JP2739378B2

JP2739378B2 - Ｄｎａに標的を定める方法

Info

Publication number: JP2739378B2
Application number: JP4501512A
Authority: JP
Inventors: カメリーニ‐オテロ，ラファエル・ディー; マッキントッシュ，マーガレット; カメリーニ−オテロ，キャロル・エス; フェリン，ランス・ジェイ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 1998-04-15
Anticipated expiration: 2013-04-15
Also published as: US5460941A; AU658386B2; EP0556330A1; JPH06500926A; CA2095624A1; EP0556330B1; CA2095624C; WO1992008791A1; ATE217906T1; EP0556330A4; AU9111691A; DE69133018D1; DE69133018T2

Description

【発明の詳細な説明】これは、1990年11月９日に出願された出願第07/611,2
68号の部分継続出願であり、前記出願は、参照すること
により本明細書に包含されている。

本発明の背景技術分野本発明は、一般に、三本鎖（triplex）DNAを形成する
方法とこの様な三本鎖DNAを使用して、二本鎖（duple
x）DNAの特定の配列を切断する方法に関する。本発明は
更に、DNAに標的を定める方法、特にDNAの特定の配列に
標的を定める方法に関する。

背景情報最近、幾つかのグループが、特定の配列においてゲノ
ムDNAを切断する効率の高い方法を報告している。例え
ば、Szybalskiと共同研究者達は、導入された１つのlac
オペレータ部位において、サッカロミセスセレビシェ
（Saccharomyces cerevisiae）と大腸菌（E.coli）のゲ
ノムを切断した（Koob等、Science 250,271（199
0））。彼らは、lacレプレッサを用いてlacオペレータ
をメチル化から守り、最初にDNAのHae II部位をメチル
化した。メチラーゼとレプレッサが不活化されると、修
飾されず、切断可能な唯一のHae II部位は、lacオペレ
ータ部位であった。この方法の利点は、収率が高く、特
異性が高い事であった。欠点は、lacオペレータ部位に
おいてしか切断できない事であった。

第二の方法は、数名の研究者によって、サッカロミセ
スセレビシェ菌の様に大きなゲノムの切断に用いられ
た。この方法は、合成ホモピリミジンオリゴヌクレオチ
ドが二重ホモピリミジン−ホモプリンの束をアニール
し、三重らせん構造を形成できる性質を利用したもので
ある。この方法は、最初にMoserとDervan（Science 23
8、645（1987））によって用いられ、オリゴヌクレオチ
ドにEDTA−Fe切断部分を導入する事によって、プラスミ
ドを切断するものであった。続いて、別の切断部分が、
ホモピリミジンオリゴヌクレオチドに付着させられた。
例えば、Schultzおよび共同研究者達は、ブドウ球菌由
来のヌクレアーゼ（staphylococcal nuclease）を（Pei
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,9858（1990））、Hele
neと共同研究者達は、フェナントロリン−銅誘導体を
（Francois等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,9702（198
9））を、切断部分として付着させた。Dervanと共同研
究者達も、グアニンの多い切断オリゴヌクレオチドを用
いて、三重構造を形成し（Beal等、Science 251、1360
（1991））、上述の三重構造とメチル化防御方法を用い
てDNAを切断した（Strobel等、Nature 350、172（199
1））。この標的を定める方法の利点は、効率が高く、
様々な誘導体の付いたオリゴヌクレオチドを使用できる
事である。欠点は、ホモピリミジンまたはグアニンの多
いオリゴヌクレオチドを使用した場合しか成功していな
い点である。

特定のDNA配列において可能な切断部位は、僅かであ
るか、実際には完全に欠如しているために、過去に報告
された方法の実際の使用は、非常に限定されている。こ
れに対して、本発明は、目的の部位または部位の対にお
いてDNAを切断する一般的な方法を提供するものであ
る。しかし、部位に特定的な切断は、本発明のひとつの
実施例に過ぎない。広い意味で言えば、切断、防御、強
化の何れのためであろうと、本発明はどの様な配列であ
れ、目的とする配列に特異的かつ効率的に標的を定める
方法に関するものである。

発明の要約三本鎖DNAの形成方法を提供する事が、本発明の一般
的目的である。

DNA含有試料における特定のDNA配列の存在を同定する
方法を提供する事が、本発明のもう１つの目的である。

特定の遺伝子配列の転写抑制法を提供する事が、本発
明のもう１つの目的である。

例えば、切断、防御、または強化を目的として、DNA
の特定の配列に標的を定める迅速かつ効率の高い一般的
方法を提供する事が、本発明のもう１つの目的である。

本発明は、三本鎖DNA分子の形成方法に関するもので
ある。ここで、三本鎖DNA分子の各鎖は、三本鎖DNA分子
の少なくとも他の一つの鎖に対合（hybridize、すなわ
ち、非共有結合）している。この方法は、二本鎖DNA分
子およびその二本鎖DNA分子の一つの鎖に対して十分に
相補的な一本鎖DNA分子へと、組換えタンパク質を接触
させて、ハイブリッド形成させることからなる。この接
触は、一本鎖DNA分子が、二本鎖DNA分子とハイブリッド
形成して三本鎖DNA分子が形成される様な条件下におい
て行われる。

更なる目的と利点は、以下の報告を読む事によって明
らかとなるであろう。

図面の簡単な説明図１は、リコンビナーゼ（recombinase）タンパク質
によって直鎖状二本鎖DNAと相同の環状一本鎖DNAとの間
で形成される２種類の結合分子構造の可能性を示してい
る。上の図では、結合分子（joint molecule）は、ヘテ
ロ二本鎖DNA（heteroduplex DNA）と置換された遊離一
本鎖を有している。置換された一本鎖が存在すると、分
枝点移動（branch migration）が起こり、ヘテロ二本鎖
部分が短い場合には、結合部分が迅速に解離してしまう
事となる。下の図では、安定した結合分子であり、三本
の鎖は追加の非共有結合性の相互作用によって連合して
おり、分枝点移動は起こり得ない。三本の鎖の配列は図
式的なものに過ぎず、開始二本鎖結合が切れていること
を意味しているのではない。

図２は、短い相同関係を用いてリコンビナーゼが結合
分子を形成する事を示している。Ａには、結合分子分析
に使用されたpGem 4の直鎖状二本鎖基質の部分地図が示
されている。四角部分は、M13mp18と相同の領域を示し
ている。二本鎖の右のポリリンカー領域の数字は、pGem
4がそれら各部位において直線化された場合、M13mp18一
本鎖DNAとの組合せに利用できる相同領域の長さを示し
ている。Ｂ〜Ｄにおいては、pGem 4直鎖状二本鎖とM13m
p18ウイルス鎖状DNAとHeLaリコンビナーゼ分画（図2
B）、またはショウジョウバエリコンビナーゼ分画（図2
C）、または大腸菌recAとSSBタンパク質（図2D）を用い
た結合分子分析が、下記の実施例のセクションに示す様
に実施され、SDSを添加して除タンパク（deproteinizat
ion）が行われた。対合に利用できる相同領域の長さが
示されている。レーンＣ、対照（control）、DNAが単独
でインキュベートされた；レーン１、Hind III−直線化
されたpGem 4;レーン２、Sal I−直線化された二本鎖；
レーン３、Bam H I−直線化された二本鎖；レーン４、K
pn I−直線化された二本鎖；レーン５、Eco R I−直鎖
化された二本鎖；レーン６、Hind IIIとEco R Iの両者
で分解された二本鎖（図2BおよびＤ）または結合対照、
二本鎖単独（図2C）。

図３は、新しい結合分子分析を示している。Ａは、直
鎖状二本鎖DNAと相同の³²Pで標識されたオリゴヌクレオ
チドの間の結合分子形成図である。Ｂでは、結合分子分
析が、37℃で10分間、HeLaリコンビナーゼ分画と100ng
のHind III−直線化pdel 9の二本鎖と5ngの³²P標識され
た相同の長さが33塩基のオリゴヌクレオチド（レーン
１）、長さが20塩基のオリゴヌクレオチド（レーン３）
または長さが13塩基のオリゴヌクレオチド（レーン５）
を用いて実施された。試料は、１％のSDSで除タンパク
された。レーン２、４、６における対照実験は、可能性
として存在するエキソヌクレアーゼ汚染による結合分子
形成が認められない事を証明している。二本鎖とオリゴ
ヌクレオチド（33−mer（塩基33個のオリゴヌクレオチ
ド）、レーン２、20−mer（塩基22個のオリゴヌクレオ
チド）、レーン４、13−mer（塩基13個のオリゴヌクレ
オチド）、レーン６）は、別々にリコンビナーゼと37℃
でインキュベートされ、１％のSDSに入れられてから、6
5℃でアニールされ、氷上で急冷せずに、室温で電気泳
動にかけられた。この様なアーニリング条件において、
33個または20個の塩基対の長さのDNA二本鎖を形成する
事ができ、これらは安定である。

図４は、結合分子の熱安定性を示している。Ａ〜Ｃ
は、短い二本鎖領域、Ｉ、分枝点移動構造（branch mig
ration structures）、II、リコンビナーゼによって形
成され、除タンパク（deproteinize）された結合分子、
III、の相対的熱安定性を決定する図。Ｄ〜Ｆは、短い
二本鎖、分枝点移動構造、38の塩基対の長さの共有相同
領域を含む結合分子についての熱安定性分析から得られ
た代表的データ。結合分子は、HeLaリコンビナーゼ分画
によってM13mp18一本鎖DNAとSal I−直線化pGem 4二本
鎖DNAの間で形成され、SDSを加えて除タンパクされた。
二本鎖と分枝点移動構造の両者の安定性が、アガロース
ゲル電気泳動後に、M13mp19一本鎖DNAの位置において³²
P標識の移動が無い事によって、モニターされた。

図５は熱安定性のデータをまとめたものである。実施
例のセクションにおいて述べる様に、13、26、38、56の
塩基対の相同領域を有する短い二本鎖、分枝点移動構
造、結合分子について熱安定性分析が実施された。表示
温度は、10分間のインキュベーション後に構造の50％以
上が解離した温度である。13塩基対の二本鎖は37℃で不
安定なため、対応する13塩基対分枝点移動構造の安定性
は、決定されなかった。

図６は、三本の無傷のDNA鎖を有する安定した結合分
子を示している。Ａは、pGem 4のプラス鎖の３′末端に
独特の³²P標識を有し、M13mp18と56塩基対の相同性を共
有するHind III−Bgl I断片から形成された結合分子。
Ｂは、recAタンパク質によって形成された³²P標識され
た結合分子の熱安定性分析。Ｃは、大腸菌recAタンパク
質（黒丸）、HeLaリコンビナーゼ分画（白丸）、対応す
る56塩基対分枝点移動構造（三角）によって形成された
³²P標識された結合分子の相対的熱安定性の比較。

図７は、recAタンパク質が存在しない状態の安定した
結合分子を示している。Ａでは、recAによって形成され
た結合分子は、実施例のセクションに記述されている様
に、除タンパクされ、12％ SDSポリアクリルアミドゲル
上で残ったrecAタンパク質が分析され、続いて抗recA抗
体と¹²⁵I標識二次抗体を用いるウェスタンブロット分析
が行われた。レーン１〜５は、それぞれ、5ng、1ng、0.
5ng、0.2ng、0.1ngの精製大腸菌recAタンパク質であ
る；レーン６は、５つの分析の除タンパクされた結合分
子全てである；レーン７は0.2ngの精製recAタンパク質
である。Ｂは、除タンパクされた結合分子の熱安定性を
示す。レーン１は、DNA基質のみ；レーン２は、recAと
反応させ、SDSとEDTAで反応を止められ、アガロースゲ
ルに直接載せられた結合分子の分析；レーン３〜７は、
図４に示されている様に除タンパクされた結合分子の熱
安定性分析である。dsとssは、二本鎖と一本鎖DNAの可
動性をそれぞれ表している。

図８は、リコンビナーゼタンパク質によって形成され
た三重らせんの対合の図式を提唱するものである。Ａ
は、主要な溝において、３番目の鎖が相同の二本鎖と対
を形成している。二本鎖は、実線で示されるワトソン−
クリック塩基対を持っている。二本鎖のワトソン（Ｗ）
またはクリック（Ｃ）鎖のどちらかのプリンと３番目の
鎖とが関与している非ワトソン−クリック対が点線で示
されている。影の部分は、各鎖の燐酸塩骨格を表してい
る。３番目の鎖が、同一のワトソン鎖に平行である事に
注意されたい。Ｂは、考えられる４種類全ての塩基トリ
プレットに関する提唱された水素結合図。３本目の鎖の
シトシン残基は、N₃位でプロトン化され、２つの水素結
合を形成する事ができる。

図９は、対合複合体（synaptic complex）と安定した
結合分子が形成される図である。二本鎖DNAと相同のオ
リゴヌクレオチドが大腸菌recAタンパク質の存在下にイ
ンキュベートされ、対合複合体を形成する。この対合複
合体において、２個のDNAは、recA核タンパク質のフィ
ラメントの中で対となっている。対合複合体の形成は、
対になっている領域内で制限エンドヌクレアーゼが二本
鎖を切断できない事によって、モニターされる。SDS洗
剤の添加によってrecAタンパク質が対合複合体から除去
されると、安定な除タンパクされた結合分子を生じる。

図10は、recAによって形成される対合複合体と結合分
子に関するものである。図10Aは、Sac Iの部位をわたる
pUC18二本鎖DNAに相同の56、38、26、20の塩基を有する
オリゴヌクレオチドに関する。図10Bは、recAによって
形成される対合複合体に関する。³²P標識されたオリゴ
ヌクレオチド、pUC18のスーパーコイル・プラスミドDN
A、recタンパク質が共にインキュベートされた。適切な
制限エンドヌクレアーゼとインキュベーション後、反応
物質は１％のSDSに加えられ、臭化エチジウムを含む１
％アガロースゲル上で電気泳動にかけられた。対合複合
体の存在形跡は、制限エンドヌクレアーゼとのインキュ
ベーション後に残るスーパーコイル・プラスミドDNAの
存在によって表される。図10Cは、recAによって形成さ
れる結合分子に関する。同じアガロースゲルのオートラ
ジオグラフは、スーパーコイル・プラスミドDNAの位置
に³²P標識の移動が認められる事から、結合分子の形成
を証明している。１は直鎖状二本鎖であり、scはスーパ
ーコイル二本鎖を示す。

