JP4564219B2 - Ｄｎａ−プローブの中のシトシン−メチル化の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲノムＤＮＡ−プローブ（Pr0be）の中の規定された５−メチルシトシンの検出方法又は５−メチルシトシン及びＳＮＰの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の方法論的開発により分子生物学においてよく研究されている観察レベルは、遺伝子自体と、この遺伝子のＲＮＡへの翻訳と、そこから作製するタンパク質である。固体の発現の経過の中でどの遺伝子がいつスイッチが入れられ、特定の細胞および組織の中の特定の遺伝子の活性および阻害がどのように制御されるかは、遺伝子もしくはゲノムのメチル化の範囲と特性とによって相関関係をつけることができる。本発明は、ゲノムＤＮＡ−プローブのメチル化状態の検出方法を記載する。この方法は、同時に点突然変異および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰs）の検出にも利用することができる。
【０００３】
５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡの中で最も頻繁に共有結合に変性した塩基である。この塩基は、たとえば転写の調節、遺伝子の刷り込みおよび腫瘍形成においてある役割を果たしている。従って、遺伝子情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定が非常に重要である。ところが、５−メチルシトシン位置は、５−メチルシトシンがシトシンと同じ塩基対挙動を有するので、配列決定によって同定することができない。さらに、ＰＣＲ増幅において５−メチルシトシンを有する後生的な情報が完全に失われてしまう。
【０００４】
比較的新しく、かつ、この間に頻繁に適用されている５−メチルシトシンについてのＤＮＡの調査方法は、シトシンと重亜硫酸塩の特異反応に基づき、これはそれに続くアルカリ加水分解によって、その塩基対挙動においてチミジンに相当するウラシルに変換される。それに対して、５−メチルシトシンは前記条件下に変性されない。それにより元のＤＮＡは、当初そのハイブリット化特性によってシトシンから区別できないメチルシトシンが、現在「普通の」分子生物学の技術によって唯一残るシトシンとして、たとえば増幅およびハイブリット化または配列決定によって検出できるように変換される。これらの技術は全て、現在完全に利用される塩基対に基づく。感度に関する先行技術は、被検査ＤＮＡをアガロース・マトリックスの中に封じ込める方法によって定義され、それによりＤＮＡの拡散および復元（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡにのみ反応する）を妨害し、全ての沈降ステップおよび洗浄ステップを速い透析で代用される（Ｏｌｅｋ，Ａ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９６，２４，５０６４−５０６６）。この方法によって個々の細胞を検査することができ、これがこの方法の可能性を具体的に示している。確かに、従来個々の部位のみが約３０００塩基対長まで調査されているが、可能なメチル化解析の数千の細胞の全体的な調査は不可能である。しかし、この方法も少ないプローブ量から非常に小さいフラグメントを確実に解析することができない。これは拡散防止にもかかわらずマトリックスによって失われる。
【０００５】
５−メチルシトシンを検出する別の公知の可能性に関する概要は、次の概要論文から読み取ることができる：Ｒｅｉｎ，Ｔ．，ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ． １９９８，２６，２２５５。
【０００６】
重亜硫酸塩技術は、従来幾つかの例外（例えば、Ｚｅｃｈｎｉｇｋ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ． Ｇｅｎ． １９９７，５，９４−９８）を除き研究にのみ使用されている。しかし、常に既知の遺伝子の短い特異的断片を重亜硫酸塩処理によって増幅し、完全に配列決定（Ｏｌｅｋ，Ａ．およびＷａｌｔｅｒ，Ｊ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１７，２７５−２７６）するか、または「プライマー拡張反応による個々のシトシンの位置」（Ｇｏｎｚａｌｇｏ，Ｍ．Ｌ．およびＪｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，２５２９−２５３１，ＷＯ ９５００６６９）によって、または酵素切片（Ｘｉｏｎｇ，Ｚ．およびＬａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，２５３２−２５３４）によって検出されている。特に、ハイブリダイゼーションによる検出も記載されている（Ｏｌｅｋら、ＷＯ ９９２８４９８）。
【０００７】
個々の遺伝子におけるメチル化検出のための重亜硫酸塩技術の適用を取り上げているその他の出版物は次のとおりである：Ｘｉｏｎｇ， Ｚ．およびＬａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．（１９９７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５３２；Ｇｏｎｚａｌｇｏ，Ｍ．Ｌ．およびＪｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．（１９９７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５２９；Ｇｒｉｇｇ，Ｓ．およびＣｌａｒｋ，Ｓ．（１９９４），Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １６，４３１；Ｚｅｓｃｈｎｉｋ，Ｍ．ら、（１９９７），Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６，３８７；Ｔｅｉｌ， Ｒ．ら、（１９９４），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，６９５；Ｍａｒｔｉｎ，Ｖ．ら、（１９９５），Ｇｅｎｅ １５７，２６１；ＷＯ ９７４６７０５およびＷＯ ９５１５３７３．
【０００８】
オリゴマーアレイ製造における先行技術に関する概要は、１９９９年１月に出版された自然発生学特別号（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２１，Ｊａｎｕａｒｙ １９９９）と、そこで引用されている文献とから読み取ることができる。
【０００９】
ＤＮＡを不動化するための様々な方法が存在する。よく知られている方法は、ビオチンで官能化されたＤＮＡのストレプトアビジン−コーティング表面への強固な結合である（Ｕｈｌｅｎ， Ｍ．ら、１９８８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，３０２５−３０３８）。このシステムの結合強度は、１個の結合もない共有結合の化学結合に相当する。標的ＤＮＡを共有結合で化学的に調製した表面に結合できるようにするために、対応する標的ＤＮＡの官能性を必要とする。ＤＮＡ自体は、好適である官能化をもたない。標的ＤＮＡに好適な官能化を導入する種々の変形がある：２種の容易に操作しうる官能化は、第一級脂肪族アミンおよびチオールである。このようなアミン類は、定量的にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって変換され、チオールが好適な条件下に定量的にアルキルヨウ化物と反応する。難点は、ＤＮＡの中へのこのような官能化の導入にある。最も簡単な変形は、ＰＣＲのプライマーによる導入である。前記変形は、５’変性プライマー（ＮＨ2およびＳＨ）と二機能リンカーとを利用する。
【００１０】
ある表面上の不動化の本質的な構成要素はその性状である。今まで説明した系は、主にケイ素または金属からなる。標的ＤＮＡの結合のための別の方法は、標的ＤＮＡの中の短い識別配列（たとえば２０塩基）を表面不動化したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに使用することに基づく。標的ＤＮＡへの化学的活性の位置の導入に関する酵素の変形も記述されている。この場合、標的ＤＮＡに酵素的に５’−ＮＨ2官能化が実施される。
【００１１】
不動化したＤＮＡ−アレーの走査のために、幾度も蛍光的に標識されたプローブが使用されている。蛍光標識に特に好適なのは、各プローブの５’−ＯＨにＣｙ３およびＣｙ５色素の簡単な取り込みである。ハイブリッドしたプローブの蛍光の検出は、たとえば共焦点顕微鏡を介して行われる。色素Ｃｙ３およびＣｙ５は、その他の多くの色素と並んで商業的に入手することができる。
【００１２】
突然変異の新規検出方法を以下に記載する：
配列決定の特殊事例として、個別塩基プライマー拡張（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）が言及する価値がある（Ｈｅａｄ，ＳＲ．，Ｒｏｇｅｒｓ，ＹＨ．，Ｐａｒｉｋｈ，Ｋ．，Ｌａｎ，Ｇ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．，Ｂｏｙｃｅｊａｃｉｎｏ ＭＴ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（２４）：５０６５−５０７１，１９９７；Ｐｉｃｏｕｌｔ−Ｎｅｗｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９（２）：１６７−１７４，１９９９）。増幅と配列決定の組合せは、米国特許第５９２８９０６号明細書に記載されており、そこでは塩基特異的末端がマトリックス分子に使用されている。もう１つの方法は、ヌクレオチドの同定のためにリガーゼ／ポリメラーゼ反応を使用する（米国特許第５９５２１７４号明細書）。
【００１３】
マトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）は、生物分子を解析するための非常に有用な開発である（Ｋａｒａｓ， Ｍ．およびＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．（１９８８），Ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓｅｓ ｅｘｅｅｄｉｎｇ １００００ ｄａｌｔｏｎｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９−２３０１）。解析体が吸光マトリックスの中へセットされる。短レーザーパルスによってマトリックスが蒸発され、解析体分子がこのようにフラグメント化されずに気相中へ輸送される。マトリックス分子との衝突によって、解析体のイオン化が達成される。印加した電圧がイオンを無電界の飛行管（Ｆｌｕｇｒｏｈｒ）の中へ加速する。前記イオンの質量が異なるために、イオンが様々な強さで加速される。より小さいイオンは、より大きいイオンよりも速く検出器に到達する。
【００１４】
ＭＡＬＤＩは、ペプチドとタンパク質の解析に非常に良く適している。核酸の解析は、若干困難である（Ｇｕｔ，Ｉ．Ｇ．およびＢｅｃｋ，Ｓ．（１９９５），ＤＮＡ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌaｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ １：１４７−１５７）。核酸の場合は、感度がペプチドの場合より約１００倍悪く、フラグメントサイズの増加とともに過度に減少する。多量に負に帯電したバックボーンを有する核酸の場合、マトリックスによるイオン化プロセスは本質的に非効率的である。ＭＡＬＤＩの場合、マトリックスの選択は顕著に重要な役割を果たす。ペプチド類の脱着については、非常に微細な結晶化を生じる幾つかの非常に有用なマトリックスが見い出されている。ＤＮＡの場合は、確かにこの間に幾つかの興味をひくマトリックスが存在するが、それによって感度差は縮小されなかった。感度差は、ＤＮＡがペプチドに類似するように、前記ＤＮＡが化学的に変性されることによって縮小させることができる。
【００１５】
通常のバックボーンのリン酸塩がチオリン酸塩で置換されたホスホロチオエート核酸は、簡単なアルキル化化学によって電荷中性ＤＮＡに変換することができる（Ｇｕｔ，Ｉ．Ｇ．およびＢｅｃｋ，Ｓ．（１９９５），Ａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：１３６７−１３７３）。この変性ＤＮＡへの「電荷標識」（ｃｈａｒｇｅ ｔａｇｓ）のカップリングは、総量がペプチドの場合で見い出されるものと同じ総量分の感度の上昇で生じる。「ｃｈａｒｇｅ ｔａｇｇｉｎｇ」のもう１つの長所は、非変性基質の検出を非常に困難にする不純物に対する解析の安定性の増大である。
【００１６】
ゲノムＤＮＡは、細胞−、組織−またはその他の実験プローブのＤＮＡから標準的方法で得られる。この標準的方法は、「フリッチおよびマニアティス編、分子クローニング：実験マニュアル、１９８９年」（ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８９）のような報告書に見い出される。
【００１７】
プロモータの間の共通性は、ＴＡＴＡボックスまたはＧＣボックスの存在にあるのみならず、どの転写因子に対して前記共通性が結合部位を有し、かつ、どの間隔で前記結合部位が互いに存在するかにもある。特定のタンパク質に対して存在する結合部位は、その配列において完全に一致しないが、「ゆらぎ」（Ｗｏｂｂｌｅｓ）の接合、すなわち各々様々な塩基が存在する位置によって、さらに伸長することができる少なくとも４個の塩基の保存順序が見い出される。さらに、前記結合部位は、互いに一定の間隔で存在する。
【００１８】
ところが、核体積の大部分を占めるインタフェース−クロマチンの中のＤＮＡの分布は、全く特異的な序列に従う。つまり、ＤＮＡは複数の部位で核マトリックスへ核膜の内側で糸状構造を付着させている。この領域は、「マトリックス付着領域（ＭＡＲ）」（ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ （ＭＡＲ））または「骨格付着領域（ＳＡＲ）」（ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ （ＳＡＲ））と呼ばれる。この付着は、転写もしくは複製に本質的な影響を及ぼす。このＭＡＲ−フラグメントは、保存配列をもたないが、７０％までＡもしくはＴからなり、転写を一般的に調節するｃｉｓ−作用領域およびトポイソメラーゼＩＩ−識別部位の付近にある。
【００１９】
プロモータおよびエンハンサーのほかに、種々の遺伝子のための別の調節要素、いわゆるインシュレータが存在する。このインシュレータは、たとえば前記インシュレータがエンハンサーとプロモータとの間にある場合、あるいはまたヘテロクロマチンと、活性遺伝子をヘテロクロマチンの影響前に保護する遺伝子との間にある場合、プロモータへのエンハンサーの作用を阻害することができる。このようなインシュレータの例：１．ＤＮＡａｓｅ Ｉに対して高感受性の複数個の部位からなる、いわゆるＬＣＲ（ｌｏｃｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎｓ）、２．ＳＣＳ（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）もしくはＳＣＳ’のような特定の配列、３５０もしくは２００ｂｐ長さおよびＤＮＡａｓｅ Ｉによる変性に対して高抵抗性のおよび高感受性の部位の両側に並ぶ（１００ｂｐずつの間隔）。ＳＣＳ’にはタンパク質ＢＥＡＦ−３２が結合する。このインシュレータは当該遺伝子の両側に置くことができる。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ゲノムＤＮＡ−プローブの中のシトシン−メチル化およびＳＮＰｓの同時検出に特に適している方法を提供することである。その場合、有利には多数のフラグメントが同時に調査できなければならない。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
この課題は、本発明により、ゲノムＤＮＡ−プローブの中の５−メチルシトシンの検出方法によって解決され、その際に下記の
（ａ）ＤＮＡプローブからゲノムＤＮＡを試薬で化学的に置換し、その際に５−メチルシトシンとシトシンとが様々に反応し、これらがそれによって反応後にＤＮＡ二重体の中で様々な塩基対挙動を示すステップと
（ｂ）ポリメラーゼと、プライマーとして少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ａ型）との使用下に前処理したＤＮＡを増幅するステップと
（ｃ）増幅したゲノムＤＮＡを少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ｂ型）で二重体の形成下にｎヌクレオチドの既知の配列によってハイブリッドし、前記のハイブリッドしたＢ型のオリゴヌクレオチドをその３’−末端で部分的または完全に、そのメチル化に関してゲノムＤＮＡプローブの中で調査するべき位置にハイブリッドするステップと
（ｄ）オリゴヌクレオチド（Ｂ型）がその３’−末端であらかじめ塩基欠損対なしに調査するべき位置にハイブリッドした場合、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１個のヌクレオチド分だけポリメラーゼによって伸長され、その際少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有し、この伸長がゲノムＤＮＡプローブの中の各シトシンのメチル化状態に依存するステップと、
（ｅ）伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査されるステップと
が実施される。
【００２２】
本発明により、一定の部位のオリゴヌクレオチド（Ｂ型）が固相に結合され、または一定の部位の増幅体を固相に結合することが有利である。
【００２３】
さらに、様々なオリゴヌクレオチド配列を平滑な固相上に直角格子または六角格子の形態で配列することが有利である。
【００２４】
さらに、本発明により、固相表面がケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることが有利である。
【００２５】
また、伸長したオリゴヌクレオチドに取り込まれた標識が、オリゴヌクレオチド配列が存在する固相の各位置で同定可能であることが有利である。
【００２６】
本発明により、増幅する際に少なくとも１個のプライマー（Ａ型）が固相に結合されていることが有利である。
【００２７】
さらに、本発明により、様々な増幅体を固相上に直角格子または六角格子の形態で配列することを有利とすることができる。
【００２８】
ＤＮＡの処理を増幅する前に重亜硫酸塩溶液（＝ジ亜硫酸塩、水素亜硫酸塩）で実施することが完全に特に有利である。
【００２９】
特に、本発明により、増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われることが有利である。
【００３０】
さらに、本発明により、使用したＡ型のオリゴヌクレオチドが塩基Ｔ、ＡおよびＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみを含有することが特に有利である。
【００３１】
さらに、ヌクレオチドの標識が蛍光標識であることが有利である。
【００３２】
さらに、本発明により、ヌクレオチドの標識が放射性核種であることが有利である。
【００３３】
ヌクレオチドの標識が質量分析計で検出される解離可能の質量標識であることが特に有利である。
【００３４】
さらに、本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドが全て一緒に質量分析計で検出され、それによって前記オリゴヌクレオチドの質量によって明確に標識されていることが有利である。また、伸長したオリゴヌクレオチドの各々１個のフラグメントが質量分析計で検出されることも特に有利である。
【００３５】
さらに、本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントが１個または複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水分解によって作製されることが有利である。
【００３６】
