン配列、具体的にはポリアデニンとポリチミンの間、ポリグアニンとポリシトシンの間の結合により二本鎖を形成しているか、あるいはクラスＩＩ制限酵素による切断部位を有するか否かにかかわりなく、如何なる種類の配列を有するものであってもよい。また、二本鎖ＤＮＡは直鎖状および環状のいずれの形状をしているものであってもよく、さらに、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。すなわち、本発明に従って、一本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡと三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうるのに必要な最低鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであれば、３０００Ｍｂｐといわれるヒトゲノムの全長をもつものであっても、本発明の特異的切断方法の対象とすることができる。勿論、上記最低鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであればゲノムＤＮＡクローンから取得されるもの、全もしくは半化学合成的に生成されたものであるか否かを問うことなく、すべて上記の対象となりうる。
【００１３】
さらにまた、切断の対象となる二本鎖ＤＮＡは上記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうるものであるかぎり、該部分の二本鎖ＤＮＡ内に１以上の不適正塩基対部位を有しうるものであってもよい。したがって、本発明にいう「三重鎖ＤＮＡ」の語は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡとの間で、必ずしも、ワトソン・クリック型塩基対もしくはフーグスティーン型塩基対のような特定の構造をとっていることを意味するものでなく、三重鎖の形成に関与する二本鎖ＤＮＡにおける塩基配列と一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡにおける塩基配列の間で何等かの特異的な相互作用によって三重鎖が形成されているものを意味する。
【００１４】
本発明に従えば、上記のような二本鎖ＤＮＡ中に切断を起こさせるためには、該二本鎖ＤＮＡと、該二本鎖ＤＮＡ中に切断を起こさせるべき箇所（ホスホジエステル結合部）を包含するかまたはその箇所に隣接するヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を有する一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を有するＰＮＡとの間で三重鎖（triplex）ＤＮＡ部分を有する複合体を形成する必要がある。
【００１５】
そのために、「一本鎖ＤＮＡ分子」は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に実質的に相同なヌクレオチド配列を少なくとも分子中に有するものである。実質的に相同な程度は、相同なヌクレオチド配列の鎖長によって若干変動するが、少なくとも７０％、好ましくは９０％以上のヌクレオチドが対応する二本鎖ＤＮＡのそれらと同一であることが必要である。この相同性は、例えば、Lion，Heidelberg により市販されているプログラム bio SCOUT を用いて決定することもできる。しかし、切断箇所により厳密な特異性をもたせるには、１００％のヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡと同一であることがより好ましい。該一本鎖ＤＮＡ分子は上記相同なヌクレオチド配列部分に加えて、追加のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、さらにはペプチドが付加されていてもよい。ペプチドが付加されている一本鎖ＤＮＡの例としては、所謂、ＰＮＡと称されている、Igloi GL，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．１９９８，９５(１５)：８５６２−７；Kuhn H．et al.，J．Mol．Biol．１９９９．２８６(５)：１３３７−１３４５に記載されているものを挙げることができる。しかし、一本鎖ＤＮＡ分子は、その全体が切断すべき（もしくは標的）二本鎖ＤＮＡの特定領域のヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配列からなるものが好ましい。この相同なヌクレオチド配列部分の鎖長は、４ｍｅｒ以上、好ましくは１５ｍｅｒ以上、さらに好ましくは２０ｍｅｒ以上であり、理論上、上限はないが、好ましくは１５０ｍｅｒ以下である。
【００１６】
また、上述のように、三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体には二本鎖ＤＮＡと、二本鎖ＤＮＡにおける特定のヌクレオチド配列と相同な塩基（すなわち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ））配列をもつペプチド核酸（ＰＮＡ）とによって形成されたものも包含される。ＰＮＡは、核酸を構成するＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの塩基がリン酸結合でなくペプチド結合によって連結された配列を有するものとして、一般的に公知の化合物である。このようなＰＮＡは、塩基の単位を少なくとも４個有するものでも本発明にいう三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成できる。したがって、ＰＮＡは比較的短い鎖長の二本鎖ＤＮＡの特定位置（ホスホジエステル結合）を切断するのに好都合であろう。ＰＮＡを用いる三重鎖（Triplex）ＤＮＡの形成については、例えば、Frank-Kamenetskii et al.，の Ann. Rev. Biochem. １９９５，６４：６５−９５参照されたい。
【００１７】
