JPH06500926A - Ｄｎａに標的を定める方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡに標的を定める方法 これは、１９９０年１１月９日に出願された出願第０７７６１１゜２６８号の部 分継続出願であり、前記出願は、参照することにより本明細書に包含されている 。

友ｌ尻二遣１ 技術分野 本発明ハ、一般に、二本鎖（ｔｒｉｐｌｅｘ）　ＤＮＡを形成す明は更に、ＤＮ Ａに標的を定める方法、特にＤＮＡの特定の配列に標的を定める方法に関する。

背景情報 最近、幾つかのグループが、特定の配列においてゲノムＤＮＡを切断する効率の 高い方法を報告している。例えば、５ｚｙｂａｌｓｋｉと共同研究者達は、導入 された工つののゲノムを切断した（　Ｋｏｏｂ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２５０．２ ７１　（１９９０））。彼らは、塗しブレ・ソサを用いて匡オペレータをメチル 化から守り、最初にＤＮＡのＨａｅ　Ｉｆ部位をメチル化した。メチラーゼとレ プレッサが不活化されると、修飾されず、切断可能な唯一のＨａｅ　ＩＩ部位は 、屡オベレータ部位であった。この方法の利点は、収率が高く、特異性が高い事 であった。欠点は、匡オペレータ部位においてしか切断できない事であった。

第二の方法は、数名の研究者によって、サツカロミセスセレビシェ菌の様に大き なゲノムの切断に用いられた。この方法は、合成ホモピリミジンオリゴヌクレオ チドが二重ホモピリミジン−ホモプリンの束をアニールし、三重らせん構造を形 成できる性質を利用したものである。この方法は、最初にＭｏ５ｅｒとＤｅｒｖ ａｎ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８．６４５　（１９８７））によって用いられ、 オリゴヌクレオチドにＥＤＴＡ−Ｆｅ切断部分を導入する事によって、プラスミ ドを切断するものであった。続いて、別の切断部分が、ホモピリミジンオリゴヌ クレオチドに付着させられた。例えば、５ｃｈｕｌｔｚおよび共同研究者達は、 ブドウ球菌由来のヌクレアーゼ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｎｕｃｌｅａ ｓｅ）　を　（Ｐｅｉ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 ８７．　９８５８　（１９９０））、Ｈａｌｅｎｅと共同研究者達は、フェナン トロリン−銅誘導体を（Ｆｒａｎｃｏｉｓ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄＳｃｉ、　ＵＳＡ　８６．９７０２　（１９ｇ９））を、切断部分として付着 させた。Ｄｅｒｖａｎと共同研究者達も、グアニンの多い切断オリゴヌクレオチ ドを用いて、三重構造を形成しくＢｅａｌ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２５１．１３６ ０　（１９９１））、上述の三重構造とメチル化防御方法を用いてＤＮＡを切断 した（Ｓｔｒｏｂｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ　３５０．１７２　（１９９１））。こ の標的を定める方法の利点は、効率か高く、様々な誘導体の付いたオリゴヌクレ オチドを使用できる事である。欠点は、７　ホモピリミジンまたはグアニンの多 いオリゴヌクレオチドを使用した場合しか成功していない点である。

特定のＤＮＡ配列において可能な切断部位は、僅かであるか、実際には完全に欠 如しているために、過去に報告された方法の実際の使用は、非常に限定されてい る。

これに対して、本発明は、目的の部位または部位の対においてＤＮＡを切断する 一般的な方法を提供するものである。しかし、部位に特定的な切断は、本発明の ひとつの実施例に過ぎない。広い意味で言えば、切断、防御、強化の何れのため であろうと、本発明はどの様な配列であべ　目的とする配列に特異的かつ効率的 に標的を定める方法に関するものである。

＆豆二１名 二本鎖ＤＮＡの形成方法を提供する事が、本発明の一般的目的である。

ＤＮＡ含有試料における特定のＤＮＡ配列の存在を同定する方法を提供する事が 、本発明のもう１つの目的である。

特定の遺伝子配列の転写抑制法を提供する事が、本発明のもう１つの目的である 。

例えば、切断、防御、または強化を目的として、ＤＮＡの特定の配列に標的を定 める迅速かつ効率の高い一般的方法を提供する事が、本発明のもう１つの目的で ある。

本発明は、三本＠　ＤｌｆＡ分子の形成方法に関するものである。ここで、二本 鎖ＤＮＡ分子の各鎖は、二本鎖ＤＮＡ分子の少なくとも他の一つの鎖に対合（ｈ ｙｂｒｉｄｉｚｅ、すなわち、非共有結合）している。この方法は、二本鎖ＤＮ Ａ分子およびその二本鎖ＤＮＡ分子の一つの鎖に対して十分に相補的な一本鎖Ｄ ＮＡ分子へと、組換えタンパク質を接触させて、ハイブリッド形成させることか らなる。

この接触は、−重鎖ＤＮＡ分子が、二本鎖ＤＮＡ分子とハイブリッド形成して二 本鎖ＤＮＡ分子が形成される様な条件下において行われる。

更なる目的と利点は、以下の報告を読む事によって明らかとなるであろう。

゛　の　な舌日 図工は、リコンビナーゼ（ｒｅｃｏｒｎｂｉｎａｓｅ）タンパク質によって直鎖 状二本鎖ＤＮＡと相同の環状一本鎖ＤＮＡとの間で形成される２種類の結合分子 構造の可能性を示している。上の図では、結合分子（ｊｏｉｎｔ　ｍｏｌｅｃｕ ｌｅ）は、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ　（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ）と置換 された遊離−重鎖を有している。置換された一本鎖が存在すると、分枝点移動（ ｂｒａｎｃｈ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が起こり、ヘテロ二本鎖部分が短い場合に は、結合部分が迅速に解離してしまう事となる。下の図では、安定した結合分子 であり、三本の鎖は追加の非共有結合性の相互作用によって連合しており、分枝 点移動は起こり得ない。

三本の鎖の配列は図式的なものに過ぎず、開始二本鎖結合が切れていることを意 味しているのではない。

図２は、短い相同関係を用いてリコンビナーセが結合分子を形成する事を示して いる。Ａには、結合分子分析に使用されたｐＧｅｍ　４の直鎖状二本鎖基質の部 分地図が示されている。四角部分は、Ｍ１３ｍｐ１８と相同の領域を示している 。二本鎖の右のポリリンカー領域の数字は、ｐＧｅｍ４がそれら各部位において 直線化された場合、Ｍ１３ｍｐ１８−重鎖ＤＮＡとの組合せに利用できる相同領 域の長さを示している。Ｂ−Ｄにおいては、ｐＧｅｍ　４直鎖状二本鎖とＭ１３ ｍｐＨｌｌウィルス鎖状ＤＮＡとＨｅＬａリコンビナーゼ分画（図２Ｂ）、また はショウジョウバエリコンビナーゼ分画（ｅ　２Ｃ）、または大腸菌ｒｅｃＡと ＳＳＢタンパク質（図２Ｄ）を用いた結合分子分析が、下記の実施例のセクショ ンに示す様に実施され、ＳＤＳを添加して除タンパク（ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚ ａｔｉｏｎ）が行われた。対合に利用できる相同領域の長さが示されている。レ ーンＣ１対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＤＮＡが単独でインキュベートされた：レー ン１、Ｈｉｎｄ　ｍ−直線化されたｐＧｅｍ　４：　レーン２、Ｓａｌ　Ｉ−一 直線化れた二本鎖：レーン３、ＢａｌＸ１旧−直線化された二本鎖：　レーン４ 、Ｋｐｎ　Ｉ−一直線化れた二本鎖：　レーン５、Ｅｃｏ　Ｒ１一直線化された 二本鎖、レーン６、Ｈｉｎｄ　ｍとＥｃｏ　ＲＩの両者で分解された二本鎖（図 ２ＢおよびＤ）または結合対照、二本鎖単独（図２Ｃ）。

図３は、新しい結合分子分析を示している。Ａは、直鎖状二本鎖ＤＮＡと相同の ３２ｐで標識されたオリゴヌクレオチドの間の結合分子形成図である。Ｂでは、 結合分子分析が、３７℃で１０分間、ＨｅＬａリコンビナーゼ分画と１０Ｏｎｇ の旧ｎｄ　ｍ−直線化ｐｄｅｌ　９の二本鎖と５ｎｇの３２ｐ標識された相同の 長さが３３塩基のオリゴヌクレオチド（レーン１）、長さが２０塩基のオリゴヌ クレオチド（レーン３）または長さが１３塩基のオリゴヌクレオチド（レーン５ ）を用いて実施された。試料は、１％のＳＤＳで除タンパクされた。レーン２． ４．６における対照実験は、可能性として存在するエキソヌクレアーゼ汚染によ る結合分子形成が認められない事を証明している。二本鎖とオリゴヌクレオチド （３３−ｍａｒ（塩基３３個のオリゴヌクレオチド）、レーン２．２０−ｍｅｒ （塩基２２個のオリゴヌクレオチド）、レーン４．１３−ｍｅｒ（塩基１３ｍの オリゴヌクレオチド）、レーン６）は、別々にリコンビナーゼと３７℃でインキ ュベートされ、１％のＳＤＳに入れられてから、６５℃でアニールされ、氷上で 急冷せずに、室温で電気泳動にかけられた。

この様なアニーリング条件において、３３個または２０個の塩基対の長さのＤＮ Ａ二本鎖を形成する事かでき、これらは安定である。

図４は、結合分子の熱安定性を示している。Ａは、短い二本鎖領域、■１　分枝 点移動構造（ｂｒａｎｃｈ　ｍｉｇｒａ−ｔｉｏｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、 ■、リコンビナーゼによって形成され、除タンパク（ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚｅ ）された結合分子、■、の相対的熱安定性を決定する図。Ｂ０短い二本鎖、分枝 点移動構造、３８の塩基対の長さの共有相同領域を含む結合分子についての熱安 定性分析から得られた代表的データ。結合分子は、ＨｅＬａリコンビナーゼ分画 によってＭ１３ｍｐ１８−重鎖ＤＮＡとＳａｌ　Ｉ−直線化ｐＧｅｍ　４二本鎖 ＤＮＡの間で形成され、ＳＤＳを加えて除タンパクされた。

二本鎖と分枝点移動構造の両者の安定性が、アガロースゲル電気泳動後に、Ｍ１ ３ｍｐ１９一本＃ＡＤＮＡの位置において３２ｐ標識の移動が無い事によって、 モニターされた。

図５は熱安定性のデータをまとめたものである。実施例のセクションにおいて述 べる様に、１３．２６．３８．５６の塩基対の相同領域を有する短い二本鎖、分 枝点移動構造、結合分子について熱安定性分析が実施された。

５０％以上が解離した温度である。１３塩基対の二本鎖は３７℃で不安定なため 、対応する１３塩基対分枝点移動構造の安定性は、決定されなかった。

図６は、三本の無傷のＤＮＡ鎖を有する安定した結合分子を示している。Ａは、 ｐＧｅｍ　４のプラス鎖の３゛末端に独特の３２ｐ標識を有し、Ｍ１３ｍｐ１８ と５６塩基対の相同性を共有するＨｉｎｄｌＩ［−Ｂｇｌ　Ｉ断片から形成され た結合分子。Ｂは、ｒｅｃＡタンパク質によって形成された３２ｐ標識された結 合分子の熱安定性分析。Ｃは、大腸菌ｒｅｃＡタンパク質（黒丸）、ＨｅＬａリ コンビナーゼ分画（白丸）、対応する５６塩基対分枝点移動構造（三角）によっ て形成された３２Ｐ標識された結合分子の相対的熱安定性の比較。

図７は、ｒｅｃＡタンパク質が存在しない状態の安定した結合分子を示している 。Ａでは、ｒｅＣＡによって形成された結合分子は、実施例のセクションに記述 されている様に、除タンパクされ、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で残 ったｒｅｃＡタンパク質が分析され、続いて抗ｒｅｃＡ抗体と１２５１標識二次 抗体を用いるウェスタンプロット分析が行われた。レーン１〜５は、それぞれ、 ５ｎｇ。

ｌｎｇ、　０．５ｎｇ、　０．２ｎｇ、　０．１ｎｇの精製大腸菌ｒｅｃＡタン パク質である：レーン６は、５つの分析の除タンパクされた結合分子全てである 。レーン７は０．２ｎｇの精製ｒｅｃＡタンパク質である。Ｂは、除タンパクさ れた結合分子の熱安定性を示す。レーン１は、ＤＮＡ基質のみ；レーン２は、ｒ ｅｃＡと反応させ、ＳＤＳとＥＤＴＡで反応を止められ、アガロースゲルに直接 載せられた結合分子の分析：レーン３〜７は、図４に示されている様に除タンパ クされた結合分子の熱安定性分析である。ｄｓとｓｓは、二本鎖と一本鎖ＤＮＡ の可動性をそれぞれ表している。

図８は、リコンビナーゼタンパク質によって形成された三重らせんの対合の図式 を提唱するものである。Ａは、主要な溝において、３番目の鎖が相同の二本鎖と 対を形成している。二本鎖は、実線で示されるワトソンークリック塩基対を持っ ている。二本鎖のワトソン（Ｗ）またはクリック（Ｃ）Ｍのどちらかのプリンと ３番目の鎖とが関与している非ワトソンークリック対が点線で示されている。影 の部分は、各鎖の燐酸塩骨格を表している。

３番目の鎖が、同一のワトソン鎖に平行である事に注意されたい。Ｂは、考えら れる４種類全ての塩基トリプレットに関する提唱された水素結合図。３木目の鎖 のシトシン残基は、Ｎ３位でプロトン化され、２つの水素結合を形成する事がで きる。

図９は、対合複合体（ｓｙｎａｐｔｉｃ　ｃｏｍｐｌｅｘ）と安定した結合分子 が形成される図である。二本鎖ＤＮＡと相同のオリゴヌクレオチドが大腸菌ｒｅ ｃＡタンパク質の存在下にインキュベートされ、対合複合体を形成する。この対 合複合体において、２個のＤＮＡは、ｒｅｃＡ核タンパク質のフィラメントの中 で対となっている。対合複合体の形成は、対になっている領域内で制限エンドヌ クレアーゼが二本鎖を切断できない事によって、モニターされる。ＳＤＳ洗剤の 添加によってｒｅｃＡタンパク質が対合複合体から除去されると、安定な除タン パクされた結合分子を生じる。

図１０は、ｒｅｃＡによって形成される対合複合体と結合分子に関するものであ る。図１０Ａは、Ｓａｃ　Ｉの部位をわたるｐＵｃ１８二本鎖ＤＮＡに相同の５ ６．３８．２６．２０の塩基を有するオリゴヌクレオチドに関する。図１０Ｂは 、ｒｅｃＡによって形成される対合複合体に関する。３２ｐ標識されたオリゴヌ クレオチド、ｐＵＣ１８のスーパーコイル・プラスミドＤＮＡ、　ｒｅｃタンパ ク質が共にインキュベートされた。適切な制限エンドヌクレアーゼとインキュベ ーション後、反応物質は１％のＳＯ５に加えられ、臭化エチジウムを含む１％ア ガロースゲル上で電気泳動にかけられた。

対合複合体の存在形跡は、制限エンドヌクレアーゼとのインキュベーション後に 残るスーパーコイル・ブラスミドＤＮＡの存在によって表される。図１０Ｃは、 ｒｅｃＡによって形成される結合分子に関する。同じアガロースゲルのオートラ ジオグラフは、スーパーコイル・プラスミドＤＮＡの位置に３２ｐ標識の移動が 認められる事から、結合分子の形成を証明している。１は直鎖状二本鎖であり、 ＳＣはスーパーコイル二本鎖を示す。