さらに、本発明により、質量分析計におけるよりよい検出可能性のために作製されたフラグメントが個々の正または負の正味電荷を有することが有利である。
【００３７】
本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドの検出がマトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ）によって実施され、かつ、視覚化されることが完全に特に有利である。
【００３８】
さらに、本発明により、ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡ−ポリメラーゼである方法が有利である。
【００３９】
本発明により、ＤＮＡメチル化に補足してＳＮＰｓも検出され、かつ、視覚化される方法も有利である。
【００４０】
さらに、使用したヌクレオチドが末端ヌクレオチド（Ｃ２型）および／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１型）である方法が有利である。
【００４１】
さらに、本発明により、ヌクレオチド（Ｃ１型およびＣ２型）が、ヌクレオべースＡ、ＴおよびＣまたは塩基ＧおよびＡおよびＴのいずれかを含有する群から選ばれる方法が有利である。
【００４２】
さらに、本発明により、増幅が反応容器中の複数のＤＮＡ切片によって実施されることが有利である。
【００４３】
本発明により、ゲノムＤＮＡがＤＮＡ−プローブから得られており、ＤＮＡのためのソース、たとえば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液が、パラフィンに植え込まれた組織、組織学的スライドおよび全ての可能なこれらの組合せを包含する方法が完全に特に有利である。
【００４４】
最後に、本発明により、上流および下流のＤＮＡ−鎖のメチル化解析が１回の実験で実施されることが有利である。この解析の実施は、有利には同時に行われる。
【００４５】
つまり、ゲノムＤＮＡ−プローブの中のメチルシトシンの検出方法が記載されている。
【００４６】
この方法は、全ＤＮＡまたはそのフラグメントの増幅、ハイブリッド化および伸長反応を含む。この方法は、メチルシトシンと同時に単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）および突然変異の検出に利用することができる。
【００４７】
解析されるゲノムＤＮＡは、有利にはＤＮＡの通常のソース、たとえば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液が、パラフィンに植え込まれた組織、組織学的スライドおよび全ての可能なこれらの組合せから得られる。
【００４８】
この方法の第１ステップで、使用したＤＮＡが有利には重亜硫酸塩（＝ジ亜硫酸塩、水素亜硫酸塩）またはさらに別の化学薬品によって、塩基対挙動に関して様々な塩基が作製するように塩基の５位にメチル化されていない全てのシトシン塩基が変化されるように処理され、他方、５位にメチル化したシトシンが不変のままに残る。重亜硫酸塩を使用するときは、非メチル化シトシン塩基に添加される。次いで、その後のアルカリ加水分解はウラシル中の非メチル化シトシン−ヌクレオべースの変換に供される。
【００４９】
この方法の第２ステップで、前処理されたＤＮＡが有利には熱安定性のポリメラーゼと少なくとも１個のプライマー（Ａ型）の使用下に増幅される。
【００５０】
この方法の特に有利な変形において、Ａ型のプライマーによる増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される。
【００５１】
この方法の有利な一変形において、複数個のＤＮＡ−フラグメントの増幅が１つの反応容器の中で実施される。これは、種々のプライマーがそれぞれ一定のフラグメントを作製する、いわゆるマルチプレックスＰＣＲとすることができる。種々の定義された増幅が１つの反応容器の中で実施される。もう１つの特に有利なこの方法の変形において、プライマーが目標を定めてかつ再現可能にその都度複数個のフラグメントを増幅する。これは、前記フラグメントがたとえばゲノム中の反復要素に結合することによって達成することができる。特に有利なこの方法の変形において、プライマーが転写因子結合サイト、プロモータまたは遺伝子中のその他の調節要素に結合する。特に有利なこの方法の変形において、増幅が固相に結合しているプライマーの伸長によって行われる。別の意味でのマルチプレックスＰＣＲは、様々なプライマーが固相の種々の定義された箇所に結合していることによって実施することができる。
【００５２】
第２方法ステップのさらに有利な変形において、様々なオリゴヌクレオチド配列が直角または六角の格子の形態で配列されている固相が平滑である。これは結果的に、様々な増幅体も固相上に直角または六角の格子の形態で配列されていることになる。上述のように、この場合には複数個の増幅体が直接固相上で作製される。
【００５３】
固相表面は、有利には、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。
【００５４】
特に有利なこの方法の変形において、Ａ型のオリゴヌクレオチドは、塩基Ｔ、ＡおよびＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみのいずれかの塩基を含有する。
【００５５】
第３方法ステップにおいて、少なくとも１個のプライマー（Ｂ型）で増幅されたゲノムＤＮＡが二重体の形成下にハイブリッドされる。ハイブリッドされたＢ型のオリゴヌクレオチドは、それぞれその３’−末端で、該オリゴヌクレオチドのメチル化に関してゲノムＤＮＡ−プローブの中で調査される位置に結合する。このとき、２つの場合を区別することができる：調査される配列がプライマーに対してその３’末端でも完全に相補性があり、この場合には、次のステップにおけるプライマーの伸長が１個のポリメラーゼ反応で可能であり、またはさらにこの配列がプライマーの配列に対して３’−末端で完全に相補性がなく、この場合にはプライマーの伸長を行うことができない。特定のＣｐＧ位置がメチル化について調査されるときは、２つの可能な状態がある。化学的な前処理、有利には重亜硫酸塩による前処理によって、ＣＧのメチル化時に、非メチル化シトシンの存在によりＵＧもしくは増幅後にＴＧが生じる。有利には、この場合の実験が２種類のプライマーによって実施され、それぞれがこの状態の１つで完全な相補性と、それにより鎖伸長のための可能性とがそれぞれ両方の可能な場合の一方で生じる。
【００５６】
まだ増幅体が固相に結合していないときは、この増幅体にハイブリッドしたオリゴヌクレオチドをその５’−末端でまたは別の塩基でまたはそのバックボーンを介して固相と結合することができるが、その３’−末端を介しては結合できない。有利には５’−末端を介して結合が行われる。有利な変形において、様々なオリゴヌクレオチド配列（Ｂ型）が直角または六角の格子の形態で配列されている固相が平滑である。
【００５７】
この固相表面は、有利には、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。
【００５８】
第４方法ステップで、作製したオリゴヌクレオチドが熱安定性ポリメラーゼによって少なくとも１個のヌクレオチド、最大で１０個のヌクレオチドまで伸長され、少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有する。伸長の方式は、この場合、ゲノムＤＮＡ−プローブの中の各シトシンのメチル化状態に依存し、さらにまた場合により存在するＳＮＰｓ、点突然変異または欠失、挿入および逆位にも依存する。
【００５９】
基本的に、末端オリゴヌクレオチド（Ｃ２型）のみが必要である。ところが、それぞれの配列に応じて、各配列コンテキストで可能である場合、鎖伸長オリゴヌクレオチドも使用してよい。
【００６０】
この方法の有利な変形において、使用したヌクレオチドが末端ヌクレオチド（Ｃ２型）および／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１型）である。特に有利なこの方法の変形において、Ｃ１型および／またはＣ２型のヌクレオべースは、塩基Ｔ、ＡおよびＣまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧを含有する群から選ばれる。
【００６１】
伸長されたＢ型のオリゴヌクレオチドの標識は、有利には吸収色素および／または化学蛍光剤および／または放射性同位元素および／または第４方法ステップで接合されたヌクレオチドを介して導入される蛍光標識を介して行われる。有利には、同様にこの標識が伸長したオリゴヌクレオチドの分子量を介して行われる。好ましくは、蛍光マーカーが、たとえばＣｙ５−ｄＣＴＰのような蛍光標識ヌクレオチドによって導入される。
【００６２】
第５方法ステップにおいて、伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査される。平滑な固相が使用されるとき、解析は、当初オリゴヌクレオチドが不動化された固相上の各箇所で行われる。
【００６３】
特に有利なこの方法の変形において、その蛍光を介して伸長したオリゴヌクレオチドの検出が行われる。
【００６４】
この方法の有利な変形において、伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントは１個または複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水分解によって作製される。
【００６５】
特に有利なこの方法の変形において、ヌクレオチドの標識は、質量分析計で検出可能である解離可能の質量標識である。
【００６６】
解離可能の質量標識、伸長したオリゴヌクレオチド全部またはそのフラグメントは、特に有利なこの方法の変形において、マトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）またはエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ）によってそれらの明確な質量を利用して検出され、かつ、視覚化される。
【００６７】
好ましくは、質量分析計で検出されたフラグメントは、個々の正または負の正味電荷を有する。
【００６８】