本発明に従えば「三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体」は、本発明の目的に沿うものである限り、如何なる様式もしくは技法によって形成されたものであってもよい。しかし、三重鎖ＤＮＡの形成は、一般的に、三重鎖ＤＮＡの形成を促進することが知られている相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在下で行うのが好ましい。相同的組換えタンパク質（または普遍的組換えに関与する多機能性タンパク質）は、その存在下で上記二本鎖ＤＮＡと上記一本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡが、該タンパク質を介して安定な複合体を形成しうるものであれば、起源を問うことなく、いかなるタンパク質であってもよい。しかし、かようなタンパク質の具体的なものとしては、大腸菌（Escherichia coli）に由来するｒｅｃＡタンパク質、耐熱性細菌（Thermus thermophilus）、他の腸内細菌において、ｒｅｃＡ遺伝子によりコードされている多機能性タンパク質、また、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、メチロフィルス メチロトローファス（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ウスティラゴ メイディス（Ustilago maydis）等に由来する、それ自体既知のｒｅｃＡ類似タンパク質が挙げられる。その他、酵母（Saccharomyces cerevisiae）やヒトに由来するｒｅｃＡ類似タンパク質も、上記相同的組換えタンパク質に包含される。これらのうち、入手容易性、安定性、機能性の観点から、大腸菌に由来するｒｅｃＡタンパク質またはそれに類似する機能を有するタンパク質（例えば、該タンパク質に由来する改変タンパク質もしくはその断片）を使用することが好ましい。改変タンパク質としては、ｒｅｃＡ遺伝子の部位特異的変異誘発等により作出されたｒｅｃＡ遺伝子産物であって、ｒｅｃＡタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｒｅｃＡタンパク質と同様に上記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうる機能を有するものを挙げることができる。数個のアミノ酸が欠失したものには、ｒｅｃＡタンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドが包含される。このようなペプチドの例としては、Voloshin et al., Science, Vol. ２７２，１９９６：８６８−８７２に記載されているものを挙げることができる。なお、以上より理解できるように、本発明にいうタンパク質の語は、ペプチドをも包含する概念で使用している。
【００１８】
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としては、アデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）またはその類似体、例えばアデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ＡＴＰ−γＳ）、あるいはｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ｄＵＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰまたはＧＴＰなどを挙げることができる。これらは、さらにヌクレオシド二リン酸（例えば、ＡＤＰ）と組み合わせて使用することもできる。なお、上記複合体を形成する系において、ＡＴＰが生物学的な分解を伴うような場合には、ヌクレオシド三リン酸の類似体（例えば、ＡＴＰ−γＳ）を使用するのが好ましい。
【００１９】
上記のような二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡとの間における三重鎖形成反応条件について、本発明の好ましい態様である大腸菌由来のｒｅｃＡタンパク質とＡＴＰ−γＳを使用する場合を例に説明する。この反応は、適当な緩衝剤によって緩衝化されていてもよい水溶液中で行う。緩衝剤を使用する場合は、例えばトリス［すなわち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］と適当な酸（例えば酢酸、塩酸、等）とによりｐＨを６.５〜７.５、好ましくは約７.２に調節したトリス系の緩衝液を使用する。緩衝剤は一般に１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭで使用する。
【００２０】
このような緩衝液中に二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡを溶解する。これらの核酸類を溶解する濃度は、それらが十分に溶解するものであればよく、当業者であれば後述する実施例に従って小実験を行うことにより最適濃度を決定できるであろう。二本鎖ＤＮＡに対する一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡの使用割合は、約２〜１０倍モルとするのがよい。ｒｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡの塩基３単位当たりｒｅｃＡ １分子に相当するように加え、またＡＴＰ−γＳはｒｅｃＡ反応緩衝液に０.５ｍＭ〜５ｍＭになるように加える。ｒｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡと複合体を形成するのに必要な割合以上で使用されるのが好ましい。過剰なｒｅｃＡタンパク質は三重鎖の形成に関与しない二本鎖ＤＮＡ部分をヌクレアーゼの攻撃に対して耐性にすることができる。こうして調製した反応液を、４〜５４℃、好ましくは約３７℃において５分以上、一般に約３０分インキュベートすることにより、目的とする三重鎖ＤＮＡの複合体を形成することができる。
【００２１】
本願発明によれば、上記のように形成された複合体が、二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼによる切断反応に供される。上記三重鎖ＤＮＡ部分を認識するとは、ヌクレアーゼが選択的に三重鎖ＤＮＡ部分に基づき作用しうることを意味する。こうして、本発明で使用するヌクレアーゼは、三重鎖ＤＮＡ部分の５′末端側に隣接するもしくはその近傍の二本鎖ＤＮＡにおけるホスホジエステル結合を優先的に切断し、また、場合によって、三重鎖ＤＮＡ部分の３′末端側に隣接するもしくはその近傍の二本鎖ＤＮＡにおけるホスホジエステル結合もしくは三重鎖ＤＮＡ部分の二本鎖ＤＮＡ内のいずれかのホスホジエステル結合をも切断することができるものである。
【００２２】
