JP2003525041A - Ｄｎａ−プローブの中のシトシン−メチル化の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ゲノムＤＮＡ―プローブの中のシトシン−メチル化およびＳＮＰｓの同時検出に特に適している方法を提供することである。 【解決手段】 ゲノムＤＮＡ―プローブの中の５−メチルシトシンの検出方法であって、（ａ）ＤＮＡ−プローブからゲノムＤＮＡを試薬で化学的に置換し、その際に５−メチルシトシンとシトシンとが様々に反応し、これらがそれによって反応後にＤＮＡ二重体の中で様々な塩基対挙動を示すステップと（ｂ）ポリメラーゼと、プライマーとして少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ａ型）との使用下に前処理したＤＮＡを増幅するステップと（ｃ）増幅したゲノムＤＮＡを少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ｂ型）で二重体の形成下にｎヌクレオチドの既知の配列によってハイブリッドし、前記のハイブリッドしたＢ型のオリゴヌクレオチドをその第３’−末端で部分的または完全に、そのメチル化に関してゲノムＤＮＡ−プローブの中で調査するべき位置にハイブリッドするステップと（ｄ）オリゴヌクレオチド（Ｂ型）がその第３’末端であらかじめ塩基欠損対なしに調査するべき位置にハイブリッドした場合に、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１個のヌクレオチド分だけポリメラーゼによって伸長され、その際に少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有し、この伸長がゲノムＤＮＡ−プローブの中の各シトシンのメチル化状態に依存するステップと（ｅ）伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査されるステップとが実施されることを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、ゲノムＤＮＡ−プローブの中の５−メチルシトシンの検出方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】

近年の方法論的開発により分子生物学においてよく研究されている観察レベル
は、遺伝子自体と、この遺伝子のＲＮＡへの翻訳と、そこから作製するタンパク
質である。固体の発現の経過の中でどの遺伝子がいつスイッチが入れられ、特定
の細胞および組織の中の特定の遺伝子の活性および阻害がどのように制御される
かは、遺伝子もしくはゲノムのメチル化の範囲と特性とによって相関関係をつけ
ることができる。本発明は、ゲノムＤＮＡ−プローブのメチル化状態の検出方法
を記載する。この方法は、同時に点突然変異および単一ヌクレオチド多型（ＳＮ
Ｐ_s）の検出にも利用することができる。

【０００３】 ５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡの中で最も頻繁に共有結合に変性し
た塩基である。この塩基は、たとえば転写の調節、遺伝子の刷り込みおよび腫瘍
形成においてある役割を果たしている。従って、遺伝子情報の構成要素としての
５−メチルシトシンの同定が非常に重要である。ところが、５−メチルシトシン
位置は、５−メチルシトシンがシトシンと同じ塩基対挙動を有するので、配列決
定によって同定することができない。さらに、ＰＣＲ増幅において５−メチルシ
トシンを有する後生的な情報が完全に失われてしまう。

【０００４】 比較的新しく、かつ、この間に頻繁に適用されている５−メチルシトシンにつ
いてのＤＮＡの調査方法は、シトシンと重亜硫酸塩の特異反応に基づき、これは
それに続くアルカリ加水分解によって、その塩基対挙動においてチミジンに相当
するウラシルに変換される。それに対して、５−メチルシトシンは前記条件下に
変性されない。それにより元のＤＮＡは、当初そのハイブリット化特性によって
シトシンから区別できないメチルシトシンが、現在「普通の」分子生物学の技術
によって唯一残るシトシンとして、たとえば増幅およびハイブリット化または配
列決定によって検出できるように変換される。これらの技術は全て、現在完全に
利用される塩基対に基づく。感度に関する先行技術は、被検査ＤＮＡをアガロー
ス・マトリックスの中に封じ込める方法によって定義され、それによりＤＮＡの
拡散および復元（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡにのみ反応する）を妨害し、全ての
沈降ステップおよび洗浄ステップを速い透析で代用される（Ｏｌｅｋ，Ａ．ら、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９６，２４，５０６４−５０６６）。この
方法によって個々の細胞を検査することができ、これがこの方法の可能性を具体
的に示している。確かに、従来個々の部位のみが約３０００塩基対長まで調査さ
れているが、可能なメチル化解析の数千の細胞の全体的な調査は不可能である。
しかし、この方法も少ないプローブ量から非常に小さいフラグメントを確実に解
析することができない。これは拡散防止にもかかわらずマトリックスによって失
われる。