図１１は、直鎖状二本鎖との対合複合体の形成に関する。図１１Ａは、ＤＮＡ基 質の地図である。直鎖状ｐＢＲ３２２二本鎖と相同の３３塩基のオリゴヌクレオ チドとＣ１ａ　Ｉ部位の位置を示している。図１１Ｂは、直鎖状二本鎖を用いた 対合複合体の分析である。非相同のオリゴヌクレオチドは、６２２８−６２６０ の位置に対応するＭ１３ｍｐ１ｇ配列である。

Ｈは相同の３３塩基のオリゴヌクレオチドであり、ＮＨ（Ｎ）は非相同の３３塩 基のオリゴヌクレオチドを示す。

図１２は、対合複合体の制限エンドヌクレアーゼの存在形跡が認められる範囲に 関する。対合複合体は、ｒｅｃＡの存在下に、相同の２０塩基オリゴヌクレオチ ドとｐＵＣ１８二本鎖ＤＮＡによって形成された。複合体は、切断部位が矢印で 示されている種々の制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートされた。対合 複合体による切断の防御は、Ｓａｃ　１位置とｓｐｈ　１位置の部位に及んだ。

Ｅｃｏ　ＲＥまたはＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位においては、防御作用は認められなか った。数字は、オリゴヌクレオチドの末端から近位切断部位までの長さを示して いる。

図１３は、対合複合体と結合分子の形成に対する方向性の影響に関する。図１３ Ａは、ｐＵｃ１８のポリリンカー領域と完全に相同であるか、あるいは更に非相 同の配列を、５°と３°位末端のどちらか、あるいはその両者に持っている５６ 塩基オリゴヌクレオチド。図１３Ｂは、ｒｅｃＡタンパク質による対合複合体の 形成は、−重鎖の５°または３°位末端、または内側の部位で開始できることを 示す。３２ｐ標識されたオリゴヌクレオチドを用いて対合複合体の分析が行われ た。レーン１において直鎖状ｐＵｃ１８のすぐ上に移動しているバンドは、開始 基質内に存在した切断された二本鎖を表している。図１３Ｃは、結合分子形成に おいて、−重鎖の５°末端で相同であると形成に有利に働くことを示す。対合複 合体分析が、ＳＤＳの添加によって除タンパクさべ　次に電気泳動とオートラジ オグラフィが行われた。レーン１〜８は、上のＢのレーン４〜１１に対応してい る。ｌは直鎖状二本鎖を、ｓｃはスーパーコイル二本鎖を示す。

図１４は、相同対を探索するための最小単位に関する。

図１４Ａでは、３３．１５．１３塩基の長さのオリゴヌクレオチドがｐＢＲ３２ ２と相同である。二本鎖におけるＥｃｏ　Ｒ１（Ｅ）、Ｃ１ａ　Ｉ（Ｃ）、Ｈｉ ｎｄ　ｍ　（Ｈ）の制限エンドヌクレアーゼ部位の位置が示されている。図１４ Ｂは、１５塩基オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と、Ｃ１ａ　ＩとＨｉｎ ｄ　ＩＩＩの切断位置を示す対応する二本鎖配列とを示す。Ｃ１ａ　ＩとＨｉｎ ｄｍの認識配列の全てまたは一部で構成されている二本鎖の塩基が太字で示され ている。図１４Ｃは、１５塩基の長さのオリゴヌクレオチドを用いる対合複合体 の形成を示す。上述の様に１５塩基オリゴヌクレオチドを用いて対合複合体か形 成された。レーン２〜４は、Ｈｉｎｄ　ｍと共にインキュベーションしたもので あり、レーン５〜７は、Ｃ１ａ　Ｉと共にインキュベーションしたもの、レーン ８〜１０は、Ｅｃｏ　Ｒ１と共にインキュベーションしたものである。

図１５において、ｒｅｃＡは、二本鎖ＤＮＡの１らせん反復単位以下の長さにわ たって対合する。図１５Ａは、Ｌ系列のオリゴヌクレオチドによる対合複合体の 形成に関する。

結果は、３つの独立した観察項目の平均値を表している。

二本鎖のパーセント防御値は、二本鎖ＤＮＡとｒｅｃＡを含む対照反応に対して 補正されている。誤差を示す縦線は、平均値の標準誤差を示している。図１５Ｂ は、Ｒ系列（実線）による対合複合体の形成に関する。結果は、４つの独立した 測定結果の平均値を表している。比較のために、対応するし系列のデータ（点線 ）が示されている。

少数の対合複合体の検出と定量化は、これらの実験においては、２００ｎｇの二 本鎖ＤＮＡを用いる事によって、容易となった。

図１６は、ｒｅｃＡの組合せ反応の特異性に関する。図１６Ａでは、Ｍ１３ｍｐ １８に相同の３０塩基のオリゴヌクレオチドは、二本鎖における３つのＮｄｅ　 Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（Ｎ）の１つを含んでいる。オリゴヌクレオチド の配列は、５’ＴＡＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＴＧ Ｃ３°である。

Ｎｄｅ１部位は太字で示されている。図１６Ｂによれば、ｒｅｃＡは、二本鎖内 の相同部位に対合複合体形成を効率よく行う。対合複合体分析において、３０塩 基のオリゴヌクレオチドが、二本＃ｊ［ＤＮＡおよびｒｅｃＡと共にインキュベ ートされ、次にＮｄｅＩと共にインキュベートされた。大きさのマーカー（Ｍ） は、ラムダＨｉｎｄ　ｍとパイＸ　１７４　Ｈａｅ■断片である。レーン６では 、Ｂａｍ旧で分解されたＭ１３ｍｐ１８二本鎖ＤＮＡが全長７．２ｋｂの直鎖状 断片を生成する。

はっきりさせるために、臭化エチジウムによって染色されたゲルは、コントラス トを逆転して表しである。

図１７は、ＤＮＡの配列の特異的な切断に用いられる方法のダイアグラムである 。本ダイアグラムは、１つの部位での切断を示している。

図１８において、図１８Ａは、太い矢印が示す部位と相同のオリゴヌクレオチド を用いたラムダＤＮＡの切断の部位を示すダイアグラムである。ラムダＤＮＡは 、太い矢印で示される１つを含む５つのＥｃｏＲ１部位を含んでいる。図１８Ｂ は、ラムダＤＮＡの配列に特異的な切断を示す臭化エチジウムで染色された寒天 ゲルを示す。レーン２は、完全な切断反応を示し、その他のレーンは示されてい る様に欠如した成分があった。メチル化されないラムダＤＮＡは、ｒｅｃＡタン パク質と、３１，７３４から３１，７６３位置のラムダ配列と同じ、３０塩基の 長さのオリゴヌクレオチドと共にインキュベートする事によって、まず保護され た。

配列は、５−ＴＣＡＣＧＣＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＧＧにＴＴＣ −３’であった。３７℃、１０分間のインキュベーション後、最小容量のＥｃｏ 　Ｒ１メチラーゼとＳ−アデノシルメチオニンか加えられ、反応が２０分間続け られた。次に、ｒｅｃＡタンパク質とメチラーゼが６５℃で１５分間加熱する事 によって不活化された。３７℃で試験管にＥｃｏ　Ｒ１制限酵素が加えられ、反 応が６０分間継続された。反応容積は４０μｍで、次の順番で加えた以下の物質 を含んでいた。２５ｍＭのトリス酢酸塩（ｐＨ７，５）、４ｍＭの酢酸マグネシ ウム、０，４ｍＭ（７）ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ） 、０　、５ｍＭのスペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１０μｇのｒｅＣＡ タンパク質、１００μＭのＥＧＴＡ、１　、１　ｍＭのＡＤＰ、０　、３ｍＭの ＡＴＰ−ガン−ｖ−５（ＦＩｕｋａ　ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ）、０．１８／ｌ　 ｇのオリゴヌクレオチド、０．９μｇのラムダＤＮＡ、４μｇのアセチル化牛血 清アルブミン（ＢＳＡ）、３．８単位のＥｃｏ　Ｒ１メチラーゼ、１２０μＭの Ｓ−アデノシルメチオニン、２０単位のＥｃｏ　ＲＩ制限酵素（ラムダＤＮＡ以 下に記載された試薬は全て、Ｎｅ、ｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社から入 手した）。トリス酢酸塩、ジチオトレイトール、スペルミジン、最終ｒｅｃＡタ ンパク質精製段階で使用された緩衝液は、Ｃｈｅｌｅｘ　１００　（Ｂｉｏ−Ｒ ａｄ）カラムを通過させ、微量の金属汚染を除去した。反応は、５μｍの６％ド デシル硫酸ナトリウム（５ＤＳ）、９０ｍＭのＥＤＴＡ、　０．１％ブロモフェ ノールブルーを用いて、停止した。

２０μ工の最終反応混合物を、６５℃で、６０μｍの０５％ＩｎＣｅｒｔアガロ ースと混合し、１．５％のアガロースゲルのウエルニ入れた。ゲルを、ＣＨＩＥ Ｆ−ＤＲＩＬＬシステム（Ｂｉ。

−Ｒａｄ）により、３６時間、１２℃、ｔ　ｓ　ｏ　ｖ、切替え時間２．５秒の パルスフィールド電気泳動にかけた。

図１９において、図１９Ａは、ｕｖｒＢおよび座ハ遺伝子の部位と相同の２つの オリゴヌクレオチドを用いる大腸菌染色体の切断部位を示す図である。図１９Ｂ は、臭化エチジウムによって染色されたアガロースゲルで、大腸菌ＤＮＡが特定 の配列で切断され、５２０ｋｂの断片が生産された事を示している。ゲルのコン プレッションゾーン（Ｃ）も示されている。レーンＹは、サツカロミセスセレビ シェ菌染色体ＤＮＡのマーカーである。レーンλは、ラムダコンカテ？　−ＤＮ Ａラダー（ｌａｍｂｄａ　ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ　ＤＮＡ　１ａｄｄｅｒ）、レ ーンＥは、Ｅｃｏ　Ｒ１による完全な分解後に変化しない大腸菌ＤＮＡである。

レーン１〜５は、各レーン毎にオリゴヌクレオチドの量が異なる場合の完全な切 断反応である。■リオリゴヌクレオチドの配列は、５°−ＴＣＡＴＧＡＧＴＡＡ ＡＣＣＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＴＴＴＡ−３’　（３６塩基の 長さ）、包Ｂオリゴヌクレオチドの配列は、５−ＣＧＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＧＧ ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＴＴＡＡ−３’　（３０塩基の長さ）であった。反応 条件は、アガロースに埋め込まれたＤＮＡについて良好な結果を得るために以下 の条件が改変された以外は、図１８の反応条件と類似していた。ｒｅｃＡタンパ ク質とオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡと共に３７℃で１５分間、前インキュベー トされ、メチラーゼとＳ−アデノシルメチオニンが添加され、メチル化が１時間 継続された。

１００μｌの２％ＳＤＳを３７℃で３０分間加える事によって、メＷｉｌｓｏｎ とＨｏｆｆｍａｎ　（Ｗｉｌｓｏｎ等、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９１、 片のポリメラーゼ連鎖反応増大（ＰＣＲ）によって作られた。ｕ戸遺伝子は、ｕ ｖｒＢとｙ遺伝子の間（こある。フィルムは露出オーバーにして微小なｌくンド を検出したが、デンシトメトリーは、露出のより少な０フィルムで実施した。レ ーン１〜５と同じ量のＤＮＡを含んで０たレーンＥは、予測された完全なＥｃｏ ＲＩ分解によって産生さンドの強度を１００％値として、５２０ｋｂ断片の収率 を計算しン１９の部位と相同の２つのオリゴヌクレオチドを用いたヒトＣＦ座の 切断位置を示す図である。遺伝子は、合計２４のエキソンを含んでいる。図２０ Ｂは、オリゴヌクレオチド濃度の減少に伴い、より小さなりＮＡ断片が出現する は、　５°−ＴＡＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＧＡＣＴＧＡＡ ＴＴＣＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＧＧＧＴＡＧＧＴＡＧ−３’　（６ ０塩基の長さ）、エキソン１９のオリゴヌクレオチド配列は、５−ＡＡＴＧＧＣ ＣＡＡＣＴＣＴＣＧＡＡＡＧＴＴ　ＡＴＧＡＴＴ　ＡＴＴＧＡＧＡＡ　ＴＴ　Ｃ ＡＣＡＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧ　ＡＴＧＡＣＡＴ　ＣＴＧＧいるエキソンエ３の 塩基４１０個を含んでいた。

聾」類似体、およびバクテリオファージＴ４　ｕｖｓＸタンパク質等がある。真 核生物由来のタンパク質も報告されており、上に参照されている。

本発明の二本鎖は、リコンビナーゼタンパク質を除去した場合でも安定である。

二本鎖の相補鎖は、どの様な塩基配列でも持つ事ができ、−末鎖分子は、二本鎖 の僅か１３個の塩基と相補性を有すれば安定した二本鎖を形成する事ができる。

本技術分野に通じた者は、相同性の塩基対の必要最小数が、使用されるリコンビ ナーゼタンパク質によって異なる事を認識するであろう。例えば、ヒトおよびシ ョウジヨウバエのリコンビナーゼは、僅か約１３塩基対の相同性を認識し、大腸 菌ｒｅｃＡが３８塩基対の相同を認識する。

本法での使用に適したリコンビナーゼタンパク質は、精製されたもの、あるいは 部分的に精製されたものであってよい。上述の様に、ヒト細胞およびショウジヨ ウバエの細胞等のリコンビナーゼタンパク質源から、実施例のセクションで引用 されている方法を用いて酵素の単離が可能である。ほかのリコンビナーゼタンパ ク質源には大腸菌がある。利用に適したリコンビナーゼの最適濃度は、本技術分 野に通じた者によって、容易に決定され得る。

本発明はまた、配列に特異的な方法でＤＮＡを切断する方法に関する。現在、こ の技術は、利用可能な制限エンドヌクレアーゼの生物学的種類の数により、限定 されている。配列に特異的な切断の範囲を拡大するために、幾つかのグループが 、ＤＮＡの化学的切断部分が付いたホモピリミジンオリゴヌクレオチドを使用し て、目的部位を切断することを試みている。この方法の理論的根拠は、第三の鎖 かピリミジン類だけで構成され、標的となる二本鎖の配列かホモプリン鎖とホモ ピリミジン鎖の「相補的」な部分を含んでいれば、二本鎖ＤＮＡ形成が容易であ る事である。この二本鎖のハイブリッド形成か行われると、第三の鎖の末端に付 （Ｆｅ−ＥＤＴＡまたはＣｕ−７ｚナンドロリン（Ｃｕ−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏ ｌｉｎｅ）といった化学的部分が、目的の二本鎖ＤＮＡの切断を行う（Ｄｒｅｙ ｅｒ等、　１９８５、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８２． ９６ｇ−９７２参照）。

配列に特異的な切断の範囲は、組換えタンパク質の存在下で、どの様な配列（す なわち、１本の鎖にプリン類とピリミジン類の両方を順番を限定する事なく含む もの）の第３の鎖でも、相同の二本鎖配列と三重らせんを形成するという出願人 の発見によって、著しく拡大された。化学切断基（例えば、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、　 Ｃｕ−フェナントロリンまたは２−メトキシ−６−クロロ−９−アミノアクリジ ン）を付けた第三の鎖のオリゴヌクレオチドを含む三重らせんＤＮＡを形成する ためにリコンビナーゼタンパク質を使用して、どの様な配列の二本鎖でも切断す る事が可能となる。この方法によって、例えば、完全な哺乳類のゲノムに１回し か発生しない２０個の塩基配列を、配列に特異的にかつ効率的に切断できる事が 期待される。本技術分野に通じている者は、ＤＮＡの相同性（オリゴヌクレオチ ドと二本鎖間で共有する配列の同一性）に対するリフンビナーゼの厳格性を操作 し、類似しているが同一ではない配列に適応する様にしたり、あるいは反復する 配列のモチーフを切断する様にする事によって、ゲノムの切断を複数回行える事 がわかるであろう。