本発明で使用するヌクレアーゼには上記の機能を有するヌクレアーゼのすべてが包含される。かりに、ヌクレアーゼが上記機能以外に三重鎖以外の二本鎖ＤＮＡ部分を切断する能力を有する場合には、上述したように、ｒｅｃＡタンパク質をはじめとする相同的組換えタンパク質を一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡとの複合体を形成するのに必要とされる以上の量存在させ、そして、必要によりヌクレオシド三リン酸またはその類似体を共存させることにより、ヌクレアーゼの攻撃から二本鎖ＤＮＡ部分を防ぐことができるので、かようなヌクレアーゼも本発明にいうヌクレアーゼに包含される。限定されるものでないが、ヌクレアーゼとしてはアスペルギルス オリーゼ（Aspergillus oryzae）を起源とするヌクレアーゼＳ１、Mung bean sprouts を起源とするマングビーンヌクレアーゼ、アルテロモナス エスペジアナ（Alteromonas espejiana）ＢＡＬ３１を起源とするＢＡＬ３１ヌクレアーゼを挙げることができる。
【００２３】
以上のようなエンドヌクレアーゼによる二本鎖ＤＮＡの切断反応は、使用する酵素の種類に応じて最適条件が変動するが、例示したヌクレアーゼはいずれも市販されており、各種研究で使用されているので、本発明においてもそれらに準じた条件下または改善した条件下で使用することができる。参考までに、ヌクレアーゼＳ１を使用する場合について、説明を加える。先行する三重鎖ＤＮＡを形成した反応液を、例えば酢酸を加えて、ｐＨを４.０〜４.６に調節した後、ヌクレアーゼＳ１を添加するか、あるいはヌクレアーゼＳ１を含む溶液を別途調製しておき、これに上記反応液を加えて、必要により、ｐＨを４.０〜４.６に調節する。さらにこれらの混合液には、適当濃度のＮａＣｌ水溶液およびＺｎＳＯ4水溶液を加え、次いで２５℃〜８５℃、好ましくは４５℃以上、より好ましくは約５５℃において混合液をインキュベートする。インキュベートする時間は、上記条件下で６０分以上を選ぶことにより、二本鎖ＤＮＡの上述したホスホジエステル結合を少なくとも４０％、さらには約８０％もしくはそれ以上切断することができる。
【００２４】
必要により、この混合液におけるヌクレアーゼを不活化するには、混合液を適当な緩衝剤でｐＨ８.８付近に高めるか、該混合液にキレート剤（例、エチレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えるか、またはタンパク質分解酵素（例、プロティナーゼＫ）を加え、あるいはこれらの処置を組み合わせて行った後、例えば、３７℃で１０分以上インキュベートすればよい。こうして得られる反応混合から切断された二本鎖ＤＮＡの回収は、それ自体公知の溶媒（例、フェノール、クロロホルム等）抽出により除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマトグラフィーを使用して行うことができる。
【００２５】
上述したように、部分的に三重鎖ＤＮＡ構造を有する二本鎖ＤＮＡの二本鎖部分は、ヌクレアーゼによる処理に際して、相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の共存下が該酵素による作用を実質的に受けなくなる。このことは、本発明に従う、二本鎖ＤＮＡの切断の特異性を高めるのに寄与する。本発明者は、このような相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸の奏する効果が、三重鎖ＤＮＡ部分の有無にかかわりなく、広く二本鎖ＤＮＡにおいて達成され、また、エンドヌクレアーゼのみならず、エキソヌクレアーゼに対しても発揮されることを見い出した。
【００２６】
したがって、別の態様の本発明として、二本鎖ＤＮＡ含有組成物中に相同的組換えタンパク質およびヌクレオチド三リン酸またはその類似体を共存させることを特徴とする二本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼによる切断に対する耐性の増強方法が提供される。ここにいう相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の具体例な説明は上記に同じである。
【００２７】
また、別の態様の本発明として、上記二本鎖ＤＮＡの特異的切断に使用することのできる試薬類の組み合わせからなるキットも提供される。かかるキットは、
（ａ）二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含むＰＮＡから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を該二本鎖ＤＮＡにおける該三重鎖ＤＮＡ部分を認定しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分もしくは近傍のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼ、
（ｂ）相同的組換えタンパク質、
（ｃ）ヌクレオシド三リン酸またはその類似体、および
（ｄ）場合により、緩衝剤
の組み合わせを含んでなる。
【００２８】
ここに記載されているエンドヌクレアーゼ、相同的組換えタンパク質、ヌクレオシド三リン酸は、前述の二本鎖ＤＮＡの特異的切断について説明したとおりである。また、「組み合わせ」とは、上記の各試薬類が同一の場所で組み合わされるか、または異なる場所（例えば、試薬の一部がある供給業者から、そして他の試薬が別の供給業者から）提供され、使用者の実験室等で組み合わされる場合をも包含される概念として使用されている。さらに、本発明に従うキットには、二本鎖ＤＮＡの特異的切断方法についての説明書、該方法を実施するための実験器具等（例えば、除タンパク質のクロマトグラフィー用カラム、タンパク質吸着フィルター付きチューブ）を含めることができる。
【００２９】
本発明によれば、如何なるヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡであっても、その特定のホスホジエステル結合を１箇所、所望により複数箇所切断することができ、また、二本鎖ＤＮＡの鎖長は、理論上、無限大のものであっても特異的に切断できる。したがって、本発明は、遺伝子組換え実験、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ断片の調製、ゲノムからの目的とするエキソン部位の切り出しとその部位のクローニング、ゲノムライブラリーの解析、等の技術分野において有用である。
【００３０】
【実施例】
以下、具体例を挙げて本発明をさらに説明するが、これらの具体例の提示は本発明の範囲をこれらに限定することを意図するものでない。
【００３１】
実施例１：反応の酵素依存性
プローブとして、長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ−具体的な配列については、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＢＲ３２２”、ＪＯＵＲＮＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４３Ｐｔ １，７７−９０（１９７９）参照−を制限酵素ＥａｇＩで直鎖状にしたもの）との間でｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行った。