【０００５】 ５−メチルシトシンを検出する別の公知の可能性に関する概要は、次の概要論
文から読み取ることができる：Ｒｅｉｎ，Ｔ．，ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，Ｍ．
Ｌ．，Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ． １９９８，
２６，２２５５。

【０００６】 重亜硫酸塩技術は、従来幾つかの例外（例えば、Ｚｅｃｈｎｉｇｋ，Ｍ．ら、
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ． Ｇｅｎ． １９９７，５，９４−９８）を除き研究にの
み使用されている。しかし、常に既知の遺伝子の短い特異的断片を重亜硫酸塩処
理によって増幅し、完全に配列決定（Ｏｌｅｋ，Ａ．およびＷａｌｔｅｒ，Ｊ．
，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１７，２７５−２７６）するか、または「プ
ライマー拡張反応による個々のシトシンの位置」（Ｇｏｎｚａｌｇｏ，Ｍ．Ｌ．
およびＪｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５
，２５２９−２５３１，ＷＯ ９５００６６９）によって、または酵素切片（Ｘ
ｉｏｎｇ，Ｚ．およびＬａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１９９７，２５，２５３２−２５３４）によって検出されている。特に、ハイブ
リダイゼーションによる検出も記載されている（Ｏｌｅｋら、ＷＯ ９９２８４
９８）。

【０００７】 個々の遺伝子におけるメチル化検出のための重亜硫酸塩技術の適用を取り上げ
ているその他の出版物は次のとおりである：Ｘｉｏｎｇ， Ｚ．およびＬａｉｒ
ｄ，Ｐ．Ｗ．（１９９７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５３２；
Ｇｏｎｚａｌｇｏ，Ｍ．Ｌ．およびＪｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．（１９９７），Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５２９；Ｇｒｉｇｇ，Ｓ．およびＣｌａｒｋ
，Ｓ．（１９９４），Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １６，４３１；Ｚｅｓｃｈｎｉｋ，
Ｍ．ら、（１９９７），Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
６，３８７；Ｔｅｉｌ， Ｒ．ら、（１９９４），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２２，６９５；Ｍａｒｔｉｎ，Ｖ．ら、（１９９５），Ｇｅｎｅ １５７，
２６１；ＷＯ ９７４６７０５およびＷＯ ９５１５３７３．

【０００８】 オリゴマーアレイ製造における先行技術に関する概要は、１９９９年１月に出
版された自然発生学特別号（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍ
ｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２１，Ｊａｎｕａｒｙ １９９９）と、そこで引用され
ている文献とから読み取ることができる。

【０００９】 ＤＮＡを不動化するための様々な方法が存在する。よく知られている方法は、
ビオチンで官能化されたＤＮＡのストレプトアビジン−コーティング表面への強
固な結合である（Ｕｈｌｅｎ， Ｍ．ら、１９８８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１６，３０２５−３０３８）。このシステムの結合強度は、１個
の結合もない共有結合の化学結合に相当する。標的ＤＮＡを共有結合で化学的に
調製した表面に結合できるようにするために、対応する標的ＤＮＡの官能性を必
要とする。ＤＮＡ自体は、好適である官能化をもたない。標的ＤＮＡに好適な官
能化を導入する種々の変形がある：２種の容易に操作しうる官能化は、第一級脂
肪族アミンおよびチオールである。このようなアミン類は、定量的にＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルによって変換され、チオールが好適な条件下に定量
的にアルキルヨウ化物と反応する。難点は、ＤＮＡの中へのこのような官能化の
導入にある。最も簡単な変形は、ＰＣＲのプライマーによる導入である。前記変
形は、５’変性プライマー（ＮＨ₂およびＳＨ）と二機能リンカーとを利用する
。

【００１０】 ある表面上の不動化の本質的な構成要素はその性状である。今まで説明した系
は、主にケイ素または金属からなる。標的ＤＮＡの結合のための別の方法は、標
的ＤＮＡの中の短い識別配列（たとえば２０塩基）を表面不動化したオリゴヌク
レオチドへのハイブリダイゼーションに使用することに基づく。標的ＤＮＡへの
化学的活性の位置の導入に関する酵素の変形も記述されている。この場合、標的
ＤＮＡに酵素的に５’−ＮＨ₂官能化が実施される。

