JP2002209590A - 核酸末端領域の非対称的修飾法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、標的核酸の末端領域の一方に、所
望の処理を優先的に施す方法を提供することを課題とす
る。 【解決手段】 前記課題を解決するために、本発明は、
標的核酸の末端領域の一方に、所望の処理を優先的に施
す方法であって、前記標的核酸を含む試料に、ＲｅｃＡ
タンパク質と、前記処理を施すべき末端領域とは反対側
の末端領域と相同な核酸プローブとを添加することによ
り、前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記標的核酸に前
記核酸プローブを結合させ、前記反対側の末端領域を三
本鎖構造にする工程と；前記標的核酸に結合した前記Ｒ
ｅｃＡタンパク質を前記標的核酸から解離させて、前記
ＲｅｃＡタンパク質が解離し、且つ前記反対側の末端領
域が三本鎖構造になった核酸を得る工程と；該核酸に前
記処理を施すことにより、標的核酸の末端領域の一方に
優先的に所望の処理を施す工程とを備えた方法を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸の末端領
域の一方に、所望の処理を優先的に施す方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子のクローニングや遺伝子ライブラ
リーの構築、ポリメラーゼ連鎖反応(以下ＰＣＲと称す
る)等の遺伝子工学的技術は、遺伝子の切断や連結、及
び遺伝子へのマーカーやアダプターの付加等の基本的操
作を組み合わせることによって行われる。

【０００３】これらの操作は、遺伝子工学に不可欠な基
礎的手法であるが、所望する特定の領域のみにこのよう
な操作を行うことができれば、さらに多くの有用な手法
を開発することができる。

【０００４】例えば、遺伝子にアダプターを付加する場
合、標的核酸の末端領域が等価であれば、両末端領域に
同じアダプターが付加されてしまうが、５’ＲＡＣＥを
実施するときには、片方の末端領域のみにアダプターを
付加することができれば有用である。

【０００５】所望する特定の領域のみに遺伝子工学的な
操作を施す場合にも、ＰＣＲは多用されているが、標的
核酸のサイズが大きい場合には、ＰＣＲによる操作は不
可能である。

【０００６】このため、所望する特定の領域や所望する
特定の遺伝子のみに遺伝子工学的な操作を施すための、
より汎用性のある方法が望まれていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、標的核酸の
末端領域の一方に、所望の処理を優先的に施す方法を提
供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に、本発明は、標的核酸の末端領域の一方に、所望の処
理を優先的に施す方法であって、前記標的核酸を含む試
料に、ＲｅｃＡタンパク質と、前記処理を施すべき末端
領域とは反対側の末端領域と相同な核酸プローブとを添
加することにより、前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前
記標的核酸に前記核酸プローブを結合させ、前記反対側
の末端領域を三本鎖構造にする工程と；前記標的核酸に
結合した前記ＲｅｃＡタンパク質を前記標的核酸から解
離させて、前記ＲｅｃＡタンパク質を介さずに前記核酸
プローブが前記反対側の末端領域に結合した核酸を得る
工程と；該核酸に前記処理を施すことにより、標的核酸
の末端領域の一方に優先的に所望の処理を施す工程とを
備えた方法を提供する。

【０００９】ここで、以下の発明の詳細な説明の理解を
助けるために、図９を参照しながら、本発明の方法の概
略を説明する。

【００１０】本発明の方法の第一の工程では、標的核
酸、一般的には標的ＤＮＡ１に、該ＤＮＡの一方の末端
領域と相同な配列を有するプローブＤＮＡ２とＲｅｃＡ
タンパク質３とを添加して、三本鎖ＤＮＡ形成反応を行
う。ＲｅｃＡタンパク質３は、プローブＤＮＡ２に結合
してプローブＤＮＡ・ＲｅｃＡタンパク質複合体４を形
成した後、標的ＤＮＡ１の末端領域に存在するプローブ
ＤＮＡ２と相同な領域を検索し、プローブＤＮＡ２を該
相同な領域に結合させる。このようなＲｅｃＡタンパク
質の作用により、第一の工程では、標的ＤＮＡ１の一方
の末端領域に、ＲｅｃＡタンパク質３を介してプローブ
ＤＮＡ２が結合し、末端領域に三本鎖ＤＮＡ構造５が形
成される。

【００１１】第二の工程では、除タンパク反応を行い、
プローブＤＮＡ２に結合したＲｅｃＡタンパク質３を除
去する。プローブＤＮＡ２が末端領域に結合している場
合には、ＲｅｃＡタンパク質３を除去した後でも三本鎖
ＤＮＡ構造５が維持される。第二の工程において、三本
鎖ＤＮＡ構造５からＲｅｃＡタンパク質３を除去するこ
とにより、三本鎖ＤＮＡ構造５に対して様々な処理を施
すことが可能となる。

【００１２】第三の工程では、ＲｅｃＡタンパク質３が
除去された三本鎖ＤＮＡ構造５に、所望の処理（図で
は、アダプターＤＮＡのライゲーションが例示されてい
る）を施す。三本鎖ＤＮＡ構造５を有する末端領域と二
本鎖の末端領域とは構造が異なるので、本来等価であっ
た二つの領域のうちの一方の領域のみに所望の処理を施
すことができる。図９には、三本鎖ＤＮＡ構造５が形成
されていない方の末端領域にアダプターＤＮＡ６がライ
ゲーションされた様子が示されている。

【００１３】なお、図に示されている具体的な反応や構
造などは、あくまでも理解を容易にする目的で記載され
ているにすぎないので、実際には、それらの細部が図面
と一致しない場合があり得る。すなわち、本発明者ら
は、本発明の方法の基礎となった本発明者らによる下記
の発見の他には、いかなる特定の理論にも拘泥しない。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、標的核酸の末端領域の
一方に、所望の処理を優先的に施す方法を提供する。

【００１５】本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を介して形
成される三本鎖構造が標的核酸の末端領域に形成される
場合には、前記三本鎖構造からＲｅｃＡタンパク質を解
離させた後にも前記三本鎖構造が維持されるという本発
明者らの発見に基づいてなされたものである。ＲｅｃＡ
タンパク質、及びＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構
造が形成されることは公知である。