オリゴヌクレオチド１：
5′-actcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtg -3′
その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク（エピセンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での、反応液量は２０μｌである。次にその全量を、１０００ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。
【００３２】
その後、その反応液に、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫをこの順に加え、３７℃で１０分間インキュベートし、Ｓ１ヌクレアーゼを失活させた。さらに、フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出をI回行うことにより、除タンパク質処理を行った。
【００３３】
その反応液全量に対し、１／１０倍量３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍量のエタノールを加え、冷却・遠心を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した後、ＤＮＡ沈殿を１０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶かし、その全量について、１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。
【００３４】
その結果を図１のレーン１に示す。レーンＭはサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン２は、ｒｅｃＡタンパクを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、オリゴヌクレオチドを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン５は、オリゴヌクレオチド２（配列番号：２；６０Ｃ−ＭＢｔ2）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
オリゴヌクレオチド２：
5′-gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct caaagcctct- 3′
レーン６は、オリゴヌクレオチド２を用いて、標的ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｃｌｌで切断したＭ１３ｍｐ１８ＲＦに代えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦの塩基配列に関する情報は、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３３（１），１０３−１１９（１９８５）参照。
【００３５】
図１によれば、全ての反応成分が加えてあるときのみ、標的ＤＮＡが切断されることがわかる。
【００３６】
実施例２：反応に必要なオリゴヌクレオチドの長さ
図２を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、１００−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド３（配列番号：３；１００−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、８０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド４（配列番号：４；８０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、６０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド５（配列番号：５；６０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、４０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド６（配列番号：６；４０-ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン５は、３０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド７（配列番号：７；３０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン６は、２０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド８（配列番号：８；２０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
オリゴヌクレオチド３：
5′-gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct-3′
オリゴヌクレオチド４：
5′-cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa-3′
オリゴヌクレオチド５：
5′-tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt- 3′
オリゴヌクレオチド６：
5′-ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat-3′
オリゴヌクレオチド７：
5′-ctccg gttcccaacg atcaaggcga gttac-3′
オリゴヌクレオチド８：
5′-gttcccaacg atcaaggcga-3′
これらの結果によれば、切断に必要なオリゴヌクレオチドの長さは、２０−ｍｅｒ以上が好ましく、６０−ｍｅｒ以上がより好ましいことがわかる。
【００３７】
実施例３：反応に必要なｒｅｃＡタンパク濃度