【００１１】 不動化したＤＮＡ−アレーの走査のために、幾度も蛍光的に標識されたプロー
ブが使用されている。蛍光標識に特に好適なのは、各プローブの５’−ＯＨにＣ
ｙ３およびＣｙ５色素の簡単な取り込みである。ハイブリッドしたプローブの蛍
光の検出は、たとえば共焦点顕微鏡を介して行われる。色素Ｃｙ３およびＣｙ５
は、その他の多くの色素と並んで商業的に入手することができる。

【００１２】 突然変異の新規検出方法を以下に記載する： 配列決定の特殊事例として、個別塩基プライマー拡張（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ
Ａｎａｌｙｓｉｓ）が言及する価値がある（Ｈｅａｄ，ＳＲ．，Ｒｏｇｅｒｓ
，ＹＨ．，Ｐａｒｉｋｈ，Ｋ．，Ｌａｎ，Ｇ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，Ｇｏ
ｅｌｅｔ，Ｐ．，Ｂｏｙｃｅｊａｃｉｎｏ ＭＴ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（２４）：５０６５−５０７１，１９９７；Ｐｉｃ
ｏｕｌｔ−Ｎｅｗｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９（２）：１６７−
１７４，１９９９）。増幅と配列決定の組合せは、米国特許第５９２８９０６号
明細書に記載されており、そこでは塩基特異的末端がマトリックス分子に使用さ
れている。もう１つの方法は、ヌクレオチドの同定のためにリガーゼ／ポリメラ
ーゼ反応を使用する（米国特許第５９５２１７４号明細書）。

【００１３】 マトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）は、生物
分子を解析するための非常に有用な開発である（Ｋａｒａｓ， Ｍ．およびＨｉ
ｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．（１９８８），Ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉ
ｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍａｓｓｅｓ ｅｘｅｅｄｉｎｇ １００００ ｄａｌｔｏｎｓ．Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ．６０：２２９９−２３０１）。解析体が吸光マトリックスの中へセッ
トされる。短レーザーパルスによってマトリックスが蒸発され、解析体分子がこ
のようにフラグメント化されずに気相中へ輸送される。マトリックス分子との衝
突によって、解析体のイオン化が達成される。印加した電圧がイオンを無電界の
飛行管（Ｆｌｕｇｒｏｈｒ）の中へ加速する。前記イオンの質量が異なるために
、イオンが様々な強さで加速される。より小さいイオンは、より大きいイオンよ
りも速く検出器に到達する。

【００１４】 ＭＡＬＤＩは、ペプチドとタンパク質の解析に非常に良く適している。核酸の
解析は、若干困難である（Ｇｕｔ，Ｉ．Ｇ．およびＢｅｃｋ，Ｓ．（１９９５）
，ＤＮＡ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒ
ｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｍ
ｏｌｅｃｕｌaｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ １：１４７−１５７）。核酸の場合は
、感度がペプチドの場合より約１００倍悪く、フラグメントサイズの増加ととも
に過度に減少する。多量に負に帯電したバックボーンを有する核酸の場合、マト
リックスによるイオン化プロセスは本質的に非効率的である。ＭＡＬＤＩの場合
、マトリックスの選択は顕著に重要な役割を果たす。ペプチド類の脱着について
は、非常に微細な結晶化を生じる幾つかの非常に有用なマトリックスが見い出さ
れている。ＤＮＡの場合は、確かにこの間に幾つかの興味をひくマトリックスが
存在するが、それによって感度差は縮小されなかった。感度差は、ＤＮＡがペプ
チドに類似するように、前記ＤＮＡが化学的に変性されることによって縮小させ
ることができる。

【００１５】 通常のバックボーンのリン酸塩がチオリン酸塩で置換されたホスホロチオエー
ト核酸は、簡単なアルキル化化学によって電荷中性ＤＮＡに変換することができ
る（Ｇｕｔ，Ｉ．Ｇ．およびＢｅｃｋ，Ｓ．（１９９５），Ａ ｐｒｏｃｅｄｕ
ｒｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：１３６７−１３７３）。この変性ＤＮＡへの
「電荷標識」（ｃｈａｒｇｅ ｔａｇｓ）のカップリングは、総量がペプチドの
場合で見い出されるものと同じ総量分の感度の上昇で生じる。「ｃｈａｒｇｅ
ｔａｇｇｉｎｇ」のもう１つの長所は、非変性基質の検出を非常に困難にする不
純物に対する解析の安定性の増大である。