特に有利なこの方法の変形において、ＳＮＰｓ（単一ヌクレオチド多型）とシトシン−メチル化とが１回の実験で解析される。
【００６９】
特に有利なこの方法の変形において、ＤＮＡ−プローブの下流鎖および上流鎖が、内部での実験コントロールを保証するために、化学的前処理後に１回の実験で解析される。
【００７０】
本発明の別の目的は、重亜硫酸塩反応の実施および／または増幅、ハイブリッド化、伸長反応および／またはポリメラーゼの実施のための化学薬品および補助剤および／またはこの方法の実施のための整備資料を含むキットである。
【００７１】
【発明の実施の形態】
以下の例が本発明を説明する。
【００７２】
【実施例】
実施例１：
以下の例は、特定のＣＧ位置がメチル化について調査される第VIII−因子遺伝子のエクソン２３のフラグメントに関する。
【００７３】
第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（配列番号１）およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（配列番号２）によって増幅される。増幅されたＤＮＡはＢ型のオリゴヌクレオチド（例えばＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＣＧ（配列番号３））にハイブリッドされ、ポリメラーゼ反応で標識された２’，３’，−ジデスオキシチミジントリフォスフェート（Ｃ２型）により伸長される。ＣＧが１個の場合のみ、すなわち当初のゲノムＤＮＡ−プローブの中にメチル化されたシトシンを有する場合にのみ、前記伸長を行うことができ、それ以外は欠損対がプライマーの３’−末端でポリメラーゼ反応を阻害する。従って、それぞれ調査するべきシトシンのメチル化状態がプライマーの伸長を決定する。
【００７４】
コントロールのために、この反応はプライマーＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧ（配列番号４）で実施することができる。この場合には、被調査ＤＮＡ−プローブの中で前記位置に非メチル化シトシンが共されている場合にのみ、伸長が行われる。ラベルは、たとえばｄｄＴＴＰまたはＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ（登録商標）のためのＭｅｇａｐｒｉｍｅ（登録商標）のような吸収色素としてよい。
【００７５】
実施例２：
以下の例は、特定のＣＧ位置がメチル化について調査される第VIII−因子遺伝子のエクソン２３のフラグメントに関する。
【００７６】
第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（配列番号１）およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（配列番号２）によって増幅される。増幅されたＤＮＡは、その５’末端で固相表面に不動化されたＢ型のオリゴヌクレオチド（たとえばＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＣＧ（配列番号３））にハイブリッドされ、ポリメラーゼ反応で標識された２’，３’，−ジデスオキシチミジントリフォスフェート（Ｃ２型）により伸長される。ＣＧが１個の場合のみ、すなわち当初のゲノムＤＮＡプローブの中にメチル化されたシトシンを有する場合にのみ、前記伸長を行うことができ、それ以外は欠損対がプライマーの３’−末端でポリメラーゼ反応を阻害する。従って、それぞれ調査するべきシトシンのメチル化状態がプライマーの伸長を決定する。
【００７７】
コントロールのために、この反応はプライマーＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧ（配列番号４）で実施することができる。この場合には、被調査ＤＮＡ−プローブの中で前記位置に非メチル化シトシンが共されている場合にのみ、伸長が行われる。ラベルは、たとえばｄｄＴＴＰまたはＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ（登録商標）のためのＭｅｇａｐｒｉｍｅ（登録商標）のような吸収色素としてよい。
【００７８】
実施例３：
以下の例は、特定のＣＧ位置がメチル化について調査される第VIII −因子遺伝子のエクソン２３のフラグメントに関する。
【００７９】
第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（配列番号１）およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（配列番号２）によって増幅される。この増幅のために、重亜硫酸塩で処理したＤＮＡを５分間９６℃でインキュベートして、その後４０サイクルで各々５０秒間９６℃で変性し、７５秒間６１．７℃でインキュベート（アニーリング）し、１００秒間７２℃でインキュベート（伸長）した。それに続く反応（最終伸長）で、反応試薬を１５分間７２℃でインキュベートする。増幅したＤＮＡは、オリゴヌクレオチドＡＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号５）（図１のスポット１）およびＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号６）（図１のスポット２）にハイブリッドし、これを固相で不動化した。伸長反応のために、２’−デスオキシチミジントリフォスフェート（ｄＴＴＰ、Ｃ１型として）、２’−デスオキシグアノシントリフォスフェート（ｄＧＴＰ、Ｃ１型として）、２’−デスオキシアデノシントリフォスフェート（ｄＡＴＰ、Ｃ１型として）および２’−デスオキシシチジントリフォスフェート（ｄＣＴＰ、Ｃ１型として）が必要であり、その際補足して蛍光標識２’−デスオキシシチジントリフォスフェートが３：１の比率（非標識２’−デスオキシシチジントリフォスフェートを基準）で添加される。増幅体と、デスオキシヌクレオチド混合物と１０ｘ緩衝液とからなる反応試薬を１５分間９６℃でインキュベートする。それにつづくプライマー伸長反応のために、ＤＮＡポリメラーゼ、ここではクレナウ・フラグメント、を添加し、この反応混合物を夜通し３７℃で固相上にインキュベートする。下図に識別されるように、実施したプライマー伸長はＤＮＡのメチル化状態を推測させる。スポット１とスポット２の比較は、図１に示したように、このメチル化状態に関する言表を可能にする：本発明の場合において、スポット１のシグナルの強さによって非メチル化ＣｐＧが検出される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、スポット１とスポット２との比較を示す説明図である。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲノムＤＮＡ−プローブ（Pr0be）の中の規定された５−メチルシトシンの検出方法又は５−メチルシトシン及びＳＮＰの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の方法論的開発により分子生物学においてよく研究されている観察レベルは、遺伝子自体と、この遺伝子のＲＮＡへの翻訳と、そこから作製するタンパク質である。固体の発現の経過の中でどの遺伝子がいつスイッチが入れられ、特定の細胞および組織の中の特定の遺伝子の活性および阻害がどのように制御されるかは、遺伝子もしくはゲノムのメチル化の範囲と特性とによって相関関係をつけることができる。本発明は、ゲノムＤＮＡ−プローブのメチル化状態の検出方法を記載する。この方法は、同時に点突然変異および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰs）の検出にも利用することができる。
【０００３】
５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡの中で最も頻繁に共有結合に変性した塩基である。この塩基は、たとえば転写の調節、遺伝子の刷り込みおよび腫瘍形成においてある役割を果たしている。従って、遺伝子情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定が非常に重要である。ところが、５−メチルシトシン位置は、５−メチルシトシンがシトシンと同じ塩基対挙動を有するので、配列決定によって同定することができない。さらに、ＰＣＲ増幅において５−メチルシトシンを有する後生的な情報が完全に失われてしまう。
【０００４】
比較的新しく、かつ、この間に頻繁に適用されている５−メチルシトシンについてのＤＮＡの調査方法は、シトシンと重亜硫酸塩の特異反応に基づき、これはそれに続くアルカリ加水分解によって、その塩基対挙動においてチミジンに相当するウラシルに変換される。それに対して、５−メチルシトシンは前記条件下に変性されない。それにより元のＤＮＡは、当初そのハイブリット化特性によってシトシンから区別できないメチルシトシンが、現在「普通の」分子生物学の技術によって唯一残るシトシンとして、たとえば増幅およびハイブリット化または配列決定によって検出できるように変換される。これらの技術は全て、現在完全に利用される塩基対に基づく。感度に関する先行技術は、被検査ＤＮＡをアガロース・マトリックスの中に封じ込める方法によって定義され、それによりＤＮＡの拡散および復元（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡにのみ反応する）を妨害し、全ての沈降ステップおよび洗浄ステップを速い透析で代用される（Ｏｌｅｋ，Ａ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９６，２４，５０６４−５０６６）。この方法によって個々の細胞を検査することができ、これがこの方法の可能性を具体的に示している。確かに、従来個々の部位のみが約３０００塩基対長まで調査されているが、可能なメチル化解析の数千の細胞の全体的な調査は不可能である。しかし、この方法も少ないプローブ量から非常に小さいフラグメントを確実に解析することができない。これは拡散防止にもかかわらずマトリックスによって失われる。
【０００５】
５−メチルシトシンを検出する別の公知の可能性に関する概要は、次の概要論文から読み取ることができる：Ｒｅｉｎ，Ｔ．，ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ． １９９８，２６，２２５５。