図３を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は８μｇのｒｅｃＡタンパク質を、レーン２は６μｇのｒｅｃＡタンパク質を、レーン３は４μｇのｒｅｃＡタンパク質を、そしてレーン４は２μｇのｒｅｃＡタンパク質を、それぞれ用いて図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン５はｒｅｃＡタンパク質を用いないで同様の反応を行った結果を示す。この結果によれば、切断に必要なｒｅｃＡタンパク質濃度は、２０μｌの三本鎖形成反応液量当たり、４μｇ以上のｒｅｃＡタンパク量が望ましいことがわかる。
【００３８】
実施例４：反応に必要なＳ１ヌクレアーゼ濃度
図４を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は１０００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン２は８００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン３は６００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン４は４００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、そしてレーン５は２００ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、それぞれ用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン６はＳ１ヌクレアーゼを用いないで同様の反応を行った結果を示す。
【００３９】
これらの結果によれば、切断に必要なＳ１ヌクレアーゼ濃度は、１２０μｌのＳ１ヌクレアーゼ反応液量当たり、好ましくは、６００ユニット以上であることがわかる。
【００４０】
実施例５：切断に必要なＳ１ヌクレアーゼ反応温度
図５を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は３７℃で、レーン２は４５℃で、レーン３は５５℃で、レーン４は６５℃で、そしてレーン５は７５℃で、それぞれ図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００４１】
これらの結果によれば、切断に必要なＳ１ヌクレアーゼ反応温度は、好ましくは４５℃以上であることがわかる。
【００４２】
実施例６：変異を入れたオリゴヌクレオチドの使用
図６を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、図１のレーン１はオリゴヌクレオチド５を、レーン２は、変異が１個入ったオリゴヌクレオチド９（配列番号：９）を、レーン３は変異が３個入ったオリゴヌクレオチド１０（配列番号：１０）を、レーン４は変異が５個入ったオリゴヌクレオチド１１（配列番号：１１）を、そしてレーン５は変異が７個入ったオリゴヌクレオチド１２（配列番号：１２）を、それぞれ用いて図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
オリゴヌクレオチド９：
5′-tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg gtcaaggcga gttacatgat cccccatgtt- 3′
オリゴヌクレオチド１０：
5′-tatggcttca ttcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga attacatgat cccccatgtt- 3′
オリゴヌクレオチド１１：
5′-tatggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga attacatgat accccatgtt- 3′
オリゴヌクレオチド１２：
5′-catggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga attacatgat accccatgtg- 3′
これらの結果によれば、オリゴヌクレオチド中の５個以内の変異では、切断が可能であることがわかる。
【００４３】
実施例７：ｒｅｃＡタンパク質の、ターゲットＤＮＡブロッキング効果
標的ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｃ ＩＩで直鎖状にしたもの）を、ｒｅｃＡタンパク質で覆う反応を行った。その反応は、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での、反応液量は２０μｌである。次に、その全量を、１０００ユニットＳ１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。その後、その反応液に、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートし、Ｓ１ヌクレアーゼを失活させた。さらに、フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行うことにより、除タンパク質処理を行った。その反応液全量に対し、１／１０倍量５Ｍ酢酸ナトリウム、２倍量のエタノールを加え、冷却・遠心を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した後、ＤＮＡ沈殿を１０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かし、その全量について、１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。
【００４４】
その結果を図７のレーン１に示す。レーン２は、標的ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にした、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、ＡＴＰ−γＳを入れないで、レーン２と同じ反応を行った結果を示す。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。
【００４５】
これらの結果によれば、活性型、つまり、ＤＮＡに結合能のあるｒｅｃＡタンパク質が、標的ＤＮＡを、ヌクレアーゼによる非特異的な切断から保護していることがわかる。
【００４６】
実施例８：オリゴヌクレオチドの末端塩基による、切断の影響
図８を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、５′末端がＡである、オリゴヌクレオチド１３（配列番号：１３）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、５′末端がＧである、オリゴヌクレオチド１４（配列番号：１４）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、５′末端Ｃである、オリゴヌクレオチド１５（配列番号：１５）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、５′末端がＴである、オリゴヌクレオチド１６（配列番号：１６）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