【００１６】以下、本発明の方法の最も典型的な実施の
態様について詳述する。

【００１７】本発明の方法を実施するには、まず、その
末端領域の一方に所望の処理を優先的に施すべき標的核
酸を含む試料に、ＲｅｃＡタンパク質と、前記処理を施
すべき末端領域とは反対側に位置する前記標的核酸中の
末端領域と相同な核酸プローブとを添加する。

【００１８】本明細書において、「標的核酸」は、任意
の単純ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドからな
るポリヌクレオチドであり得、本方法の実施者が任意に
選択し得る。標的核酸は、典型的には、ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡ等のＤＮＡ、並びにｍＲＮ
Ａ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、及び合成ＲＮＡ等のＲＮＡ
である。「単純ヌクレオチド」には、アデニン、グアニ
ン、チミン、シトシン、及びウラシルが含まれる。「修
飾ヌクレオチド」には、例えば、イノシン、アセチルシ
チジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリ
ン酸エステルなどが含まれる。

【００１９】「標的核酸を含む試料」は、生物から採取
した未処置の試料、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、
プラスミドを含む生物試料であり得る。また、「標的核
酸を含む試料」は、前記未処置の試料に対して様々な操
作又は処理を行った試料であり得る。このような操作又
は処理は、核酸抽出操作、増幅操作、制限酵素、リガー
ゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼを含む酵素による処
理、及び遺伝子工学の領域において周知であるその他の
処理、並びにこれらの組み合わせであり得る。

【００２０】「核酸抽出操作」は、フェノール抽出、エ
タノール沈殿であり得るが、これらに限定されない。

【００２１】「増幅操作」は、典型的にはＰＣＲ、又は
その変法、例えば、逆転写ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、５‘ＲＡ
ＣＥ、３’ＲＡＣＥであり得る。

【００２２】あるいは、「標的核酸を含む試料」は、人
工的に調製した核酸を含有する試料、又は該試料に前記
各処理を施すことによって調製された試料であってもよ
い。

【００２３】より具体的には、前記「標的核酸を含む試
料」は、遺伝子のクローニングの各段階で得られる試
料、例えば、ＤＮＡライブラリー、標的ｍＲＮＡを含む
試料、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを含む試料、ア
ダプターが付加された１ｓｔｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを
含む試料、ＰＣＲ産物がその中にサブクローニングされ
たプラスミドを含む試料であり得る。

【００２４】本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク
質」とは、二本鎖核酸の一方のストランド中の任意の領
域に、該領域と相同な一本鎖核酸を結合させることによ
り、前記領域に三本鎖構造を形成させ得るタンパク質を
意味する。ＲｅｃＡタンパク質は、相同的組換え、ＤＮ
Ａの修復、又は大腸菌のＳＯＳ遺伝子の発現などに関与
することが知られている。ＲｅｃＡタンパク質の中で
は、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質が最も有
名である。しかしながら、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質
に類似した構造及び機能を有するタンパク質は、大腸菌
以外の生物にも広く分布していることが知られており、
これらのタンパク質は、一般に、ＲｅｃＡ類似タンパク
質と呼称されている。本明細書において、「ＲｅｃＡタ
ンパク質」には、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパ
ク質のみならず、ＲｅｃＡ類似タンパク質も含まれる。

【００２５】前述のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一
本鎖核酸を二本鎖核酸にランダムに結合させるのではな
く、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する相同な
領域に結合させる。二つの核酸が「相同」であるという
ことは、ＲｅｃＡタンパク質を介して特異的な三本鎖構
造を形成し得る程度に、両核酸が同一である、又は類似
していることを意味する。「類似」とは、例えば、二つ
の塩基配列が少なくとも５０％、好ましくは８０％、よ
り好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の同
一性であり得る。

【００２６】前記核酸プローブは、三本鎖構造を形成し
ない部分を含んでもよい。該部分は、核酸プローブの中
間及び／又は末端に位置し得る。

【００２７】三本鎖構造を形成しない部分が、核酸プロ
ーブの末端に位置する場合には、核酸プローブは、例え
ば、前記末端が、標的核酸の末端領域から１塩基以上突
出するように標的核酸に結合する。三本鎖構造を形成し
ない部分が、核酸プローブの中間に位置する場合には、
核酸プローブは、ループ状の中間部を有するように標的
核酸に結合する。

【００２８】ＲｅｃＡタンパク質は上記のごとき機能を
有しているので、前記試料に、ＲｅｃＡタンパク質及び
相同な核酸プローブを添加すると、該核酸プローブは、
標的核酸に、より正確には、標的核酸の一方のストラン
ド中に存在する相同な部分に結合する。核酸プローブが
結合した末端領域には三本鎖構造が形成されるので、該
末端領域の構造は、核酸プローブが結合していないほう
の末端領域の構造とは異なる。本発明の方法は、一方の
末端領域に、一般的には、三本鎖構造が形成されていな
い方の末端領域に、優先的に所望の処理を施すためにこ
のような構造の相違を利用する。

【００２９】一般的には、ＲｅｃＡタンパク質が末端領
域に結合した状態では、標的核酸に所望の処理を行えな
いので、以下に記載されているように、ＲｅｃＡタンパ
ク質は、最終的には、標的核酸から解離させる必要があ
る。

【００３０】しかしながら、末端領域以外の領域に核酸
プローブを結合させた場合には、標的核酸からＲｅｃＡ
タンパク質を解離させると、一旦形成された三本鎖構造
が再び解消する。それ故、本発明の方法では、核酸プロ
ーブは標的核酸の末端領域に結合させなければならな
い。

【００３１】所望の処理を施すべき標的領域が、末端領
域に位置していないときには、該領域が末端領域に位置
するように標的核酸の一部を切除してから、本発明の方
法を適用すればよい。あるいは、一度環状の核酸にして
から、特定領域が末端領域にくるように再び切断しても
よい。また、標的核酸が、環状の核酸であるときには、
三本鎖核酸を形成させる前に、又は形成させた後に、所
望の処理を施すべき領域が末端領域に位置するように環
状の標的核酸を切断すればよい。