図11は、直鎖状二本鎖との対合複合体の形成に関す
る。図11Aは、DNA基質の地図である。直鎖状pBR322二本
鎖と相同の33塩基のオリゴヌクレオチドとCla I部位の
位置を示している。図11Bは、直鎖状二本鎖を用いた対
合複合体の分析である。非相同のオリゴヌクレオチド
は、6228−6260の位置に対応するM13mp18配列である。
Ｈは相同の33塩基のオリゴヌクレオチドであり、NH
（Ｎ）は非相同の33塩基のオリゴヌクレオチドを示す。

図12は、対合複合体の制限エンドヌクレアーゼの存在
形跡が認められる範囲に関する。対合複合体は、recAの
存在下に、相同の20塩基オリゴヌクレオチドとpUC18二
本鎖DNAによって形成された。複合体は、切断部位が矢
印で示されている種々の制限エンドヌクレアーゼと共に
インキュベートされた。対合複合体による切断の防御
は、Sac I位置とSph I位置の部位に及んだ。Eco R Iま
たはHind III部位においては、防御作用は認められなか
った。数字は、オリゴヌクレオチドの末端から近位切断
部位までの長さを示している。

図13は、対合複合体と結合分子の形成に対する方向性
の影響に関する。図13Aは、pUC18のポリリンカー領域と
完全に相同であるか、あるいは更に非相同の配列を、
５′と３′位末端のどちらか、あるいはその両者に持っ
ている56塩基オリゴヌクレオチド。図13Bは、recAタン
パク質による対合複合体の形成は、一本鎖の５′または
３′位末端、または内側の部位で開始できることを示
す。³²P標識されたオリゴヌクレオチドを用いて対合複
合体の分析が行われた。レーン１において直鎖状pUC18
のすぐ上に移動しているバンドは、開始基質内に存在し
た切断された二本鎖を表している。図13Cは、結合分子
形成において、一本鎖の５′末端で相同であると形成に
有利に働くことを示す。対合複合体分析が、SDSの添加
によって除タンパクされ、次に電気泳動とオートラジオ
グラフィが行われた。レーン１〜８は、上のＢのレーン
４〜11に対応している。１は直鎖状二本鎖を、scはスー
パーコイル二本鎖を示す。

図14は、相同対を探索するための最小単位に関する。
図14Aでは、33、15、13塩基の長さのオリゴヌクレオチ
ドがpBR322と相同である。二本鎖におけるEco R I
（Ｅ）、Cla I（Ｃ）、Hind III（Ｈ）の制限エンドヌ
クレアーゼ部位の位置が示されている。図14Bは、15塩
基オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と、Cla IとH
ind IIIの切断位置を示す対応する二本鎖配列とを示
す。Cla IとHind IIIの認識配列の全てまたは一部で構
成されている二本鎖の塩基が太字で示されている。図14
Cは、15塩基の長さのオリゴヌクレオチドを用いる対合
複合体の形成を示す。上述の様に15塩基オリゴヌクレオ
チドを用いて対合複合体が形成された。レーン２〜４
は、Hind IIIと共にインキュベーションしたものであ
り、レーン５〜７は、Cla Iと共にインキュベーション
したもの、レーン８〜10は、Eco R Iと共にインキュベ
ーションしたものである。

図15において、recAは、二本鎖DNAの１らせん反復単
位以下の長さにわたって対合する。図15Aは、Ｌ系列の
オリゴヌクレオチドによる対合複合体の形成に関する。
結果は、３つの独立した観察項目の平均値を表してい
る。二本鎖のパーセント防御値は、二本鎖DNAとrecAを
含む対照反応に対して補正されている。誤差を示す縦線
は、平均値の標準誤差を示している。図15Bは、Ｒ系列
（実線）による対合複合体の形成に関する。結果は、４
つの独立した測定結果の平均値を表している。比較のた
めに、対応するＬ系列のデータ（点線）が示されてい
る。少数の対合複合体の検出と定量化は、これらの実験
においては、200ngの二本鎖DNAを用いる事によって、容
易となった。

図16は、recAの組合せ反応の特異性に関する。図16A
では、M13mp18に相同の30塩基のオリゴヌクレオチド
は、二本鎖における３つのNde I制限エンドヌクレアー
ゼ部位（Ｎ）の１つを含んでいる。オリゴヌクレオチド
の配列は、５′TATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGC 3′で
ある。Nde I部位は太字で示されている。図16Bによれ
ば、recAは、二本鎖内の相同部位に対合複合体形成を効
率よく行う。対合複合体分析において、30塩基のオリゴ
ヌクレオチドが、二本鎖DNAおよびrecAと共にインキュ
ベートされ、次にNde Iと共にインキュベートされた。
大きさのマーカー（Ｍ）は、ラムダHind IIIとパイX 17
4 Hae III断片である。レーン６では、Bam H Iで分解さ
れたM13mp18二本鎖DNAが全長7.2kbの直鎖状断片を生成
する。はっきりさせるために、臭化エチジウムによって
染色されたゲルは、コントラストを逆転して表してあ
る。

図17は、DNAの配列の特異的な切断に用いられる方法
のダイアグラムである。本ダイアグラムは、１つの部位
での切断を示している。

図18において、図18Aは、太い矢印が示す部位と相同
のオリゴヌクレオチドを用いたラムダDNAの切断の部位
を示すダイアグラムである。ラムダDNAは、太い矢印で
示される１つを含む５つのEcoR I部位を含んでいる。図
18Bは、ラムダDNAの配列に特異的な切断を示す臭化エチ
ジウムで染色された寒天ゲルを示す。レーン２は、完全
な切断反応を示し、その他のレーンは示されている様に
欠如した成分があった。メチル化されないラムダDNA
は、recAタンパク質と、31,734から31,763位置のラムダ
配列と同じ、30塩基の長さのオリゴヌクレオチドと共に
インキュベートする事によって、まず保護された。配列
は、５′−TCACGCCGGAAGTGAATTCAAACAGGGTTC−３′であ
った。37℃、10分間のインキュベーション後、最小容量
のEco R IメチラーゼとＳ−アデノシルメチオニンが加
えられ、反応が20分間続けられた。次に、recAタンパク
質とメチラーゼが65℃で15分間加熱する事によって不活
化された。37℃で試験管にEco R I制限酵素が加えら
れ、反応が60分間継続された。反応容積は40μｌで、次
の順番で加えた以下の物質を含んでいた。25mMのトリス
酢酸塩（pH7.5）、4mMの酢酸マグネシウム、0.4mMのジ
チオトレイトール（dithiothreitol）、0.5mMのスペル
ミジン（spermidine）、10μｇのrecAタンパク質、100
μＭのEGTA、1.1mMのADP、0.3mMのATP−ガンマ−Ｓ（Fl
uka BioChemica）、0.18μｇのオリゴヌクレオチド、0.
9μｇのラムダDNA、４μｇのアセチル化牛血清アルブミ
ン（BSA）、3.8単位のEco R Iメチラーゼ、120μＭのＳ
−アデノシルメチオニン、20単位のEco R I制限酵素
（ラムダDNA以下に記載された試薬は全て、New England
Biolabs社から入手した）。トリス酢酸塩、ジチオトレ
イトール、スペルミジン、最終recAタンパク質精製段階
で使用された緩衝液は、Chelex 100（Bic−Rad）カラム
を通過させ、微量の金属汚染を除去した。反応は、５μ
ｌの６％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、90mMのEDT
A、0.1％ブロモフェノールブルーを用いて、停止した。
20μｌの最終反応混合物を、65℃で、60μｌの0.5％InC
ertアガロースと混合し、1.5％のアガロースゲルのウェ
ルに入れた。ゲルを、CHIEF−DRILLシステム（Bio−Ra
d）により、36時間、12℃、180V、切替え時間2.5秒のパ
ルスフィールド電気泳動にかけた。

図19において、図19Aは、uvrBおよびtopA遺伝子の部
位と相同の２つのオリゴヌクレオチドを用いる大腸菌染
色体の切断部位を示す図である。図19Bは、臭化エチジ
ウムによって染色されたアガロースゲルで、大腸菌DNA
が特定の配列で切断され、520kbの断片が生産された事
を示している。ゲルのコンプレッションゾーン（Ｃ）も
示されている。レーンＹは、サッカロミセスセレビシェ
菌染色体DNAのマーカーである。レーンλは、ラムダコ
ンカテマーDNAラダー（lambda concatemer DNA ladde
r）、レーンＥは、Eco R Iによる完全な分解後に変化し
ない大腸菌DNAである。レーン１〜５は、各レーン毎に
オリゴヌクレオチドの量が異なる場合の完全な切断反応
である。uvrBオリゴヌクレオチドの配列は、５′−TCAT
GAGTAAACCGTTCAAACTGAATTCCGCTTTTA−３′（36塩基の長
さ）、topAオリゴヌクレオチドの配列は、５′−CGAGAT
CGAAGAGGGCGAATTCCGCATTAA−３′（30塩基の長さ）であ
った。反応条件は、アガロースに埋め込まれたDNAにつ
いて良好な結果を得るために以下の条件が改変された以
外は、図18の反応条件と類似していた。recAタンパク質
とオリゴヌクレオチドが、DNAと共に37℃で15分間、前
インキュベートされ、メチラーゼとＳ−アデノシルメチ
オニンが添加され、メチル化が１時間継続された。100
μｌの２％ SDSを37℃で30分間加える事によって、メチ
ル化が停止された。次に、100mMのトリス塩酸（pH8.
0）、50mMの塩化ナトリウム、1.5μＭのジチオトレイト
ール、200μg/mlのアセチル化されていないBSA（Calbio
chem−Behring）の中でビーズが平衡化された。Wilson
とHoffman（Wilson等、Anal.Biochem.191、370（1990）
の観察結果、すなわち、この緩衝液がアガロースに埋め
込まれたDNAに対するEco R Iの非特異的または顕著な活
性を阻害する作用に優れている事が確認された。他の試
薬の濃度は、各試験管には20μｇのrecAタンパク質、各
オリゴヌクレオチドの表示された量、30μｌ（充填容
量）の大腸菌DNAを含むビーズ、40単位のメチラーゼが
ふくまれていることを除いて、図18の試薬濃度と同様で
あり、分解は40単位のEco R I制限酵素によって行われ
た。反応を停止させた後、ビーズを、１％アガロースゲ
ル上で12℃で30分間、160V、切替え時間60〜140秒で電
気泳動にかけた。図19Cは、Ｂに示したゲルのサザンブ
ロット分析である。製造者の説明書に従って、GeneScre
en Plusナイロン膜（Dupont）上にゲルをしみこさせ
た。プローブは、³²Pデオキシシチジン５′−三燐酸塩
（³²P−deoxycytidine 5′−triphosphate）を用いて大
腸菌由来のtrpA遺伝子の600塩基対断片のポリメラーゼ
連鎖反応増大（PCR）によって作られた。trpA遺伝子
は、uvrBとtopA遺伝子の間にある。フィルムは露出オー
バーにして微小なバンドを検出したが、デンシトメトリ
ーは、露出のより少ないフィルムで実施した。レーン１
〜５と同じ量のDNAを含んでいたレーンＥは、予測され
た完全なEco R I分解によって産生される40kb断片とプ
ローブとがハイブリッド形成する事を示した（Kohara
等、Cell 50、495（1987））。このバンドの強度を100
％値として、520kb断片の収率を計算した。

図20において、図20Aは、イントロン１およびエキソ
ン19の部位と相同の２つのオリゴヌクレオチドを用いた
ヒトCF座の切断位置を示す図である。遺伝子は、合計24
のエキソンを含んでいる。図20Bは、オリゴヌクレオチ
ド濃度の減少に伴い、より小さなDNA断片が出現する事
を示す臭化エチジウムにより染色されたアガロースゲル
である。レーンＳは、未修飾のHeLa細胞DNAのSfi I分解
物である。レーンλは、ラムダコンカテマーDNAラダー
（はしご状パターン）である。レーン１〜６は、表示さ
れた量の各オリゴヌクレオチドによる完全な切断反応で
ある。イントロン１のオリゴヌクレオチド配列は、５′
−TAAGTGCTCAGAAAACATTTCTTGACTGAATTCAGCCAACAAAAATTT
TGGGGTAGGTAG−３′（60塩基の長さ）、エキソン19のオ
リゴヌクレオチド配列は、５′−AATGGCCAACTCTCGAAAGT
TATGATTATTGAGAATTCACACGTGAAGAAAGATGACATCTGG−３′
（63塩基の長さ）であった。全段階の反応容量が２倍
で、各反応毎に25μｌ（充填容量）のHeLaビーズが使用
された以外は、反応条件は図19と同じであった。製造者
の説明書に従って、レーンＳにおいて80単位のSfi I（N
ew England Biolabs）が使用された。１％アガロースゲ
ルが、12℃で32時間、160V、切替え時間40〜120秒で電
気泳動にかけられた。図20Cは、Ｂのゲルのサザンブロ
ット分析である。Sfi I分解物のバンドは270kbの長さ
で、180kb断片の収率の計算に使用された。プローブ
は、CF cDNA T8−B3プラスミド（American Type Cultur
e Collectionから得た）のPCRによって作られた。この
プローブは、550塩基の長さを有し、エキソン14の140個
の塩基と同じ線形順序に対応する部分がならんでいるエ
キソン13の塩基410個を含んでいた。

発明の詳細な説明本発明は、少なくとも一部は、DNA二本鎖と第三のDNA
鎖の間に非共有結合作用が働いている三本鎖DNA分子に
関するものである。更に、本発明は、この様な三本鎖を
形成する酵素的方法に関するものである。

本発明の三本鎖は、二本鎖と一本鎖の分子の間のハイ
ブリッド形成が可能な条件下において、リコンビナーゼ
（recombinase）タンパク質をDNA二本鎖と一本鎖DNA配
列に接触させる事によって形成する事ができる。リコン
ビナーゼタンパク質には、細胞内または生体内における
相同性の組換えに疑似した生化学的段階を試験管内で行
うタンパク質や、特に、相同性に依存して、一本鎖また
は二本鎖の２つのDNAを組み合わせる事が可能なタンパ
ク質が含まれている。この様なタンパク質の例として、
大腸菌recAタンパク質および他の細菌のrecA類似体、お
よびバクテリオファージT4 uvsXタンパク質等がある。
真核生物由来のタンパク質も報告されており、上に参照
されている。