オリゴヌクレオチド１３：
5′-agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg- 3′
オリゴヌクレオチド１４：
5′-gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc- 3′
オリゴヌクレオチド１５：
5′-ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca- 3′
オリゴヌクレオチド１６：
5′-tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctgcaggcat- 3′
これらの結果によれば、標的ＤＮＡの切断は、オリゴヌクレオチドの末端塩基に影響されないことがわかる。
【００４７】
実施例９：ＡＴＰ−γＳに代え、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液の使用
図９を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、図１のレーン１と同じ結果を示す。レーン２は、ＡＴＰ−γＳのかわりに、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液（濃度比：１：３）を用いて、レーン１と同じ実験を行った結果を示す。
【００４８】
これらの結果によれば、ＡＴＰ−γＳのかわりに、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液を用いることで、切断が可能である。また、その効率は、ＡＴＰ−γＳのみで反応させる場合にくらべて、多少高い効率が得られる傾向にある。
【００４９】
実施例１０：良好なＤＮＡ切断効率が得られる、反応条件
図１０を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、Ｓ１ヌクレアーゼを加えないで、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、以下の反応条件により、標的ＤＮＡを切断した結果を示す。プローブとして、長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にしたもの）との間でｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行った。その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での反応液量は２０μｌである。次にその全量を、１０００ユニットＳ１ヌクレアーゼ（ＭＢl Fermentas 社）、４０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ４.６）、３３８ｍＭ ＮａＣｌ、１.３５ｍＭ ＺｎＳＯ4、６.８％グリセロールを含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。その後の実験操作は、図１のレーン１と同じである。
【００５０】
これらの結果によれば、反応に用いるＳ１ヌクレアーゼの購入先、または、Ｓ１ヌクレアーゼの反応液組成を至適化することで、標的ＤＮＡの切断効率８０％以上を達成することができることがわかる。
【００５１】
実施例１１：中性付近で作用する、ヌクレアーゼによる切断
図１１を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、ヌクレアーゼを加えないで、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、反応の至適ｐＨが中性付近である、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼを用いて下記に示す反応を行った結果を示す。プローブとして、長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にしたもの）との間でｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行った。その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での、反応液量は２０μｌである。次にその全量を、２５ユニットＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＮＣｌ（ｐＨ８.０）、６００ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ ＣａＣｌ2、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、を含むＢＡＬ３１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。その後の実験操作は、図１のレーン１と同じである。
【００５２】
これらの結果によれば、ｒｅｃＡ反応液のｐＨと同じｐＨに至適反応条件をもつ、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼでも二本鎖ＤＮＡが切断が可能であることがわかる。このことより、三本鎖形成とヌクレアーゼの反応を同時に行うことも可能であり、それにより、切断の効率も向上させることができる。また、この実験データでは、標的ＤＮＡの切断効率は若干低いが、用いるＢＡＬ３１ヌクレアーゼの量を増やすことで、Ｓ１ヌクレアーゼと同程度の切断効率を得ることができる。
【００５３】
実施例１２：標的ＤＮＡの切断箇所の検討１