【００３２】なお、本明細書において、標的核酸の「末
端領域」とは、標的核酸の終末端と標的核酸の終末端か
ら４００番目、より好ましくは２００番目、より好まし
くは１５０番目、より好ましくは１００番目、より好ま
しくは８０番目、さらに好ましくは６０番目、さらに好
ましくは５０番目、さらに好ましくは４０番目、さらに
好ましくは２０番目、さらに好ましくは１０番目の塩基
との間に位置する領域（各終末端を含む）を指すものと
する。

【００３３】末端領域の終末端の形状は、平滑末端と突
出末端のうち何れでもよい。標的核酸に施すべき処理
が、アダプターの付加等の終末端への付加反応である場
合には、終末端の形状は突出末端であることが好まし
い。

【００３４】下記の実験例に詳述されているように、前
記核酸プローブが、ＲｅｃＡタンパク質を介して試料中
の標的核酸に結合する場合、核酸プローブの方向性によ
っては三本鎖構造を形成しないことがある。従って、適
切な方向性を有する核酸プローブを使用しないと、三本
鎖構造は形成されないことがあることに注意しなければ
ならない。

【００３５】典型的には、三本鎖構造を形成させるべき
末端領域において５’末端を有するストランドと相同な
配列を有する核酸プローブを使用すれば、三本鎖構造が
形成される。

【００３６】下記の実験例に詳述されているように、Ｒ
ｅｃＡタンパク質が解離した後にも三本鎖構造が安定に
維持されるためには、前記核酸プローブの長さは、少な
くとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、好まし
くは２０塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、さら
に好ましくは４０塩基以上、最も好ましくは６０塩基以
上である。

【００３７】安定な三本鎖構造を得るためには、三本鎖
構造の両末端のうち外側（すなわち、標的核酸の終末端
側）に存在する末端が、標的核酸の終末端から５０番目
の塩基、より好ましくは３０番目の塩基、さらに好まし
くは２０番目の塩基、さらに好ましくは１０番目の塩基
よりも外側に位置することが好ましい。

【００３８】ＲｅｃＡタンパク質は、本来、ＡＴＰの存
在下において、相同的な組換えを触媒するタンパク質な
ので、前記試料中にＡＴＰが存在すると相同的組換えが
進行して、三本鎖構造は直ぐに消滅してしまう。

【００３９】従って、本発明の方法を実施する場合に
は、少なくとも三本鎖核酸を形成させているときと、三
本鎖核酸を形成させた後には、試料中にＡＴＰが４．８
ｍＭ以上存在してはならないことに注意しなければなら
ない。好ましくは、ＡＴＰの濃度は、０．４８ｍＭ以下
であり、ＡＴＰが試料中に存在しないことが最も好まし
い。

【００４０】ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を
形成させるためには、ＡＴＰの機能を代替し得る物質、
例えば、ＡＴＰγＳのような非分解性ＡＴＰ類似体を添
加しなければならない。

【００４１】ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を
形成させる前工程に続いて、前記標的核酸に結合したＲ
ｅｃＡタンパク質を解離させる工程を実施する。本工程
において、標的核酸からＲｅｃＡタンパク質を解離させ
ることによって、続く最後の工程で、標的核酸の末端領
域の一方に所望の処理を施すことが可能となる。

【００４２】前述のように、標的核酸の末端領域に形成
された三本鎖構造は、ＲｅｃＡタンパク質が該領域から
解離しても維持される。従って、本工程において、前記
標的核酸からＲｅｃＡタンパク質を解離させれば、末端
領域のうち一方のみに三本鎖構造が形成された標的核酸
が得られる。

【００４３】三本鎖構造が形成されている領域と形成さ
れていない領域では、次工程で施すべき所望の処理の効
率が異なるので、両末端領域のうちの一方に対して優先
的に、より好ましくは選択的に所望の処理を施すことが
可能となる。一般的には、優先的に所望の処理が施され
るのは、三本鎖構造が形成されていないほうの末端領域
である。

【００４４】標的核酸からのＲｅｃＡタンパク質の解離
は、トリクロロ酢酸、過塩素酸の添加等の除タンパク操
作、ＳＤＳのような界面活性剤の添加、又はタンパク質
分解酵素の添加のような簡易な操作によって行い得る。

【００４５】次に、末端領域の一方だけが三本鎖構造と
なった標的核酸に所望の処理を与えれば、典型的には、
三本鎖構造が形成されていないほうの末端領域に対し
て、優先的に、好ましくは選択的に所望の処理を施すこ
とができる。

【００４６】本明細書において、「優先的に」とは、一
方の末端領域に対する処理の効率が、他方の末端領域に
対する処理の効率を上回ることを意味する。「選択的
に」とは、一方の末端領域のみに所望の処理が施される
ことを意味する。

【００４７】本工程で与えるべき所望の処理は、ヌクレ
アーゼ、ポリメラーゼ、及びリガーゼ等を用いた酵素反
応、化学的な修飾や付加を含む化学反応、ＤＮＡチップ
の基板などの固相担体への吸着や電荷の付与などの物理
的な処理など核酸に対してなし得る任意の処理であり得
る。該処理は、末端領域に形成された三本鎖構造が破壊
されない条件で行わなければならない。

【００４８】末端領域に施すべき所望の処理としては、
例えば、アンカー配列の付加、アダプターの付加等を挙
げることができる。これらの処理において使用されるリ
ガーゼに対しては、両末端領域は等価なので、本発明の
方法を用いなければ、両末端領域には共にアンカー配
列、又はアダプターが付加される。

【００４９】本発明の方法を用いて、一方の末端領域の
みにアダプターを付加させる場合、標的核酸の長さは、
ＰＣＲでアダプターを付加できないサイズ、具体的に
は、４０ｋｂ以上、例えば、５０ｋｂ、７５ｋｂ、１０
０ｋｂ、１５０ｋｂ、又は２００ｋｂのサイズであり得
る。