【０００６】
重亜硫酸塩技術は、従来幾つかの例外（例えば、Ｚｅｃｈｎｉｇｋ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ． Ｇｅｎ． １９９７，５，９４−９８）を除き研究にのみ使用されている。しかし、常に既知の遺伝子の短い特異的断片を重亜硫酸塩処理によって増幅し、完全に配列決定（Ｏｌｅｋ，Ａ．およびＷａｌｔｅｒ，Ｊ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１７，２７５−２７６）するか、または「プライマー拡張反応による個々のシトシンの位置」（Ｇｏｎｚａｌｇｏ，Ｍ．Ｌ．およびＪｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，２５２９−２５３１，ＷＯ ９５００６６９）によって、または酵素切片（Ｘｉｏｎｇ，Ｚ．およびＬａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５，２５３２−２５３４）によって検出されている。特に、ハイブリダイゼーションによる検出も記載されている（Ｏｌｅｋら、ＷＯ ９９２８４９８）。
【０００７】
個々の遺伝子におけるメチル化検出のための重亜硫酸塩技術の適用を取り上げているその他の出版物は次のとおりである：Ｘｉｏｎｇ， Ｚ．およびＬａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．（１９９７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５３２；Ｇｏｎｚａｌｇｏ，Ｍ．Ｌ．およびＪｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．（１９９７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５２９；Ｇｒｉｇｇ，Ｓ．およびＣｌａｒｋ，Ｓ．（１９９４），Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １６，４３１；Ｚｅｓｃｈｎｉｋ，Ｍ．ら、（１９９７），Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６，３８７；Ｔｅｉｌ， Ｒ．ら、（１９９４），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，６９５；Ｍａｒｔｉｎ，Ｖ．ら、（１９９５），Ｇｅｎｅ １５７，２６１；ＷＯ ９７４６７０５およびＷＯ ９５１５３７３．
【０００８】
オリゴマーアレイ製造における先行技術に関する概要は、１９９９年１月に出版された自然発生学特別号（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２１，Ｊａｎｕａｒｙ １９９９）と、そこで引用されている文献とから読み取ることができる。
【０００９】
ＤＮＡを不動化するための様々な方法が存在する。よく知られている方法は、ビオチンで官能化されたＤＮＡのストレプトアビジン−コーティング表面への強固な結合である（Ｕｈｌｅｎ， Ｍ．ら、１９８８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，３０２５−３０３８）。このシステムの結合強度は、１個の結合もない共有結合の化学結合に相当する。標的ＤＮＡを共有結合で化学的に調製した表面に結合できるようにするために、対応する標的ＤＮＡの官能性を必要とする。ＤＮＡ自体は、好適である官能化をもたない。標的ＤＮＡに好適な官能化を導入する種々の変形がある：２種の容易に操作しうる官能化は、第一級脂肪族アミンおよびチオールである。このようなアミン類は、定量的にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって変換され、チオールが好適な条件下に定量的にアルキルヨウ化物と反応する。難点は、ＤＮＡの中へのこのような官能化の導入にある。最も簡単な変形は、ＰＣＲのプライマーによる導入である。前記変形は、５’変性プライマー（ＮＨ2およびＳＨ）と二機能リンカーとを利用する。
【００１０】
ある表面上の不動化の本質的な構成要素はその性状である。今まで説明した系は、主にケイ素または金属からなる。標的ＤＮＡの結合のための別の方法は、標的ＤＮＡの中の短い識別配列（たとえば２０塩基）を表面不動化したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに使用することに基づく。標的ＤＮＡへの化学的活性の位置の導入に関する酵素の変形も記述されている。この場合、標的ＤＮＡに酵素的に５’−ＮＨ2官能化が実施される。
【００１１】
不動化したＤＮＡ−アレーの走査のために、幾度も蛍光的に標識されたプローブが使用されている。蛍光標識に特に好適なのは、各プローブの５’−ＯＨにＣｙ３およびＣｙ５色素の簡単な取り込みである。ハイブリッドしたプローブの蛍光の検出は、たとえば共焦点顕微鏡を介して行われる。色素Ｃｙ３およびＣｙ５は、その他の多くの色素と並んで商業的に入手することができる。
【００１２】
突然変異の新規検出方法を以下に記載する：
配列決定の特殊事例として、個別塩基プライマー拡張（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）が言及する価値がある（Ｈｅａｄ，ＳＲ．，Ｒｏｇｅｒｓ，ＹＨ．，Ｐａｒｉｋｈ，Ｋ．，Ｌａｎ，Ｇ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．，Ｂｏｙｃｅｊａｃｉｎｏ ＭＴ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（２４）：５０６５−５０７１，１９９７；Ｐｉｃｏｕｌｔ−Ｎｅｗｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９（２）：１６７−１７４，１９９９）。増幅と配列決定の組合せは、米国特許第５９２８９０６号明細書に記載されており、そこでは塩基特異的末端がマトリックス分子に使用されている。もう１つの方法は、ヌクレオチドの同定のためにリガーゼ／ポリメラーゼ反応を使用する（米国特許第５９５２１７４号明細書）。
【００１３】
マトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）は、生物分子を解析するための非常に有用な開発である（Ｋａｒａｓ， Ｍ．およびＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．（１９８８），Ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓｅｓ ｅｘｅｅｄｉｎｇ １００００ ｄａｌｔｏｎｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９−２３０１）。解析体が吸光マトリックスの中へセットされる。短レーザーパルスによってマトリックスが蒸発され、解析体分子がこのようにフラグメント化されずに気相中へ輸送される。マトリックス分子との衝突によって、解析体のイオン化が達成される。印加した電圧がイオンを無電界の飛行管（Ｆｌｕｇｒｏｈｒ）の中へ加速する。前記イオンの質量が異なるために、イオンが様々な強さで加速される。より小さいイオンは、より大きいイオンよりも速く検出器に到達する。
【００１４】
ＭＡＬＤＩは、ペプチドとタンパク質の解析に非常に良く適している。核酸の解析は、若干困難である（Ｇｕｔ，Ｉ．Ｇ．およびＢｅｃｋ，Ｓ．（１９９５），ＤＮＡ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌaｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ １：１４７−１５７）。核酸の場合は、感度がペプチドの場合より約１００倍悪く、フラグメントサイズの増加とともに過度に減少する。多量に負に帯電したバックボーンを有する核酸の場合、マトリックスによるイオン化プロセスは本質的に非効率的である。ＭＡＬＤＩの場合、マトリックスの選択は顕著に重要な役割を果たす。ペプチド類の脱着については、非常に微細な結晶化を生じる幾つかの非常に有用なマトリックスが見い出されている。ＤＮＡの場合は、確かにこの間に幾つかの興味をひくマトリックスが存在するが、それによって感度差は縮小されなかった。感度差は、ＤＮＡがペプチドに類似するように、前記ＤＮＡが化学的に変性されることによって縮小させることができる。
【００１５】
通常のバックボーンのリン酸塩がチオリン酸塩で置換されたホスホロチオエート核酸は、簡単なアルキル化化学によって電荷中性ＤＮＡに変換することができる（Ｇｕｔ，Ｉ．Ｇ．およびＢｅｃｋ，Ｓ．（１９９５），Ａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：１３６７−１３７３）。この変性ＤＮＡへの「電荷標識」（ｃｈａｒｇｅ ｔａｇｓ）のカップリングは、総量がペプチドの場合で見い出されるものと同じ総量分の感度の上昇で生じる。「ｃｈａｒｇｅ ｔａｇｇｉｎｇ」のもう１つの長所は、非変性基質の検出を非常に困難にする不純物に対する解析の安定性の増大である。
【００１６】
ゲノムＤＮＡは、細胞−、組織−またはその他の実験プローブのＤＮＡから標準的方法で得られる。この標準的方法は、「フリッチおよびマニアティス編、分子クローニング：実験マニュアル、１９８９年」（ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８９）のような報告書に見い出される。
【００１７】
プロモータの間の共通性は、ＴＡＴＡボックスまたはＧＣボックスの存在にあるのみならず、どの転写因子に対して前記共通性が結合部位を有し、かつ、どの間隔で前記結合部位が互いに存在するかにもある。特定のタンパク質に対して存在する結合部位は、その配列において完全に一致しないが、「ゆらぎ」（Ｗｏｂｂｌｅｓ）の接合、すなわち各々様々な塩基が存在する位置によって、さらに伸長することができる少なくとも４個の塩基の保存順序が見い出される。さらに、前記結合部位は、互いに一定の間隔で存在する。
【００１８】