本発明の三本鎖は、リコンビナーゼタンパク質を除去
した場合でも安定である。二本鎖の相補鎖は、どの様な
塩基配列でも持つ事ができ、一本鎖分子は、二本鎖の僅
か13個の塩基と相補性を有すれば安定した三本鎖を形成
する事ができる。本技術分野に通じた者は、相同性の塩
基対の必要最小数が、使用されるリコンビナーゼタンパ
ク質によって異なる事を認識するであろう。例えば、ヒ
トおよびショウジョウバエのリコンビナーゼは、僅か約
13塩基対の相同性を認識し、大腸菌recAが38塩基対の相
同を認識する。

本法での使用に適したリコンビナーゼタンパク質は、
精製されたもの、あるいは部分的に精製されたものであ
ってよい。上述の様に、ヒト細胞およびショウジョウバ
エの細胞等のリコンビナーゼタンパク質源から、実施例
のセクションで引用されている方法を用いて酵素の単離
が可能である。ほかのリコンビナーゼタンパク質源には
大腸菌がある。利用に適したリコンビナーゼの最適濃度
は、本技術分野に通じた者によって、容易に決定され得
る。

本発明はまた、配列に特異的な方法でDNAを切断する
方法に関する。現在、この技術は、利用可能な制限エン
ドヌクレアーゼの生物学的種類の数により、限定されて
いる。配列に特異的な切断の範囲を拡大するために、幾
つかのグループが、DNAの化学的切断部分が付いたホモ
ピリミジンオリゴヌクレオチドを使用して、目的部位を
切断することを試みている。この方法の理論的根拠は、
第三の鎖がピリミジン類だけ構成され、標的となる二本
鎖の配列がホモプリン鎖とホモピリミジン鎖の「相補
的」な部分を含んでいれば、三本鎖DNA形成が容易であ
る事である。この三本鎖のハイブリッド形成が行われる
と、第三の鎖の末端に付くFe−EDTAまたはCu−フェナン
トロリン（Cu−phenanthroline）といった化学的部分
が、目的の二本鎖DNAの切断を行う（Dreyer等、1985、P
roc.Natl.Acad.Sci USA 82、968−972参照）。

配列に特異的な切断の範囲は、組換えタンパク質の存
在下で、どの様な配列（すなわち、１本の鎖にプリン類
とピリミジン類の両方を順番を限定する事なく含むも
の）の第３の鎖でも、相同の二本鎖配列と三重らせんを
形成するという出願人の発見によって、著しく拡大され
た。化学切断基（例えば、Fe−EDTA、Cu−フェナントロ
リンまたは２−メトキシ−６−クロロ−９−アミノアク
リジン）を付けた第三の鎖のオリゴヌクレオチドを含む
三重らせんDNAを形成するためにリコンビナーゼタンパ
ク質を使用して、どの様な配列の二本鎖でも切断する事
が可能となる。この方法によって、例えば、完全な哺乳
類のゲノムに１回しか発生しない20個の塩基配列を、配
列に特異的にかつ効率的に切断できる事が期待される。
本技術分野に通じている者は、DNAの相同性（オリゴヌ
クレオチドと二本鎖間で共有する配列の同一性）に対す
るリコンビナーゼの厳格性を操作し、類似しているが同
一ではない配列に適応する様にしたり、あるいは反復す
る配列のモチーフを切断する様にする事によって、ゲノ
ムの切断を複数回行える事がわかるであろう。

配列に特異的な切断が随意にできるという事は、幾つ
かの事柄を意味する。第一に、これはDNA分子クローニ
ングにおいて非常に貴重な道具を提供する。第二に、DN
Aの100万塩基対のオーダーの長い範囲にわたる遺伝子地
図が比較的簡単に作成できるようになる。第三に、哺乳
類のゲノムにおいて切断部位を１つ導入できれば、特に
これが細胞内で行われれば、遺伝子に標的を定めること
がはるかに容易になる更に本発明は、遺伝子に標的を定める方法を強化する
事に関するものである。遺伝子に標的を定める方法は、
活発な研究分野である。その理由は、それによってヒト
疾患の動物モデルを作製する事ができ、また遺伝子治療
の方法を提供できるからである（患者の遺伝子の以上を
矯正する）。リコンビナーゼタンパク質を用いて配列に
特異的な切断をゲノムのDNAに対して行えれば、今日ま
で遺伝子の標的を定めることを妨げてきた最大の要因、
すなわち細胞内において標的を定める際の効率が極めて
低いという問題を克服できる可能性がある。本技術分野
に精通している者は、遺伝子療法の標的部位として、遺
伝子表現を停止させる遺伝子不活化またはRNA不活化の
ための標的部位が含まれる事を知るであろう。

更に、本発明は、DNAを含む試料中の特定の配列の二
本鎖DNA分子の存在を同定する方法に関するものであ
る。現在、DNA分子の同定は、しばしば手間のかかる方
法で行われている。つまり、DNA分子をゲル上で電気泳
動にかけ、変性させ、ニトロセルロース膜等の固体の支
持体に移し、その場でマーカーDNAにプローブさせる
か、またはハイブリッド形成させる。この本発明を実施
例に用いれば、リコンビナーゼタンパク質を用いて溶液
中で三本鎖DNA分子を形成し、ハイブリッドを形成する
事ができる。リコンビナーゼタンパク質は、標識された
（例えば放射活性のある）DNAプローブを目的の二本鎖D
NA分子とハイブリッド形成させる事ができる。次に、
「標識された」分子は、適切な技術（例えば、電気泳動
後のオートラジオグラフィー）によって、余分のハイブ
リッド形成しないプローブから分離した後、目で観察す
る事ができる。この様な方法は、より迅速で、目的とす
る分子の変性を避ける事ができるので、分子を本来のコ
ンフォメーションで研究する事ができ、また別の分子
を、例えば１つのゲル上で別のプローブを使用して簡単
に迅速にスクリーニングできる。

本発明は、複数の制限酵素による切断部位を持つDNA
のクローニングとマッピングに、これらの三本鎖DNAの
形成を利用する方法に関するものでもある。制限酵素に
よる切断部位の内、限定された部位だけを切断する事が
望ましい場合がしばしばある。現在のところ、無差別的
な「部分的切断」方法が用いられ、あるいは特定の制限
酵素によって認識される全ての部位で切断をブロックす
るメチラーゼが使用されている。残念ながら、メチラー
ゼの種類は非常に限定されており、それらが利用できる
範囲においても、メチラーゼは、特定の制限酵素によっ
て認識される全ての部位を修飾してしまう。幾つかの研
究所の研究によって、ポリプリン／ポリピリミジンの配
列を含む三重らせんは、三重らせんDNAの領域内では、
制限酵素による切断を免れる事が明らかになっている。
ここで明らかにする技術によって、リコンビナーゼタン
パク質の利用を基礎として、この様な切断に対する防御
を、殆ど全ての制限酵素が認識する配列に拡大応用する
事ができる。

本発明のもうひとつの側面は、特定の遺伝子の転写を
停止するために、リコンビナーゼによって形成された三
本鎖DNAを使用する方法に関するものである。現在、細
胞内の翻訳を阻害するために「アンチセンス」オリゴヌ
クレオチドを利用する事に多大な関心が寄せられてい
る。この技術において、オリゴヌクレオチドは、細胞内
でメッセンジャーRNA（mRNA）とハイブリッド形成し、
特定のタンパク質合成（翻訳）を阻害するか、あるい
は、リボソームRNAとハイブリッド形成し、それによっ
て細胞内の全てのタンパク質合成を阻害する。この方法
は、目的のタンパク質に対応する利用可能なmRNAまたは
リボソームRNAが、オリゴヌクレオチドの標的とならな
くてはならず、不活化しなくてはならないRNAがコピー
がしばしば数千に上るため、かなり限界がある。本発明
は、特定のたった１つの遺伝子の転写に影響するという
点で、遥かに効率の高い方法である。種類を問わず１つ
の遺伝子につき多数のRNAが転写されるのと対照的に、
細胞内における遺伝子のコピー数は通常かなり少なく、
12以下で、通常は二倍体細胞一つにつきコピーは２つ以
下である。遺伝子表現を阻害する事によりタンパク質合
成を阻害する本方法は、細胞内の過剰のリコンビナーゼ
タンパク質により、オリゴヌクレオチドがある遺伝子を
標的とするようにして、DNA三重らせん（DNA triple he
lix）を形成する事によって、行われる。

上述の様に、本発明はDNAに配列特異的に標的を定め
る方法に関するものである。一般的な言葉で述べれば、
本方法は、組換えタンパク質、例えば、大腸菌からのre
cAタンパク質が、オリゴヌクレオチドをそれと相同の二
本鎖DNAの配列と対合させ、三本鎖DNA分子を形成させる
ことができる性質を利用している。この様な対合複合体
（synaptic complex）と安定した結合分子（joint mole
cule）の形成の概略を、図９に示す。

本発明の方法は、応用範囲が広い。本発明方法を利用
すれば、特定の配列（すなわち、オリゴヌクレオチドが
複合体を形成する様な配列）を、例えばメチラーゼによ
る修飾から、あるいは制限酵素などによる切断から守る
ことができる。更に、本発明は、切断部分、例えば化学
的切断部分をオリゴヌクレオチドに付着させる事によっ
て、部位特異的な切断を行うために使用する事ができ
る。更に、本発明方法は、２段階のプロセスにより特定
の部位を切断するためにも利用できる。まず、特定の配
列を修飾から保護し（三本鎖分子の形成によって）、次
にオリゴヌクレオチドを除去し、予め保護されていた部
位が切断される様にする（他の部位は事前の修飾によっ
て切断から保護されている）。更にもう１つの実施例に
おいて、本発明は、結合している対の片方、例えばビオ
チンを付けたオリゴヌクレオチドの誘導体を作り、次に
結合対の他方の相手、この場合はアビジンを使用して、
目的の二本鎖とオリゴヌクレオチドの複合体からなる三
本鎖DNA分子を選択する事によって、目的の配列のDNAプ
ールの濃縮に使用できる。この方法によって、特定の二
本鎖DNA分子を精製する事ができる。本発明の他の実施
例として、特定の二本鎖分子に標識を付けるために、検
出可能な標識を結合したオリゴヌクレオチドの利用、お
よび活性化されると、安定した三本鎖分子を形成する交
又結合する試薬を結合したオリゴヌクレオチドの利用等
がある。ここに開示されたことろを読めば、本技術分野
に精通する者には、その他の本方法の応用は明らかであ
る。

本発明での使用に適したオリゴヌクレオチドは、目的
とする結果を最適なものにできる様に、設計する事がで
きる。例えば、オリゴヌクレオチドの長さは、過度の実
験を行う事なく、特定の目的のプロトコールに合わせて
調整する事ができる。

本発明については、上述の防御と制限／修飾の実施例
について、詳細な説明がなされるが、本技術分野に精通
している者は、この方法が試験管内でも生体内でも更に
広く応用できる事を知るであろう。

本発明の防御の側面は、下記の実施例12にある程度詳
細に説明されている。実施例のセクションを読めば明ら
かな様に、recAは、例えば、二本鎖DNA分子の特定部位
の切断を防御するために利用できる。これは、その部位
において対合複合体を形成する事によって効果を発揮す
る。オリゴヌクレオチドと相同の二本鎖DNA間の複合体
形成は、迅速かつ効率的に行われる。

明確化のために、制限／修飾の実施例に関係する反応
の特定の配列が、下記の実施例13〜15に詳細に示されて
いる。48.5キロベース（kb）の長さのラムダDNA（Lambd
a II、Hendrix等編（Cold Spring Harbor、N.Y.1983）
にある、Daniels等の論文、519−676ページ）の様な切
断しにくい標的DNAに関しては、反応は溶液中で有利に
行われる。しかし、より大きなゲノムは、アガロースマ
イクロビーズ中に埋め込む事ができる（実施例14および
15参照）。

例示された制限／修飾の実施例における、二本鎖DNA
の配列特異的な切断における最初のステップは、切断す
る特定のEco R I部位を選択する事である。一般に30〜6
0塩基の長さの相同のオリゴヌクレオチドが、Eco R I部
位が都合よくオリゴヌクレオチドの中央に来る様に合成
される。５′または３′末端に認識配列を持つオリゴヌ
クレオチドも使用されるが、効率が低い事が観察される
場合がある（実施例14参照）。オリゴヌクレオチドとre
cAタンパク質が二本鎖DNAと共にインキュベートされ、
相同部位で複合体が形成される。次にEco R IとＳ−ア
デノシルメチオニンが加えられ、全ての利用可能な部位
がメチル化されるが、オリゴヌクレオチドとrecAタンパ
ク質複合体が関与している部位は、メチル化を免れる。
次に、複合体とメチラーゼが不活化され、Eco R I制限
酵素が加えられ、この時点で剥き出しになったEco R I
部位が切断される。

１つの部位における切断が図17に示されているが、２
種類のオリゴヌクレオチドを同時に加える事ができる。
これによって、長い、あるいは環状のゲノムから断片を
単離する事ができる。以下の式は、この様な断片の収率
を示すものである。

収率（％）＝（PC）^２［１−（１−Ｍ）Ｃ］^ｘ（１−Ｎ）x100 ここで、Ｐは、recAタンパク質による相同部位のメチル化防御
効率である（１という値は、完全な防御を意味する。）Ｃは、制限酵素による切断効率である。

Ｍは、防御されていない部位のメチル化効率である。

Ｘは、断片中に認められるEco R I部位の数である。

Ｎは、非特異的ヌクレアーゼまたは切断により破壊さ
れた断片の分画である。

式中の３つの項は、反応の重要なパラメーターを含
む。第一項から、相同部位の防御を最大にしなくてはな
らない事、また防御効率の低下は、２つの部位が関与す
ると２乗される事が明らかである。防御効率は、両部位
で同じと仮定される。第二項は、Ｘ乗されるため、複数
のEco R I部位を内側に有する長い断片では特に、メチ
ル化が、有利には、殆ど完全なまでに行われなくてはな
らない。第三項から、非特異的ヌクレアーゼは最小限に
すべきで、実際、精製度の高いタンパク質を使用すべき
であることが明かである。