【００１６】 ゲノムＤＮＡは、細胞−、組織−またはその他の実験プローブのＤＮＡから標
準的方法で得られる。この標準的方法は、「フリッチおよびマニアティス編、分
子クローニング：実験マニュアル、１９８９年」（ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８９）のような報告書に見い出される。

【００１７】 プロモータの間の共通性は、ＴＡＴＡボックスまたはＧＣボックスの存在にあ
るのみならず、どの転写因子に対して前記共通性が結合部位を有し、かつ、どの
間隔で前記結合部位が互いに存在するかにもある。特定のタンパク質に対して存
在する結合部位は、その配列において完全に一致しないが、「ゆらぎ」（Ｗｏｂ
ｂｌｅｓ）の接合、すなわち各々様々な塩基が存在する位置によって、さらに伸
長することができる少なくとも４個の塩基の保存順序が見い出される。さらに、
前記結合部位は、互いに一定の間隔で存在する。

【００１８】 ところが、核体積の大部分を占めるインタフェース−クロマチンの中のＤＮＡ
の分布は、全く特異的な序列に従う。つまり、ＤＮＡは複数の部位で核マトリッ
クスへ核膜の内側で糸状構造を付着させている。この領域は、「マトリックス付
着領域（ＭＡＲ）」（ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ
（ＭＡＲ））または「骨格付着領域（ＳＡＲ）」（ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｔｔａ
ｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ （ＳＡＲ））と呼ばれる。この付着は、転写も
しくは複製に本質的な影響を及ぼす。このＭＡＲ−フラグメントは、保存配列を
もたないが、７０％までＡもしくはＴからなり、転写を一般的に調節するｃｉｓ
−作用領域およびトポイソメラーゼＩＩ−識別部位の付近にある。

【００１９】 プロモータおよびエンハンサーのほかに、種々の遺伝子のための別の調節要素
、いわゆるインシュレータが存在する。このインシュレータは、たとえば前記イ
ンシュレータがエンハンサーとプロモータとの間にある場合、あるいはまたヘテ
ロクロマチンと、活性遺伝子をヘテロクロマチンの影響前に保護する遺伝子との
間にある場合、プロモータへのエンハンサーの作用を阻害することができる。こ
のようなインシュレータの例：１．ＤＮＡａｓｅ Ｉに対して高感受性の複数個
の部位からなる、いわゆるＬＣＲ（ｌｏｃｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ
ｓ）、２．ＳＣＳ（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅｓ）もしくはＳＣＳ’のような特定の配列、３５０もしくは２００ｂｐ
長さおよびＤＮＡａｓｅ Ｉによる変性に対して高抵抗性のおよび高感受性の部
位の両側に並ぶ（１００ｂｐずつの間隔）。ＳＣＳ’にはタンパク質ＢＥＡＦ−
３２が結合する。このインシュレータは当該遺伝子の両側に置くことができる。

【００２０】

【発明が解決しようとする課題】

本発明の課題は、ゲノムＤＮＡ−プローブの中のシトシン−メチル化およびＳ
ＮＰｓの同時検出に特に適している方法を提供することである。その場合、有利
には多数のフラグメントが同時に調査できなければならない。

【００２１】

【課題を解決するための手段】

この課題は、本発明により、ゲノムＤＮＡ−プローブの中の５−メチルシトシ
ンの検出方法によって解決され、その際に下記の （ａ）ＤＮＡプローブからゲノムＤＮＡを試薬で化学的に置換し、その際に５
−メチルシトシンとシトシンとが様々に反応し、これらがそれによって反応後に
ＤＮＡ二重体の中で様々な塩基対挙動を示すステップと （ｂ）ポリメラーゼと、プライマーとして少なくとも１個のオリゴヌクレオチ
ド（Ａ型）との使用下に前処理したＤＮＡを増幅するステップと （ｃ）増幅したゲノムＤＮＡを少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ｂ型）
で二重体の形成下にｎヌクレオチドの既知の配列によってハイブリッドし、前記
のハイブリッドしたＢ型のオリゴヌクレオチドをその３’−末端で部分的または
完全に、そのメチル化に関してゲノムＤＮＡプローブの中で調査するべき位置に
ハイブリッドするステップと （ｄ）オリゴヌクレオチド（Ｂ型）がその３’−末端であらかじめ塩基欠損対
なしに調査するべき位置にハイブリッドした場合、前記オリゴヌクレオチドが少
なくとも１個のヌクレオチド分だけポリメラーゼによって伸長され、その際少な
くとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有し、この伸長がゲノムＤＮＡプ
ローブの中の各シトシンのメチル化状態に依存するステップと、 （ｅ）伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査されるステップ
と が実施される。