配列に特異的な切断が随意にできるという事は、幾つかの事柄を意味する。第一 に、これはＤＮＡ分子クローニングにおいて非常に貴重な道具を提供する。第二 に、ＤＮＡの１００万塩基対のオーダーの長い範囲にわたる遺伝子地図が比較的 簡単に作成できるようになる。第三に、哺乳類のゲノムにおいて切断部位を１つ 導入できれば、特にこれが細胞内で行われれば、遺伝子に標的を定めることがは るかに容易になる 更に本発明は、遺伝子に標的を定める方法を強化する事に関するものである。遺 伝子に標的を定める方法は、活発な研究分野である。その理由は、それによって ヒト疾患の動物モデルを作製する事ができ、また遺伝子治療の方法を提供できる からである（患者の遺伝子の異常を矯正する）。リコンビナーゼタンパク質を用 いて配列に特異的な切断をゲノムのＤＮＡに対して行えれば、今日まで遺伝子の 標的を定めることを妨げてきた最大の要因、すなわち細胞内において標的を定め る際の効率か極めて低いという問題を克服できる可能性がある。本技術分野に精 通している者は、遺伝子療法の標的部位として、遺伝子表現を停止させる遺伝子 不活化またはＲＮＡ不活化のための標的部位が含まれる事を知るであろう。

更に、本発明は、ＤＮＡを含む試料中の特定の配列の二本鎖ＤＮＡ分子の存在を 同定する方法に関するものである。

現在、ＤＮＡ分子の同定は、しばしば手間のかかる方法で行われている。つまり 、ＤＮＡ分子をゲル上で電気泳動にかげ、変性させ、ニトロセルロース膜等の固 体の支持体に移し、その場でマーカーＤＮＡにプローブさせるか、またはハイブ リッド形成させる。この本発明を実施例に用いれば、リコンビナーゼタンパク質 を用いて溶液中で二本鎖ＤＮＡ分子を形成し、ハイブリッドを形成する事ができ る。リコンビナーゼタンパク質は、標識された（例えば放射活性のある）　ＤＮ Ａプローブを目的の二本鎖ＤＮＡ分子とハイブリッド形成させる事ができる。次 に、「標識された」分子は、適切な技術（例えば、電気泳動後のオートラジオグ ラフィー）によって、余分のハイブリッド形成しないプローブから分離した後、 目で観察する事ができる。この様な方法は、より迅速で、目的とする分子の変性 を避ける事ができるので、分子を本来のコンフォメーションで研究する事ができ 、また別の分子を、例えば１つのゲル上で別のプローブを使用して簡単に迅速に スクリーニングできる。

本発明は、複数の制限酵素による切断部位を持つＤＮＡのクローニングとマツピ ングに、これらの三本ＨｉＤＮＡの形成を利用する方法に関するものでもある。

制限酵素による切断部位の内、限定された部位だけを切断する事が望ましい場合 がしばしばある。現在のところ、無差別的な「部分的切断」方法が用いられ、あ る（１は特定の制限酵素によって認識される全ての部位で切断をブロックするメ チラーゼが使用されて（Ａる。残念ながら、メチラーゼの種類は非常に限定され ており、それらが利用できる範囲においても、メチラーゼは、特定の制限酵素に よって認識される全ての部位を修飾してしまう。幾つかの研究所の研究によって 、ポリブＩＪン／ポリピリミジンの配列を含む三重らせんは、三重らせんＤＮＡ の領域内では、制限酵素による切断を免れる事が明らかになっている。ここで明 らかにする技術によって、リコンビナーゼタンノくり質の利用を基礎として、こ の様な切断に対する防御を、殆ど全ての制限酵素が認識する配列に拡大応用する 事ができる。

本発明のもうひとつの側面は、特定の遺伝子の転写を停止するために、リコンビ ナーゼによって形成された二本鎖ＤＮＡを使用する方法に関するものである。現 在、細胞内の翻訳を阻害するために「アンチセンス」第１ノゴヌクレオチドを利 用する事に多大な関心力（寄せられている。この技術において、オリゴヌクレオ チドζは、細胞内でメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）とハイブリツド形成し 、特定のタンパク質合成（翻訳）を阻害するか、あるいは、リポソームＲＮＡと ハイプリント形成し、それによって細胞内の全てのタンパク質合成を阻害する。

この方法は、目的のタンパク質に対応する利用可能なｍＲＮＡまたはリポソーム ＲＮＡが、オリゴヌクレオチドの標的とならなくてはならず、不活化しなくては ならないＲＮＡのコピーがしばしば数千に上るため、かなり限界がある。本発明 は、特定のたった１つの遺伝子の転写に影響するという点で、遥かに効率の高い 方法である。種類を問わず１つの遺伝子につき多数のＲＮＡが転写されるのと対 照的に、細胞内における遺伝子のコピー数は通常かなり少なく、１２以下で、通 常は二倍体細胞一つにつきコピーは２つ以下である。遺伝子表現を阻害する事に よりタンパク質合成を阻害する本方法は、細胞内の過剰のりフンビナーゼタンパ ク質により、オリゴヌクレオチドがある遺伝子を標的とするようにして、ＤＮＡ 三重らせん（ＤＮＡ　ｔｒｉｐｌｅ　ｈｅｌｉｘ）を形成する事によッテ、行わ れる。

上述の様に、本発明はＤＮＡに配列特異的に標的を定める方法に関するものであ る。一般的な言葉で述べれば、本方法は、組換えタンパク質、例えば、大腸菌か らのｒｅｃＡタンパク質が、オリゴヌクレオチドをそれと相同の二本ＩＩ　ＤＮ Ａの配列と対合させ、二本鎖ＤＮＡ分子を形成させることができる性質を利用し ている。この様な対合複合体（ｓｙｎａｐｔｉｃ　ｃｏｍｐｌｅｘ）と安定した 結合分子（ｊｏｉｎｔ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の形成の概略を、図９に示す。

本発明の方法は、応用範囲が広い。本発明方法を利用すれば、特定の配列（すな わち、オリゴヌクレオチドが複合体を形成する様な配列）を、例えばメチラーゼ による修飾から、あるいは制限酵素などによる切断から守ることができる。更に 、本発明は、切断部分、例えば化学的切断部分をオリゴヌクレオチドに付着させ る事によって、部位特異的な切断を行うために使用する事ができる。更に、本発 明方法は、２段階のプロセスにより特定の部位を切断するためにも利用できる。

まず、特定の配列を修飾から保護しく二本鎖分子の形成によって）、次にオリゴ ヌクレオチドを除去し、予め保護されていた部位が切断される様にする（他の部 位は事前の修飾によって切断から保護されている）。

更にもう１つの実施例において、本発明は、結合している対の片方、例えばビオ チンを付けたオリゴヌクレオチドの誘導体を作り、次に結合対の他方の相手、こ の場合はアビジンを使用して、目的の二本鎖とオリゴヌクレオチドの複合体から なる二本鎖ＤＮＡ分子を選択する事によって、目的の配列のＤＮＡプールの濃縮 に使用できる。この方法によって、特定の二本鎖ＤＮＡ分子を精製する事ができ る。本発明の他の実施例として、特定の二本鎖分子に標識を付けるために、検出 可能な標識を結合したオリゴヌクレオチドの利用、および活性化されると、安定 した二本鎖分子を形成する交叉結合する試薬を結合したオリゴヌクレオチドの利 用等がある。ここに開示されたことろを読めば、本技術分野に精通する者には、 その他の本方法の応用は明らかである。

本発明での使用に適したオリゴヌクレオチドは、目的とする結果を最適なものに できる様に、設計する事ができる。例えば、オリゴヌクレオチドの長さは、過度 の実験を行う事なく、特定の目的のプロトコールに合わせて調整する事ができる 。

本発明については、上述の防御と制限／修飾の実施例について、詳細な説明がな されるが、本技術分野に精通している者は、この方法が試験管内でも生体内でも 更に広く応用できる事を知るであろう。

本発明の防御の側面は、下記の実施例１２にある程度詳細に説明されている。実 施例のセクションを読めば明らかな様に、ｒｅｃＡは、例えば、二本鎖ＤＮＡ分 子の特定部位の切断を防御するために利用できる。これは、その部位において対 合複合体を形成する事によって効果を発揮する。オリゴヌクレオチドと相同の二 本鎖ＤＮＡ間の複合体形成は、迅速かつ効率的に行われる。

明確化のために、制限／修飾の実施例に関係する反応の特定の配列が、下記の実 施例１３〜１５に詳細に示されている。４８５キロベース（ｋｂ）の長さのラム ダＤＮＡ（Ｌａｍｂｄａ　ｎ、Ｈｅｎｄｒｉｘ等Ｗ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ。

Ｙ、　１９８３）にある、Ｄａｎｉｅｌｓ等の論文、５１９−６７６ページ）の 様な切断しにくい標的ＤＮＡに関しては、反応は溶液中で有利に行われる。しが し、より大きなゲノムは、アガロースマイクロビーズ中に埋め込む事ができる（ 実施例１４および１５参照）。

例示された制限／修飾の実施例における、二本鎖ＤＮＡの配列特異的な切断にお ける最初のステップは、切断する特定のＥｃｏ　Ｒ１部位を選択する事である。

一般に３０〜６０塩基の長さの相同のオリゴヌクレオチドが、Ｅｃ。

Ｒ１部位が都合よくオリゴヌクレオチドの中央に来る様に合成される。５°また は３゛末端に認識配列を持つオリゴヌクレオチドも使用されるが、効率が低い事 が観察される場合がある〔実施例１４参照〕。オリゴヌクレオチドとｒｅｃＡタ ンパク質が二本鎖ＤＮＡと共にインキュベートされ、相同部位で複合体が形成さ れる。次にＥＣＯＲ１とＳ−アデノシルメチオニンが加えられ、全ての利用可能 な部位がメチル化されるが、オリゴヌクレオチドとｒｅｃＡタンパク質複合体が 関与している部位は、メチル化を免れる。次に、複合体とメチラーゼが不活化さ れ、’　Ｅｃｏ　ＲＩＩＩＪ限酵素が加えらべ　この時点で剥き出しになったＥ ｃｏ　ＲＩ部位が切断される。

１つの部位における切断が図１７に示されているが、２種類のオリゴヌクレオチ ドを同時に加える事ができる。

これによって、長い、あるいは環状のゲノムがら断片を単離する事ができる。以 下の式は、この様な断片の収率を示すものである。

収率（％）＝　（ＰＣ）２［１−（１−Ｍ）Ｃ］ｙ（１−Ｎ）　ｘ　１００ここ で、 Ｐは、ｒｅｃＡタンパク質による相同部位のメチル化防御効率である（１という 値は、完全な防御を意味する。）Ｃは、＃Ｉ限酵素による切断効率である。

Ｍは、防御されていない部位のメチル化効率である。

Ｘは、断片中に認められるＥｃｏ　Ｒｒ部位の数である。

Ｎは、非特異的ヌクレアーゼまたは切断により破壊された断片の分画である。

式中の３つの項は、反応の重要なパラメーターを含む。第一項から、相同部位の 防Ｘを最大にしなくてはならない事、また防御効率の低下は、２つの部位が関与 すると２乗される事が明らかである。防御効率は、両部位で同じと仮定される。

第二項は、Ｘ乗されるため、複数のＥｃｏ　Ｒ１部位を内側に有する長い断片で は特に、メチル化が、有利には、殆ど完全なまでに行われなくてはならない。第 三項から、非特異的ヌクレアーゼは最小限にすべきで、実際、精製度の高いタン パク質を使用すべきであることが明かである。

本技術分野に精通している者は、前述の内容を読めば、使用されるオリゴヌクレ オチドを誘導体合成しないようにする事ができる一方、オリゴヌクレオチドの誘 導体を合成する事によって、より多目的な標的化が可能となることを理解するこ とができるであろう。可能な誘導体には、タンパク質、ビオチン（上述の様に） 、蛍光染料、化学的反応部分（例えば、切断用）、または光化学的反応部分等が ある。本技術分野において公知の方法を用いて誘導体を作る事ができる。

本発明が関係している方法は、多くの応用例があり、ゲノムマツピングもそのひ とつである。２つの遺伝子座の物理的距離は、単純に断片の大きさである。例え ば、パルスフィールドゲル電気泳動を用いて、一旦断片を分離すれば、特定の目 的の遺伝子を見つける複雑さは、断片化されていないゲノムＤＮＡを用いる研究 と比べれば、数桁も軽減される。

本技術分野に精通している者は、前記より、大きなゲノム内の部位も含めて、Ｄ ＮＡ配列のどの部位にもオリゴヌクレオチドが標的を定める事ができる様に設計 できる事がわかるであろう。従って、オリゴヌクレオチドは設計可能で、細胞内 環境において特定の遺伝子の切断、組換え、または抑制に使用できるのである。

本発明のある側面について、以下の非限定的な実施例おいて、さらに詳細に述べ る。

Ｋ施１ 実施例１〜５に関する実験の詳細。

リコンヒナーゼタンハク　（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　ｒｏｔｅｉｎｓ）：部分 精製されたＨｅＬａリコンビ六−ゼ分画は、別に報告されている様に（Ｈｓｉｅ ｈおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ、１９８９、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、　２６４．５０８９−５０９７）、核抽出物から調製された。部分精製され たショウジョウバエリコンビナーゼタンパク質である分画■は、過去に報告され ている様に（ＥｉｓｅｎおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ、　１９８８、Ｐ ｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．７４８１−７４８５ ）、２４時間胚から調製された。ヒトリコンビナーゼ試料は、トリクロロ酢酸に 沈澱するカウント数によって定量したところ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活 性を全く示さなかった。

結合分子分析の条件を用いて、ヒトリコンビナーゼ分画とインキュベーション後 、３２Ｐで３゛末端を標識された二本鎖ＤＮＡから３２ｐの放射能（ｃｐｍ）は 全く放出されなかった（データは示されていない）。前述の様に、ショウジョウ バエリコンビチーゼ分画は、同様の分析においては、３２ｐの放射能（ｃｐｍ） を１０％未満除去した（ＥｉｓｅｎおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ、　１ ９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．７４８１−７４８５）。ここで述べられる結合分子分 析とは関係ないが、リコンビナーゼ分画試料の５゜−３°エキソヌクレアーゼ活 性は極めて低かった。つまり、ショウジヨウバエおよびヒトリコンビナーゼ分画 によって、それぞれ５％未満の３２ｐの放射能（ｃｐｍ）と１０〜１５％の３２ ｐの放射能（ｃｐｍ）が、トリクロロ酢酸に溶解するカウント数として放出され た（　ＥｉｓｅｎおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−ｏｔｅｒｏ、　１９８８、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．７４８１−７４８５） 。精製された大腸菌のｒｅｃＡおよびＳＳＢタンパク質は、ご厚意により、Ｎｏ ｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ の５ｔｅｐｈｅｎ　Ｃ，Ｋｏｖｙａｌｃｚｙｋｏｖｔｓｋｉ博士（Ｋｏｗａｌｃ ｚｙｋｏｗｓｋ　ｉおよびＫｒｕｐｐ、　１９ｇ？、Ｊ、　Ｍｏ１Ｂｉｏ１．１ ９３．９７−１１３）に提供していただいた。両大腸菌タンパク質は、ＳＤＳ　 ＰＡＧＥにおいて単一の均質なポリペプチドとして移動し、トリクロロ酢酸に溶 解するカウント数の放出として判定したところでは、検出可能なエキソヌクレア ーゼは全く含んでいなかった（　Ｓ、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ、私信によ る、データは示されていない）。