本技術分野に精通している者は、前述の内容を読め
ば、使用されるオリゴヌクレオチドを誘導体合成しない
ようにする事ができる一方、オリゴヌクレオチドの誘導
体を合成する事によって、より多目的な標的化が可能と
なることを理解することができるであろう。可能な誘導
体には、タンパク質、ビオチン（上述の様に）、蛍光染
料、化学的反応部分（例えば、切断用）、または光化学
的反応部分等がある。本技術分野において公知の方法を
用いて誘導体を作る事ができる。

本発明が関係している方法は、多くの応用例があり、
ゲノムマッピングもそのひとつである。２つの遺伝子座
の物理的距離は、単純に断片の大きさである。例えば、
パルスフィールドゲル電気泳動を用いて、一旦断片を分
離すれば、特定の目的の遺伝子を見つける複雑さは、断
片化されていないゲノムDNAを用いる研究と比べれば、
数桁も軽減される。

本技術分野に精通している者は、前記より、大きなゲ
ノム内の部位も含めて、DNA配列のどの部位にもオリゴ
ヌクレオチドが標的を定める事ができる様に設計できる
事がわかるであろう。従って、オリゴヌクレオチドは設
計可能で、細胞内環境において特定の遺伝子の切断、組
換え、または抑制に使用できるのである。

本発明のある側面について、以下の非限定的な実施例
において、さらに詳細に述べる。

実施例実施例１〜５に関する実験の詳細。

リコンビナーゼタンパク質（recombinase proteins）：部分精製されたHeLaリコンビナーゼ分画は、別に報告
されている様に（HsiehおよびCamerini−Otero、1989、
J.Biol.Chem.264、5089−5097）、核抽出物から調製さ
れた。部分精製されたショウジョウバエリコンビナーゼ
タンパク質である分画IVは、過去に報告されている様に
（EisenおよびCamerini−Otero、1988、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 85、7481−7485）、24時間胚から調製され
た。ヒトリコンビナーゼ試料は、トリクロロ酢酸に沈澱
するカウント数によって定量したところ、３′−５′エ
キソヌクレアーゼ活性を全く示さなかった。結合分子分
析の条件を用いて、ヒトリコンビナーゼ分画とインキュ
ベーション後、³²Pで３′末端を標識された二本鎖DNAか
ら³²Pの放射能（cpm）は全く放出されなかった（データ
は示されていない）。前述の様に、ショウジョウバエリ
コンビナーゼ分画は、同様の分析においては、³²Pの放
射能（cpm）を10％未満除去した（EisenおよびCamerini
−Otero、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85、7481−74
85）。ここで述べられる結合分子分析とは関係ないが、
リコンビナーゼ分画試料の５′−３′エキソヌクレアー
ゼ活性は極めて低かった。つまり、ショウジョウバエお
よびヒトリコンビナーゼ分画によって、それぞれ５％未
満の³²Pの放射能（cpm）と10〜15％の³²Pの放射能（cp
m）が、トリクロロ酢酸に溶解するカウント数として放
出された（EisenおよびCamerini−Otero、1988、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 85、7481−7485）。精製された大腸
菌のrecAおよびSSBタンパク質は、ご厚意により、North
western University Medical SchoolのStephen C.Kowal
czykowski博士（KowalczykowskiおよびKrupp、1987、J.
Mol.Biol.193、97−113）に提供していただいた。両大
腸菌タンパク質は、SDS PAGEにおいて単一の均質なポリ
ペプチドとして移動し、トリクロロ酢酸に溶解するカウ
ント数の放出として判定したところでは、検出可能なエ
ンドヌクレアーゼは全く含んでいなかった（S.Kowalczy
kowski、私信による、データは示されていない）。

DNA基質 pGem 4プラスミドDNAは、Promega Biotec社より入手
した。M13mp18ウイルスDNAと制限酵素は、New England
Biolabs社から入手した。M13mp19ウイルスDNAとpdel 9
プラスミドDNA、ヌクレオチド1745から2505を削除され
たpBR322の誘導体（Brenner等、1985、Mol.Cell.Biol.
5,684−691）は、標準的手法に従って調製された。オリ
ゴヌクレオチドは、別に報告されている様に（Hsiehお
よびCamerini−Otero、1989、J.Biol.Chem.264、5089−
5097）、合成され精製された。pdel 9のプラス鎖と相同
のオリゴヌクレオチドは、pBR322の位置17〜29、10〜2
9、4359〜29にわたっており、これらはそれぞれ13mer
（13個の塩基のポリマー）、20mer、33merであった（Su
tcliffe、1978、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.
43,77−99）。pGem 4のポリリンカー領域と相同のオリ
ゴヌクレオチドは、M13mp19のマイナス鎖から誘導さ
れ、下記の様にM13mp19に位置づけされた（Yannisch−P
erron等、1985、Gene 33、103−119）。部分的二本鎖に
使用されるオリゴヌクレオチドは、13塩基対、26塩基
対、38塩基対、56塩基対のそれぞれの位置6278〜6290、
6265〜6290、6253〜6290、6235〜6290にわたっていた。
分枝点移動構造に使用されるオリゴヌクレオチドは、23
塩基対、36塩基対、48塩基対、66塩基対のそれぞれの位
置6278〜6300、6265〜6300、6253〜6300、6235〜6300に
わたっていた。オリゴヌクレオチドは、³²P−ガンマ−A
TP（New England Nuclear）とT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（Pharmacia）によって標識され、G25スピンカラム
（Boehringer Mannheim）上を通過させるか、あるいは
透析によって脱塩処理された。放射能で標識されたオリ
ゴヌクレオチドとM13mp19ウイルス鎖DNAから³²Pで標識
された部分的二本鎖を調製する方法は別報で述べられて
いる通りであった（HsiehおよびCamerini−Otero、198
9、J.Biol.Chem.264、5089−5097）。分枝点移動構造
は、部分的二本鎖分子と放射能で標識されていないオリ
ゴヌクレオチドとインキュベートする事によって形成さ
れた。このオリゴヌクレオチドは、³²Pで標識され、ア
ニールされたオリゴヌクレオチドと配列は同じだが、³²
Pで標識された断片の５′に更に10個の塩基から成るア
ニーリング部位を直接接続している。DNA濃度は、ヌク
レオチドのモル数または重量によって表されている。

一本鎖と二本鎖基質の間に共通の相同部分の長さは、
結合分子内の一本鎖DNAと相補的な直鎖状二本鎖基質の
間で対にできる最大塩基数として定義されている。ウィ
スコンシン大学BESTFITプログラムを用いて、pGem 4とM
13mp18の間に共通の２つの重要な相同領域が発見され
た。これらは、pGem 4において互いに逆の方向性を示し
ている。lac i遺伝子からの59塩基対の領域の地図の位
置は、M13mp18の6001〜6059（Yannisch−Perron等、198
5、Gene 33,103〜119）とpGem 4の104〜162である。57
塩基対のポリリンカー領域は、M13mp18の位置の6231〜6
287、pGem 4の10〜66に位置づけられる。

ユニークな３′³²P標識を付けたpGem 4直鎖状二本鎖 pGem 4 DNAは、Hind IIIによって直線化され、Klenow
DNAポリメラーゼ断片（Pharmacia）を用いて、３′末
端に³²P−アルファ−dATP（New England Nuclear）と冷
たいデオキシヌクレオチドを作用させる事によって放射
能で標識される。65℃で10分間加熱して、反応を停止さ
せ、100mMのNaClに加えられ、Bgl Iで分解される。ポリ
リンカー領域を含む1,635塩基対のBgl I−Hind III断片
がゲル精製され、10mMトリス−塩酸、pH8.0と1mMのEDTA
に対して大規模に透析が行われる。この³²Pで標識され
た断片がPst Iで分解され、８％変性ポリアクリルアミ
ドゲルまたは１％アガロースゲル上で電気泳動後、デン
シトメトリーによって分析されると、99％以上の放射能
標識が1.6kbの断片から除去された。従って、³²P標識
は、二本鎖基質のプラス鎖の３′末端の10個塩基以内に
残留した。

結合分子分析結合分子分析は、20μｌについて、報告（Hsiehおよ
びCamerini−Otero、1989、J.Biol.Chem.264、5089−50
97）の様に、150pmol（50ng）のM13mp18ウイルスDNAと1
50pmol（50ng）の直鎖状pGem 4 DNAまたは300pmol（100
ng）の直鎖状pdel 9、および5ngの³²P標識されたオリゴ
ヌクレオチドと、100ngのHeLaタンパク質または40ngの
ショウジョウバエタンパク質を用いて、37℃、10分間で
行った。７μｇのrecAタンパク質と700ngのSSBタンパク
質を含む分析標本を、報告（HsiehおよびCamerini−Ote
ro、1989、J.Biol.Chem.264、5089−5097）の様に37℃
で10分間、前インキュベーションした。分析標本を１％
SDSと10mMのEDTAに加え、臭化エチジウムを含むTAE緩
衝液（40mMトリス−酢酸塩、pH8、1mM EDTA）中で0.7％
アガロースゲル状で室温で12〜16時間、0.6V/cmで電気
泳動にかけた。定量は、デンシトメトリーによっておこ
なわれた。Kleinschmidt法の変法を用いて、電子顕微鏡
検査が行われた。

熱安定性分析 ³²Pで標識されたオリゴヌクレオチドとM13mp19ウイル
ス鎖DNAをアニールして生成した³²P標識された部分的二
本鎖（150pmol）が、表示されている温度で、または１
％SDSと10mMのEDTAを含む鎖交換緩衝液中の氷上で10分
間インキュベートされた。0.1％ブロモフェノールブル
ーと50％グリセロールを含むTAE緩衝液が加えられ、混
合物は臭化エチジウムを含むTAE緩衝液中で0.7％アガロ
ースゲル上で室温で12〜16時間、0.6V/cmで電気泳動に
かけられ、続いてオートラジオグラフィーにかけられ
た。分枝点移動構造の安定性分析のために、150pmolの
³²P標識された部分的二本鎖とM13mp19に対する10塩基の
アニーリング部位を含む4ngの第二のオリゴヌクレオチ
ドが、表示されている温度で、または１％SDSと10mMのE
DTAを含む鎖交換緩衝液中の氷上で10分間インキュベー
トされた。上述の様に、反応物はアガロースゲル上で電
気浮動にかけられ、次にオートラジオグラフィーにかけ
られた。結合分子は、リコンビナーゼによって形成され
た。反応は、１％SDSと10mMのEDTAによって停止され、
表示された温度または氷上で10分間更にインキュベート
され、アガロースゲル上で電気泳動にかけられた。

結合分子の除タンパク recAとSSBタンパク質を含む反応済の結合分子分析試
料を１％ SDS、10mMのEDTA、20μg/mlのタンパク質分解
酵素（proteinase）Ｋ（Boehringer Mannheim）に加
え、更に37℃で20分間インキュベートした。分析試料
は、フェノール、フェノール−クロロホルム、クロロホ
ルムの順に用いて抽出された。試料は、使用直前に水で
飽和させた無水エチルエーテルで４回抽出された。残留
エーテルは窒素中で除去された。除タンパクされた結合
分子は、12％ポリアクリルアミドゲル（Novex）上でSDS
PAGE（Laemmli、1970）によって分析され、次に銀染色
（Hochstrasser等、1988、Anal.Biochem.173、412−42
3）またはウェスタンブロッティングが行われた。Schle
icher and Schuellのミニブロット（Miniblot）装置を
用いて電気泳動とニトロセルロースに移す方法は、製造
者の説明書に従った。移した後、ニトロセルロースのフ
ィルターは燐酸緩衝食塩水、PBS中の10％乳中で１時間
ブロックされた。フィルターは、PBS中の５％乳、0.1％
v/v Tween 20中の精製recAタンパク質に対するウサギ
抗血清の1:500希釈液20mlと共に１時間インキュベート
された。十分洗浄した後、フィルターは15μCiの¹²⁵I標
識されたロバの抗ウサギIgG（3000Ci/mmol、Amersham）
を含む20mlのPBS中の５％乳、0.1％ v/v Tween 20と共
に１時間インキュベートされた後、十分洗浄された。強
化スクリーンを使用して、３日間オートラジオグラフィ
ーを行った。

実施例１短い相同領域を有する結合分子三本鎖DNAの形成をテストするために、リコンビナー
ゼタンパク質の短い相同領域を用いて安定した結合分子
を形成する能力がモニターされた。リコンビナーゼタン
パク質が直鎖状２本鎖DNAと相同の環状一本鎖DNAと共に
インキュベートされ、２つの基質が非共有結合により連
合している結合分子生成物が形成された。安定した結合
分子形成は、直鎖状二本鎖の末端から開始される。環状
一本鎖DNA基質は、M13mp18ファージのウイルス（プラ
ス）鎖である。直鎖状二本鎖基質はプラスミド、pGem 4
（図2A）である。pGem 4とM13mp18は２つの重要な相同
領域を共有している。それは、大腸菌lac i遺伝子の59
塩基対領域と相同の57塩基対領域で、これらはpGem 4と
M13mp18の両者のポリリンカークローニング部位を構成
している。これら２つの相同領域は、非相同の37塩基対
によってpGem 4において分離される。ポリリンカー部位
においてpGem 4が直線化されると、ヒト（HeLa）および
ショウジョウバエのリコンビナーゼ分画による鎖交換に
は方向性があるため、図2Aに示される様に、pGem 4の直
鎖状二本鎖の右端部の相同配列のみが利用される（Hsie
h等、1986、Cell 44,885−894;EisenおよびCamerini−O
tero、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85、7481−748
5）。pGem 4の右端は、図に示す様に、M13mp18ポリリン
カー配列のプラス鎖の３′末端となっている。

HeLaリコンビナーゼ分画は、M13mp18一本鎖DNAと直線
化されたpGem 4二本鎖DNAの間で結合分子を形成した
（図2B）。試料は電気泳動の前に除タンパクされた。驚
く事に、わずか13個の塩基の共通な相同領域によって、
安定した結合分子を十分に形成する事ができた（レーン
４）。直鎖状二本鎖右端の５塩基長の相同配列と二本鎖
左端の52塩基長の相同配列は利用されなかった（レーン
５）。この結果から、ヒトのリコンビナーゼ分画による
鎖交換の方向性が確認される。ポリリンカー領域のマイ
ナス鎖を含むM13mp19一本鎖DNAを用いた対照実験では、
Hind IIIではなくEco R IによってpGem 4が直線化され
た場合に、安定した結合分子が出現した。Hind IIIとEc
o R Iの両者により分解されたpGem 4を用いた分析で、
５塩基対以外全て削除された場合にも、何も生成されな
かった事から、二本鎖左端から内側部位の37塩基対に位
置する第二の共通相同領域が、結合分子の形成におい
て、HeLaリコンビナーゼ分画によって利用されない事を
示している。非常に短い配列の相同領域を用いる結合分
子分析は、16〜26％の二本鎖を結合分子に転換し、驚く
べき高い効率であった。完全に相同なDNAを用いる同様
の分析条件下で、ヒトのリコンビナーゼ分画は、直鎖状
二本鎖の1/3から1/2を結合分子に転換する（Hsieh等、1
986、Cell 44、885−894;HsiehおよびCamerini−Oter
o、1989、J.Bio.Chem.264、5089−5097）。