【００２２】 本発明により、一定の部位のオリゴヌクレオチド（Ｂ型）が固相に結合され、
または一定の部位の増幅体を固相に結合することが有利である。

【００２３】 さらに、様々なオリゴヌクレオチド配列を平滑な固相上に直角格子または六角
格子の形態で配列することが有利である。

【００２４】 さらに、本発明により、固相表面がケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニ
ウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることが有利である。

【００２５】 また、伸長したオリゴヌクレオチドに取り込まれた標識が、オリゴヌクレオチ
ド配列が存在する固相の各位置で同定可能であることが有利である。

【００２６】 本発明により、増幅する際に少なくとも１個のプライマー（Ａ型）が固相に結
合されていることが有利である。

【００２７】 さらに、本発明により、様々な増幅体を固相上に直角格子または六角格子の形
態で配列することを有利とすることができる。

【００２８】 ＤＮＡの処理を増幅する前に重亜硫酸塩溶液（＝ジ亜硫酸塩、水素亜硫酸塩）
で実施することが完全に特に有利である。

【００２９】 特に、本発明により、増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われ
ることが有利である。

【００３０】 さらに、本発明により、使用したＡ型のオリゴヌクレオチドが塩基Ｔ、Ａおよ
びＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみを含有することが特に有利である。

【００３１】 さらに、ヌクレオチドの標識が蛍光標識であることが有利である。

【００３２】 さらに、本発明により、ヌクレオチドの標識が放射性核種であることが有利で
ある。

【００３３】 ヌクレオチドの標識が質量分析計で検出される解離可能の質量標識であること
が特に有利である。

【００３４】 さらに、本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドが全て一緒に質量分析計
で検出され、それによって前記オリゴヌクレオチドの質量によって明確に標識さ
れていることが有利である。また、伸長したオリゴヌクレオチドの各々１個のフ
ラグメントが質量分析計で検出されることも特に有利である。

【００３５】 さらに、本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントが１個ま
たは複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水分解によ
って作製されることが有利である。

【００３６】 さらに、本発明により、質量分析計におけるよりよい検出可能性のために作製
されたフラグメントが個々の正または負の正味電荷を有することが有利である。

【００３７】 本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドの検出がマトリックス介助レーザ
ー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレー質量分析
法（ＥＳＩ）によって実施され、かつ、視覚化されることが完全に特に有利であ
る。

【００３８】 さらに、本発明により、ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡ−ポリメラーゼである
方法が有利である。

【００３９】 本発明により、ＤＮＡメチル化に補足してＳＮＰｓも検出され、かつ、視覚化
される方法も有利である。

【００４０】 さらに、使用したヌクレオチドが末端ヌクレオチド（Ｃ２型）および／または
鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１型）である方法が有利である。

【００４１】 さらに、本発明により、ヌクレオチド（Ｃ１型およびＣ２型）が、ヌクレオべ
ースＡ、ＴおよびＣまたは塩基ＧおよびＡおよびＴのいずれかを含有する群から
選ばれる方法が有利である。

【００４２】 さらに、本発明により、増幅が反応容器中の複数のＤＮＡ切片によって実施さ
れることが有利である。

【００４３】 本発明により、ゲノムＤＮＡがＤＮＡ−プローブから得られており、ＤＮＡの
ためのソース、たとえば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液が、パラフィンに
植え込まれた組織、組織学的スライドおよび全ての可能なこれらの組合せを包含
する方法が完全に特に有利である。

【００４４】 最後に、本発明により、上流および下流のＤＮＡ−鎖のメチル化解析が１回の
実験で実施されることが有利である。この解析の実施は、有利には同時に行われ
る。