ところが、核体積の大部分を占めるインタフェース−クロマチンの中のＤＮＡの分布は、全く特異的な序列に従う。つまり、ＤＮＡは複数の部位で核マトリックスへ核膜の内側で糸状構造を付着させている。この領域は、「マトリックス付着領域（ＭＡＲ）」（ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ （ＭＡＲ））または「骨格付着領域（ＳＡＲ）」（ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ （ＳＡＲ））と呼ばれる。この付着は、転写もしくは複製に本質的な影響を及ぼす。このＭＡＲ−フラグメントは、保存配列をもたないが、７０％までＡもしくはＴからなり、転写を一般的に調節するｃｉｓ−作用領域およびトポイソメラーゼＩＩ−識別部位の付近にある。
【００１９】
プロモータおよびエンハンサーのほかに、種々の遺伝子のための別の調節要素、いわゆるインシュレータが存在する。このインシュレータは、たとえば前記インシュレータがエンハンサーとプロモータとの間にある場合、あるいはまたヘテロクロマチンと、活性遺伝子をヘテロクロマチンの影響前に保護する遺伝子との間にある場合、プロモータへのエンハンサーの作用を阻害することができる。このようなインシュレータの例：１．ＤＮＡａｓｅ Ｉに対して高感受性の複数個の部位からなる、いわゆるＬＣＲ（ｌｏｃｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎｓ）、２．ＳＣＳ（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）もしくはＳＣＳ’のような特定の配列、３５０もしくは２００ｂｐ長さおよびＤＮＡａｓｅ Ｉによる変性に対して高抵抗性のおよび高感受性の部位の両側に並ぶ（１００ｂｐずつの間隔）。ＳＣＳ’にはタンパク質ＢＥＡＦ−３２が結合する。このインシュレータは当該遺伝子の両側に置くことができる。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ゲノムＤＮＡ−プローブの中のシトシン−メチル化およびＳＮＰｓの同時検出に特に適している方法を提供することである。その場合、有利には多数のフラグメントが同時に調査できなければならない。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
この課題は、本発明により、ゲノムＤＮＡ−プローブの中の５−メチルシトシンの検出方法によって解決され、その際に下記の
（ａ）ＤＮＡプローブからゲノムＤＮＡを試薬で化学的に置換し、その際に５−メチルシトシンとシトシンとが様々に反応し、これらがそれによって反応後にＤＮＡ二重体の中で様々な塩基対挙動を示すステップと
（ｂ）ポリメラーゼと、プライマーとして少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ａ型）との使用下に前処理したＤＮＡを増幅するステップと
（ｃ）増幅したゲノムＤＮＡを少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ｂ型）で二重体の形成下にｎヌクレオチドの既知の配列によってハイブリッドし、前記のハイブリッドしたＢ型のオリゴヌクレオチドをその３’−末端で部分的または完全に、そのメチル化に関してゲノムＤＮＡプローブの中で調査するべき位置にハイブリッドするステップと
（ｄ）オリゴヌクレオチド（Ｂ型）がその３’−末端であらかじめ塩基欠損対なしに調査するべき位置にハイブリッドした場合、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１個のヌクレオチド分だけポリメラーゼによって伸長され、その際少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有し、この伸長がゲノムＤＮＡプローブの中の各シトシンのメチル化状態に依存するステップと、
（ｅ）伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査されるステップと
が実施される。
【００２２】
本発明により、一定の部位のオリゴヌクレオチド（Ｂ型）が固相に結合され、または一定の部位の増幅体を固相に結合することが有利である。
【００２３】
さらに、様々なオリゴヌクレオチド配列を平滑な固相上に直角格子または六角格子の形態で配列することが有利である。
【００２４】
さらに、本発明により、固相表面がケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることが有利である。
【００２５】
また、伸長したオリゴヌクレオチドに取り込まれた標識が、オリゴヌクレオチド配列が存在する固相の各位置で同定可能であることが有利である。
【００２６】
本発明により、増幅する際に少なくとも１個のプライマー（Ａ型）が固相に結合されていることが有利である。
【００２７】
さらに、本発明により、様々な増幅体を固相上に直角格子または六角格子の形態で配列することを有利とすることができる。
【００２８】
ＤＮＡの処理を増幅する前に重亜硫酸塩溶液（＝ジ亜硫酸塩、水素亜硫酸塩）で実施することが完全に特に有利である。
【００２９】
特に、本発明により、増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われることが有利である。
【００３０】
さらに、本発明により、使用したＡ型のオリゴヌクレオチドが塩基Ｔ、ＡおよびＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみを含有することが特に有利である。
【００３１】
さらに、ヌクレオチドの標識が蛍光標識であることが有利である。
【００３２】
さらに、本発明により、ヌクレオチドの標識が放射性核種であることが有利である。
【００３３】
ヌクレオチドの標識が質量分析計で検出される解離可能の質量標識であることが特に有利である。
【００３４】
さらに、本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドが全て一緒に質量分析計で検出され、それによって前記オリゴヌクレオチドの質量によって明確に標識されていることが有利である。また、伸長したオリゴヌクレオチドの各々１個のフラグメントが質量分析計で検出されることも特に有利である。
【００３５】
さらに、本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントが１個または複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水分解によって作製されることが有利である。
【００３６】
さらに、本発明により、質量分析計におけるよりよい検出可能性のために作製されたフラグメントが個々の正または負の正味電荷を有することが有利である。
【００３７】
本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドの検出がマトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ）によって実施され、かつ、視覚化されることが完全に特に有利である。
【００３８】
さらに、本発明により、ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡ−ポリメラーゼである方法が有利である。
【００３９】
本発明により、ＤＮＡメチル化に補足してＳＮＰｓも検出され、かつ、視覚化される方法も有利である。
【００４０】
さらに、使用したヌクレオチドが末端ヌクレオチド（Ｃ２型）および／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１型）である方法が有利である。
【００４１】
さらに、本発明により、ヌクレオチド（Ｃ１型およびＣ２型）が、ヌクレオべースＡ、ＴおよびＣまたは塩基ＧおよびＡおよびＴのいずれかを含有する群から選ばれる方法が有利である。
【００４２】
さらに、本発明により、増幅が反応容器中の複数のＤＮＡ切片によって実施されることが有利である。
【００４３】
本発明により、ゲノムＤＮＡがＤＮＡ−プローブから得られており、ＤＮＡのためのソース、たとえば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液が、パラフィンに植え込まれた組織、組織学的スライドおよび全ての可能なこれらの組合せを包含する方法が完全に特に有利である。
【００４４】
最後に、本発明により、上流および下流のＤＮＡ−鎖のメチル化解析が１回の実験で実施されることが有利である。この解析の実施は、有利には同時に行われる。
【００４５】
つまり、ゲノムＤＮＡ−プローブの中のメチルシトシンの検出方法が記載されている。
【００４６】
この方法は、全ＤＮＡまたはそのフラグメントの増幅、ハイブリッド化および伸長反応を含む。この方法は、メチルシトシンと同時に単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）および突然変異の検出に利用することができる。
【００４７】
解析されるゲノムＤＮＡは、有利にはＤＮＡの通常のソース、たとえば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液が、パラフィンに植え込まれた組織、組織学的スライドおよび全ての可能なこれらの組合せから得られる。
【００４８】
この方法の第１ステップで、使用したＤＮＡが有利には重亜硫酸塩（＝ジ亜硫酸塩、水素亜硫酸塩）またはさらに別の化学薬品によって、塩基対挙動に関して様々な塩基が作製するように塩基の５位にメチル化されていない全てのシトシン塩基が変化されるように処理され、他方、５位にメチル化したシトシンが不変のままに残る。重亜硫酸塩を使用するときは、非メチル化シトシン塩基に添加される。次いで、その後のアルカリ加水分解はウラシル中の非メチル化シトシン−ヌクレオべースの変換に供される。
【００４９】
この方法の第２ステップで、前処理されたＤＮＡが有利には熱安定性のポリメラーゼと少なくとも１個のプライマー（Ａ型）の使用下に増幅される。
【００５０】
この方法の特に有利な変形において、Ａ型のプライマーによる増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される。
【００５１】