ヒトのリコンビナーゼ分画の様に、ショウジョウバエ
リコンビナーゼ分画も僅か13塩基対の相同領域で結合分
子を形成し（図2C、レーン４）、５塩基対の相同領域を
利用することなく予想通りの結合分子形成の方向性を示
した（レーン５）。レーン１〜３において、約20％の直
鎖状二本鎖が結合分子に転換された。完全に相同なDNA
を用いる同様の分析条件下で、ショウジョウバエリコン
ビナーゼ分画は2/3の２本鎖を結合分子に転換する（Eis
enおよびCamerini−Otero、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 85、7481−7485）。

pGem 4直鎖状二本鎖、M13mp18一本鎖DNA、recAタンパ
ク質および大腸菌SSBタンパク質を用いる結合分子分析
が図2Dに示されている。分析条件は、他の研究者により
明らかにされたもので、数千もの塩基対にわたるrecAに
よる大規模な鎖交換を促進するものである（Radding,19
82 Ann.Review Genetics 16,405−437に概説されてい
る）。相同な56塩基対または38塩基対（レーン１および
２）が、recAによる結合分子形成にとって十分である事
が観察された；直鎖状二本鎖の28％と19％がそれぞれ結
合分子に転換された。しかし、相同性が26塩基対に限定
されると（レーン３）、結合分子は観察されなかった。
完全に相同な基質を用いた同じ反応条件において、recA
は、本質的に全ての二本鎖を高次構造に転換する事が観
察された。この分析において、recAの方向性は、真核生
物のリコンビナーゼ分画の方向性と同一であった。すな
わち、直鎖状二本鎖の右端の相同領域だけが、recAタン
パク質によって利用された（レーン１と５を比較せ
よ）。ヒトのリコンビナーゼ分画について観察された様
に、M13mp19一本鎖DNAと共にrecAとSSBタンパク質がイ
ンキュベートされた場合には、Hind IIIによって直線化
された二本鎖ではなく、Eco R Iによって直線化されたp
Gem 4によって、効率的に結合分子が形成された。短い
相同領域を用いるrecAによる鎖ペアリングの方向性が、
広い相同領域を共有する基質を用いる他のリコンビナー
ゼによる方向性と異なっているのかは、現在のところ、
不明である（Raddingにおいて概説されている、198
2）。しかし、recAによる鎖交換の方向性は、真核生物
のリコンビナーゼタンパク質の方向性と異なり、基質依
存性がある（KonfortiおよびDavis、1990、J.Biol.Che
m.265、6916−6920）。

recAによって形成された結合分子の電子顕微鏡検査に
より、直鎖状二本鎖と環状一本鎖DNAのペアリングが、
二本鎖の末端で起こった事が確認された。置換された鎖
は観察されなかったが、ペアリング領域の第三の鎖の立
体配置を決定するには、分解能が不十分であった。更
に、３種類のリコンビナーゼ全てによる結合分子の形成
には、DNAとリコンビナーゼタンパク質の両者が同時に
存在しなくてはならず、二本鎖のエキソヌクレアーゼ作
用処理とそれに続く二本鎖DNAのアニールによるもので
はなかった（図６参照）。M13mp18一本鎖DNAとHind III
により直線化されたpGem 4のDNA（56塩基対の相同性）
を別々にリコンビナーゼと共にインキュベートし、続い
て非酵素的アニールを促進するために、１％ SDSと10％
w/vポリエチレングリコールの存在下に処理された基質
を65℃で10分間同時にインキュベートすると、結合分子
は全く形成されなかった。

実施例２新しい結合分子分析これらの結合分子の安定性に関する１つの説明は、環
状一本鎖が、相同領域と非相同領域の接合部で二本鎖に
よってその場で非特異的に保持されているか、「挟まれ
ている」というものである。これとその他の捕獲形態の
可能性を除外するために、新しい分析法が考案された。
この分析法においては、一本鎖が２つの末端を有し、非
常に短く、二本鎖と完全に相同である。更に、この分析
法は、短い相同領域の認識が、M13mp18のポリリンカー
配列に限定されていない。直鎖状二本鎖DNAと直鎖状二
本鎖の１本の３′末端と同じ５′−³²P標識オリゴヌク
レオチドの結合分子形成に関する新しい分析法が図3Aに
示されている。安定した結合分子の形成は、アガロース
ゲル上で、直鎖状二本鎖DNAの位置に放射能標識の移動
が出現する事によってモニターされた。

安定した結合分子は、ヒトのリコンビナーゼ分画によ
って、pdel 9直鎖状二本鎖DNAと33塩基または20塩基の
長さのオリゴヌクレオチドの間で形成された（図3B、レ
ーン１および３）。13塩基の長さのオリゴヌクレオチド
（レーン５）、または非相同のオリゴヌクレオチドによ
って、結合分子は形成されなかった。レーン１の直鎖状
二本鎖の約50％が、結合分子に転換された。レーン２、
４、６の対照実験は、リコンビナーゼ分画試料中に可能
性として存在するエキソヌクレアーゼによる二本鎖の劣
化により、結合分子が形成されず、オリゴヌクレオチド
とアニールできる二本鎖を露出させることとなった事を
証明している。つまり、２つのDNA基質を別々にリコン
ビナーゼ分画と共にインキュベートし、次に反応を停止
させるためSDSの存在下に65℃で10分間同時にインキュ
ベートすると、結合分子は全く観察されなかった。pdel
9のマイナス鎖に対応するオリゴヌクレオチドを使用し
た場合、結合分子は全く形成されなかった。これは、ヒ
トのリコンビナーゼ分画の３′−５′方向性、すなわち
オリゴヌクレオチドのペアリングが、二本鎖のうちの非
相補鎖の３′末端で開始する事を反映している。

実施例３結合分子の熱安定性上記で検討された短い相同領域の除タンパクされた結
合分子のある鎖が置換されていると、分枝点移動による
解離が迅速に起こる事がある。DNA分枝点移動は塩基対
形成の進行過程でランダムに発生し、DNAを幾何的構成
に依存するが、１つの塩基対の通過に必要な時間は、12
〜200マイクロ秒である（Thompson等、1976、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 73、2299−2303;Radding等、1977、J.M
ol.Biol.116、825−839;GreenおよびTibbetts、1981、N
ucl.Acids Res.9、1905−1918）。従って、二本鎖の末
端まで到達するのに必要な時間は、距離（56塩基対）の
２乗に通過時間をかけ（0.2ミリ秒）、２または約300ミ
リ秒で割った値とほぼ等しい（Feller、1957、Vol.1.32
5ページ、John Wiley and Sons、New York）。驚く事
に、これらの除タンパクされた結合分子は、室温で数時
間（＞10⁴秒）非常に安定である事が観察された。

室温における結合分子の安定性は、第三の鎖と二本鎖
の間に更に別の相互作用が形成されている事を反映して
いる。この様な相互作用の強さを確認し、共有結合作用
の可能性を除外するために、結合分子の熱安定性が検討
され、部分的二本鎖分子と非酵素的な分枝点移動が起こ
り得る分子の安定性と比較された（図4A参照）。部分的
二本鎖分子、Ｉ、の短い二本鎖領域は、リコンビナーゼ
によって、Hind III（56塩基対）、Sal I（38塩基
対）、Bam H I（26塩基対）、Kpn I（13塩基対）により
分解されたpGem 4直鎖状二本鎖と、M13mp18一本鎖DNAと
の間で形成された図２に示す結合分子における塩基対の
形成が予想される領域と、配列および長さの点で正確に
対応していた。分枝点移動構造、IIは、潜在的な分枝点
移動の配列、長さ、方向において、リコンビナーゼによ
って形成される結合分子と正確に対応していた（「材
料」のセクションを参照）。非酵素的分枝点移動によ
り、³²P標識されたオリゴヌクレオチドが置換される。
この分析において、アニールされた断片が置換される現
象は、相同性に依存する分枝点移動を介して発生した。
と言うのは、第二のオリゴヌクレオチドが、二本鎖領域
と相同でない配列に付着している10塩基のアニーリング
部位を含んでいた場合には、³²P標識された断片が置換
される現象が観察されなかったからである。

Sal Iによって直線化されたpGem 4とM13mp18 DNAの間
で形成された結合分子に対応する38塩基対の相同領域に
関する安定性実験の代表的データが、図4Bに示されてい
る。二本鎖（58％ G−Ｃ）が65℃で10分後に安定で、75
℃で融解し、一方分枝点移動構造は45℃で10分後に分離
した。ヒトのリコンビナーゼ分画によって形成された結
合分子は、65℃で10分後に安定で、75℃で分離した。こ
れは、リコンビナーゼによって形成された結合分子と長
さ、配列、分枝点移動の方向性が同じ分枝点移動構造と
の間に相対的安定性の点で30℃の差がある事を表してい
る。臭化エチジウムで染色されたゲル内で結合分子より
もゆっくりと移動するかすかな第三のバンドは、pGem 4
のダイマーで、リガーゼ活性による汚染が原因である。

４種類の異なる長さの相同領域にわたり形成された二
本鎖、分枝点移動構造、３種類のリコンビナーゼによっ
て形成された結合分子に関する同様の熱安定性データが
図５に示されている。結合分子は安定性が顕著で、分枝
点移動構造よりも20℃から30℃高い温度で解離した。全
例において、二本鎖において観察された融解温度は、配
列の長さとＧ−Ｃ含有量に基づいて計算された温度と近
似していた（Sambrook等、1989 Molecular Cloning:a L
aboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spr
ing Harbor）。更に、結合分子の分離温度が相同領域の
長さと比例しているという観察結果から、共有結合が安
定性に関与している可能性は非常に低い。

結合分子は、大きな環状一本鎖DNAを使用した結果生
じる非特異的なDNA基質の捕獲または挟む事により安定
していたのではなかった。例えば、ちょうど交換点の所
を構造的にブロックされた結合分子に、正常の二本鎖DN
Aが並んでいる（図３も参照）。ヒトのリコンビナーゼ
分画によって、M13mp18直鎖状二本鎖と相同の³²P標識さ
れた26塩基長のオリゴヌクレオチドの間で形成された結
合分子も、対応する分枝点移動構造よりも有意に安定性
が高かった。対応する二本鎖と同様に（42％ G−Ｃ）、
除タンパクされた結合分子は、55℃で分離したが分枝点
移動構造は室温で不安定であった（データは示されてい
ない）。

リコンビナーゼによって形成される結合分子と比較し
てその安定性を評価するために、結合分子構造の非酵素
的な再構築が行われた。熱変性した直鎖状pGem 4とM13m
p18一本鎖DNAを、中性のpHまたはpH5.5で（Voloshin
等、1988、Nature 333、475−476）、10％ w/vポリエチ
レングリコールの存在下でアニールし、アガロースゲル
上で電気泳動にかけた。結合分子は、全く観察されなか
った。同様に、熱変性した直鎖状pdel 9を³²P標識され
たオリゴヌクレオチドとアニールすると、安定した結合
分子は生成できなかった。

実施例４安定な結合分子は３つの無傷の鎖を持つもしも、直鎖状二本鎖のプラス鎖の３′末端がエキソ
ヌクレアーゼ作用によって分解され、結合分子内のヘテ
ロ二本鎖DNAだけが残っているのであれば、これらの結
合分子の驚くべき安定性を説明する事ができるであろう
（図１の上図参照）。以下の実験は、安定した結合分子
が無傷の第三の鎖を持っている事を示している（ポリリ
ンカー領域のプラス鎖）。

HeLaリコンビナーゼ分画またはrecAとSSBタンパク質
を用いて、M13mp18一本鎖DNAと直鎖状二本鎖のプラス鎖
の３′最末端を³²P標識されたpGem 4断片の間で結合分
子分析が行われた（図6A）。放射能標識された二本鎖の
制限酵素分解物によって、³²Pによる標識の99％以上がp
Gem 4断片のプラス鎖の３′末端の10個の塩基に限定さ
れていた事が確認された（「方法」のセクション参
照）。従って、³²P認識された結合分子が形成されると
いう事は、第三の鎖が無傷である事を意味する。と言う
のは、９塩基対以下のヘテロ二本鎖は、非常に不安定
で、この様な条件下では回収できないからである（図５
参照）。これらの分析において、放射能標識された二本
鎖の15〜20％が結合分子に転換されたので、³²P標識さ
れた結合分子の殆ど全ては無傷な第三の鎖を持っていた
はずである。recAによって形成される³²P標識された結
合分子の熱安定性（図6B参照）は、３つの無傷な鎖を持
つ分子が比較的高温で解離する事を示した（図５参
照）。迅速に移動する低いバンドは、³²P標識された二
本鎖から³²Pの標識の非酵素的喪失を表している。これ
はリコンビナーゼタンパク質が存在しない条件で高温で
発生した。

recAとHeLaリコンビナーゼ分画によって形成された³²
P標識された結合分子と対応する56塩基の分枝点移動構
造の相対的安定性の定量結果を、図6Cに示す。ヒトのリ
コンビナーゼ分画によって形成された³²P標識された結
合分子は、recAタンパク質によって形成されたものと同
様に、極めて高い安定性を示した。分断されたpGem 4直
鎖状二本鎖を用いるこれらの結果は、結合分子の安定性
が、直鎖状二本鎖の右端のポリリンカーの相同領域だけ
に限って塩基対を形成する事によるものである事も証明
している。