坦１１ ｐＧｅｍ　４プラスミドＤＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ社より入手し た。Ｍ１３ｍｐ１ｇウィルスＤＮＡと制限酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ社から入手した。Ｍ１３ｍｐ１９ウィルスＤＮＡとｐｃｆｅｌ　９ プラスミドＤＮＡ、ヌクレオチド１７４５から２５０５を削除されたｐＢＲ３２ ２の誘導体（Ｂｒｅｎｎｅｒ等、１９８５、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏｌ、 　５．６８４−６９１）は、標準的手法に従って調製された。オリゴヌクレオチ ドは、別に報告されている様に（ＨｓｉｅｈおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒ ｏ、１９８９、Ｊ、　ＢｉｏｌＣｈｅｍ、　２６４．５０８９−５０９７）、合 成され精製された。ｐｄｅ１９のプラス鎖と相同のオリゴヌクレオチドは、ｐＢ Ｒ３２２の位置１７〜２９．１０〜２９．４３５９〜２９にわたっており、これ らはそれぞれＨｍｅｒ　（１３個の塩基のポリマー）、２Ｑｍａｒ、　３３ｍｅ ｒであった（　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　１９７８、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ ｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、４３．７７−９９）。ｐＧｅ ｔｎ　４のポリリンカー領域と相同のオリゴヌクレオチドは、Ｍ１３ｍｐ１９の マイナス鎮から誘導され、下記の様にＭ１３ｍｐ１９に位置づけされた（　Ｙａ ｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、１９８５、Ｇｅｎｅ　３３．１０３−１１９） 。部分的二本鎖に使用されるオリゴヌクレオチドは、１３塩基対、２６塩基対、 ３８塩基対、５６塩基対のそれぞれの位置６２７８〜６２９０．６２６５〜６２ ９０．６２５３〜６２９０．６２３５〜６２９０にわたっていた。分枝点移動構 造に使用されるオリゴヌクレオチドは、１３塩基対、２６塩基対、３８塩基対、 ５６塩基対のそれぞれの位置６２７８〜６３００．６２６５〜６３００．６２５ ３〜６３００．６２３５〜６３００にわたっていた。オリゴヌクレオチドは、３ ２ｐ−ガンマ−ＡＴＰ　（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）とＴ４ポリ ヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって標識され、Ｇ２５スピン カラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅＬｍ）上を通過させるか、あるい は透析によって脱塩処理された。放射能で標識されたオリゴヌクレオチドとＭ１ ３ｍｐ１９ウィルスＩ　ＤＮＡから３２ｐで標識された部分的二本鎖を調製する 方法は別報で述べられている通りであった（　ＨｓｉｅｈおよびＣａｍｅｒｉｎ ｉ−Ｏｔｅｒｏ、　１９８９、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６４．５０８９−５０９７）。分枝点移動構造ハ、部分的二本鎖 分子と放射能で標識されていないオリゴヌクレオチドとインキュベートする事に よって形成された。

このオリゴヌクレオチドは、３２Ｐで標識され、アニールされたオリゴヌクレオ チドと配列は同じだか、３：Ｐで標識された断片の５°に更に１０個の塩基から 成るアニーリング部位を直接接続している。ＤＮＡ濃度は、ヌクレオチドのモル 数または重量によって表されている。

−重鎖と二本鎖基質の間に共通の相同部分の長さは、結合分子内の一本鎖ＤＮＡ と相補的な直鎖状二本鎖基質の間で対にできる最大塩基数として定義されている 。ライスコンシン大学ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いて、ｐＧｅｍ４とＭ１３ ｍｐ１８の間に共通の２つの重要な相同領域が発見された。これらは、ｐＧｅｍ 　４において互いに逆の方向性を示している。ｌａｃ　ｉ遺伝子からの５９塩基 対の領域の地図の位置は、Ｍ１３ｍｐ１ｇの６００１〜６０５９　（Ｙａｎｎｉ ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、１９８５、Ｇｅｎｅ　３３．　１０３−１１９）　と ｐＧｅｍ　４の１０４〜１６２である。

５７塩基対のポリリンカー領域は、Ｍ１３ｍｐ１８の位置の６２３１〜６２８７ 、ｐＧｅｍ　４の１０〜６６に位置づけられる。

ユニークな３°３２ｐ標識を付けたｐＧｅｍ　４直鎖状二本鎖ｐＧｅｒｎ　４　 ＤＮＡは、Ｈｉｎｄ　ｍによって直線化され、Ｋｌｅｎ。

ｗ　ＤＮＡポリメラーゼ断片（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、３°末端に３２ ｐ−アルフｙ　−ｄＡＴＰ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）と冷 たいデオキシヌクレオチドを作用させる事によって放射能で標識される。６５℃ で１０分間加熱して、反応を停止させ、１００ｍＭのＮａＣ１に加えられ、Ｂｇ ｌ　Ｉで分解される。

ポリリンカー領域を含む１，６３５塩基対のＢｇｌ　ｌ−Ｈｌｎｄ　ｍ断片がゲ ル精製され、１０１１１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ８，０と１ｍＭのＥＤＴＡに対し て大規模に透析が行われる。この３２ｐで標識された断片がＰｓｔ　Ｉで分解さ れ、８％変性ポリアクリルアミドゲルまたは１％アガロースゲル上で電気泳動後 、デンシトメトリーによって分析されると、９９％以上の放射能標識が１　、６ ｋｂの断片がら除去された。従って、３２ｐ標識は、二本鎖基質のプラス鎖の３ ゛末端の１０個塩基以内に残留した。

１支欠王メ上 結合分子分析は、２０１１１について、報告（ＨｓｉｅｈおよびＣａｍｅｒｉｎ ｉ−Ｏｔｅｒｏ、　１９８９、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．５ｏ８ ９−５０９７）の様に、１５０ｐｍｏｌ　（５０ｎｇ）のＭ１３ｍｐ１Ｂウィル スＤＮＡと１５０ｐｍｏｌ　（５０ｎｇ）の直鎖状ｐＧｅｍ　４　ＤＮＡまたは ３００ｐｍｏ１　（１０１００ｎの直鎖状ｐｄｅｌ　９、および５ｎｇの３２ｐ 標識さ才たオリゴヌクレオチドと、ＩＱＱｎｇのＨｅＬａタンパク質まｔ、は４ ０ｎｇのショウジヨウバエタンパク質を用いて、３７℃、１０分間で行った。７ μｇのｒｅｃＡタンパク質と７００ｎｇのＳＳＢタンパク質を含む分析標本を、 報告（ＨｓｉｅｈおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−ＯｔｅｒｏＳ１９８９、Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４．５０８９−５０９７ｊの様に３７℃で１０分間、 前インキュベーションした。分析標本を１％ＳＤＳとｆＯｍＭのＥＤＴＡに加え 、臭化エチジウムを含むＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ　ｈリス−酢酸塩、ｐＨ８，１ ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で０７％アガロースゲル上で室温で１２〜１６時間、０．６ Ｖ／ｃｍで電気泳動にがけた。定量は、デンシトメトリーによっておこなわれた 。Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ法の変法を用いて、電子顕微鏡検査が行われた。

翫支足並メ逝 ３２ｐで標識されたオリゴヌクレオチドと旧３ｍｐ１９ウィルス鎖ＤＮＡをアニ ールして生成した３２ｐ標識された部分的二本＠　（１５０ｐｍｏｌ）が、表示 されている温度で、または１％ＳＤＳと１０＋ｎＭのＥＤＴＡを含む鎖交換緩衝 液中の氷上で１０分間インキュベートされた。０１％ブロモフェノールブルーと ５０％グリセロールを含むＴＡＥ緩衝液が加えられ、混合物は臭化エチジウムを 含むＴＡＥ緩衝液中で０７％アガロースゲル上で室温で１２〜１６時間、０　、 ６Ｖ／ｃｍで電気泳動９　にかけられ、続いてオートラジオグラフィーにかけら ０　れた。分枝点移動構造の安定性分析のために、１５０ｐｍ。

１１の３２Ｐ標識された部分的二本鎖と１３ｍｐ１９に対する１０塩れ　基のア ニーリング部位を含む４ｎｇの第二のオリゴヌクした　オチドが、表示されてい る温度で、または１％ＳＤＳと１０ｍＭのＥＤＴＡを含む鎖交換緩衝液中の氷上 で１０分間インキュ３　ベートされた。上述の様に、反応物はアガロースゲル６ 　上で電気浮動にかけられ、次にオートラジオグラフィ′）　−にかけられた。

結合分子は、リコンビナーゼによって形成された。反応は、１％ＳＤＳと１０ｍ ＭのＥＤＴＡによって停止され、表示された温度または氷上で１０分間更にイン キュベートされ、アガロースゲル上で電気泳動にかけｒｅｃＡとＳＳＢタンパク 質を含む反応済の結合分子分析試料を１％ＳＤＳ、　１０ｍＭのＥＤＴＡ、　２ ０ｐ　ｇ／ｍｌのタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）　Ｋ　（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に加え、更に３７℃で２０分間インキュベ ートした。分析試料は、フェノール、フェノール−クロロホルム、クロロホルム の順に用いて抽出された。試料は、使用直前に水で飽和させた無水エチルエーテ ルで４回抽出された。残留エーテルは窒素中で除去された。除タンパクされた結 合分子は、１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）上でＳＤＳ　ＰＡＧＥ 　（Ｌａｅｍｔｎｌｉ、　１９７０）によって分析され、次に銀染色　（Ｈｏｃ ｈｓｔｒａｓｓｅｒ等、　１９８８、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、１７３．４ １２−４２３）またはウェスタンブロッティングが行われた。

５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌのミニプロット　（Ｍｉｎｉｂ ｌｏｔ）装置を用いて電気泳動とニトロセルロースに移す方法は、製造者の説明 書に従った。移した後、ニトロセルロースのフィルターは燐酸緩衝食塩水、ＰＢ Ｓ中の１０％乳中で１時間ブロックされた。フィルターは、ＰＢＳ中の５％乳、 ０１％ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ　２０中の精製ｒｅｃＡタンパク質に対するウサギ抗 血清の１　：５００希釈液２０ｍ１と共に１時間インキュベートされた。十分洗 浄した後、フィルターはＩ５μＣＬの１２５Ｉ標識されたロバの抗ウサギＩｇＧ 　（３０００Ｃｉ／ｒｎｒｎｏｌ、Ａｔｎｅｒｓｈａｒｎ）を含む２０ｍｌのＰ ＢＳ中の５％乳、０．１％ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ　２０と共に１時間インキュベー トされた後、十分洗浄された。強化スクリーンを使用して、３日間オートラジオ 三本鎖ＤＮＡの形成をテストするために、リコンビナーゼタンパク質の短い相同 領域を用いて安定した結合分子を形成する能力がモニターされた。リコンビナー ゼタンパク質か直鎖状２本１ｍ１ＤＮＡと相同の環状二本鎖ＤＮＡと共にインキ ュベートされ、２つの基質か非共有結合により連合している結合分子生成物が形 成された。安定した結合分子形成は、直鎖状二本鎖の末端から開始される。環状 一本ｔａＤＮＡ基質は、Ｍ１３ｍｐ１８ファージのウィルス（プラス）鎖である 。直鎖状二本鎖基質はプラスミド、ｐＧｅｍ　４　（図２Ａ）である。ｐＧｅｍ 　４とＭＩ３ｔｎｐ１８は２つの重要な相同領域を共有している。それは、大腸 菌匠↓遺伝子の５９塩基対領域と相同の５７塩基対領域で、これらはｐＧｅｍ　 ４とＭ１３ｍｐ１ｇの両者のポリリンカークローニング部位を構成している。こ れら２つの相同領域は、非相同の３７塩基対によってｐＧｅｆｆ４において分離 される。ポリリンカ一部位においてｐＧｅｒｎ　４が直線化されると、ヒト（Ｈ ｅＬａ）およびショウジヨウバエのリコンビナーゼ分画による鎖交換には方向性 があるため、図２Ａに示される様に、ｐＧｅｍ　４の直鎖状二本鎖の右端部の相 同配列のみが利用される（Ｈｓｉｅｈ等、１９８６、Ｃｅ１ｌ　４４．８８５− ８９４；　ＥｉｓｅｎおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−ＯｔｅｒｏＳ１９８ｇ、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８５．７Ｌ８１−７４８５）。ｐＧｅｍ　４ の右端は、図に示す様に、Ｍ１３ｍｐ１８ポリリンカー配列のプラス鎖の３′末 端となっている。

ＨｅＬａリコンビナーゼ分画は、Ｍ１３ｍｐ１８−末鎖ＤＮＡと直線化されたｐ Ｇｅｍ　４二本鎖ＤＮＡの間で結合分子を形成した（図２Ｂ）。試料は電気泳動 の前に除タンパクされた。

驚く事に、わずか１３個の塩基の共通な相同領域によって、安定した結合分子を 十分に形成する事ができた（レーン４）。直鎖状二本鎖右端の５塩基長の相同配 列と二本鎖左端の５２塩基長の相同配列は利用されなかった（レーン５）。この 結果から、ヒトのりフンビナーゼ分画による鎖交換の方向性が確認される。ポリ リンカー領域のマイナス鎖を含むＭ１３ｍｐ１９−末鎖ＤＮＡを用いた対照実験 では、Ｈｉｎｄ　ｍではな（Ｅｃｏ　ＲＥによってｐＧｅｍ４が直線化された場 合に、安定した結合分子が出現した。

Ｈｉｎｄ　ｍとＥｃｏ　ＲＩの両者により分解されたｐＧｅｍ　４を用いた分析 で、５塩基対以外全て削除された場合にも、何も生成されなかった事から、二本 鎖左端から内側部位の３７塩基対に位置する第二の共通相同領域が、結合分子の 形成において、ＨｅＬａリコンビナーゼ分画によって利用されない事を示してい る。非常に短い配列の相同領域を用いる結合分子分析は、１６〜２６％の二本鎖 を結合分子に転換し、驚くべき高い効率であった。完全に相同なりＮＡを用いる 同様の分析条件下で、ヒトのリコンビナーゼ分画は、直鎖状二本鎖の１７３から １７２を結合分子に転換する（Ｈｓｉｅｈ等、１９８６、Ｃｅ１ｌ　４４．８８ ５−８９４；　ＨｓｉｅｈおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ、１９８９、Ｊ 、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．５０８９−５０９７）。

ヒトのリコンビナーゼ分画の様に、ショウジョウバエリコンビナーゼ分画も僅か １３塩基対の相同領域で結合分子を形成しく図２０、レーン４）、５塩基対の相 同領域を利用することなく予想通りの結合分子形成の方向性を示した（レーン５ ）。レーン１〜３において、約２０％の直鎖状二本鎖が結合分子に転換された。

完全に相同なりＮＡを用いる同様の分析条件下で、ショウジョウバエリコンビナ ーゼ分画は２／３の２本鎖を結合分子に転換する（　ＥｉｓｅｎおよびＣａｍｅ ｒｉｎ　１−Ｏｔｅｒｏ、１９８８、Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　８５．７４８１−７４８５）。