この方法の有利な一変形において、複数個のＤＮＡ−フラグメントの増幅が１つの反応容器の中で実施される。これは、種々のプライマーがそれぞれ一定のフラグメントを作製する、いわゆるマルチプレックスＰＣＲとすることができる。種々の定義された増幅が１つの反応容器の中で実施される。もう１つの特に有利なこの方法の変形において、プライマーが目標を定めてかつ再現可能にその都度複数個のフラグメントを増幅する。これは、前記フラグメントがたとえばゲノム中の反復要素に結合することによって達成することができる。特に有利なこの方法の変形において、プライマーが転写因子結合サイト、プロモータまたは遺伝子中のその他の調節要素に結合する。特に有利なこの方法の変形において、増幅が固相に結合しているプライマーの伸長によって行われる。別の意味でのマルチプレックスＰＣＲは、様々なプライマーが固相の種々の定義された箇所に結合していることによって実施することができる。
【００５２】
第２方法ステップのさらに有利な変形において、様々なオリゴヌクレオチド配列が直角または六角の格子の形態で配列されている固相が平滑である。これは結果的に、様々な増幅体も固相上に直角または六角の格子の形態で配列されていることになる。上述のように、この場合には複数個の増幅体が直接固相上で作製される。
【００５３】
固相表面は、有利には、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。
【００５４】
特に有利なこの方法の変形において、Ａ型のオリゴヌクレオチドは、塩基Ｔ、ＡおよびＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみのいずれかの塩基を含有する。
【００５５】
第３方法ステップにおいて、少なくとも１個のプライマー（Ｂ型）で増幅されたゲノムＤＮＡが二重体の形成下にハイブリッドされる。ハイブリッドされたＢ型のオリゴヌクレオチドは、それぞれその３’−末端で、該オリゴヌクレオチドのメチル化に関してゲノムＤＮＡ−プローブの中で調査される位置に結合する。このとき、２つの場合を区別することができる：調査される配列がプライマーに対してその３’末端でも完全に相補性があり、この場合には、次のステップにおけるプライマーの伸長が１個のポリメラーゼ反応で可能であり、またはさらにこの配列がプライマーの配列に対して３’−末端で完全に相補性がなく、この場合にはプライマーの伸長を行うことができない。特定のＣｐＧ位置がメチル化について調査されるときは、２つの可能な状態がある。化学的な前処理、有利には重亜硫酸塩による前処理によって、ＣＧのメチル化時に、非メチル化シトシンの存在によりＵＧもしくは増幅後にＴＧが生じる。有利には、この場合の実験が２種類のプライマーによって実施され、それぞれがこの状態の１つで完全な相補性と、それにより鎖伸長のための可能性とがそれぞれ両方の可能な場合の一方で生じる。
【００５６】
まだ増幅体が固相に結合していないときは、この増幅体にハイブリッドしたオリゴヌクレオチドをその５’−末端でまたは別の塩基でまたはそのバックボーンを介して固相と結合することができるが、その３’−末端を介しては結合できない。有利には５’−末端を介して結合が行われる。有利な変形において、様々なオリゴヌクレオチド配列（Ｂ型）が直角または六角の格子の形態で配列されている固相が平滑である。
【００５７】
この固相表面は、有利には、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。
【００５８】
第４方法ステップで、作製したオリゴヌクレオチドが熱安定性ポリメラーゼによって少なくとも１個のヌクレオチド、最大で１０個のヌクレオチドまで伸長され、少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有する。伸長の方式は、この場合、ゲノムＤＮＡ−プローブの中の各シトシンのメチル化状態に依存し、さらにまた場合により存在するＳＮＰｓ、点突然変異または欠失、挿入および逆位にも依存する。
【００５９】
基本的に、末端オリゴヌクレオチド（Ｃ２型）のみが必要である。ところが、それぞれの配列に応じて、各配列コンテキストで可能である場合、鎖伸長オリゴヌクレオチドも使用してよい。
【００６０】
この方法の有利な変形において、使用したヌクレオチドが末端ヌクレオチド（Ｃ２型）および／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１型）である。特に有利なこの方法の変形において、Ｃ１型および／またはＣ２型のヌクレオべースは、塩基Ｔ、ＡおよびＣまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧを含有する群から選ばれる。
【００６１】
伸長されたＢ型のオリゴヌクレオチドの標識は、有利には吸収色素および／または化学蛍光剤および／または放射性同位元素および／または第４方法ステップで接合されたヌクレオチドを介して導入される蛍光標識を介して行われる。有利には、同様にこの標識が伸長したオリゴヌクレオチドの分子量を介して行われる。好ましくは、蛍光マーカーが、たとえばＣｙ５−ｄＣＴＰのような蛍光標識ヌクレオチドによって導入される。
【００６２】
第５方法ステップにおいて、伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査される。平滑な固相が使用されるとき、解析は、当初オリゴヌクレオチドが不動化された固相上の各箇所で行われる。
【００６３】
特に有利なこの方法の変形において、その蛍光を介して伸長したオリゴヌクレオチドの検出が行われる。
【００６４】
この方法の有利な変形において、伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントは１個または複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水分解によって作製される。
【００６５】
特に有利なこの方法の変形において、ヌクレオチドの標識は、質量分析計で検出可能である解離可能の質量標識である。
【００６６】
解離可能の質量標識、伸長したオリゴヌクレオチド全部またはそのフラグメントは、特に有利なこの方法の変形において、マトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）またはエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ）によってそれらの明確な質量を利用して検出され、かつ、視覚化される。
【００６７】
好ましくは、質量分析計で検出されたフラグメントは、個々の正または負の正味電荷を有する。
【００６８】
特に有利なこの方法の変形において、ＳＮＰｓ（単一ヌクレオチド多型）とシトシン−メチル化とが１回の実験で解析される。
【００６９】
特に有利なこの方法の変形において、ＤＮＡ−プローブの下流鎖および上流鎖が、内部での実験コントロールを保証するために、化学的前処理後に１回の実験で解析される。
【００７０】
本発明の別の目的は、重亜硫酸塩反応の実施および／または増幅、ハイブリッド化、伸長反応および／またはポリメラーゼの実施のための化学薬品および補助剤および／またはこの方法の実施のための整備資料を含むキットである。
【００７１】
【発明の実施の形態】
以下の例が本発明を説明する。
【００７２】
【実施例】
実施例１：
以下の例は、特定のＣＧ位置がメチル化について調査される第VIII−因子遺伝子のエクソン２３のフラグメントに関する。
【００７３】
第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（配列番号１）およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（配列番号２）によって増幅される。増幅されたＤＮＡはＢ型のオリゴヌクレオチド（例えばＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＣＧ（配列番号３））にハイブリッドされ、ポリメラーゼ反応で標識された２’，３’，−ジデスオキシチミジントリフォスフェート（Ｃ２型）により伸長される。ＣＧが１個の場合のみ、すなわち当初のゲノムＤＮＡ−プローブの中にメチル化されたシトシンを有する場合にのみ、前記伸長を行うことができ、それ以外は欠損対がプライマーの３’−末端でポリメラーゼ反応を阻害する。従って、それぞれ調査するべきシトシンのメチル化状態がプライマーの伸長を決定する。
【００７４】
コントロールのために、この反応はプライマーＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧ（配列番号４）で実施することができる。この場合には、被調査ＤＮＡ−プローブの中で前記位置に非メチル化シトシンが共されている場合にのみ、伸長が行われる。ラベルは、たとえばｄｄＴＴＰまたはＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ（登録商標）のためのＭｅｇａｐｒｉｍｅ（登録商標）のような吸収色素としてよい。
【００７５】
実施例２：
以下の例は、特定のＣＧ位置がメチル化について調査される第VIII−因子遺伝子のエクソン２３のフラグメントに関する。
【００７６】
第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（配列番号１）およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（配列番号２）によって増幅される。増幅されたＤＮＡは、その５’末端で固相表面に不動化されたＢ型のオリゴヌクレオチド（たとえばＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＣＧ（配列番号３））にハイブリッドされ、ポリメラーゼ反応で標識された２’，３’，−ジデスオキシチミジントリフォスフェート（Ｃ２型）により伸長される。ＣＧが１個の場合のみ、すなわち当初のゲノムＤＮＡプローブの中にメチル化されたシトシンを有する場合にのみ、前記伸長を行うことができ、それ以外は欠損対がプライマーの３’−末端でポリメラーゼ反応を阻害する。従って、それぞれ調査するべきシトシンのメチル化状態がプライマーの伸長を決定する。
【００７７】