【００５０】一方の末端領域に対して、優先的に、ある
いは選択的にアダプターを付加するためには、核酸プロ
ーブは、その一端が核酸塩基の終末端から一ヌクレオチ
ド以上突出するように標的核酸に結合するものを選択す
ることが好ましい。このような核酸プローブは、標的核
酸の終末端の一方のみに優先的に所望の処理を施す場合
に、一般的に有用であろう。

【００５１】さらに、本発明の方法は、ＤＮＡ組み換え
反応を利用した、クローニング技術にも有用である。こ
の技術は、遺伝子、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ産物などのＤ
ＮＡ断片を、制限酵素やリガーゼ連結の使用なしで、ベ
クターＤＮＡにクローニングすることができる技術であ
る。そこでは、λファージの部位特異的組換え系を使っ
ているため、目的ＤＮＡ断片の両端に組換えに必要な異
なるDNA配列を付加する必要がある。それ故、本発明の
方法は、特に、ＰＣＲを使用できないような長いＤＮＡ
断片を、この方法によりクローニングする際に有用であ
る。

【００５２】このように、本発明の方法を用いれば、標
的核酸の末端領域の一方に、所望の処理を優先的に施す
ことができる。それ故、末端領域の一方に所望の処理が
優先的に施すことによって、末端領域が非対称的に修飾
された核酸、及びこのような核酸を製造する方法も本発
明の範囲に属する。

【００５３】末端領域が非対称的に修飾された核酸とし
ては、一方の末端領域のみが制限酵素、ヌクレアーゼ、
リガーゼなどで処理された核酸、一方の末端領域のみに
アダプターが付加された核酸、一方の末端領域のみに固
相担体（ＤＮＡチップなどの基板）が結合した核酸が挙
げられるが、これらに限定されない。

【００５４】末端領域が非対称的に修飾された核酸を製
造するには、前記本発明の方法の各工程を行えばよい。

【００５５】以上が、本発明の方法の基本的な操作であ
るが、以下に示すように、これらの各操作を改変した操
作を行ってもよく、さらに、上記各操作に新たな操作を
適宜付加してもよい。

【００５６】新たな操作を付加する場合、上記基本的な
操作を行って標的核酸の末端領域の一方に優先的に所望
の処理を施した後に、前記反対側の末端領域に形成され
た前記三本鎖構造を解消させ、該反対側の末端領域に前
記処理とは異なる処理を施してもよい。このような操作
を行えば、標的核酸中の等価な領域に対して異なる二種
類の処理を施すことが可能になる。

【００５７】このような操作を行えば、標的核酸の一方
の終末端に第一のアダプターを付加した後、他方の終末
端に前記第一のアダプターとは異なる第二のアダプター
を付加することができる。これによって、現在、ＰＣＲ
ではアダプターを付加できないサイズが大きな標的核酸
にも、異なるアダプターを付加することが可能となる。

【００５８】三本鎖構造を解消させるためには、例え
ば、熱処理、アルカリ処理、酵素処理（ＤＮＡポリメラ
ーゼなど）を使用し得る。あるいは、三本鎖構造を解消
させやすくするために、変異が導入された核酸プローブ
を使用することも有用である。変異が導入された核酸プ
ローブは、標的核酸への結合性が弱いために三本鎖構造
を解消させやすい。

【００５９】さらに、本発明は、ＲｅｃＡタンパク質な
どのタンパク質を介さずに、二本鎖核酸の末端領域の一
方又は双方に、該末端領域と相同な一本鎖核酸を結合す
ることにより、末端領域の一方又は双方に三本鎖構造が
形成された末端被修飾核酸を製造する方法、及びこのよ
うな末端被修飾核酸も提供する。

【００６０】一方の末端領域のみに三本鎖構造が形成さ
れた末端被修飾核酸を作成するためには、本発明の方法
の第一の工程と第二の工程を実施すればよい。双方の末
端領域に三本鎖構造が形成された末端被修飾核酸を作成
するためには、前記第一の工程において、二種類のプロ
ーブ、すなわち、一方の末端領域と相同な核酸プローブ
と他方の末端領域と相同な核酸プローブとを添加すれば
よい。

【００６１】以下、実験例及び実施例に従って、本発明
をさらに詳細に説明するが、いかなる意味においても本
発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【００６２】［実験例１］本実験例では、図１を参照し
ながら、三本鎖構造の形成における各反応成分の依存性
について記載する。

【００６３】まず、標的核酸として、Ｍ１３ｍｐ１８Ｒ
Ｆ ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで直鎖状にしたもの
と、前記標的核酸の末端領域と相同な配列を有する６０
マーの核酸プローブ１（配列番号１）を用意した。核酸
プローブ１は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと［γ−
^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、^３２Ｐで５’末端を標識し
た。前記標的核酸と標識された核酸プローブ１との間に
三本鎖を形成させるために、１ｐｍｏｌの標識核酸プロ
ーブ１、３．０μｇのＲｅｃＡタンパク質、４．８ｍＭ
ＡＴＰ−γＳ、２００ｎｇの標的核酸を、２０ｍＭ
酢酸マグネシウム、３０ｍＭ 酢酸トリス（ｐＨ７．
２）中にて、３７℃で３０分間保温した。以下、本実験
例、及び実験例２〜４において、該反応条件を標準反応
条件と称する。

【００６４】反応後に、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、
０．７ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを加え、３７℃で３
０分間保温することにより、除タンパクを行い、その半
分量を１％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後
に、エチジウムプロミドでゲルを染色し、ＤＮＡの写真
を記録した。結果を図１（Ｂ）に示す。

【００６５】図１（Ｂ）から、全てのレーン（各レーン
の反応条件は、以下に記載されている）で、標的核酸が
正しく泳動されていることが分かる。

【００６６】次に、ゲルを濾紙の上に載せてゲル乾燥器
で乾燥させた後、ゲルのオートラジオグラムをとり、標
識核酸プローブ１からのシグナルをＸ線フィルム上に記
録した。結果を図１（Ａ）に示す。