実施例５安定した結合分子はタンパク質を持たない結合分子の安定性を説明するのに、１％ SDSの存在下
で、結合分子がリコンビナーゼタンパク質と連合し続け
ている、と考える事ができる。図７に示す実施例は、re
cAタンパク質によって形成される安定したDNA結合分子
が、幾つかの除タンパク試薬によって処理された後は、
recAタンパク質と連合していない事を証明している。相
同の56塩基対を有する結合分子は、上述の様に、１％ S
DSの存在下にプロテイナーゼＫによって除タンパクさ
れ、フェノール／クロロホルムによって抽出された。re
cAタンパク質残留量は、recAタンパク質に対するポリク
ロナール抗体を用いたウェスタンブロット法によって評
価された（図7A）。同じように処理された結合分子は、
熱安定性についても分析を行い、75℃と85℃の間で解離
した（図7B）。

ウェスタンブロット法によるrecAタンパク質の実験的
検出限界（0.1ngまたは2.5fmol、図7Aのレーン５）と、
除タンパク結合分子の回収率（30fmol、図7Bのレーン
３）に基づき、結合分子の90％以上がrecAタンパク質を
持っていないと推定された（図7Aのレーン６）。銀染色
によってrecAポリペプチドは検出されなかった。このブ
ロット中、recAポリペプチド、一本鎖DNAまたは二本鎖D
NAの位置において、recAの移動は観察されなかった。

たとえ活性を有するリコンビナーゼが存在したとして
も、リコンビナーゼが分枝点移動とそれに続くDNA分子
の解離を妨害しなかった事も観察された。図4Aに示され
る³²P標識された部分的二本鎖構造が、結合分子分析の
条件下に、recAタンパク質とSSBタンパク質またはHeLa
リコンビナーゼ分画を存在させ、10塩基のアニーリング
部位を含む第二のオリゴヌクレオチドと共に37℃でイン
キュベートされた。分枝点移動構造が形成され、10分以
内に³²P標識されたオリゴヌクレオチドが分離した。

実施例６〜12に関する実験の詳細 recAタンパク質：生成された大腸菌のrecAタンパク質は、ノースウェス
タン大学メディカルスクールのStephen C.Kowalczykows
ki博士から提供された。

DNA基質： pBR322およびpUC18プラスミドDNAとM13mp18複製型DNA
は、Pharmaciaより入手した。オリゴヌクレオチドは、
前に述べた様に、合成され、Mono Qカラム（Pharmaci
a）を通過させて精製された（HsiehおよびCamerini−Ot
ero、J.Biol.Chem.264:5089（1989））。前に述べた様
に（HsiehおよびCamerini−Otero、J.Biol.Chem.264:50
89（1989））、オリゴヌクレオチドは、³²P−ガンマ−A
TP（New England Nuclear）とT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（Pharmacia）を用いて、５′−末端を放射能標識
された。

pBR322のプラス鎖に完全に相同なオリゴヌクレオチド
（図11および14）は、pBR322の位置15〜29、10〜29、43
59〜29にわたっており、それらはそれぞれ15、20、33塩
基長のオリゴヌクレオチドである（Sutcliffe、Cold Sp
ring Harbor Symp.Quant.Biol.49、561（1978））。20L
系列のオリゴヌクレオチド（図15）は、pBR322のプラス
鎖の３′末端に相同の様々な大きさの相同領域を持って
おり、pBR322の位置10〜29、20〜29、22〜29、24〜29、
26〜29にわたっており、それらはそれぞれ20、10、８、
６、４塩基長のオリゴヌクレオチドである。20R系列の
オリゴヌクレオチド（図15）は、pBR322のプラス鎖の
５′末端に相同の相同領域を持っており、pBR322の位置
20〜39、20〜29、20〜27、20〜25、20〜23にわたってお
り、それらはそれぞれ20、10、８、６、４塩基長のオリ
ゴヌクレオチドである。pUC18のプラス鎖に相同のオリ
ゴヌクレオチド（図10）は、pUC18の位置230〜285、230
〜267、230〜255、230〜249にわたっており、それらは
それぞれ56、38、26、20塩基長のオリゴヌクレオチドで
ある（Norrander等、Gene 26、101（1983））。pBR322
の位置4359〜29と相同の33塩基長さのオリゴヌクレオチ
ドは、pUC18のポリリンカー領域とは対を成さなかっ
た。図12に示される実験に使用された20塩基長のオリゴ
ヌクレオチドは、pUC18のマイナス鎖の248〜267の位置
と相同でなかった。図13に示されるオリゴヌクレオチド
は、230〜285の位置に対応するpUC18のプラス鎖と相同
な56塩基を含んでいた。M13mp18のプラス鎖と相同の30
塩基長のオリゴヌクレオチド（図16）は、6831〜6860の
位置にわたっていた（Yannisch−Perron等、Gene 33、1
03（1985））。DNAは、ヌクレオチドのモル数または重
量で表されている。

対合複合体（synaptic complex）形成：対合複合体は、20mMのトリス−塩酸、0.4mMのジチオ
トレイトール、125mMの塩化マグネシウム、0.3mMのATP
−ガンマ−Ｓ（Fluka）、1.1mMのADP（Sigma）を含むpH
7.5の緩衝液に、1.8μＭ（15ng）のオリゴヌクレオチ
ド、18μＭの二本鎖DNA（150ng）および1.5μＭ（1.5μ
ｇ）のrecAタンパク質を入れて、総容量25μｌとし、37
℃で15分間インキュベートする事によって形成された。
対合複合体の形成に続き、10〜20単位の適当な制限エン
ドヌクレアーゼ（New England Biolabs）が加えられ、
更に５分間インキュベーションが続けられた。SDSとEDT
Aを、最終濃度がそれぞれ１％と10mMとなる様に加え
て、反応を停止した。反応物を40mMのトリス−酢酸塩、
pH8.0、1mMのEDTA、１μg/mlの臭化エチジウム中の１％
アガロースゲル上で、0.6V/cmで14〜16時間、室温で電
気泳動にかけた。Polaroid 665のネガのデンシオメータ
ースキャンニングを用いて、150ngの未反応の二本鎖DNA
と反応させた分析標本を比較する事によって定量を行っ
た。対合複合体分析における無傷（未反応）の二本鎖DN
Aの回収率は、150ngの未反応の二本鎖DNAを含む標準と
比較した。幾つかの分析標本において、対合複合体分析
は１％SDSの添加により反応を停止し、89mMのトリス−
ホウ酸塩、pH8.3、5mMのMgCl₂中の１％アガロースゲル
上で、0.6V/cmで14〜16時間、室温で電気泳動にかけ
た。

除タンパクされた結合分子（deproteinized joint moel
cues）：５′−³²P標識オリゴヌクレオチドを使用した以外
は、上述と同様にして対合複合体を形成した。上述の様
に、SDSとEDTAを加えて反応を停止し、電気泳動にかけ
た。次にゲルを固定し、Kodak XAR−２フィルムに感光
させた。数例においては、電気泳動にかける前に、既に
述べた様に、結合分子をプロテイナーゼＫ（Boehringer
Mannheim）処理と、フェノール：クロロホルム抽出に
より除タンパクした（Hsieh等、Genes Devel.4、1951
（1990））。結合分子の定量は、再構築実験によって決
定された。この実験では、³²P標識された56塩基のオリ
ゴヌクレオチドと既知量のM13mp19一本鎖DNAを65℃また
はrecAの存在下にアニールした。（アニーリングの効率
に差は認められなかった。）電気泳動とオートラジオグ
ラフィーに続いて、これらのアニール化した標準物質の
相対的強度を、結合分子の相対的強度と比較した。

実施例６対合複合体と結合分子の形成 recAによる対合複合体と安定した結合分子の形成に関
する実験図が図９に示されている。対合複合体の形成
は、スーパーコイルプラスミドDNAの様な二本鎖DNA、相
同のオリゴヌクレオチド、recAタンパク質をインキュベ
ートする事によって行われた。オリゴヌクレオチドは、
二本鎖DNAの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んで
いる。recAタンパク質、オリゴヌクレオチド、二本鎖DN
Aを含む対合複合体の形成によって、二本鎖に制限エン
ドヌクレアーゼによる切断に対する抵抗性が与えられ
る。対合複合体に対応する制限エンドヌクレアーゼが存
在した形跡は、適切な制限エンドヌクレアーゼと共に複
合体をインキュベーションした後に残るスーパーコイル
プラスミドDNAとして、臭化エチジウムによって染色さ
れたアガロースゲル上に見る事ができる。recAタンパク
質は、EDTAとSDS洗剤を加える事によって、これらの対
合複合体から分離でき、除タンパクされた結合分子が生
成され、この結合分子の中でオリゴヌクレオチド（５′
末端が³²P標識されている）は、安定して二本鎖と対を
形成している。結合分子の存在は、アガロースゲル上で
二本鎖DNAの位置に³²P放射能標識の移動が出現する事を
分析する事によって決定する事ができる。

ATPおよびATP再生系の存在下に、recAタンパク質によ
る結合分子形成が検討された。この様な反応条件下に、
recAタンパク質によって60塩基対以下の相同性を共有す
る直鎖状二本鎖と環状一本鎖DNAとの間に安定した除タ
ンパクされた結合分子が形成される事は、過去に観察さ
れていた（Hsieh等、Genes Devel.4、1951（1990））。
安定した除タンパクされた結合分子が、recAタンパク質
によってpUC18スーパーコイルDNAと相同の56塩基オリゴ
ヌクレオチドとの間で形成された。ATP加水分解が存在
する条件で、除タンパクされた結合分子が１分後に回収
されたが、非常に不安定であった。つまり、３分後には
結合分子の半分が解離しており、15分のインキュベーシ
ョン後には、除タンパクされた結合分子は回収されなか
った。一旦最初のペアリングと解離が起こってしまう
と、二本鎖は、それ以後のペアリングに参加できない様
に見えた。このペアリングの一過性の性質により、対合
複合体が存在した形跡を求める事は、ATPの存在下では
不可能であった。ATPを加水分解不可能なATPの類似体で
あるATP−ガンマ−ＳとADPに代える事によって、ペアリ
ング反応を止め、中間物を蓄積する事ができた。

0.3mMのATP−ガンマ−Ｓと1.1mMのADPの存在下での、
recAタンパク質による対合複合体と結合分子の形成を図
10に示す。recAタンパク質の存在下に、pUC18プラスミ
ドポリリンカー配列と相同の³²P標識されたオリゴヌク
レオチドがスーパーコイルpUC18プラスミドDNAと共にイ
ンキュベートされた後、Sac I制限エンドヌクレアーゼ
が添加された。図10Aに示される様に、全てのオリゴヌ
クレオチドがpUC18プラスミドのユニークなSac I制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいた。

対合複合体は、オリゴヌクレオチドと二本鎖DNAが共
有する相同の20個の塩基によって形成されていた（図10
B、レーン９）。Sac Iによる分解から防御されたスーパ
ーコイルDNAの定量によって、オリゴヌクレオチドが相
同の塩基を56または38個含んでいる場合には、二本鎖DN
Aの70〜75％が対合複合体として存在する事が示された
（レーン３および５）。55％と20％の二本鎖が、それぞ
れ26および20個の相同の塩基をもつ対合複合体に転換さ
れた。対合複合体の形成には、recAタンパク質と相同の
オリゴヌクレオチドの両者が必要であった。レーン１の
対照は、制限酵素を含めずに、オリゴヌクレオチドとre
cAと共に二本鎖インキュベートすると、スーパーコイル
DNAが無傷で残る事を示している。レーン10に示す様
に、Hind IIIは38塩基長のオリゴヌクレオチドに含まれ
る範囲から14塩基対離れた部位において切断するが、対
合複合体はHind IIIによる切断を防御しなかったので、
対合複合体の存在形跡がオリゴヌクレオチドと平行する
二本鎖の領域を大幅に超えない事が推定された。更に、
この分析において、相同でないオリゴヌクレオチドは、
recAにより対合複合体を形成しない。

recAタンパク質は、相同の³²P標識されたオリゴヌク
レオチドとpUC18プラスミドDNAの間で、除タンパクされ
た時に安定な結合分子を形成する事ができる（図10
C）。この分析ではオリゴヌクレオチドと二本鎖DNAに共
通な相同塩基がわずか26個あれば、結合分子を形成する
のに十分であったが、20個の相同塩基では不十分であっ
た。安定した結合分子の回収量の定量から、複合体をTA
E緩衝液（図10の説明を参照）中で電気泳動にかける
と、pUC18二本鎖の約20〜50％が相同の56塩基長のオリ
ゴヌクレオチドと対を形成している事が示された。対合
複合体について観察された様に、recAタンパク質による
結合分子形成の効率は、ペアリングに利用できる相同性
の長さの関数として、増大する。これらの除タンパクさ
れた結合分子は、スーパーらせん歪み（superhelical s
train）がペアリング領域の外側に位置する制限エンド
ヌクレアーゼ部位における直線化の際に遊離されると、
解離する（図10C、レーン10）。

二本鎖DNAとオリゴヌクレオチドの間で形成される結
合分子は、残留しているrecAタンパク質によって安定化
される事はない。SDS、プロテイナーゼＫとフェノール
／クロロホルム抽出処理により対合複合体を除タンパク
した場合、回収された安定した結合分子の数は変わらな
かった。

対合複合体の形成に用いられた分析条件は、相同の56
塩基対を用いる結合分子形成に最適である事が証明され
たものであった。結合分子形成によって、オリゴヌクレ
オチド濃度の最適条件1.2μＭの幅が狭く、0.9μＭのオ
リゴヌクレオチドでは結合分子が生成されず、1.8μＭ
まで濃度を増加しても、結合分子の収率の増加は全く認
められなかった。これらの分析に使用されたrecAの量
（1.5μＭ）は、一本鎖オリゴヌクレオチド濃度に関し
て飽和している。ATP−ガンマ−ＳとADPの両者が1:3の
モル比で存在していると、対合複合体と結合分子を迅速
に検出する事ができた。ATP−ガンマ−ＳとADPの比率、
またはこれらの二つの補因子の濃度が変化すると、対合
複合体と結合分子の両者の形成効率が低下した。

二価の陽イオンが試験管内におけるrecA活性に必須で
ある事は十分に確立されている。結合分子の安定化にMg
²⁺が必要かどうかを決定するために、研究が行われた。
図10に示す様に、recAの存在下に対合複合体が形成され
た。SDSだけを加えて反応物を除タンパクし、反応生成
物を5mMのMgCl₂を含むアガロースゲル上で電気泳動にか
けて分析した。Mg²⁺が存在する場合の結合分子の回収率
は、電気泳動段階でMg²⁺が含まれない場合よりも２〜４
倍高かったが、質的な差異はみとめられなかった。すな
わち、安定した結合分子は、相同な26塩基を含むオリゴ
ヌクレオチドとは形成されたが、相同な20塩基を含むオ
リゴヌクレオチドとは形成されなかった。