コントロールのために、この反応はプライマーＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧ（配列番号４）で実施することができる。この場合には、被調査ＤＮＡ−プローブの中で前記位置に非メチル化シトシンが共されている場合にのみ、伸長が行われる。ラベルは、たとえばｄｄＴＴＰまたはＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ（登録商標）のためのＭｅｇａｐｒｉｍｅ（登録商標）のような吸収色素としてよい。
【００７８】
実施例３：
以下の例は、特定のＣＧ位置がメチル化について調査される第VIII −因子遺伝子のエクソン２３のフラグメントに関する。
【００７９】
第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（配列番号１）およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（配列番号２）によって増幅される。この増幅のために、重亜硫酸塩で処理したＤＮＡを５分間９６℃でインキュベートして、その後４０サイクルで各々５０秒間９６℃で変性し、７５秒間６１．７℃でインキュベート（アニーリング）し、１００秒間７２℃でインキュベート（伸長）した。それに続く反応（最終伸長）で、反応試薬を１５分間７２℃でインキュベートする。増幅したＤＮＡは、オリゴヌクレオチドＡＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号５）（図１のスポット１）およびＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号６）（図１のスポット２）にハイブリッドし、これを固相で不動化した。伸長反応のために、２’−デスオキシチミジントリフォスフェート（ｄＴＴＰ、Ｃ１型として）、２’−デスオキシグアノシントリフォスフェート（ｄＧＴＰ、Ｃ１型として）、２’−デスオキシアデノシントリフォスフェート（ｄＡＴＰ、Ｃ１型として）および２’−デスオキシシチジントリフォスフェート（ｄＣＴＰ、Ｃ１型として）が必要であり、その際補足して蛍光標識２’−デスオキシシチジントリフォスフェートが３：１の比率（非標識２’−デスオキシシチジントリフォスフェートを基準）で添加される。増幅体と、デスオキシヌクレオチド混合物と１０ｘ緩衝液とからなる反応試薬を１５分間９６℃でインキュベートする。それにつづくプライマー伸長反応のために、ＤＮＡポリメラーゼ、ここではクレナウ・フラグメント、を添加し、この反応混合物を夜通し３７℃で固相上にインキュベートする。下図に識別されるように、実施したプライマー伸長はＤＮＡのメチル化状態を推測させる。スポット１とスポット２の比較は、図１に示したように、このメチル化状態に関する言表を可能にする：本発明の場合において、スポット１のシグナルの強さによって非メチル化ＣｐＧが検出される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、スポット１とスポット２との比較を示す説明図である。
【配列表】
Claims (25)
- ゲノムＤＮＡ−プローブ中の規定された５−メチルシトシンの検出又は規定された５−メチルシトシン及びＳＮＰを検出する方法であって、下記ステップ：
（ａ） ＤＮＡ−プローブからゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩（＝ジ亜硫酸塩、水素亜硫酸塩）溶液で化学的に処理して５−メチルシトシンは変換されないが、シトシンをウラシルに変換させ、それにより上記重亜硫酸塩処理の結果としてＤＮＡ二重体が異なる塩基対挙動を示す変換ステップ；
（ｂ） ステップ（ａ）により重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡの規定されたフラグメントを、ポリメラーゼ及び少なくとも一つのプライマーオリゴヌクレオチドを用いて増幅するステップ；
（ｃ） 増幅されたゲノムＤＮＡを、既知の配列を有する少なくとも１個のオリゴヌクレオチドにハイブリッドして二重体を形成させ；それにより前記オリゴヌクレオチッドをその３’−末端で、それらのメチル化の状態に関して調査されるべきゲノムＤＮＡ−プローブ内の位置に完全に又は部分的にハイブリッドするステップ；
（ｄ） その３’−領域が、調査されるべきゲノムＤＮＡプローブ内の位置に完全にハイブリッドするステップ（ｃ）によるオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによって少なくとも１個のヌクレオチド分だけ伸長して、それにより少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有するが、これに対し、３’−領域が、調査されるべきゲノムＤＮＡプローブ内の位置に部分的にハイブリッドするステップ（ｃ）によるオリゴヌクレオチドは伸張しないステップ；及び
（ｅ） 伸長したオリゴヌクレオチドを標識の存在について分析するステップ；を実施することを特徴とする上記方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが、定義された箇所で固相に結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 増幅体が、限定された箇所で固相に結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 異なったオリゴヌクレオチド配列が、矩形格子又は六角形格子の形で平らな固相面に配列されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- 固相表面が、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀又は金で構成されることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか一項に記載の方法。
- 伸長したオリゴヌクレオチドに取り付けられる標識が、オリゴヌクレオチド配列が存在する固相の各位置で同定可能であることを特徴とする請求項２ないし５のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも１個のプライマーが、増幅の間に固相に結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 様々な増幅体が固相上に長方形格子又は六角格子の形態で配列されることを特徴とする請求項１、３又は７に記載の方法。
- 増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なうことを特徴とする上記請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１で使用したタオプＡのオリゴヌクレオチドが、塩基Ｔ、Ａ及びＣ、又は塩基Ｔ及びＡ及びＧのいずれかの塩基群を含有することを特徴とする上記請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１で使用したヌクレオチドの標識が、蛍光標識であることを特徴とする上記請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレオチドの標識が、放射性核種であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレオチドの標識が、質量分析計で検出される分離可能な質量標識であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
- 伸長したオリゴヌクレオチドが全て一緒に質量分析計で検出され、それによって前記オリゴヌクレオチドの質量により明確に標識にされることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
- 伸長したオリゴヌクレオチドの各々１個のフラグメントが、質量分析計で検出されることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
- 伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントが、１個又は複数個のエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによる加水分解によって作られることを特徴とする請求項１５記載の方法。
- 質量分析計におけるよりよい検出可能性のために、作製されたフラグメントが個別的に正又は負の正味電荷を有することを特徴とする請求項１６記載の方法。
- 伸長したオリゴヌクレオチドの検出が、マトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）又はエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ）を利用して実施され、かつ視覚化されることを特徴とする請求項１ないし１７のいずれか一項に記載の方法。
- ポリメラーゼが、熱安定性ＤＮＡ−ポリメラーゼである請求項１ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
- ＳＮＰｓも検出され、ＤＮＡ−メチル化に加えて視覚化される請求項１ないし１９のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ（ｂ）の増幅に用いられたヌクレオチドが、末端ヌクレオチド及び／又は鎖伸長ヌクレオチドである上記請求項１に記載の方法。
- ステップ（ｂ）の増幅用ヌクレオチドが、ヌクレオ塩基群Ａ、Ｔ及びＣ又は塩基群Ｇ及びＡ並びにＴよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
- 複数個のＤＮＡセグメントの増幅が、一つの反応容器中で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- ゲノムＤＮＡがＤＮＡプローブから得られ、ＤＮＡのソースが、パラフィンに埋め込まれた細胞株，血液，痰，便，尿，脳脊髄液が、組織，組織学的スライド及び可能な全てのそれらの組合せを包含する請求項１に記載の方法。
- 上方及び下方のＤＮＡストランドのメチル化の解析が、１回の実験で実施されることを特徴とする請求項１ないし２３のいずれか一項に記載の方法。
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