【００６７】図１（Ａ）中、レーンＭは、ＤＮＡサイズ
マーカーであり、図面の左端にはそれらのサイズが示さ
れている。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄIIIで切断し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
と［γ―^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、^３２Ｐで５’末端標
識したものである。

【００６８】レーン２は、前記標準反応条件からＲｅｃ
Ａタンパク質を除いた条件を用いて、三本鎖形成反応を
行った場合の結果である。

【００６９】レーン３は、前記標準反応条件からＡＴＰ
−γＳを除いた条件を用いて、三本鎖形成反応を行った
場合の結果である。

【００７０】レーン４は、前記標準反応条件からＲｅｃ
Ａタンパク質とＡＴＰ−γＳを除いた条件を用いて、三
本鎖形成反応を行った場合の結果である。

【００７１】レーン５は、前記標準反応条件において、
^３２Ｐ標識核酸プローブ１に代えて、^３２Ｐ標識核酸プ
ローブ２（配列番号２）を用いた条件で、三本鎖形成反
応を行った場合の結果である。

【００７２】レーン６は、前記標準反応条件において、
^３２Ｐ標識核酸プローブ１に代えて、^３２Ｐ標識核酸プ
ローブ３（配列番号３）を用いた条件で、三本鎖形成反
応を行った場合の結果である。

【００７３】レーン７は、前記標準反応条件において、
標的核酸として、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａ
Ｉで切断したものを使用し、且つ該標的核酸の末端領域
と相同な配列を有する前記^３２Ｐ標識核酸プローブ４
（配列番号４）を用いた条件で、三本鎖形成反応を行っ
た場合の結果である。

【００７４】図１（Ａ）のレーン２〜４では、三本鎖が
全く形成されていないので、三本鎖形成反応には、Ｒｅ
ｃＡタンパク質とＡＴＰ−γＳが不可欠であることが分
かる。また、標的核酸と相同でない核酸プローブを用い
たレーン５とレーン６では、三本鎖は形成されなかった
ので、三本鎖は、ＲｅｃＡタンパク質を介した特異的な
反応によって形成されることが明らかである。

【００７５】レーン１とレーン７では、三本鎖が形成さ
れたので、標的核酸と相同な核酸プローブを用いれば、
任意の標的核酸に三本鎖が形成されることが分かった。

【００７６】［実験例２］本実験例では、三本鎖形成反
応において使用すべきオリゴヌクレオチドの方向性につ
いて検討した。以下、図２を参照しながら、本実験例に
ついて説明する。

【００７７】図２（Ａ）の各レーンは、実験例１と同様
に、標的核酸に結合した標識核酸プローブを検出したも
のである。

【００７８】レーン１は、標準反応条件を用いて三本鎖
形成反応を行った後に、実験例１に記載されている除タ
ンパク操作及び電気泳動を行った場合の結果である。

【００７９】レーン２は、標準反応条件において、核酸
プローブ１に代えて、核酸プローブ２を用いた場合の結
果である。

【００８０】レーン３は、標準反応条件において、核酸
プローブ１に代えて、核酸プローブ５（配列番号５）を
用いた場合の結果である。

【００８１】レーン４は、標準反応条件において、核酸
プローブ１に代えて、核酸プローブ６（配列番号６）を
用いた場合の結果である。

【００８２】核酸プローブ１及び２は、前記標的核酸中
の一方の末端領域において三本鎖核酸を形成する。これ
に対して、核酸プローブ５及び６は、核酸プローブ１及
び２が三本鎖核酸を形成する末端領域とは反対側の末端
領域において三本鎖核酸を形成する。

【００８３】また、核酸プローブ１及び５は、標的核酸
の各ストランドの５’末端と相同性を有するのに対し
て、核酸プローブ２及び６は、標的核酸の各ストランド
の３’と相同性を有する。

【００８４】図２の（Ａ）から明らかなように、核酸プ
ローブ１（レーン１）と核酸プローブ５（レーン３）
は、標的核酸と三本鎖を安定に形成することができた
が、核酸プローブ２（レーン２）と核酸プローブ６（レ
ーン４）は、標的核酸と三本鎖を安定に形成することが
できなかった。

【００８５】図２の（Ｂ）は、エチジウムブロミドで全
てのＤＮＡを染色した結果を示している。図２の（Ｂ）
では、全てのレーンで標的核酸が泳動されているので、
核酸プローブ２と核酸プローブ６は、標的核酸が存在し
ているにもかかわらず、標的核酸と安定に三本鎖を形成
し得なかったことが分かる。

【００８６】本実験例によって、安定な三本鎖を形成す
るためには、一般に、標的核酸の各ストランドの５’末
端と相同な核酸プローブを使用すべきであることが明ら
かとなった。

【００８７】［実験例３］本実験例では、三本鎖の形成
に必要な核酸プローブの長さについて調べた。

【００８８】反応は、前記標準反応条件において、核酸
プローブ１に代えて、核酸プローブ７、８、９、１０、
及び１１（配列番号７、８、９、１０、及び１１）を用
いた条件下で行った。

【００８９】核酸プローブ７、８、９、１０、及び１１
は、それぞれ、核酸プローブ１の５‘末端から、１０、
２０、３０、４０、及び５０個のヌクレオチドを除去し
たものである。

【００９０】本実験例の結果を図３に示す。

【００９１】図３（Ａ）に示されているように、核酸プ
ローブが長いほど、より多くの三本鎖を形成することが
できた。核酸プローブ９は、ほとんど三本鎖を形成する
ことができなかった（レーン４）。核酸プローブ１０、
及び１１は、三本鎖を形成することができなかった（レ
ーン５、及び６）。核酸プローブ８は、ある程度三本鎖
を形成することができた。これに対して、核酸プローブ
７と核酸プローブ１は、大量の三本鎖を形成することが
できた。