図10に示すデータは、ATP−ガンマ−Ｓの存在下にお
ける対合複合体の形成は、安定した除タンパク結合分子
を形成する経路の中間段階である事を示している。除タ
ンパクされた結合分子とrecAを含む対合複合体の形成か
ら、ペアリングに利用できる相同領域の長さに対する依
存性が示された。また、対合複合体と結合分子の両者の
形成が、相同な56塩基によって、比較的高い効率で起こ
る事も示された。すなわち、これらの対合複合体を除タ
ンパクするとき、二本鎖DNAの大部分はなお、Mg²⁺の存
在下で、安定した結合分子内のオリゴヌクレオチドと対
を形成している。

実施例７直鎖状二本鎖DNAを含む対合複合体非常に短い相同領域を含む対合複合体の形成には、ス
ーパーらせん歪み（superhelical strain）は必須では
ない。対合複合体の形成には、recA、直鎖状二本鎖、33
塩基長の相同のオリゴヌクレオチドが必要である（図11
A）。図11Bにおいて、recAがこれら２つの基質の間で対
合複合体を形成し、それによって直鎖状二本鎖をCla I
による切断から防御している事は、明らかである（レー
ン４）。recAまたはオリゴヌクレオチドが存在しない場
合（それぞれレーン２および６）、あるいは非相同のオ
リゴヌクレオチドが存在する場合には（レーン５）、対
合複合体は形成されなかった。

実施例８対合複合体が存在した形跡 recA対合複合体による制限エンドヌクレアーゼの切断
作用の防御範囲がマッピングされた（図12）。pUC18プ
ラスミドDNAのポリリンカー配列部位と相同の20塩基の
オリゴヌクレオチドを、スーパーコイルpUC18とrecAの
存在下にインキュベートし、対合複合体を形成した。Ba
m H I、Kpn I、Pst I、Sac I、Sph I制限エンドヌクレ
アーゼ部位において防御作用が観察された。しかし、Ec
o R IとHind IIIによる切断は、対合複合体が存在して
も、防御されなかった。従って、対合複合体の存在を示
す形跡は、対を形成したオリゴヌクレオチドの５′と
３′末端から約13〜14塩基超えた所まで、対称に及んで
いる事は明らかである。

実施例９対合複合体と結合分子形成の方向性結合分子形成の方向性は、明らかにDNA基質の選択、
共有相同領域の長さ、反対の方向性により形成された結
合分子の相対的安定性によって影響される（Konforti
等、J.Biol.Chem.265、6916（1990）;Rao等、Proc.Nat
l.Acad.Sci.88、2984（1991））。従って、スーパーコ
イル二本鎖とオリゴヌクレオチドを含む対合複合体形成
と結合分子形成の両者の方向性が検討された。56塩基の
相同領域を含む対合複合体の形成は、方向性を示さな
い。オリゴヌクレオチドのどちらの末端に相同領域が位
置しているかとは無関係に、対合複合体がrecAによって
形成された。図13の実験において、pCU18のポリリンカ
ー領域に相同な56塩基のオリゴヌクレオチドを用いた。
あるいは同じ56塩基の配列とオリゴヌクレオチドの５′
末端、３′末端、または５′と３′末端の両方に非相同
の20塩基の配列を持つ幾つかのオリゴヌクレオチドと１
つを用いた（図13A）。全例において、対合複合体は、
ほぼ同じ効率で形成された（図13B、レーン５、７、
９、11）。これに反して、recAによる安定した結合分子
の形成は、方向性を示し、オリゴヌクレオチドの５′末
端に相同部位がある場合に非常に高い効率で形成され
た。76Rオリゴヌクレオチドによって形成された結合分
子数は、56塩基のオリゴヌクレオチドによって形成され
た結合分子数の半分であり（図13C、レーン２および
６）、一方76Lオリゴヌクレオチド（レーン４）または9
6オリゴヌクレオチド（レーン８）は10倍も少ない結合
分子を形成した。

実施例10 相同領域の探索に必要な最小構造 pBR322の配列と相同の33、15、13塩基長の３つのオリ
ゴヌクレオチド（図14A）を、recAの存在下に、pBR322
スーパーコイルプラスミドDNAと共にインキュベートし
た。15塩基オリゴマーの潜在的な切断部位は図14Bに、
そしてその形跡は図14Cに示されている。Hind IIIとCla
Iエンドヌクレアーゼによる切断に対する抵抗性から証
明された様に、15塩基のオリゴマーは、対合複合体を形
成するのに十分な長さであった（レーン４および７）。
この分析において、33塩基のオリゴマーを使用すると、
対合複合体を形成したが、13塩基のオリゴマーは形成さ
れなかった。対照実験によって、対合複合体の形成に
は、オリゴヌクレオチドとrecAの両方が存在する必要が
あった事が示されている。対合複合体が存在した形跡
は、ペアリング領域以外には及ばなかった事は明らかで
ある（図14C、レーン10参照）。この実験は、recAが、p
UC18（図10）またはpBR322（図11）の配列のどちらかを
含む相同のDNAで対を形成した事から、recAによる対合
複合体の形成が、特定の配列に限定されなかった事も証
明している。

実施例11 ペアリングの核を形成するには、核タンパク質フィラメ
ントのらせんの半回転が必要である recAによって認識される最小相同領域を決定するため
に、Cla I部位が付いたpBR322と５′または３′末端に
相同領域を有する20塩基長の一連のオリゴヌクレオチド
を使用した（表１参照）。この実験は、この分析におい
てrecAによって認識される最小相同領域を確立するだけ
でなく、recAによるペアリングの開始に方向性があるか
どうかを明確に確立するものである。図15に示す結果
は、recAが、相同の僅か８個の塩基を５′または３′末
端で、低効率ではあるが（それぞれ10％および12％）、
結合できる事を示している。これらの結果より明らかに
なった事は、核タンパク質フィラメントの形成と相同部
分のペアリングの閾値は異なっており、一本鎖DNAの
５′末端あるいは３′末端のどちらでもペアリングの核
となり得ることである。相同部分の探索を行い得る構造
を形成するには、15個の塩基が必要であるが、これらの
塩基の内半分だけがrecAによって認識され、ペアリング
されれば良いのである。

実施例12 recAによりオリゴヌクレオチドの標的を定める一つの二本鎖分子内に存在していて、類似しているが
異なる配列を標的として、recAがどの程度それらの標的
を区別できるかが検討された。３箇所のNde I認識部位
を有するスーパーコイルM13mp18遺伝子の複写型DNAが、
recAの存在下に、Nde I認識配列を含む30塩基長のオリ
ゴヌクレオチドと、M13mp18の３箇所のNde I認識部位の
１箇所に隣接する配列がインキュベートされた（第Ｉ部
位、図16A参照）。対合複合体の第Ｉ部位のみにおける
形成は、対合複合体をNde Iエンドヌクレアーゼによっ
て分解した後に6170塩基長のM13mp18断片が出現するか
どうかでモニターした。このような断片は、第Ｉ部位が
切断されずに第Ｉ部位と第II部位の両者が切断された時
のみに出現する。

recAは、DNA分子の大多数において第Ｉ部位のみへの
ペアリングを標的とすることが出来た（図16B、レーン
５）。このような標的化には、オリゴヌクレオチドとre
cAの両者の存在が必要であった（レーン３および４）。
Nde Iとインキュベートされた全試料において1080塩基
長の断片が存在するのは、防御されていない第II部位と
第III部位の両者にNde Iによる切断が及ぶ程度を知るた
めの対照である。レーン５における各分画の定量化によ
って、標的とした第Ｉ部位へのペアリングの識別能力
は、これらの条件下では、第II部位および第III部位の
約７〜８倍であることが示されている。

実施例13〜15に関する実験の詳細。

オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは、FPLC Mono Qカラム（Pharmac
ia）によって、20mMの水酸化ナトリウム中の100mMから1
Mの塩化ナトリウム勾配液を用いて精製された。ピーク
の分画の部分標本は、³²P標識され、ポリアクリラミド
ゲル上で電気泳動された。最も精製度が高い分画が貯蔵
され、エタノールで沈殿され、水に溶解された。260nM
におけるOD単位の１単位は、33μｇであると想定して濃
度を決定した。

recA: recAタンパク質は細菌株を用いて精製された。プロト
コルの詳細は、シカゴのノースウェスタン大学メディカ
ルスクールのStephen Kowalczykowski博士の好意によっ
て提供された。使用された細菌株は、JC12772であった
（Uhlin等、J.Bacteriol.148、386（1981））。精製
は、スペルミジン沈殿法（J.Griffith等、Biochemistry
24、158（1985））に基づき、ATP溶出による一本鎖DNA
アガロースカラム（Cox等、J.Biol.Chem.256、4676（19
81））を用い、微量のヌクレアーゼによる汚染を無くす
ために、Mono Qカラムを使用した。このような汚染の除
去は、望ましくない非特異的なDNA分子のニック（三本
鎖DNA分子の一本鎖の切断）を避けるために重要であ
る。recAタンパク質の濃度は、^１％E₂₈₀＝5.9の吸光度
係数を使用して測定した（Craig等、J.Biol.Chem.256、
8039（1981））。

実施例13 ラムダDNAの配列特異的な切断配列に特異的なラムダDNAの１箇所における切断は、
図18において証明されている。ラムダDNAの長さは48.5k
bで、５箇所のEco R I部位を含む（Lambda II、Hendrix
等編（Cold Spring Harbor,N.Y.1983）中のDaniels等、
516−678ページ）。31,747のヌクレオチド位置が切断部
位として選ばれ、ラムダDNAを31.7kbと16.8kbの２つの
断片に切断した。この部位に相同な30塩基長のオリゴヌ
クレオチドが合成された。図18Bはこのオリゴヌクレオ
チドを用いた切断実験の結果を示している。レーン１は
切断されていないラムダDNAであり、レーン２は完全に
切断された実験結果を示している。レーン２の濃度測定
によって、DNAの79％が、計画通りの２つの断片に切断
され、19％は切断されなかったことが判明した。全部で
２％のDNAは、ラムダDNAに存在する他の４箇所のEco R
I切断部位の内の１箇所で切断されていた。これは、rec
Aタンパク質とオリゴヌクレオチド複合体による非特異
的なメチル化による防御、あるいは、不完全メチル化が
原因である。レーン３、４、５の対照は、それぞれrecA
タンパク質、オリゴヌクレオチド、メチラーゼを除いた
ものである。レーン３においては、recAタンパク質を除
いたことによる不完全なメチル化が明らかに認められ
た。これは、恐らくrecAタンパク質によって覆われない
遊離オリゴヌクレオチドがメチラーゼを抑制しているの
が原因と思われる。レーン４においてもDNA分子は、軽
度の不完全メチル化を呈していた。恐らく、この原因
は、遊離recAタンパク質がラムダDNAの二本鎖分子に結
合することにより、非特異的な防御作用が発揮されるか
らであろう。この作用は、オリゴヌクレオチドの定量化
が行われた図19および図20において、より顕著に認めら
れた。

実施例14 大腸菌DNAの配列に特異的な切断実験の詳細： American Type Culture Collectionより、野性型の大
腸菌株W3110を入手し、Luria−Bertani培地で、600nmの
吸光度（OD）が５になるまで、１晩培養した。5mlの細
胞が小球化され（湿性重量30mg）、10mMのトリス塩酸
（pH7.2）、20mMの塩化ナトリウム、100mMのEDTAで一度
だけ洗浄し、この緩衝液1ml中に再度懸濁された。この
懸濁液は65℃にされ、65℃の1.6％低温融解アガロース
（InCert agarose,FMC Bioproducts）1mlとパラフィン
オイル4mlに加えられた。懸濁液を渦巻き状にして、直
径25から100μｍのマイクロビーズが作成された（M.McC
lelland、Methods Enzymol.155、22（1987））。ビーズ
は、ImBedキット（New England Biolabs）を用いて、製
造会社の使用指示書に従ってリゾチーム（lysozyme）と
プロテイナーゼＫによって分解された。他社製のリゾチ
ームとプロテイナーゼＫの試薬でも同様な良好な結果が
得られた。ビーズは、４度で貯蔵され、使用直前に50mM
のEDTAで30分間インキュベートされ、25mMのトリス酢酸
（pH7.5）、4mMの酢酸マグネシウム、0.4mMのジチオト
レイトール、0.5mMのスペルミジンで平衡化された。

結果：大腸菌DNAに切断反応を行った結果は、図19に示され
ている。この場合には、２箇所を切断して断片を作成す
るために、１組のオリゴヌクレオチドが加えられた。本
方法の能力を知るために、大きな断片が生成された。図
19Aに示されているように、１つのオリゴヌクレオチド
はuvrB遺伝子と相同であり、もう１つのオリゴヌクレオ
チドはtopA遺伝子と相同であった。オリゴヌクレオチド
はこれらの各遺伝子中に、Eco R I部位を含んでいた。
この２つの遺伝子は、染色体上で520kb離れて位置し（R
udd等、Nucl.Acids Res.18、313（1990））、これらの
２箇所の標的となる配列の間に、少なくとも67箇所のEc
o R I部位が存在する（Kohara等、Cell 50、495（198
7））。図19Bは、予想された520kbのバンドを示してい
る。recAタンパク質モノマーに対する５種類のヌクレオ
チド残基を有するオリゴヌクレオチドの濃度の最適範囲
がかなり明瞭に観察された（レーン２）。これは、図19
Cのサザンブロットにおいてより明瞭に認められる。ブ
ロットの濃度測定では、収率は断片の40％であった。ラ
ムダDNAの切断において見られた様に、オリゴヌクレオ
チドの濃度が低い場合には、メチル化に対してrecAタン
パク質による非特異的な防御作用が存在し、520kbの断
片はより小さな断片に切断された。オリゴヌクレオチド
の濃度が高い場合でも、520kbの断片はより小さな断片
に切断された。これは、図18Bのレーン３におけるラム
ダDNAを用いた結果からも予想されることである。recA
タンパク質モノマーに対する５つのヌクレオチド残基の
最適量に関しては、オリゴヌクレオチドの長さが30塩基
から60塩基に増加しても、同様のパターンを呈した。こ
の場合のみ、20kb断片の収率は60％に増加した。異なる
オリゴヌクレオチドの組み合わせによる40％および60％
の収率は、それぞれ、片側よりの切断の最小効率である
63％、77％に対応する。この値は、ラムダDNAの切断効
率である79％に近似している。