ｐＧｅｍ　４直鎖状二本鎖、Ｍ１３ｍｐ１ｇ−末鎖ＤＮＡ、　ｒｅＣＡタンパク 質および大腸菌ＳＳＢタンパク質を用いる結合分子分析が図ｚＤに示されている 。分析条件は、他の研究者により明らかにされたもので、数千もの塩基対にわた るｒｅｃＡによる大規模な鎖交換を促進するものである（Ｒａｄｄｉｎｇ、１９ ８２　Ａｎｎ、　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１６．４０５−４３７１： 概説されている）。相同な５６塩基対または３８塩基対（レーン１および２）が 、ｒｅｃＡによる結合分子形成にとって十分である事が観察された：直鎖状二本 鎖の２８％と１９％がそれぞれ結合分子に転換された。しかし、相同性が２６塩 基対に限定されると（レーン３）、結合分子は観察されなかった。完全に相同な 基質を用いた同じ反応条件において、ｒｅｃＡは、本質的に全ての二本鎖を高次 構造に転換する事が観察された。この分析において、ｒｅｃＡの方向性は、真核 生物のリコンビナーゼ分画の方向性と同一であった。すなわち、直鎖状二本鎖の 右端の相同領域だｔすが、ｒｅｃＡタンパク質によって利用された（レーン１と ５を比較せよ）。ヒトのリコンビナーゼ分画について観察された様に、Ｍ１３ｍ ｐ１９−末鎖ＤＮＡと共にｒｅｃＡとＳＳＢタンパク質がインキュベートされた 場合には、Ｈｉｎｄ　ｍによって直線化された二本鎖ではなく、Ｅｃｏ　ＲＩに よって直線化されたｐＧｅｍ　４によって、効率的に結合分子が形成された。短 い相同領域を用いるｒｅｃＡによる鎖ベアリングの方向性が、広い相同領域を共 有する基質を用いる他のリコンビナーゼによる方向性と異なっているのかは、現 在のところ、不明である（　Ｒａｄｄｉｎｇにおいて概説されている、１９８２ ）。しかし、ｒｅｃＡによる鎖交換の方向性は、真核生物のリコンビナーゼタン パク質の方向性と異なり、基質依存性がある（ＫｏｎｆｏｒｔｉおよびＤａｖｉ ｓ、　１９９０、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５．６９１６−６９２０ ）。

ｒｅｃＡによって形成された結合分子の電子顕微鏡検査により、直鎖状二本鎖と 環状一本鎖ＤＮＡのベアリングが、二本鎖の末端で起こった事か確認された。置 換された鎖は観察されなかったが、ベアリング領域の第三の鎖の立体配置を決定 するには、分解能が不十分であった。

更に、３種類のリコンビナーゼ全てによる結合分子の形成には、ＤＮＡとリコン ビナーゼタンパク質の両者が同時に存在しなくてはならず、二本鎖のエキソヌク レアーゼ作用処理とそれに続く二本鎖ＤＮＡのアニールによるものではなかった （図６参照）。Ｍ１３＋ｎｐ１ｇ−末鎖ＤＮＡとＨｉｎｄｍにより直線化された ｐＧｅｍ　４のＤＮＡ（５６塩基対の相同性）を別々にリコンビナーゼと共にイ ンキュベートし、続いて非酵素的アニールを促進するために、１％ＳＤＳとｌＯ ％Ｗ／Ｖポリエチレングリコールの存在下に処理された基質を６５℃で１０分分 間時にインキュベートすると、結合分子は全く形成されなかった。

実施例２　しい　Ａ これらの結合分子の安定性に関する１つの説明は、環状一本鎖が、相同領域と非 相同領域の接合部で二本鎖によってその場で非特異的に保持されているか、「挟 まれている」というものである。これとその他の捕獲形態の可能性を除外するた めに、新しい分析法が考案された。この分析法においては、−末鎖が２つの末端 を有し、非常に短く、二本鎖と完全に相同である。

更に、この分析法は、短い相同領域の認識が、Ｍ１３ｍｐ１８のポリリンカー配 列に限定されていない。直鎖状二本鎖ＤＮＡと直鎖状二本鎖の１本の３′末端と 同じ５’−３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドの結合分子形成に関する新しい分析法 が図３Ａに示されている。安定した結合分子の形成は、アガロースゲル上で、直 鎖状二本鎖ＤＮＡの位置に放射能標識の移動が出現する事によってモニターされ た。

安定した結合分子は、ヒトのリコンビナーゼ分画によって、ｐｄｅｌ　９直鎖状 二本鎖ＤＮＡと３３塩基または２０塩基の長さのオリゴヌクレオチドの間で形成 された（図３Ｂ、レーン１および３）。１３塩基の長さのオリゴヌクレオチド（ レーン５）または非相同のオリゴヌクレオチドによって、結合分子は形成されな かった。レーン１の直鎖状二本鎖の約５０％が、結合分子に転換された。レーン ２．４．６の対照実験は、リコンビナーゼ分画試料中に可能性として存在するエ キソヌクレアーゼによる二本鎖の劣化により、結合分子が形成されず、オリゴヌ クレオチドとアニールできる二本鎖を露出させることとなった事を証明している 。つまり、２つのＤＮＡ基質を別々にリコンビナーゼ分画と共にインキュベート し、次に反応を停止させるためＳＤＳの存在下に６５℃で１０分分間時にインキ ュベートすると、結合分子は全く観察されなかった。ｐｄｅｌ　９のマイナス鎖 に対応するオリゴヌクレオチドを使用した場合、結合分子は全く形成されなかっ た。これは、ヒトのリコンビナーゼ分画の３−５’方向性、すなわちオリゴヌク レオチドのベアリングが、二本鎖のうちの非相補鎖の３゛末端で開始する事を反 映している。

実施例３　八　〇熱 上記で検討された短い相同領域の除タンパクされた結合分子のある鎖が置換され ていると、分枝点移動による解離が迅速に起こる事かある。ＤＮＡ分枝点移動は 塩基対形成の進行過程でランダムに発生し、ＤＮＡを幾何的構成に依存するが、 １つの塩基対の通過に必要な時間は、１２〜２００マイクロ秒である（　Ｔｈｏ ｍｐｓｏｎ等、１９７６、ＰｒｏｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　？３ ．２２９９−２３Ｃ１３：　Ｒａｄｄｉｎｇ等、１９７７、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌ、　１１６．８２５−８３９；　ＧｒｅｅｎおよびＴｉｂｂｅｔｔｓ、　 １９８１．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９．１９０５−１９１８）。

従って、二本鎖の末端まで到達するのに必要な時間は、距離（５６塩基対）の２ 乗に通過時間をかけ（０２ミリ秒）、２または約３００ミリ秒で割った値とほぼ 等しい（Ｆｅｌｌｅｒ。

１９５７、　Ｖｏｌ、１．　３２５ページ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　 ５ｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。驚く事に、これらの除タンパクされた結合分子は 、室温で数時間（＞１０’秒）安定である事が観察された。

室温における結合分子の安定性は、第三の鎖と二本鎖の間に更に別の相互作用が 形成されている事を反映している。この様な相互作用の強さを確認し、共有結合 作用の可能性を除外するために、結合分子の熱安定性が検討され、部分的二本鎖 分子と非酵素的な分枝点移動が起こり得る分子の安定性と比較された（図４Ａ参 照）。部分的二本鎖分子、■、の短い二本鎖領域は、リコンビナーゼによって、 Ｈｉｎｄ　ｍ　（５６塩基対）、Ｓａｌ　Ｉ（３８塩基対）、Ｂａｍ旧（２６塩 基対）、ＫｐｎＩ（１３塩基対）により分解されたｐＧｅｍ　４直鎖状二本鎖と 、ＭＨｍｐ１８−末鎖ＤＮＡとの間で形成された図２に示す結合分子における塩 基対の形成が予想される領域と、配列および長さの点で正確に対応していた。分 校点移動構造、■は、潜在的な分枝点移動の配列、長さ、方向において、リコン ビナーゼによって形成される結合分子と正確に対応していた（「材料」のセクシ ョンを参照）。非酵素的分枝点移動により、３２ｐ標識されたオリゴヌクレオチ ドが置換される。この分析において、アニールされた断片が置換される現象は、 相同性に依存する分枝点移動を介して発生した。と言うのは、第二のオリゴヌク レオチドが、二本鎖領域と相同でない配列に付着している１０塩基のアニーリン グ部位を含んでいた場合には、３２ｐ標識された断片が置換される現象が観察さ れなかったからである。

Ｓａｌ　Ｉによって直線化されたｐＧｅｍ　４とＭ１３ｍｐｌＢ　ＤＮＡの間で 形成された結合分子に対応する３８塩基対の相同領域に関する安定性実験の代表 的データが、図４Ｂに示されている。二本鎖（５８％Ｇ−Ｃ）が６５℃で１０分 後に安定で、７５℃で融解し、一方分枝点移動構造は４５℃で１０分後に分離し た。ヒトのリコンビナーゼ分画によって形成された結合分子は、６５℃で１０分 後に安定で、７５℃で分離した。これは、リコンビナーゼによって形成された結 合分子と長さ、配列、分枝点移動の方向性が同じ分枝点移動構造との間に相対的 安定性の点で３０℃の差がある事を表している。臭化エチジウムで染色されたゲ ル内で結合分子よりもゆっくりと移動するかすかな第三のバンドは、ｐＧｅｒｎ ４のダイマーで、リガーゼ活性による汚染が原因である。

４種類の異なる長さの相同領域にわたり形成された二本鎖、分枝点移動構造、３ 種類のリコンビナーゼによって形成された結合分子に関する同様の熱安定性デー タが図５に示されている。結合分子は安定性が顕著で、分枝点移動構造よりも２ ０℃から３０°Ｃ高い温度で解離した。

金側において、二本鎖において観察された融解温度は、配列の長さとＧ−Ｃ含有 量に基づいて計算された温度と近似していた（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９ 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）。更に、結合分子の分ｍ温度か相同領域の長さと比例し ているという観察結果から、共有結合か安定性に関与している可能性は非常に低 い。

結合分子は、大きな環状−末鎖ＤＮＡを使用した結果生じる非特異的なりＮＡ基 質の捕獲または挟む事により安定していたのではなかった。例えば、ちょうど交 換点の所を構造的にブロックされた結合分子に、正常の二本鎖ＤＮＡが並んでい る（図３も参照）。ヒトのリコンビナーゼ分画によって、Ｍ１３ｍｐ１８直鎖状 二本鎖と相同の３２ｐ標識された２６塩基長のオリゴヌクレオチドの間で形成さ れた結合分子も、対応する分枝点移動構造よりも有意に安定性が高かった。対応 する二本鎖と同様に（４２％Ｇ−Ｃ）、除タンパクされた結合分子は、５５℃で 分離したが分枝点移動構造は室温で不安定であった（データは示されていない） ５ リコンビナーゼによって形成される結合分子と比較してその安定性を評価するた めに、結合分子構造の非酵素的な再構築が行われた。熱変性した直鎖状ｐＧｅｍ 　４と旧３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを、中性ノｐＨまたはｐＨ５，５テ（Ｖ。

１ｏｓｈｉｎ等、　１９８８、Ｎａｔｕｒｅ　３３３．４７５−４７６）、　１ ０％ｗ／ｖ　ポリエチレングリコールの存在下でアニールし、アガロースゲル上 で電気泳動にかけた。結合分子は、全く観察されなかった。同様に、熱変性した 直鎖状ｐｃｌｅｌ　９を３２ｐ標識されたオリゴヌクレオチドとアニールすると 、安定した結合分子は生成できなかった。

実施例４　安定な　合　は３つの無　の宙を、つもしも、直鎖状二本鎖のプラス 鎖の３゛末端がエキソヌクレアーゼ作用によって分解され、結合分子内のへテロ 二本鎖ＤＮＡだけが残っているのであれば、これらの結合分子の驚くべき安定性 を説明する事ができるであろう（図１の上図参照）。以下の実験は、安定した結 合分子が無傷の第三の鎖を持っている事を示している（ポリリンカー領域のプラ ス＃ＪＩ）。

ＨｅＬａリコンビナーゼ分画またはｒｅｃＡとＳＳＢタンパク質を用いて、旧３ ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡと直鎖状二本鎖のプラス鎖の３゛最末端を３２ｐ標識され たｐＧｅｒｎ　４断片の間で結合分子分析が行われた（図６Ａ）。放射能標識さ れた二本鎖の制限酵素分解物によって、３２ｐによる標識の９９％以上がｐＧｅ ｍ　４断片のプラス鎖の３°末端の１０個の塩基に限定されていた事が確認され た（「方法」のセクション参照）。従って、３２ｐ標識された結合分子が形成さ れるという事は、第三の鎖が無傷である事を意味する。と言うのは、９塩基対以 下のへテロ二本鎖は、非常に不安定で、この様な条件下では回収できないからで ある（図５参照）。これらの分析において、放射能標識された二本鎖の１５〜２ ０％が結合分子に転換されたので、３２ｐ標識された結合分子の殆ど全ては無傷 な第三の鎖を持っていたはずである。ｒｅｃＡによって形成される３２ｐ標識さ れた結合分子の熱安定性（図６Ｂ参照）は、３つの無傷な鎖を持つ分子が比較的 高温で解離する事を示した（図５参照）。迅速に移動する低いバンドは、３２Ｐ 標識された二本鎖から３２ｐの標識の非酵素的喪失を表している。これはリコン ビナーゼタンパク質が存在しない条件で高温で発生した。

ｒｅｃＡとＨｅＬａリコンビナーゼ分画によって形成された３２ｐ標識された結 合分子と対応する５６塩基の分枝点移動構造の相対的安定性の定量結果を、図６ Ｃに示す。ヒトのリコンビナーゼ分画によって形成された３２ｐ標識された結合 分子は、ｒｅｃＡタンパク質によって形成されたものと同様に、極めて高い安定 性を示した。分断されたｐＧｅｍ　４直鎖状二本鎖を用いるこれらの結果は、結 合分子の安定性が、直鎖状二本鎖の右端のポリリンカーの相同領域だけに限って 塩基対を形成する事によるものである事も証明している。

実施例５　足した　Ａ　はタンパク　を、たない結合分子の安定性を説明するの に、１％ＳＤＳの存在下で、結合分子がリコンビナーゼタンパク質と連合し続け ている、と考える事ができる。図７に示す実施例は、ｒｅｃＡタンパク質によっ て形成される安定したＤＮＡ結合分子が、幾つかの除タンパク試薬によって処理 された後は、ｒｅｃＡタンパク質と連合していない事を証明している。相同の５ ６塩基対を有する結合分子は、上述の様に、１％ＳＤＳの存在下にプロティナー ゼＫによって除タンパクされ、フェノール／クロロホルムによって抽出された。

ｒｅｃＡタンパク質残留量は、ｒｅｃＡタンパク質に対するポリクロナール抗体 を用いたウェスタンプロット法によって評価された（図７Ａ）。同じように処理 された結合分子は、熱安定性についても分析を行い、７５℃と８５℃の間で解離 した（図７Ｂ）。

ウェスタンプロット法によるｒｅｃＡタンパク質の実験的検出限界（０，１ｎｇ または２．５ｆｍｏｌ、図７Ａのレーン５）と、除タンパク結合分子の回収率（ ３０ｆｍｏｌ、図７Ｂのレーン３）に基づき、結合分子の９０％以上がｒｅｃＡ タンパク質を持っていないと推定された（図７Ａのレーン６）。銀染色によって ｒｅｃＡポリペプチドは検出されなかった。このプロット中、ｒｅｃＡポリペプ チド、一本＠　ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの位置において、ｒｅｃＡの移動は観 察されなかった。

たとえ活性を有するリコンビナーゼが存在したとしても、リコンビナーゼが分枝 点移動とそれに続＜　ＤＮＡ分子の解離を妨害しなかった事も観察された。図４ Ａに示される３２ｐ標識された部分的二本鎖構造が、結合分子分析の条件下に、 ｒｅｃＡタンパク質とＳＳＢタンパク質またはＨｅＬａリコンビナーゼ分画を存 在させ、１０塩基のアニーリング部位を含む第二のオリゴヌクレオチドと共に３ ７℃でインキュベートされた。分枝点移動構造が形成され、１０分以内に３２ｐ 標識されたオリゴヌクレオチドが分離した。

実施例６〜１２に関する実験の詳細 ｒｅｃＡタンパク質： 生成された大腸菌のｒｅｃＡタンパク質は、ノースウェスタン大学メディカルス クールの５ｔｅｐｈｅｎ　Ｃ，Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ博士から提供され た。