【００９２】図３（Ｂ）は、エチジウムブロミド染色で
染色した標的核酸を表している。

【００９３】本実験例から、三本鎖を形成するために
は、一定の長さ以上の長さを有する核酸プローブを用い
ることが必要であることが明らかとなった。

【００９４】［実験例４］本実験例では、三本鎖が形成
される位置と三本鎖の形成量との関係について調べた。

【００９５】同一の長さ（６０マー）を有する４種類の
核酸プローブ１、１２（配列番号１２）、１３（配列番
号１３）、及び１４（配列番号１４）を調製した。核酸
プローブ１２、１３、及び１４の３’末端は、それぞ
れ、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ標的核酸のストランドの５’末
端から１０、２０、及び３０番目のヌクレオチドと結合
する。結果を図４（Ａ）及び４（Ｂ）に示す。

【００９６】図４（Ａ）に示されているように、三本鎖
が標的核酸の終末端から近い位置に形成される核酸プロ
ーブを用いると、三本鎖の形成量が多かった。

【００９７】図４（Ａ）において、レーン１〜３は、そ
れぞれ、核酸プローブ１、１２、及び１３を用いたとき
の結果を示している。

【００９８】標的核酸の終末端から３０番目のヌクレオ
チドに、３’末端が結合する核酸プローブ１４は、全く
三本鎖を形成しなかった（レーン４）。

【００９９】本実験例でも、エチジウムブロミド染色に
よって、各レーンに標的ＤＮＡが存在することが確認さ
れた（図４Ｂ）。

【０１００】本実験例の結果から、三本鎖を効率よく形
成させるためには、できる限り、標的核酸の末端付近に
三本鎖を形成させるべきであることが明らかとなった。

【０１０１】[実施例１]本実施例では、図５を参照しな
がら、標的核酸の一方の末端にアダプターＤＮＡをライ
ゲーションする方法について説明する。

【０１０２】本実施例では、標的核酸として、ｐＢＲ３
２２ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで直鎖状にしたものと、
該標的核酸の末端領域の一方と相同な配列を有する６０
マーの核酸プローブ１５（配列番号１５）を用意した。

【０１０３】標的核酸と核酸プローブ１５との間の三本
鎖形成反応は、１０ｐｍｏｌの核酸プローブ１５、５．
０μｇのＲｅｃＡタンパク質、４．８ｍＭ ＡＴＰ−γ
Ｓ、１００ｎｇの標的核酸を、２０ｍＭ酢酸マグネシウ
ム、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）中で、３７℃で
３０分間保温した。反応後に、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤ
Ｓ、０．７ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを加え、３７℃
で３０分間保温することにより、除タンパクを行った。

【０１０４】その後、４０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、６０
μＬとして、フェノール・クロロホルム抽出を１回、ク
ロロホルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿を行っ
た。

【０１０５】乾燥させたＤＮＡペレットを、１０μＬの
蒸留水に溶かした。続いて、１ｐｍｏｌの^３２Ｐ標識ア
ダプターを加え、ライゲーションキット（タカラ酒造）
を用いて、１６℃で６０分間保温することにより、ライ
ゲーション反応を行った。ここで用いたアダプターＤＮ
Ａは、オリゴヌクレオチド１（配列番号１６）とオリゴ
ヌクレオチド２（配列番号１７）を０．１×ＳＳＣ中に
て、８０℃で１０分間保温し、２時間かけて徐々に冷却
して二本鎖にすることによって調製した。

【０１０６】ライゲーション反応後に、フェノール・ク
ロロホルム抽出を１回、クロロホルム抽出を１回行った
後、エタノール沈殿を行った。

【０１０７】乾燥させたＤＮＡペレットを、８μＬの蒸
留水に溶かした後、２μＬの、ゲルローディング バッ
ファー（０．２５％ ブロモフェノールブルー、 ０．
２５％キシレン シアノール ＦＦ、 １５％ フィコ
ール （タイプ ４００；ファルマシア）ｉｎ ｗａｔ
ｅｒ）を混ぜ、その半分量について、３７℃で６０分間
保温した。その半分量について、１％アガロースゲル電
気泳動を行った。

【０１０８】泳動後に、ゲルをエチジウムブロミド染色
し、ＤＮＡの写真を記録した（図５（Ｂ））。また、ゲ
ルを濾紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた後、ゲル
のオートラジオグラムをとり、標識核酸アダプターから
のシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図
５（Ａ）に示す。

【０１０９】レーン１は、標的核酸にさらなる処理を行
わずに、三本鎖を形成させた場合の結果を示している。

【０１１０】レーン２は、前記標的核酸の一ヶ所を制限
酵素で切断して得られた産物の半分量をゲルにかけ、核
酸プローブ１５を用いて該産物を検出した場合の結果を
示している。制限酵素による切断は、エタノール沈殿後
の前記乾燥ＤＮＡペレットを、８μＬの蒸留水に溶かし
た後、１０Ｕｎｉｔｓの制限酵素ＰｙｕIIを加えて、３
７℃で６０分間保温することによって行った。

【０１１１】核酸プローブ１５は、レーン２のサイズが
小さいほうのバンドに相当する断片と三本鎖を形成する
ことができる。

【０１１２】レーン３は、レーン２に存在するバンドの
うちサイズが大きいほうのバンドに相当する断片と三本
鎖を形成することができる核酸プローブ１６（配列番号
１８）を用いた場合の結果を示す。

【０１１３】レーン４は、レーン２と同様に、標的核酸
の一ヶ所を制限酵素で切断して得られた産物の半分量を
ゲルにかけた場合の結果を示している。レーン４では、
核酸プローブ１６を使用した。

【０１１４】レーン５は、標的核酸を制限酵素で切断せ
ずにゲルにかけた場合の結果を示している。レーン５で
は、核酸プローブ１５と１６を使用した。

【０１１５】レーン６は、レーン２と同様に、標的核酸
の一ヶ所を制限酵素で切断して得られた産物の半分量を
ゲルにかけた場合の結果を示している。レーン６では、
核酸プローブ１５と１６を使用した。