オリゴヌクレオチド１７（配列番号：１７）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った。次に、電気泳動を行う前のＤＮＡを、制限酵素Ｐｓｔｌで切断することにより小断片化した。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法により、含まれるＤＮＡ分子を濃縮した。常法に従い、［γ−32Ｐ］ＡＴＰによりＤＮＡの５′末端標識反応を行った後、再度、エタノール沈殿法により、含まれるＤＮＡ分子を濃縮した。ＤＮＡ沈殿を１０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした後、その適量について、４.０％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。そのゲルのオートラジオグラフィーの結果を図１２のレーン１に示す。レーン２は、オリゴヌクレオチド１（配列番号：１）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、４０−ｍｅｒの長さをもつ、オリゴヌクレオチド（配列番号：１８）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、４０−ｍｅｒの長さをもつ、オリゴヌクレオチド１９（配列番号：１９）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。
オリゴヌクレオチド１７：
5′-cact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgat- 3′
オリゴヌクレオチド１８：
5′-ttct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtg-3′
オリゴヌクレオチド１９：
5′-cacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaa-3′
これらの結果によれば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いたときは、約２７７ｂｐと２１７ｂｐの長さのシグナルが、４０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いたときは、約２６７ｂｐと２０７ｂｐの長さのシグナルが出現していることから、切断される部位は、オリゴヌクレオチドの５′末端付近であることがわかる。
【００５４】
実施例１３：標的ＤＮＡの切断箇所の検討２
ゲルから切り出し抽出したＤＮＡ断片の解析結果［下線を引いた配列はベクターＤＮＡの配列であり、その後に続く配列は、インサートＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ）の配列である］を示す図１３を参照されたい。図１のレーン１と同じ反応を行い、アガロースゲル電気泳動した後のＤＮＡ切断をゲルから切り出し抽出した。その切り出したＤＮＡ断片を、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ Vector（Promega 社）のＨｉｎｃ ＩＩ部位にサブクローニングした後、断片の含まれるプラスミドＤＮＡに対して、塩基配列の決定を行った。その結果、標的ＤＮＡが切断されている部位は、大部分がオリゴヌクレオチドの５′末端の一カ所、もしくは、５′末端付近であることが判明した。
【００５５】
これらの結果によれば、切断されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した結果、標的ＤＮＡの切断される部位は、１カ所であることがわかる。
【００５６】
実施例１４：２本のオリゴヌクレオチドの使用（その１）
図１４を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、標的ＤＮＡとしてｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａｌで切断したものを用いて、かつ、下記のオリゴヌクレオチドを加えないで、図１のレーン１と同様の反応を行った。レーン２は、オリゴヌクレオチド２０（配列番号：２０，６０−ｐＢＲｔｅｔ１）を加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、オリゴヌクレオチド２１（配列番号：２１，６０−ｐＢＲｔｅｔ２）を加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、オリゴヌクレオチド２０と、オリゴヌクレオチド２１を同時に加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００５７】
オリゴヌクレオチド２０：
5'-atgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg caccgtcacc ctggatgctg taggc -3'
オリゴヌクレオチド２１：
5'-tcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg caacgcgggg aggcagacaa ggta -3'
この結果から、２本のオリゴヌクレオチドを用いることで、標的ＤＮＡを２カ所同時に切断することができることがわかる。
【００５８】
実施例１５：２本のオリゴヌクレオチドの使用（その２）
図１５を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、標的ＤＮＡとして、環状ｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いて、かつ、オリゴヌクレオチドを加えないで、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、オリゴヌクレオチド２１を加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、オリゴヌクレオチド と、オリゴヌクレオチド を同時に加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００５９】
この結果から、プラスミドのような環状ＤＮＡを標的とした場合でも、２本のオリゴヌクレオチドを用いることで、標的ＤＮＡを２カ所同時に切断することができることがわかる。