ＤＮＡ基質。

ｐＢＲ３２２およびｐＵｃ１８プラスミドＤＮＡと１１３ｍｐ１８複製型ＤＮＡ は、Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手した。オリゴヌクレオチドは、前に述べた様に 、合成され、Ｍｏｎｏ　Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させて精製され た（　ＨｓｉｅｈおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、　２６４：５０８９　（１９８９））。前に述べた様に（Ｈｓｉｅｈおよ びＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６４：５０８９　（１９８９））、オリゴヌクレオチドは、３２ｐ−ガン？− ＡＴＰ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）とＴ４ポリヌクレオチド キナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、５°−末端を放射能標識された。

ｐＢＲ３２２のプラス鎖に完全に相同なオリゴヌクレオチド（図１１および１４ ）は、ｐＢＲ３２２の位置１５〜２９．１０〜２９．４３５９〜２９にわたって おり、それらはそれぞれ１５．２０．３３塩基長のオリゴヌクレオチドである（ 　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、 　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　４９．５６１　（１９７８））。２０Ｌ系列のオ リゴヌクレオチド（９１５）は、ｐＢＲ３２２のプラス鎖の３゛末端に相同の様 々な大きさの相同領域を持っており、ｐＢＲ３２２の位置１０〜２９．２０〜２ ９．２２〜２９．２４〜２９．２６〜２９にわたっており、それらはそれぞれ２ ０．１０．８．６．４塩基長のオリゴヌクレオチドである。２ＯＲ系列のオリゴ ヌクレオチド（図１５）は、ｐＢＲ３２２のプラス鎖の５°末端に相同の相同領 域を持っており、ｐＢＲ３２２の位置２０〜３９．２０〜２９．２０〜２７．２ ０〜２５．２０〜２３にわたっており、それらはそれぞれ２０．１０．８．６． ４塩基長のオリゴヌクレオチドである。ｐＵｃ１８のプラス鎖に相同のオリゴヌ クレオチド（図１０）は、ｐＵｃ１８の位置２３０〜２８５．２３０〜２６７． ２３０〜２５５．２３０〜２４９にわたっており、それらはそれぞれ５６．３８ ．２６．２０塩基長のオリゴヌクレオチドである（　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ等、Ｇ ｅｎｅ　２６．１０１　（１９８３））。ｐＢＲ３２２の位置４３５９〜２９と 相同の３３塩基長さのオリゴヌクレオチドは、ｐＵｃ１８のポリリンカー領域と は対を成さなかった。図１２に示される実験に使用された２０塩基長のオリゴヌ クレオチドは、ｐＵｃ１８のマイナス鎖の２４８〜２６７の位置と相同でなかっ た。図１３に示されるオリゴヌクレオチドは、２３０〜２８５の位置に対応する ｐＵｃ１８のプラス鎖と相同な５６塩基を含んでいた。Ｍ１３ｍｐ１８のプラス 鎖と相同の３０塩基長のオリゴヌクレオチド（図１６）は、６８３１〜６８６０ の位置にわたっていた（Ｙａｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、　Ｇｅｎｅ　３３ ．１０３　（１９８５））。　ＤＮＡは、　ヌクレオチドのモル数または重量で 表されている。

対合複合体（ｓｙｎａｐｔｉｃ　ｃｏｍｐｌｅｘ）形成。

対合複合体は、２０ｍＭのトリス−塩酸、０．４ｍＭのジチオトレイトール、１ ２．５ｍＭの塩化マグネシウム、０．３ｍＭのＡＴＰ−ガン？　−Ｓ　（Ｆｌｕ ｋａ）、１　、１ｍＭのＡＤＰ　（Ｓｉｇｍａ）を含むｐＨ７，５の緩衝液に、 １．８μＭ　（１５ｎｇ）のオリゴヌクレオチド、１８μＭの二本ＩＥＩＤＮＡ 　（１５０ｎｇ）および１．５μＭ　（ｌ、５μｇ）のｒｅｃＡタンパク質を入 れて、総容量２５μｍとし、３７℃で１５分間インキュベートする事によって形 成された。

対合複合体の形成に続き、１０〜２０単位の適当な制限エンドヌクレアーゼ（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）が加えられ、更に５分間インキュベー ションが続けられた。ＳＤＳとＥＤＴＡを、最終濃度がそれぞれ１％と１０ｍＭ となる様に加えて、反応を停止した。反応物を４０ｍＭのトリス−酢酸塩、ｐＨ ８，０，１ｍＭのＥＤＴＡ、　１　μｇ／ｍｌの臭化エチジウム中の１％アガロ ースゲル上で、０　、６Ｖ／Ｃｍで１４〜１６時間、室温で電気泳動にかけた。

Ｐｏ１ａｒｏｉｄ　６６５のネガのデンシオメータースキャンニングを用いて、 １５０ｎｇの未反応の二本鎖ＤＮＡと反応させた分析標本を比較する事によって 定量を行った。対合複合体分析における無傷（未反応）の二本鎖ＤＮＡの回収率 は、１５０ｎｇの未反応の二本鎖ＤＮＡを含む標準と比較した。幾つかの分析標 本において、対合複合体分析は１％ＳＯ５の添加により反応を停止し、８９ｍＭ のトリス−ホウ酸塩、ｐＨ８，３，５ｍＭのＭｇＣｌ２中の１％アガロースゲル 上で、０．６ｖ／ｃｍで１４〜１６時間、室温で電気泳動にかけた。

除タンパクされた結合分子（ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚｅｄ　ｊｏｉｎｔ　ｍ。

ｅｌｃｕｅｓ）　： ５’−３２ｐ標識オリゴヌクレオチドを使用した以外は、上述と同様にして対合 複合体を形成した。上述の様に、ＳＤＳとＥＤＴＡを加えて反応を停止し、電気 泳動にかけた。

次にゲルを固定し、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−２フイルムに感光させた。

数例においては、電気泳動にかける前に、既に述べた様に、結合分子をプロテイ ナーゼＫ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）処理と、フェノール、 クロロホルム抽出により除タンパクした（　Ｈｓｉｅｈ等、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ ｅｌ、　４．１９５１　（１９９０））。結合分子の定量は、再構築実験によっ て決定された。この実験では、３２ｐ標識された５６塩基のオリゴヌクレオチド と既知量のＭ１３ｍｐ１９−末鎖ＤＮＡを６５℃またはｒｅｃＡの存在下にアニ ールした。　（アニーリングの効率に差は認められなかった。）電気泳動とオー トラジオグラフィーに続いて、これらのアニールした標準物質の相対的強度を、 結合分子の相対的強度と比較した。

対合複合体と結合分子の形成 ｒｅｃＡによる対合複合体と安定した結合分子の形成に関する実験図が図９に示 されている。対合複合体の形成は、スーパーコイルプラスミドＤＮＡの様な二本 鎖ＤＮＡ。

相同のオリゴヌクレオチド、ｒｅｃＡタンパク質をインキュベートする事によっ て行われた。オリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ認 識部位を含んでいる。ｒｅｃＡタンパク質、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ を含む対合複合体の形成によって、二本鎖に制限エンドヌクレアーゼによる切断 に対する抵抗性が与えられる。対合複合体に対応する制限エンドヌクレアーゼが 存在した形跡は、適切な制限エンドヌクレアーゼと共に複合体をインキュベーシ ョンした後に残るスーパーコイルプラスミドＤＮＡとして、臭化エチジウムによ って染色されたアガロースゲル上に見る事ができる。ｒｅｃＡタンパク質は、Ｅ ＤＴＡとＳＤＳ洗剤を加える事によって、これらの対合複合体から分離でき、除 タンパクされた結合分子が生成され、この結合分子の中でオリゴヌクレオチド（ ５°末端が３２ｐ標識されている）は、安定して二本鎖と対を形成している。結 合分子の存在は、アガロースゲル上で二本鎖ＤＮＡの位置に３２ｐ放射能標識の 移動が出現する事を分析する事によって決定する事ができる。

ＡＴＰおよびＡＴＰ再生系の存在下に、ｒｅｃＡタンパク質による結合分子形成 が検討された。この様な反応条件下に、ｒｅｃＡタンパク質によって６０塩基対 以下の相同性を共有する直鎖状二本鎖と環状−末鎖ＤＮＡとの間に安定した除タ ンパクされた結合分子が形成される事は、過去に観察されていた（Ｈｓｉｅｈ等 、ＧｅｎｅＳ　ＤｅＶｅＬ、　４．１９５１（１９９０））。安定した除タンパ クされた結合分子が、ｒｅｃＡタンパク質によってｐＵｃ１８スーパーコイルＤ ＮＡと相同の５６塩基オリゴヌクレオチドとの間で形成された。ＡＴＰ加水分解 が存在する条件で、除タンパクされた結合分子が１分後に回収されたが、非常に 不安定であった。つまり、３分後には結合分子の半分が解離しており、１５分の インキュベーション後には、除タンパクされた結合分子は回収されなかった。一 旦最初のベアリングと解離が起こってしまうと、二本鎖は、それ以後のベアリン グに参加できない様に見えた。このベアリングの一過性の性質により、対合複合 体が存在した形跡をめる事は、ＡＴＰの存在下では不可能であった。ＡＴＰを加 水分解不可能なＡＴＰの類似体であるＡＴＰ−ガンマ−８とＡＤＰに代える事に よって、ベアリング反応を止め、中間物を蓄積する事ができた。

０．３＋ｏＭのＡＴＰ−ガン？−Ｓと１．１ｍＭのＡＤＰの存在下での、ｒｅｃ Ａタンパク質による対合複合体と結合分子の形成を図１０に示す。ｒｅｃＡタン パク質の存在下に、ｐＵＣ１８プラスミドポリリン力−配列と相同の３２ｐ標識 されたオリゴヌクレオチドがスーパーコイルｐＵｃ１８プラスミドＤＮＡと共に インキュベートされた後、Ｓａｃ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼが添加された。図 １０Ａに示される様に、全てのオリゴヌクレオチドがｐＵｃ１８プラスミドのユ ニークなＳａｃ　１制限工ンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいた。

対合複合体は、オリゴヌクレオチドと二本鎖ＤＮＡが共有する相同の２０個の塩 基によって形成されていた（図１０８１　レーン９）。Ｓａｃ　ｒによる分解か ら防御されたスーパーコイルＤＮＡの定量によって、オリゴヌクレオチドが相同 の塩基を５６または３８個含んでいる場合には、二本鎖ＤＮＡの７０〜７５％が 対合複合体として存在する事か示された（レーン３および５）。５５％と２０％ の二本鎖が、それぞれ２６および２０個の相同の塩基をもつ対合複合体に転換さ れた。対合複合体の形成には、ｒｅｃＡタン／＜り質と相同のオリゴヌクレオチ ドの両者が必要であった。レーン１の対照は、制限酵素を含めずに、オリゴヌク レオチドとｒｅｃＡと共に二本鎖をインキュベートすると、スーパーコイルＤＮ Ａが無傷で残る事を示している。レーンｌＯに示す様に、Ｈｉｎｄ　ｍは３８塩 基長のオリゴヌクレオチドに含まれる範囲から１４塩基対離れた部位において切 断するが、対合複合体はＨｉｎｄ　ｍによる切断を防御しなかったので、対合複 合体の存在形跡がオリゴヌクレオチドと平行する二本鎖の領域を大幅に超えない 事が推定された。更に、この分析において、相同でないオリゴヌクレオチドは、 ｒｅｃＡにより対合複合体を形成しない。

ｒｅｃＡタンパク質は、相同の３２ｐ標識されたオリゴヌクレオチドとｐＵｃ１ ８プラスミドＤＮＡの間で、除タンパクされた時に安定な結合分子を形成する事 ができる（図１００）。この分析ではオリゴヌクレオチドと二本＠　ＤＮＡに共 通な相同塩基がわずか２６個あれば、結合分子を形成するのに十分であったが、 ２０個の相同塩基では不十分であった。安定した結合分子の回収量の定量から、 複合体をＴＡＢ緩衝液（図１０の説明を参照）中で電気泳動にかけると、ｐＵｃ １８二本鎖の約２０〜５０％が相同の５６塩基長のオリゴヌクレオチドと対を形 成している事が示された。対合複合体について観察された様に、ｒｅｃＡタンパ ク質による結合分子形成の効率は、ベアリングに利用できる相同性の長さの関数 として、増大する。これらの除タンパクされた結合分子は、スーパーらせん歪み （ｓｕｐｅｒｈｅｌｉｃａｌ　５ｔｒａｉｎ）がベアリング領域の外側に位置す る制限エンドヌクレアーゼ部位における直線化の際に遊離されると、解離する（ 図１０ｃ、レーン１０）。

二本ｆｆ１ＤＮＡとオリゴヌクレオチドの間で形成される結合分子は、残留して いるｒｅｃＡタンパク質によって安定化される事はない。ＳＤＳ、プロテイナー ゼにとフェノール／クロロホルム抽出処理により対合複合体を除タンパクした場 合、回収された安定した結合分子の数は変わらなかった。

対合複合体の形成に用いられた分析条件は、相同の５６塩基対を用いる結合分子 形成に最適である事が証明されたものであった。結合分子形成によって、オリゴ ヌクレオチド濃度の最適条件［２ａＭの幅が狭く、０．９μＭのオリゴヌクレオ チドでは結合分子が生成されず、１゜８μＭまで濃度を増加しても、結合分子の 収率の増加は全く認められなかった。これらの分析に使用されたｒｅｃＡの量（ １５μＭ）は、−末鎖オリゴヌクレオチド濃度に関して飽和している。ＡＴＰ− ガンマ−３とＡＤＰの両者が１．３のモル比で存在していると、対合複合体と結 合分子を迅速に検出する事ができた。ＡＴＰ−ガンマ−８とＡＤＰの比率、また はこれらの二つの補因子の濃度が変化すると、対合複合体と結合分子の両者の形 成効率が低下した。

二価の陽イオンが試験管内におけるｒｅｃＡ活性に必須である事は十分に確立さ れている。結合分子の安定化にＭｇ２″−が必要かどうかを決定するために、研 究が行われた。図１０に示す様に、ｒｅｃＡの存在下に対合複合体が形成された 。ＳＤＳだけを加えて反応物を除タンパクし、反応生成物を５ｍＭのＭｇＣ１， を含むアガロースゲル上で電気泳動にかｔすて分析した。Ｍｇ＝＋が存在する場 合の結合分子の回収率は、電気泳動段階でＭｇ”が含まれない場合よりも２〜４ 倍高かったが、質的な差異はみとめられなかった。すなわち、安定した結合分子 は、相同な２６塩基を含むオリゴヌクレオチドとは形成されたが、相同な２０塩 基を含むオリゴヌクレオチドとは形成されなかった。

図１０に示すデータは、ＡＴＰ−ガンマ−８の存在下における対合複合体の形成 は、安定した除タンパク結合分子を形成する経路の中間段階である事を示してい る。除タンパクされた結合分子とｒｅｃＡを含む対合複合体の形成から、ベアリ ングに利用できる相同領域の長さに対する依存性が示された。また、対合複合体 と結合分子の両者の形成が、相同な５６塩基によって、比較的高い効率で起こる 事も示された。すなわち、これらの対合複合体を除タンパクするとき、二本＠　 ＤＮＡの大部分はなお、Ｍｇ２＋の存在下で、安定した結合分子内のオリゴヌク レオチドと対を形成している。

直鎖状二本鎖ＤＮＡを含む対合複合体 非常に短い相同領域を含む対合複合体の形成には、スーパーらせん歪み（ｓｕｐ ｅｒｈｅｌｉｃａｌ　５ｔｒａｉｎ）は必須ではない。対合複合体の形成には、 ｒｅｃＡ、直鎖状二本鎖、３３塩基長の相同のオリゴヌクレオチドが必要である （図１１Ａ）。図１１８において、ｒｅｃＡがこれら２つの基質の間で対合複合 体を形成し、それによって直鎖状二本鎖をＣ１ａ　Ｉによる切断から防御してい る事は、明らかである（レーン４）。ｒｅｃＡまたはオリゴヌクレオチドが存在 しない場合（それぞれレーン２および６）、あるいは非相同のオリゴヌクレオチ ドが存在する場合には（レーン５）、対合複合体は形成されなかった。