【０１１６】レーン７〜１２では、それぞれ、標的核酸
の終末端からその末端が１塩基突出するように標的核酸
と三本鎖を形成する核酸プローブ１７（配列番号９；レ
ーン７及び８）、核酸プローブ１８（配列番号２０；レ
ーン９及び１０）、及び核酸プローブ１７と核酸プロー
ブ１８の両者（レーン１１及び１２）を使用した。核酸
プローブ１７は、レーン８のサイズが小さいほうの断片
と三本鎖を形成することができ、核酸プローブ１８は、
レーン８のサイズが大きいほうの断片と三本鎖を形成す
ることができる。

【０１１７】レーン７、９、及び１１では、標的核酸を
制限酵素で処理せずにゲルにかけた。レーン８、１０、
及び１２では、レーン２と同様に、標的核酸を制限酵素
で処理した後にゲルにかけた。

【０１１８】レーン１〜６では、標的核酸の終末端か
ら、その末端が突出しないように三本鎖を形成する核酸
プローブ１５及び１６（以下、非突出プローブという）
を使用したので、標識アダプターの付加を効率的に阻害
することができなかった。

【０１１９】これに対して、標的核酸の終末端から、そ
の末端が突出するように三本鎖を形成する核酸プローブ
１７及び１８（以下、突出プローブ）を使用すると、標
識アダプターの付加を効率的に阻害することができた。
レーン８、１０、及び１２の対応するバンドが薄くなっ
ていることから、核酸プローブ１７、１８、及び両者を
用いたときに、それぞれ、小さいほうの断片への標識ア
ダプターの付加、大きいほうの断片への標識アダプター
の付加、及び両断片への標識アダプターの付加が効率的
に阻害されたことが分かる。

【０１２０】本実施例により、本発明の方法を用いる
と、標的核酸の末端へのアダプターの付加を阻害できる
ことが明らかとなった。本実施例により、標的核酸の終
末端から、その末端が突出するような核酸プローブを用
いると、アダプターの付加を効率的に阻害できることも
明らかとなった。

【０１２１】［実施例２］本実施例では、図６を参照し
ながら、標的核酸へのアダプター付加の阻害における、
各反応成分への依存性について説明する。

【０１２２】図６のレーン１は、実施例１における図５
のレーン８と同じ反応を行ったときの結果を示してい
る。

【０１２３】レーン２は、ＲｅｃＡタンパク質を添加せ
ずに、レーン１と同じ反応を行ったときの結果を示して
いる。

【０１２４】レーン３は、図５のレーン８で使用した反
応工程において、エタノール沈殿後の乾燥ＤＮＡペレッ
トを、８μＬの蒸留水に溶かした後に、８５℃で１０分
間熱処理を行い、その後は同じ処理を行ったときの結果
を示している。

【０１２５】レーン４は、ＡＴＰ−γＳとＲｅｃＡタン
パク質をともに添加せずに、レーン１と同じ反応を行っ
た結果を示している。

【０１２６】レーン５は、核酸プローブを添加せずに、
レーン１と同じ反応を行ったときの結果を示している。

【０１２７】レーン６は、標的核酸と相同な配列を持た
ない核酸プローブ１（配列番号１）を用いて、レーン１
と同じ反応を行ったときの結果を示している。

【０１２８】図６の（Ａ）から、標的核酸へのアダプタ
ーの付加を阻害するためには、ＡＴＰ−γＳ、ＲｅｃＡ
タンパク質、標的核酸と相同な核酸プローブを使用しな
ければならないことが明らかとなった。

【０１２９】図６の（Ａ）のレーン３では、標的核酸の
アダプターの付加が阻害されているので、標的核酸と核
酸プローブとによって形成される三本鎖は、熱処理に対
して比較的安定であることも明らかとなった。

【０１３０】図６の（Ｂ）は、エチジウムブロミドで全
てのＤＮＡを染色した結果を示している。

【０１３１】［実施例３］本実施例では、図７を参照し
ながら、標的核酸へのアダプターの付加の阻害に対す
る、標的核酸の末端の形状の効果について説明する。

【０１３２】図７の（Ａ）のレーン１は、実施例１にお
ける図５のレーン８と同じ反応を行ったときの結果を示
している。

【０１３３】レーン２は、核酸プローブを添加せずに、
レーン１と同じ反応を行ったときの結果を示している。

【０１３４】レーン３は、標的核酸として、ｐＢＲ３２
２ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断したものを用いたこ
とと、核酸プローブ１９（配列番号２１）を用いたこと
以外は、図５のレーン８と同じ反応を行ったときの結果
を示している。

【０１３５】レーン４は、核酸プローブを添加せずに、
レーン３と同じ反応を行ったときの結果を示している。

【０１３６】レーン１とレーン３では、ともに、アダプ
ターの付加が阻害されているが、突出末端を有する標的
核酸を使用したレーン１のほうが、平滑末端を有する標
的核酸を使用したレーン３に比べて、より効率的に、ア
ダプターの付加が阻害されることが分かった。

【０１３７】核酸プローブを添加しなかったレーン２と
レーン４では、アダプターの付加は全く阻害されなかっ
た。

【０１３８】図７の（Ｂ）は、エチジウムブロミドで全
てのＤＮＡを染色した結果を示している。

【０１３９】本実施例から、標的核酸の末端の形状が、
アダプターの付加の阻害効率に影響を与えることが明ら
かとなった。

【０１４０】［実施例４］本実施例では、図８を参照し
ながら、本発明の方法によるアダプター付加の阻害の経
時変化について説明する。

【０１４１】図８（Ａ）のレーン１は、実施例１におけ
る図５のレーン２で使用した条件（非突出プローブを使
用）において、三本鎖形成反応を３０秒行ったときの結
果を示している。

【０１４２】レーン２、３、４、及び５は、レーン１と
同一の条件下で、それぞれ、３０、６０、１２０、及び
１８０分間、三本鎖形成反応を行ったときの結果を示し
ている。