【００６０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】三重鎖ＤＮＡ形成反応の酵素依存性を調べた実施例１のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】三重鎖ＤＮＡ形成反応に必要なオリゴヌクレオチドの長さを調べた実施例２のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】三重鎖ＤＮＡ形成反応に用いられるｒｅｃＡタンパク質の濃度の影響について調べた実施例３のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断に用いられるヌクレアーゼの濃度の影響について調べた実施例４のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断反応温度について調べた実施例５のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図６】置換変異を有するオリゴヌクレオチドを用いる三重鎖ＤＮＡ形成反応について調べた実施例６のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】ｒｅｃＡタンパク質を用いる二本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼ作用のブロッキング効果について調べた実施例７のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】三重鎖ＤＮＡ形成に用いるオリゴヌクレオチドの両末端の変化が、切断反応に影響を及ぼすか、否かを調べた実施例８のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】三重鎖ＤＮＡ形成反応におけるヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ−γＳ）とヌクレオシド二リン酸（ＡＤＰ）の組み合わせ使用の効果について調べた実施例９のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡのさらなる切断条件について調べた実施例１０のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断反応におけるｐＨの影響を調べた実施例１１のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１２】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断箇所について調べた実施例１２のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１３】三本鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断箇所の塩基配列を調べた実施例１３の塩基配列表の結果を示す図面である。
【図１４】三本鎖ＤＮＡ形成反応によって、二本のオリゴヌクレオチドを用いて直鎖状標的ＤＮＡの任意の部位を切り出した実施例１４のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１５】三本鎖ＤＮＡ形成反応によって、二本のオリゴヌクレオチドを用いて環状標的ＤＮＡの任意の部位を切り出した実施例１５のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
Claims (10)
- 酵素を使用する二本鎖ＤＮＡの特異的切断方法であって、
（Ａ） 切断すべき二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレオチド配列に対して相同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含むＰＮＡとの三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成する工程、
（Ｂ） 該複合体を、該二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分に隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼにより切断し、こうして該二本鎖ＤＮＡの両鎖が該隣接する部分のホスホジエステル結合において切断された二本鎖ＤＮＡ断片を形成する工程、および
（Ｃ） 該ヌクレアーゼを不活化する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 複合体の形成が相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸の存在する水性溶液中でのインキュベーションにより行われる請求項１記載の方法。
- 相同的組換えタンパク質が大腸菌（Escherichia coli）のｒｅｃＡタンパク質である請求項２記載の方法。
- ヌクレオシド三リン酸がＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰおよびＡＴＰ−γＳからなる群より選ばれる１種以上である請求項２または３記載の方法。
- ヌクレアーゼがヌクレアーゼＳ１、マングビーンヌクレアーゼおよびＢＡＬ３１ヌクレアーゼからなる群より選ばれる１種以上である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体が一本鎖ＤＮＡ分子を用いて形成される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 切断すべき二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレオチド配列に対して相同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子が、１５ｍｅｒ以上である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 酵素を使用する二本鎖ＤＮＡの両鎖の特異的切断用のキットであって、
（ａ） 二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレオチド配列に対して相同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含むＰＮＡとから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を該二本鎖ＤＮＡにおける該三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分に隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレアーゼ、
（ｂ） 相同的組換えタンパク質、および
（ｃ） ヌクレオシド三リン酸
の組み合わせを含んでなるキット。 - ヌクレアーゼがヌクレアーゼＳ１、マングビーンヌクレアーゼおよびＢＡＬ３１ヌクレアーゼからなる群より選ばれる請求項８記載のキット。
- 相同的組換えタンパク質が大腸菌（Escherichia coli）のｒｅｃＡタンパク質であり、そしてヌクレオシド三リン酸がＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰおよびＡＴＰ−γＳからなる群より選ばれる請求項８または９記載のキット。
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