支１■ 対合複合体が存在した形跡 ｒｅｃＡ対合複合体による制限エンドヌクレアーゼの切断作用の防御範囲がマツ ピングされた（図１２）。ｐＵｃ１８プラスミドＤＮＡのポリリンカー配列部位 と相同の２０塩基のオリゴヌクレオチドを、スーパーコイルｐＵｃ１８とｒｅｃ Ａの存在下にインキュベートし、対合複合体を形成した。Ｂａｍ旧、Ｋｐｎ　Ｉ 、Ｐｓｔ　Ｉ、　Ｓａｃ　Ｌ　Ｓｐｈ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位において 防御作用が観察された。しかし、Ｅｃｏ　ＲＥとＨｉｎｄ　ｍによる切断は、対 合複合体が存在しても、防御されなかった。従って、対合複合体の存在を示す形 跡は、対を形成したオリゴヌクレオチドの５゛と３゛末端から約１３〜１４塩基 超えた所まで、対称に及んでいる事は明らかである。

Ｌ１■ 対合複合体と結合分子形成の方向性 結合分子形成の方向性は、明らかにＤＮＡ基質の選択、共有相同領域の長さ、反 対の方向性により形成された結合分子の相対的安定性によって影響される（　Ｋ ｏｎｆｏｒｔｉ等、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２６５．６９１６　（１９９０ ）；　Ｒａｏ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８８．２９ ８４　（１９９１））。従って、スーパーコイル二本鎖とオリゴヌクレオチドを 含む対合複合体形成と結合分子形成の両者の方向性が検討された。５６塩基の相 同領域を含む対合複合体の形成は、方向性を示さない。オリゴヌクレオチドのど ちらの末端に相同領域が位置しているかとは無関係に、対合複合体がｒｅｃＡに よって形成された。図１３の実験において、ｐｕｃｔｇのポリリンカー領域に相 同な５６塩基のオリゴヌクレオチドを用いた。あるいは同じ５６塩基の配列とオ リゴヌクレオチドの５゛末端、３°末端、または５°と３′末端の両方に非相同 の２０塩基の配列を持つ幾つかのオリゴヌクレオチドの１つを用いた（図１３Ａ ）。金側において、対合複合体は、はぼ同じ効率で形成された（図１３Ｂ１　レ ーン５．７．９．１１）。これに反して、ｒｅｃＡによる安定した結合分子の形 成は、方向性を示し、オリゴヌクレオチドの５°末端に相同部位がある場合に非 常に高い効率で形成された。７６Ｒオリゴヌクレオチドによって形成された結合 分子数は、５６塩基のオリゴヌクレオチドによって形成された結合分子数の半分 であり（図１３Ｃ１レーン２および６）、一方７６Ｌオリゴヌクレオチド（レー ン４）または９６オリゴヌクレオチド（レーン８）は１０倍も少ない結合分子を 形成した。

割１五月 相同領域の探索に必要な最小構造 ｐＢＲ３２２の配列と相同の３３．１５．１３塩基長の３つのオリゴヌクレオチ ド（図１４Ａ）を、ｒｅｃＡの存在下に、ｐＢＲ３２２スーパーコイルプラスミ ドＤＮＡと共にインキュベートした。１５塩基オリゴマーの潜在的な切断部位は 図１４Ｂに、そしてその形跡は図１４Ｃに示されている。Ｈｉｎｄ　ｍとＣ１ａ ｌエンドヌクレアーゼによる切断に対する抵抗性から証明された様に、１５塩基 のオリゴマーは、対合複合体を形成するのに十分な長さであった（レーン４およ び７）。

この分析において、３３塩基のオリゴマーを使用すると、対合複合体を形成した が、１３塩基のオリゴマーは形成されなかった。対照実験によって、対合複合体 の形成には、オリゴヌクレオチドとｒｅｃＡの両方が存在する必要があった事が 示されている。対合複合体が存在した形跡は、ベアリング領域以外には及ばなか った事は明らかである（図１４Ｃ１レーン１０参照）。この実験は、ｒｅｃＡが 、ｐＵｃ１８　（図１０）またはｐＢＲ３２２（図１１）の配列のどちらかを含 む相同のＤＮＡで対を形成した事から、ｒｅＣＡによる対合複合体の形成が、特 定の配列に限定されなかった事も証明している。

寒１」１」 ベアリングの核を形成するには、 核タンパク質フィラメントのらせん の半回転が必要である ｒｅｃＡによって認識される最小相同領域を決定するために、Ｃ１ａ　１１７８ 位が付いたｐＢＲ３２２と５°または３゛末端に相同領域を有する２０塩基長の 一連のオリゴヌクレオチドを使用した（表１参照）。この実験は、この分析にお いてｒｅｃＡによって認識される最小相同領域を確立するだけでなく、ｒｅｃＡ によるベアリングの開始に方向性があるかどうかを明確に確立するものである。

図１５に示す結果は、ｒｅｃＡが、相同の僅か８個の塩基を５゛または３°末端 で、低効率ではあるが（それぞれ１０％および１２％）、結合できる事を示して いる。これらの結果より明らかになった事は、核タンパク質フィラメントの形成 と相同部分のベアリングの閾値は異なっており、−末鎖ＤＮＡの５′末端あるい は３°末端のどちらでもベアリングの核となり得ることである。相同部分の探索 を行い得る構造を形成するには、１５個の塩基が必要であるが、これらの塩基の 内半分だけがｒｅｃＡによって認識さべ　ベアリングされれば良いのである。

表１　ｐＢＲ３２２に対する相同な塩基数を減少させたオリゴヌクレオチドの配 Ｆｌｌ囚り系刊 配列　相同性（塩基数） ５’　ＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡ　３’　２０ＧＡＡＴＡＴＡ ＴＧＣＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡ　１０ＧＡＡＴＡＴＡ丁ＧＣＣＡＣＡＴＣＧＡＴＡ 　ＢＧＡＡＴＡＴＡＴＧＣＣＡＴＧＴＣＧＡＴＡ　６ＧＡＡＴＡＴＡＴＧＣＣＡ ＴＧＧＡＧＡＴＡ　４ＧＡＡＴＡＴＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＣＧＴ　Ｏ包り系烈 配列　相同性（塩基数） ＣＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧＡＡＴＡＴＡＴＧＣ０衷、１ＬｉＬば ｒｅｃＡによりオリゴヌクレオチドの標的を定める一つの二本鎖分子内に存在し ていて、類似しているが異なる配列を標的として、ｒｅｃＡがどの程度それらの 標的を区別できるかが検討された。３箇所のＮｄｅ　Ｉ認識部位を有するスーパ ーコイルＭ１３ｍｐ１ｇ遺伝子の複写型ＤＮＡが、ｒｅｃＡの存在下に、Ｎｄｅ 　Ｉ認識配列を含む３ｏ塩基長のオリゴヌクレオチドと、Ｍ１３ｍｐ１８の３箇 所のＮｄｅ　Ｔ認識部位の１箇所に隣接する配列がインキュベートされた（第１ 部位、図１６Ａ参照）。対合複合体の第■部位のみにおける形成は、対合複合体 をＮｄｅ　ｒエンドヌクレアーゼによって分解した後に６１７０塩基長のＭ１３ ｍｐ１８断片が出現するかどうかでモニターした。このような断片は、第■部位 が切断されずに第■部位と第■部位の両者が切断された時のみに出現する。

ｒｅｃＡは、ＤＮＡ分子の大多数において第■部位のみへのベアリングを標的と することが出来た（図１６Ｂ１　レーン５）。このような標的化には、オリゴヌ クレオチドとｒｅｃＡの両者の存在が必要であった（レーン３および４）。

Ｎｄｅ　Ｉとインキュベートされた全試料において１０８０塩基長の断片が存在 するのは、防御されていない第■部位と第■部位の両者にＮｄｅ　Ｉによる切断 が及ぶ程度を知るための対照である。レーン５における各分画の定量化によって 、標的とした第１部位へのベアリングの識別能力は、これらの条件下では、第■ 部位および第■部位の約７〜８倍であることか示されている。

実施例１３〜１５に関する実験の詳細。

オリゴヌクレオチド： オリゴヌクレオチドは、ＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に よって、２０ｍＭの水酸化ナトリウム中の１００ｍＭからＩＭの塩化ナトリウム 勾配液を用いて精製された。ピークの分画の部分標本は、３２ｐ標識され、ポリ アクリラミドゲル上で電気泳動された。最も精製度が高い分画が貯蔵され、エタ ノールで沈殿され、水に溶解された。

２６０ｎＭにおけるＯＤ単位の１単位は、３３μｇであると想定して濃度を決定 した。

ｒｅｃＡ ｒｅｃＡタンパク質は細菌株を用いて精製された。プロトコルの詳細は、シカゴ のノースウェスタン大学メディカルスクールの５ｔｅｐｈｅｎ　Ｋｏｔｖａｌｃ ｚｙｋｏｗｓｋｉ博士の好意によって提供された。使用された細菌株は、ＪＣ１ ２７７２であった（Ｕｈｌｉｎ等、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４８．３８ ６　（１９８１））。

精製は、スペルミジン沈殿法（Ｊ、　Ｇｒｉｆｆｉｔｈ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　２４．１５８　（１９８５））に基づき、ＡＴＰ溶出による一本鎖ＤＮ Ａアガロースカラム（Ｃｏｘ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌｌ、　２５６ ．４６７６　（１９８１））を用い、微量のヌクレアーゼによる汚染を無くすた めに、Ｍｏｎｏ　Ｑカラムを使用した。このような汚染の除去は、望ましくない 非特異的なりＮＡ分子のニック（二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖の切断）を避けるた めに重要である。ｒｅｃＡタンパク質の濃度は、１％Ｅ２８゜＝５．９の吸光度 係数を使用して測定した（Ｃｒａｉｇ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｎ、　２ ５６．８０３９　（１９８１））。

支五五月 ラムダＤＮＡの配列特異的な切断 配列に特異的なラムダＤＮＡの１箇所における切断は、図１８において証明され ている。ラムダＤＮＡの長さは４８゜５ｋｂで、５箇所のＥｃｏ　ＲＩ部位を含 む（Ｌａｍｂｄａ　ＩＩ、ＨｅｎｄｒｉＸ等編（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、　１９８３）中のＤａｎｉｅｌｓ等、　５１６−６７８ペ ージ）。３１，７４７のヌクレオチド位置が切断部位として選ばれ、ラムダＤＮ Ａを３１．７ｋｂと１６．８ｋｂの２つの断片に切断した。この部位に相同な３ ０塩基長のオリゴヌクレオチドが合成された。図１８Ｂはこのオリゴヌクレオチ ドを用いた切断実験の結果を示している。レーン１は切断されていないラムダＤ ＩｆＡであり、レーン２は完全に切断された実験結果を示している。レーン２の 濃度測定によって、ＤＮＡの７９％が、計画通りの２つの断片に切断され、１９ ％は切断されなかったことが判明した。全部で２％のＤＮＡは、ラムダＤＮＡに 存在する他の４箇所のＥｃ。

Ｒ１切断部位の内の１箇所で切断されていた。これは、ｒｅｃＡタンパク質とオ リゴヌクレオチド複合体による非特異的なメチル化による防御、あるいは、不完 全メチル化が原因である。レーン３．４．５の対照は、それぞれｒｅｃＡタンパ ク質、オリゴヌクレオチド、メチラーゼを除いたものである。レーン３において は、ｒｅｃＡタンパク質を除いたことによる不完全なメチル化が明らかに認めら れた。これは、恐ら＜　ｒｅｃＡタンパク質によって覆われない遊離オリゴヌク レオチドがメチラーゼを抑制しているのが原因と思われる。レーン４においても ＤＮＡ分子は、軽度の不完全メチル化を呈していた。恐らく、この原因は、遊離 ｒｅｃＡタンパク質がラムダＤＮＡの二本３１分子に結合することにより、非特 異的な防御作用が発揮されるからであろう。この作用は、オリゴヌクレオチドの 定量化が行われた図１９および図２０において、より顕著に認められた。

１１轟］ 大腸菌ＤＮＡの配列に特異的な切断 実験の詳細 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎより、野 性型の大腸菌株Ｗ３１１０を入手し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で、６０ ０ｎｍの吸光度（ＯＤ）が５になるまで、１晩培養した。５ｍｌの細胞が小球化 され（湿性重量３ｏｍｇ）、１（１ｍＭのトリス塩Ｈ（ｐＨ７，２）、２０ｔｎ ＭｔＤｔＭ化ｆ　）　’）　ウＬ、１００ａ＋ＭノＥＤＴＡチ一度だけ洗浄し、 このＭ新液１ｒｎｌ中に再度懸濁された。

この懸濁液は６５℃にされ、６５℃の１．６％低温融解アガロース（ＩｎＣｅｒ ｔ　ａｇａｒｏｓｅ、　ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　１ｍｌとパラフィン オイル４ｍｌに加えられた。懸濁液を渦巻き状にして、直径２５から１００μｍ のマイクロビーズが作成された（Ｍ、　ＭｃＣＩｅｌｌａｎｄＸＭｅｔｈｏｄｓ 　Ｅｎｚｙｒｎｏｌ、　１５５．２２　（１９８７））。

ビーズは、ＩｍＢｅｄキット（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用 ２　いて、製造会社の使用指示書に従ってリゾチーム（ｌｙ’　ｓｏｚｙｍｅ） とプロティナーゼＫによって分解された。他社ｊ１　製のリゾチームとブロティ ナーゼにの試薬でも同様な良４　好な結果が得られた。ビーズは、４℃で貯蔵さ れ、使用直前に５０ｍＭのＥＤＴＡで３０分間インキュベートされ、２５ｍＭ蹟 ノドリス酢酸（ｐＨ７，５）、４ｍＭの酢酸マグネシウム、０４ｍＭのジチオト レイトール、０．５ｍＭのスペルミジンで平衡化された。

結果： 大腸菌ＤＮＡに切断反応を行った結果は、図１９に示されている。この場合には 、２箇所を切断して断片を作成するために、１組のオリゴヌクレオチドが加えら れた。本方法の能力を知るために、大きな断片が生成された。

図１９Ａに示されているように、１つのオリゴヌクレオチドはこれらの各遺伝子 中に、ＥｃｏＲＴ部位を含んでいた。この２つの遺伝子は、染色体上で５２０ｋ ｂｌｊｉれて位置し　（Ｒｕｄｄ等、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８． ３１３　（１９９０））、　これらの２箇所の標的となる配列の間に、少なくと も６７箇所のＥｃｏ　Ｒ１部位が存在する（　Ｋｏｈａｒａ等、Ｃｅ１ｌ　５０ ．４９５（１９８７））。図１９Ｂｉ；！、予想サレタ５２ｏｋｂノハントヲ示 シている。ｒｅｃＡタンパク質モノマーに対する５種類のヌクレオチド残基を有 するオリゴヌクレオチドの濃度の最適範囲がかなり明瞭に観察された（レーン２ ）。コレハ、図１９Ｃのサザンプロットにおいてより明瞭に認められる。

プロットの濃度測定では、収率は断片の４０％であった。

ラムダＤＮＡの切断において見られた様に、オリゴヌクレオチドの濃度が低い場 合には、メチル化に対してｒｅｃＡタンパク質による非特異的な防御作用が存在 し、５２０ｋｂの断片はより小さな断片に切断された。オリゴヌクレオチドの濃 度が高い場合でも、５２０ｋｂの断片はより小さな断片に切断された。これは、 図１８Ｂのレーン３におけるラムダＤＮＡを用いた結果からも予想されることで ある。