【０１４３】レーン６は、図５のレーン８で使用した条
件（突出プローブを使用）において、三本鎖形成反応を
３０秒行ったときの結果を示している。

【０１４４】図８（Ｃ）は、図８（Ａ）のレーン１〜５
のシグナル強度を、ＢＡＳ ２０００ Ｉｍａｇｅ ａ
ｎａｌｙｚｅｒを用いて測定し、これをグラフ化したも
のである。

【０１４５】レーン７、８、９、及び１０は、レーン６
と同一の条件下で、三本鎖形成反応を、それぞれ、３
０、６０、１２０、及び１８０分間行ったときの結果を
示している。

【０１４６】図８（Ｄ）は、図８（Ａ）のレーン６〜１
０のシグナル強度を、ＢＡＳ ２０００ Ｉｍａｇｅ
ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定し、これをグラフ化した
ものである。

【０１４７】図８（Ｃ）と（Ｄ）の横軸は反応時間であ
り、縦軸は標的核酸に付加された放射能のパーセントで
ある。アダプター中の放射能の総量が１００％である。

【０１４８】図８（Ａ）のレーン１〜５、及び図８
（Ｃ）から明らかなように、三本鎖形成反応に、非突出
プローブを使用すると、三本鎖の形成は殆ど進行しない
ために、アダプター付加及びこれに続くライゲーション
反応が阻害されなかった。

【０１４９】図８（Ａ）のレーン６〜１０、及び図８
（Ｄ）から明らかなように、三本鎖形成反応に、突出プ
ローブを使用すると、三本鎖の形成は殆ど進行しないた
めに、アダプター付加及びこれに続くライゲーション反
応が経時的に阻害された。

【０１５０】図８（Ｂ）は、エチジウムブロミドで全て
のＤＮＡを染色した結果を示している。

【０１５１】本実施例から、突出プローブを用いると、
三本鎖が経時的に形成され、アダプター付加及びライゲ
ーション反応が経時的に阻害されるのに対して、非突出
プローブを用いると、殆ど三本鎖が形成されず、このた
め、アダプター付加及びライゲーション反応が殆ど阻害
されないことが明らかとなった。

【０１５２】

【発明の効果】本発明によれば、標的核酸の末端領域の
一方に、所望の処理を優先的に、又は選択的に施すこと
ができる。

【０１５３】本発明によれば、標的核酸の末端領域の一
方のみに、アダプターなどの配列を付加することができ
る。あるいは、標的核酸の末端領域に、それぞれ異なる
アダプターを付加することができる。

【０１５４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Aisin Cosmos Institute Inc. Kazusa DNA Research Institute <120> Method for giving an unequivalent modification to terminal regions of a nucleic acid <130> A000002745 <160> 21 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 1 agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe <400> 2 gtaatgccac tacgaaggca ccaacctaaa acgaaagagg cgaaagaata cactaaaaca 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of pBR322 <400> 3 tctccgaaac tcctgatttc tgaaaaagta ctccttcaaa ggtaatttgc ccattttatg 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 4 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 5 tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta gtggcaatac 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 6 gtaatgccac tacgaaggca ccaacctaaa acgaaagagg cgaaagaata cactaaaaca 60 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 7 aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 50 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 8 actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 40 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 9 gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 30 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 10 ccattaaacg ggtaaaatac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 11 ggtaaaatac 10 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 12 gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga cgatcccgca 60 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 13 caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 60 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of M13mp18RF <400> 14 caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 60 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of pBR322 <400> 15 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 60 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Adaptor <400> 16 aattcggcgg ccgcggatcc 20 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Adaptor <400> 17 ccgcggatcc 10 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of pBR322 <400> 18 acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 60 <210> 19 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of pBR322 <400> 19 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 60 t 61 <210> 20 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of pBR322 <400> 20 acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 60 t 61 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe for a restriction fragment of pBR322 <400> 21 ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 60

【図面の簡単な説明】

【図１】実験例１の結果を示す電気泳動。

【図２】実験例２の結果を示す電気泳動。

【図３】実験例３の結果を示す電気泳動。

【図４】実施例４の結果を示す電気泳動。

【図５】実施例１の結果を示す電気泳動。

【図６】実施例２の結果を示す電気泳動。

【図７】実施例３の結果を示す電気泳動。

【図８】実施例４の結果を示すグラフと電気泳動。

【図９】本発明の方法の基本的操作の概略を示した模式
図。

【符号の説明】

１ 標的ＤＮＡ ２ プローブＤＮＡ ３ ＲｅｃＡタンパク質 ４ プローブＤＮＡ・ＲｅｃＡタンパク質複合体 ５ 三本鎖ＤＮＡ構造 ６ アダプターＤＮＡ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小原 收 千葉県木更津市矢那1532番３号 財団法人 かずさディー・エヌ・エー研究所内 (72)発明者 大石 道夫 千葉県木更津市矢那1532番３号 財団法人 かずさディー・エヌ・エー研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 HA12 4B063 QA20 QQ42 QQ52 QR16 QR32 QR35 QR38 QR42 QR48 QR56 QS28 QS34

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的核酸の末端領域の一方に、所望の処
   理を優先的に施す方法であって、 前記標的核酸を含む試料に、ＲｅｃＡタンパク質と、前
   記処理を施すべき末端領域とは反対側の末端領域と相同
   な核酸プローブとを添加することにより、前記ＲｅｃＡ
   タンパク質を介して前記標的核酸に前記核酸プローブを
   結合させ、前記反対側の末端領域を三本鎖構造にする工
   程と；前記標的核酸に結合した前記ＲｅｃＡタンパク質
   を前記標的核酸から解離させて、前記ＲｅｃＡタンパク
   質を介さずに前記核酸プローブが前記反対側の末端領域
   に結合した核酸を得る工程と；該核酸に前記処理を施す
   ことにより、標的核酸の末端領域の一方に優先的に所望
   の処理を施す工程とを備えた方法。
2. 【請求項２】 前記処理が、アダプターのライゲーショ
   ンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記核酸プローブが、前記反対側の末端
   領域の終末端から、その末端を１塩基以上突出するよう
   に前記反対側の末端領域に結合することを特徴とする請
   求項１又は２に記載の方法。