ある種の応用の場合には、Eco R I部位の両側の配列
を知ることは困難である。従って、Eco R Iの認識部位
であるGAATTC配列が、前記の研究の様にオリゴヌクレオ
チドの中間ではなく、１組のオリゴヌクレオチドの５′
末端、あるいは３′末端に存在する場合の断片の収率が
測定された。認識配列がオリゴヌクレオチド（長さ30塩
基）の５′末端に存在した場合には、収率は２ないし４
倍低下した。この配列が３′末端に存在した場合には、
収率はさらに２倍低下した。

実施例15 ヒトDNAの配列に特異的な切断実験の詳細：１×10⁸個の細胞（湿性重量150mg）を燐酸塩緩衝等張
食塩水で２回洗浄し、リゾチームによる分解処理は行わ
ず、それ以外は実施例９の大腸菌ビーズの様に、HeLa細
胞のDNAを含むビーズが調整された。

結果：ヒトDNAに対する切断反応が起こり、切断は同様に成
功した。嚢胞性線維症（cystic fibrosis:CF）の遺伝子
の部位は、広い範囲に渡って同定され配列が決定されて
いるので（Rommons等、Science 245、1059（1989）;Rio
rdan等、Science 245、1066（1989）;Zielenski等、Gen
omics 10、214（1991））、この方法を試験するための
遺伝子部位として用いられた。図20Aは、CF遺伝子部位
の簡略な模式図である。Eco R I部位は、イントロン１
に存在し、エキソン19に存在するもう１箇所のEco R I
部位から180kb離れている。この180kbの長さのゲノムDN
Aの上に、他に少なくとも41箇所のEco R I部位が発見さ
れている（Rommons等、Science 245、1059（1989））。
臭化エチジウムで染色されたゲルが図20Bに示されてお
り、オリゴヌクレオチドの濃度が低下するとより小さな
断片がどのように生成されるかを示している。このパタ
ーンは、再現性が非常に高く、サザンブロット分析を行
わなくてもオリゴヌクレオチドの最適濃度を決定するこ
とが出来た。このゲルのサザンブロット分析は図20Cに
示されている。断片の最高収率はレーン３に認められた
（86％）。レーン２では、収率はより少なくなっている
（32％）が、全体の切断がレーン２においてはレーン３
よりもかなり低下していた。従って、レーン２の180kb
領域から得られたDNAは、恐らくCF遺伝子部位からのDNA
の中で最も濃縮されていたものと思われた。レーンＳに
示された対照は、Sfi Iによる分解によって生成された2
70kbの断片である（Rommons等、Science 245、1059（19
89））。予想されていた48kbの断片も、エキソン13およ
び19における特異的な切断によって生成することが出来
た。

図20Cにおいては、レーン３〜６において180kbの断片
がより小さな断片に更に切断されていたことも認められ
た。これらの断片は、恐らくイントロン１あるいはエキ
ソン19における１箇所の特異的な切断、および断片内部
の非特異的な切断によって生成されたものであろう。エ
キソン19の部位から50kbのプローブを用いたので、50kb
以下の長さの断片はハイブリッド形成しなかったが、50
kb以下の長さの断片が存在すると推定された。

上に記載された全ての参考文献の全内容は、参照する
ことにより本明細書の一部をなすものとする。

本発明のある部分は、明確さと理解を得るために、あ
る程度詳細に記載されている。本技術分野に精通する者
には、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形式お
よび詳細に関して種々の変更が行われ得ることが理解で
きるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者カメリーニ−オテロ，キャロル・エスアメリカ合衆国、20895 メリーランド、ケンジントン、リトルデイル・ロード 3619 (72)発明者フェリン，ランス・ジェイアメリカ合衆国、20852 メリーランド、ロックヴィル、アパートメント・シャープ８、ブランフィールド・コート 12411

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のステップを含む、三本鎖DNA分子の
形成方法。（１）二本鎖DNA分子と、該二本鎖DNA分子の一つの鎖と
十分相補的でありそれとハイブリッド形成できる一本鎖
DNA分子とに、相同組換えタンパク質を接触させ、ここ
で、該接触を、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下において、
該一本鎖DNA分子が該二本鎖DNA分子とハイブリッド形成
して三本鎖DNA分子を形成するような条件下で行い、こ
こで、該ハイブリッド形成が起きている部位において、
該三本鎖DNA分子の各鎖が、すべて該三本鎖DNA分子の他
の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成するステッ
プ。（２）該三本鎖DNA分子を、該相同組換えタンパク質か
ら分離するステップ。
【請求項２】下記のステップを含む、特定部位において
二本鎖DNA分子を切断する方法。（１）該二本鎖DNA分子と、該二本鎖DNA分子の一部と十
分相補的でありそれとハイブリッド形成できる一本鎖DN
A分子とに、相同組換えタンパク質を接触させ、ここ
で、該接触を、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下において、
該一本鎖DNA分子が該二本鎖DNA分子とハイブリッド形成
して三本鎖DNA分子を形成するような条件下で行うステ
ップ、ここで、該ハイブリッド形成が起きている部位におい
て、該三本鎖DNA分子の各鎖がすべて該三本鎖DNA分子の
他の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成し、ここで、該一本鎖DNA分子の一方の末端がそれに結合し
た切断部分を有しており、該末端は該特定切断部位に隣
接している。（２）該切断部分が該特定切断部位において切断作用を
行うような条件下に該切断部分をさらすステップ。
【請求項３】上記組換えタンパク質がバクテリア又はバ
クテリオファージのタンパク質である請求項１又は請求
項２に記載の方法。
【請求項４】上記タンパク質が大腸菌recAである請求項
３に記載の方法。
【請求項５】上記組換えタンパク質が真核細胞のリコン
ビナーゼである請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項６】上記リコンビナーゼタンパク質がヒトのリ
コンビナーゼタンパク質である請求項５に記載の方法。
【請求項７】上記切断部分がキレート剤である請求項２
に記載の方法。
【請求項８】上記切断部分が光によって活性化される色
素である請求項２の方法。
【請求項９】下記のステップを含む、二本鎖DNA分子内
の特定のDNA配列を同定する方法。（１）該二本鎖DNA分子と、該二本鎖DNA分子内に存在す
る特定の配列と十分相補的でありそれとハイブリッド形
成できる一本鎖DNA分子、あるいは、その相補DNAである
一本鎖DNA分子とに、相同組換えタンパク質を接触さ
せ、ここで、該接触を、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下に
おいて、該一本鎖DNA分子が該二本鎖DNA分子とハイブリ
ッド形成して、三本鎖DNA分子を形成するような条件下
で行うステップ、ここで、該ハイブリッド形成が起きている部位におい
て、該三本鎖DNA分子の各鎖はすべて該三本鎖DNA分子の
他の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成し、ここで、該一本鎖DNA分子は、それに結合した検出可能
な標識を有している。（２）該三本鎖DNA分子を、ハイブリッド形成しなかっ
た一本鎖DNA分子から分離するステップ。（３）該三本鎖DNA分子に結合した標識を検出するステ
ップ。
【請求項１０】少なくとも一箇所の制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位を有する二本鎖DNA分子を該制限酵素によ
る切断から防御する方法であって、該二本鎖DNA分子と、少なくとも一箇所の制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を含む該二本鎖DNA分子の一方の鎖
のある部分と十分相補的でありそれとハイブリッド形成
できる一本鎖DNA分子とに、相同組換えタンパク質を接
触させるステップを含み、ここで、該接触は、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下におい
て、該一本鎖DNA分子と該二本鎖DNA分子がハイブリッド
形成して、三本鎖DNA分子を形成するような条件下で行
い、ここで、該ハイブリッド形成が起きている部位におい
て、該三本鎖DNA分子の各鎖はすべて該三本鎖DNA分子の
他の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成する上記方
法。
【請求項１１】二本鎖DNA分子の一つの鎖に存在する特
定の遺伝子配列の転写を抑制する方法であって、該二本鎖DNA分子と、該遺伝子配列と十分相補的であり
それとハイブリッド形成できる一本鎖DNA分子とを、相
同組換えタンパク質に接触させることを含み、ここで、
該接触は、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下において、該一
本鎖DNA分子が該遺伝子配列とハイブリッド形成して、
三本鎖DNA分子を形成するような条件下で行い、ここで、該ハイブリッド形成が起きている部位におい
て、該三本鎖DNA分子の各鎖がすべて該三本鎖DNA分子の
他の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成する上記方
法。
【請求項１２】下記のステップを含む、試料中に存在す
る特定の二本鎖DNA分子を選別する方法。（１）該二本鎖DNA分子と、該二本鎖DNA分子中に存在す
る特定の配列と十分相補的でありそれとハイブリッド形
成できる一本鎖DNA分子とに、相同組換えタンパク質を
接触させるステップ、ここで、該接触は、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下におい
て、かつ、該一本鎖DNA分子が該二本鎖DNA分子にハイブ
リッド形成し、三本鎖DNA分子を形成する条件下で行
い、ここで、該ハイブリッド形成が起きている部位におい
て、該三本鎖DNA分子の各鎖がすべて該三本鎖DNA分子の
他の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成し、該一本
鎖DNA分子は、それと結合した結合対の一方をもつ。（２）該三本鎖DNA分子を、ハイブリッド形成していな
い一本鎖DNA分子から分離するステップ。（３）該三本鎖DNA分子を、該結合対の他方と接触させ
るステップ（４）該結合対の他方と結合した該三本鎖DNA分子を単
離するステップ。
【請求項１３】下記のステップを含む、少なくとも二箇
所の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有する二本鎖DN
A分子を、該部位のうちの一部位で該部位に特異的な制
限酵素によって切断する方法。（１）該二本鎖DNA分子と、制限エンドヌクレアーゼ認
識部位の該一部位を含む該二本鎖DNA分子の一方の鎖の
一部分に十分相補的でありそれとハイブリッド形成でき
る一本鎖DNA分子とに、組換えタンパク質を接触させる
ステップ、ここで、該接触は、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下におい
て、該制限エンドヌクレアーゼ認識部位の該一部位にお
いて、該一本鎖DNA分子が該二本鎖DNA分子とハイブリッ
ド形成して、該三本鎖DNA分子を形成するような条件下
で行い、ここで、該ハイブリッド形成が起きている部位におい
て、該三本鎖DNA分子の各鎖がすべて該三本鎖DNA分子の
他の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成する。（２）該制限酵素から防御するため、該認識部位の少な
くとも一方を修飾するステップ。（３）該二本鎖DNA分子から該一本鎖DNA分子を解離させ
るステップ。（４）該制限酵素認識部位の該一部位において、ステッ
プ（３）で残った該二本鎖DNA分子を切断するステッ
プ。
【請求項１４】下記のステップを含む、二本鎖DNA分子
の配列を遺伝子修飾剤による修飾作用から防御する方
法。（１）二本鎖DNA分子と、該二本鎖DNA分子の該配列に十
分相補的でありそれとハイブリッド形成できる一本鎖DN
A分子とに、組換えタンパク質を接触させ、ここで、該接触を、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下におい
て、該一本鎖DNA分子が該二本鎖DNA分子とハイブリッド
形成して、三本鎖DNA分子を形成するような条件下で行
い、ここで、該ハイブリッド形成が起きている部位におい
て、該三本鎖DNA分子の各鎖がすべて該三本鎖DNA分子の
他の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成するステッ
プ。（２）該三本鎖DNA分子に、該三本鎖DNA分子が変化しな
いような条件下で、該遺伝子修飾剤を接触させ、該配列
を修飾から保護するステップ。
【請求項１５】下記のステップを含む、少なくとも二箇
所の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む二本鎖DNA
分子を、該制限エンドヌクレアーゼ認識部位の一部位に
おける該制限エンドヌクレアーゼによる切断から防御す
る方法。（１）該二本鎖DNA分子と、該一制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を有する該二本鎖DNA分子の一方の鎖のある
部分と十分相補的でありそれとハイブリッド形成できる
一本鎖DNA分子とに、組換えタンパク質を接触させ、ここで、該接触は、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下におい
て、かつ、該制限エンドヌクレアーゼ認識部位の該一部
位において、該一本鎖DNA分子が該二本鎖DNA分子とハイ
ブリッド形成して、三本鎖DNA分子を形成する条件下で
行い、ここで、該ハイブリッド形成が起きている部位に
おいて、該三本鎖DNA分子の各鎖がすべて該三本鎖DNA分
子の他の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成するス
テップ。（２）該三本鎖DNA分子がそのまま残るような条件の下
で、該制限エンドヌクレアーゼに該三本鎖DNA分子を接
触させるステップ、ここで、該制限エンドヌクレアーゼ
認識部位の該一部位が切断から防御される。
【請求項１６】ステップ（１）の上記接触の間、ATP−
γ−Ｓ及びADPがモル比約1:3で存在する請求項１〜15の
いずれか一に記載の方法。
【請求項１７】ステップ（１）の上記接触の間、ADPが
濃度約1.1mMで存在する請求項１〜15のいずれか一に記
載の方法。
【請求項１８】ステップ（１）の上記接触の間、ATP−
γ−Ｓが濃度約0.3mMで存在する請求項１〜15のいずれ
か一に記載の方法。
【請求項１９】マグネシウム及び／又はスペルミジンの
存在下において、ステップ（１）の上記接触を行う請求
項１〜15のいずれか一に記載の方法。
【請求項２０】マグネシウムの濃度が少なくとも4mMで
ある請求項19に記載の方法。
【請求項２１】二本鎖DNA分子の一方の鎖に存在するあ
る特定の配列の転写及び複製を抑制する方法であって、
該二本鎖DNA分子と、該配列と十分相補的でありそれと
ハイブリッド形成できる一本鎖DNA分子とに、組換えタ
ンパク質を接触させ、ここで、該接触は、ATP−γ−Ｓ及びADPの存在下におい
て、該一本鎖DNA分子が該遺伝子配列とハイブリッド形
成して、該三本鎖DNA分子を形成する条件下で行い、ここで、該ハイブリッド形成が起きている部位におい
て、該三本鎖DNA分子の各鎖がすべて該三本鎖DNA分子の
他の少なくとも一つの鎖とハイブリッド形成し、それに
よって該配列の転写及び複製を抑制する上記方法。