ｒｅｃＡタンパク質モノマーに対する５つのヌクレオチド残基の最適量に関して は、オリゴヌクレオチドの長さが３０塩基から６０塩基に増加しても、同様のパ ターンを呈した。この場合のみ、２０ｋｂ断片の収率は６０％に増加した。

異なるオリゴヌクレオチドの組み合わせによる４０％および６０％の収率は、そ れぞれ、片側よりの切断の最小効率である６３％、７７％に対応する。この値は 、ラムダＤＮＡの切断効率である７９％に近似している。

ある種の応用の場合には、Ｅｃｏ　ＲＩ部位の両側の配列を知ることは困難であ る。従って、Ｅｃｏ　Ｒ１の認識部位であるＧＡＡＴＴＣ配列が、前記の研究の 様にオリゴヌクレオチドの中間ではなく、１組のオリゴヌクレオチドの５゛末端 、あるいは３′末端に存在する場合の断片の収率が測定された。認識配列がオリ ゴヌクレオチド（長さ３０塩基）の５°末端に存在した場合には、収率は２ない し４倍低下した。この配列が３′末端に存在した場合には、収率はさらに２倍低 下した。

実ｍ ヒトＤＮＡの配列に特異的な切断 実験の詳細： ｌＸｌｏａ個の細胞（湿性重量１５０ｍｇ）を燐酸塩緩衝等張食塩水で２回洗浄 し、リゾチームによる分解処理は行わず、それ以外は実施例９の大腸菌ビーズの 様に、ＨｅＬａ細胞のＤＮＡを含むビーズが調整された。

結果： ヒトＤＮＡに対する切断反応が起こり、切断は同様に成功した。嚢胞性線維症（ ｃｙｓｔｉｃ　Ｈｂｒｏｓｉｓ：　ＣＦ）の遺伝子の部位は、広い範囲に渡って 同定され配列が決定されているので（Ｒｏｍｍｏｎｓ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ５．１０５９　（１９８９）；　Ｒｉｏｒｄａｎ等、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４５ ．１０６６　（１９ｇ９）；　Ｚｉｅｌｅｎｓｋｉ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１０ ．２１４　（１９９１））、この方法を試験するための遺伝子部位として用いら れた。図２ＯＡは、ＣＦ遺伝子部位の簡略な模式図である。Ｅｃｏ　Ｒ１部位は 、イントロン１に存在し、エキソン１９に存在するもう１箇所のＥｃｏ　Ｒ１部 位から１８０ｋｂ離れている。この１８０ｋｂの長さのゲノムＤＮＡの上に、他 に少なくとも４１箇所のＥｃｏ　ＲＩ部位が発見されている（　Ｒｏｍｍｏｎｓ 等、５ｃｉｅｎｃｅ　２４５．１０５９　（１９８９））。臭化エチジウムで染 色されたゲルが図２０Ｂに示されており、オリゴヌクレオチドの濃度が低下する とより小さな断片がどのように生成されるがを示している。このパターンは、再 現性が非常に高く、サザンブロフト分析を行わなくてもオリゴヌクレオチドの最 適濃度を決定することが出来た。このゲルのサザンプロット分析は図２０Ｃに示 されている。断片の最高収率はレーン３に認められた（８６％）。レーン２では 、収率はより少なくなっている（３２％）が、全体の切断がレーン２においては レーン３よりもかなり低下していた。従って、レーン２の１８０ｋｂ領域から得 られたＤＮＡは、恐ら＜ＣＦ遺伝子部位からのＤＮＡの中で最も濃縮されていた ものと思われた。

レーンＳに示された対照は、５ｆｉＩによる分解によって生成された２７０ｋｂ の断片である（　Ｒｏｍｍｏｎｓ等、５ｃｉｅｎｃｅ２４５．１０５９　（１９ ８９））。予想されていた４８ｋｂの断片も、エキソン１３および１９における 特異的な切断によって生成することが出来た。

図２０Ｃにおいては、レーン３〜６において１８０ｋｂの断片がより小さな断片 に更に切断されていたことも認められた。これらの断片は、恐らくイントロンｌ あるいはエキソン１９における１箇所の特異的な切断、および断片内部の非特異 的な切断によって生成されたものであろう。

エキソン１９の部位から５０ｋｂのプローブを用いたので、５０ｋｂ以下の長さ の断片はハイブリッド形成しなかったが、５０ｋｂ以下の長さの断片が存在する と推定された。

上に記載された全ての参考文献の全内容は、参照することにより本明細書の一部 をなすものとする。

本発明のある部分は、明確さと理解を得るために、ある程度詳細に記載されてい る。本技術分野に精通する者には、本発明の真の範囲がら逸脱することなく、形 式および詳細に関して種々の変更が行われ得ることが理解できるであろう。

ＦＩＧ、　ＩＡ ＦＩＧ、　ＩＢ ｎ σ３グ４どビ６ダ７５°ａぎ ０°３７°４ｇ５５′ピアＣ８５゜ 原点→ Ｍ１３ｍｐ１９−・−＃　ＦＩＧ、　４Ｅ原点時 ｄｓ◆ ＦＩＧ、　７Ａ ００５５°６５°７５°８５゜ ＦＩＧ、　７Ｂ ＦＩＧ、　８Ａ ＦＩＧ、　８Ｂ−１ ＦＩＧ、　８Ｂ−２ ＦＩＧ、　８Ｂ−３ ＦＩＧ、　８Ｂ−４ Ｃ１ａｌ　−＋　＋　＋　＋　＋ ＦＩＧ、１１Ｂ ゜暴１９゜−−−−５６−−７６Ｌ−−７６Ｒ−−９６−ＲｅｃＡ　−−＋　− ＋　−＋　−＋　−＋ＢａｍＨ１−＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋口 Ｇ、１３Ｂ ５’　ＡＧＣＴＴＡＴＣＡ丁ＣＧＡＴＡ　３’ＦＩＧ、　１４Ｃ 相同の長さく塩基対数ｂｐ） 日Ｇ、１５Ａ 相同の長さく塩基対数ｂｐ） 日Ｇ、１５８ ＦＩＧ、　１６Ａ ＲｅｃＡ　−−−−＋＋　− Ｎｄｅｌ　−−＋　＋　十　＋Ｂａｍ）ｌ・、−・　・　・　・１ ｍ−４−６１７０ 一−−−３０４３ ＦＩＧ、　１６Ｂ λＤＮＡ 叱、５　ｋｂ ＦＩＧ、　１８Ａ ＦＩＧ、　１８８ 手続補正書岨発） 平成５年６月２８日。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．三本鎖ＤＮＡ分子の鎖項が、該三本鎖ＤＭ分子の他の少なくとも一つの鎖と ハイブリッド形成している三本鎖ＤＮＡ分子の形成方法であって、二本鎖ＤＮＡ 分子と、該二本鎖ＤＭ分子の一つの鎖と十分に相補的な一本鎖ＤＮＡ分子とを、 組換えタンパク質に接触させ、それらの間でハイブリッド形成を行うことからな り、ここで該接触が該一本鎖ＤＭ分子が該二本鎖ＤＮＡ分子とハイブリッド形成 して、該三本鎖ＤＮＡ分子を形成するような条件下で行われる三本鎖ＤＮＡ分子 の形成方法。
2. ２．上記組換えタンパク質が、大腸菌ｒｅｃＡであるか、または、細菌あるいは バクテリオファージのｒｅＣＡ類似タンパク質である請求項１に記載の方法。
3. ３．上記組換えタンパク質が、真核細胞のリコンピナーゼあるいはｒｅｃＡ類似 のタンパク質である請求項１に記載の方法。
4. ４．上記リコンビナーゼタンパク質がヒトのリコンビナーゼタンパク質である請 求項３に記載の方法。
5. ５．下記のステップからなる、特定部位において二本鎖ＤＮＡ分子を切断する方 法。 ｉ）組換えタンパク質を、該二本鎖ＤＭ分子と、該二本鎖ＤＭ分子の一部に十分 に用相補的な一本鎖ＤＮＡ分子とに接触させるステップ、ここで該接触は、該一 本鎖ＤＭ分子が、該二本鎖ＤＭ分子に対合して三本鎖ＤＭ分子が形成される様な 条件下において行われ、ここで、該三本鎖ＤＮＡ分子の各鎖は、該三本鎖ＤＮＡ 分子の他の少なくとも一つ鎖とハイブリッド形成しており、 ここで、当該一本鎖ＤＭ分子の一方の末端には切断部分が付着しており、該末端 は該特定切断部位に隣接している。 ｉｉ）該切断部分が該特定切断部位において切断作用を発揮するような条件下に 該切断部分をさらすステップ。
6. ６．上記組換えタンパク質が、大腸菌ｒｅｃＡであるか、または、細菌あるいは バクテリオファージのｒｅＣＡ類似タンパク質である請求項５に記載の方法。
7. ７．上記組換えタンパク質が、真核細胞のリコンビナーゼあるいはｒｅｃＡ類似 のタンパク質である請求項５に記載の方法。
8. ８．上記切断部分がキレート剤である請求項５に記載の方法。
9. ９．上記切断部分が光によって活性化される色素である請求項５に記載の方法。
10. １０．上記切断部分が上記一本鎖ＤＮＡ分子にスペーサ分子を介して結合してい る請求項５に記載の方法。
11. １１．上記スペーサ分子が、少なくとも１個のメチレン基からなる請求項１０に 記載の方法。
12. １２．上記特定部位が遺伝子治療の標的部位である請求項５に記載の方法。
13. １３．上記特定部位が遺伝子不活性化あるいはＲＮＡ不活性化のための標的であ る請求項１２に記載の方法。
14. １４．下記のステップからなる、二本鎖ＤＮＡ分子内の特定のＤＮＡ配列の存在 を同定する方法。 ｉ）該二本鎖ＤＭ分子と、該二本鎖ＤＮＡ分子内に存在する特定の配列と十分に 相補的であるかあるいはその相補ＤＮＡである一本鎖ＤＮＡ分子とを組換えタン パク質に接触させ、それらの間にハイブリッドを形成させるステップ、ここで該 接触は、該一本鎖ＤＮＡ分子が該二本鎖ＤＮＡ分子とハイブリッド形成して、三 本鎖ＤＮＡ分子が形成されるような条件下で作用させ、 ここで、該三本鎖ＤＮＡ分子の各鎖は、該三本鎖ＤＮＡ分子の他の少なくとも一 つ鎖とハイブリッド形成しており、 ここで、該一本鎖ＤＮＡ分子は、検出可能な指標を結合している。 ｉｉ）該三本鎖ＤＭ分子をハイブリッド形成しなかった一本鎖ＤＮＡ分子から選 別するステップ。 ｉｉｉ）該三本鎖Ｄ甘Ａ分子に付着した指標を検出するステップ。
15. １５．少なくとも１箇所の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有する二本鎖ＤＮ Ａ分子を該制限酵素による切断から防御する方法であって、 二本鎖ＤＮＡ分子と、該二本鎖ＤＮＡ分子内に存在する特定の部分に十分に相補 的であり、少なくとも最低一箇所の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む一本 鎖ＤＮＡ分子とを組換えタンパク質に接触させ、該一本鎖ＤＮＡ分子と該二本鎖 分子とのハイブリッド形成を起こし、三本鎖ＤＮＡ分子を形成するステップから なり、ここで、該接触は、該一本鎖ＤＭ分子が該二本鎖ＤＮＡ分子とハイブリッ ド形成して、該三本鎖ＤＮＡ分子が形成されるような条件下で作用させ、 ここで、該三本鎖ＤＮＡ分子の各鎖は、該三本鎖ＤＮＡ分子の他の少なくとも一 つの鎖とハイブリッド形成している、 少なくとも１箇所の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有する二本鎖ＤＮＡ分子 を該制限酵素による切断から防御する方法
16. １６．二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖に存在する特定の遺伝子配列の転写を抑制す る方法であって、該二本鎖ＤＮＡ分子と、該遺伝子配列に十分に相補的な一本鎖 ＤＭ分子とを、組換えタンパク質に接触させ、それらの間にハイブリッド形成を 起こすことからなり、ここで、該接触は、該一本鎖ＤＮＡ分子が該遺伝子配列と ハイブリッド形成して、三本鎖ＤＮＡ分子が形成されるような条件下で作用させ 、 ここで、該三本鎖ＤＮＡ分子の各鎖が、該三本鎖ＤＮＡ分子の他の少なくとも一 つの鎖とハイブリッド形成している、 二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖に存在する特定の遺伝子配列の転写を抑制する方法 。
17. １７．下記のステップからなる、試料中に存在する特定の二本鎖ＤＮＡ分子を選 別する方法。 ｉ）該二本鎖ＤＮＡ分子と、該二本鎖ＤＮＡ分子中に存在する特定の配列に十分 相補的な一本鎖ＤＭ分子とを組換えタンパク質に接触させ、それらの間にハイブ リッド形成を起こすステップ、ここで、該接触は、該一本鎖ＤＮＡ分子が該遺伝 子配列とハイブリッド形成して、三本鎖ＤＭ分子が形成されるような条件下で作 用させ、ここで、該三本鎖ＤＮＡ分子の各鎖は、該三本鎖ＤＮＡ分子の少なくと も他の一本鎖とハイブリッド形成しており、 ここで、該一本鎖ＤＮＡ分子は、それに結合した結合対の最初の部分を持つ。 ｉｉ）該三本鎖ＤＮＡ分子をハイブリッド形成しなかった一本鎖ＤＮＡ分子から 選別するステップ。 ｉｉｉ）該三本鎖ＤＮＡ分子を該結合対の第二部分と接触させるステップ。 ｉｖ）該結合対の該第二部分と結合した該三本鎖ＤＮＡ分子を分離するステップ 。
18. １８．下記のステップからなる、少なくとも２箇所の制限エンドヌクレアーゼ認 識部位を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、第一部位において該部位に特異的な制限酵 素によって切断する方法。 ｉ）二本鎖ＤＮＡ分子と、該制限エンドヌクレアーゼ認識部位の第一部位を含む 該二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖の一部と十分に相補的な一本鎖ＤＮＡ分子とを、 組換えタンパク質に接触させ、それらの間にハイブリッド形成を起こすステップ 、 ここで、該接触は、該一本鎖ＤＮＡ分子が該二本鎖ＤＮＡ分子とハイブリッド形 成して、三本鎖ＤＮＡ分子が形成されるような条件下で作用させ、 ここで、該三本鎖ＤＮＡ分子の各鎖は、該三本鎖ＤＮＡ分子の他の鎖の少なくと も一つとハイブリッド形成している。 ｉｉ）該認識部位の他の少なくとも一つの部位を修飾して該制限酵素から防御す るステップ。 ｉｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ分子から該一本鎖ＤＭ分子を解離させるステップ。 ｉｖ）該二本鎖ＤＭ分子を該制限酵素認識部位の該第一部位で切断するステップ 。
19. １９．二本鎖ＤＭ分子の配列を遺伝子修飾剤による修飾作用から防御する方法で あって、 二本鎖ＤＮＡ分子と、該二本鎖ＤＮＡ分子の該配列に十分相補的な一本鎖ＤＮＡ 分子とを、組換えタンパク質に接触させ、それらの間にハイブリッド形成を起こ すことからなり、 ここで、該接触は、該一本鎖ＤＮＡ分子が該二本鎖ＤＮＡ分子とハイブリッド形 成して、三本鎖ＤＮＡ分子が形成されるような条件下で作用させ、 ここで、該三本鎖ＤＮＡ分子の各鎖が、該三本鎖ＤＮＡ分子の他の少なくとも一 つの鎖とハイブリッド形成している、 二本鎖ＤＭ分子の配列を遺伝子修飾剤による修飾作用から防御する方法。
20. ２０．該修飾がメチル化であり、該修飾剤がメチラーゼである請求項１９に記載 の方法。