【００４５】 つまり、ゲノムＤＮＡ−プローブの中のメチルシトシンの検出方法が記載され
ている。

【００４６】 この方法は、全ＤＮＡまたはそのフラグメントの増幅、ハイブリッド化および
伸長反応を含む。この方法は、メチルシトシンと同時に単一ヌクレオチド多型（
ＳＮＰｓ）および突然変異の検出に利用することができる。

【００４７】 解析されるゲノムＤＮＡは、有利にはＤＮＡの通常のソース、たとえば細胞株
、血液、痰、便、尿、脳脊髄液が、パラフィンに植え込まれた組織、組織学的ス
ライドおよび全ての可能なこれらの組合せから得られる。

【００４８】 この方法の第１ステップで、使用したＤＮＡが有利には重亜硫酸塩（＝ジ亜硫
酸塩、水素亜硫酸塩）またはさらに別の化学薬品によって、塩基対挙動に関して
様々な塩基が作製するように塩基の５位にメチル化されていない全てのシトシン
塩基が変化されるように処理され、他方、５位にメチル化したシトシンが不変の
ままに残る。重亜硫酸塩を使用するときは、非メチル化シトシン塩基に添加され
る。次いで、その後のアルカリ加水分解はウラシル中の非メチル化シトシン−ヌ
クレオべースの変換に供される。

【００４９】 この方法の第２ステップで、前処理されたＤＮＡが有利には熱安定性のポリメ
ラーゼと少なくとも１個のプライマー（Ａ型）の使用下に増幅される。

【００５０】 この方法の特に有利な変形において、Ａ型のプライマーによる増幅はポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される。

【００５１】 この方法の有利な一変形において、複数個のＤＮＡ−フラグメントの増幅が１
つの反応容器の中で実施される。これは、種々のプライマーがそれぞれ一定のフ
ラグメントを作製する、いわゆるマルチプレックスＰＣＲとすることができる。
種々の定義された増幅が１つの反応容器の中で実施される。もう１つの特に有利
なこの方法の変形において、プライマーが目標を定めてかつ再現可能にその都度
複数個のフラグメントを増幅する。これは、前記フラグメントがたとえばゲノム
中の反復要素に結合することによって達成することができる。特に有利なこの方
法の変形において、プライマーが転写因子結合サイト、プロモータまたは遺伝子
中のその他の調節要素に結合する。特に有利なこの方法の変形において、増幅が
固相に結合しているプライマーの伸長によって行われる。別の意味でのマルチプ
レックスＰＣＲは、様々なプライマーが固相の種々の定義された箇所に結合して
いることによって実施することができる。

【００５２】 第２方法ステップのさらに有利な変形において、様々なオリゴヌクレオチド配
列が直角または六角の格子の形態で配列されている固相が平滑である。これは結
果的に、様々な増幅体も固相上に直角または六角の格子の形態で配列されている
ことになる。上述のように、この場合には複数個の増幅体が直接固相上で作製さ
れる。

【００５３】 固相表面は、有利には、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、
鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。

【００５４】 特に有利なこの方法の変形において、Ａ型のオリゴヌクレオチドは、塩基Ｔ、
ＡおよびＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみのいずれかの塩基を含有する。

【００５５】 第３方法ステップにおいて、少なくとも１個のプライマー（Ｂ型）で増幅され
たゲノムＤＮＡが二重体の形成下にハイブリッドされる。ハイブリッドされたＢ
型のオリゴヌクレオチドは、それぞれその３’−末端で、該オリゴヌクレオチド
のメチル化に関してゲノムＤＮＡ−プローブの中で調査される位置に結合する。
このとき、２つの場合を区別することができる：調査される配列がプライマーに
対してその３’末端でも完全に相補性があり、この場合には、次のステップにお
けるプライマーの伸長が１個のポリメラーゼ反応で可能であり、またはさらにこ
の配列がプライマーの配列に対して３’−末端で完全に相補性がなく、この場合
にはプライマーの伸長を行うことができない。特定のＣｐＧ位置がメチル化につ
いて調査されるときは、２つの可能な状態がある。化学的な前処理、有利には重
亜硫酸塩による前処理によって、ＣＧのメチル化時に、非メチル化シトシンの存
在によりＵＧもしくは増幅後にＴＧが生じる。有利には、この場合の実験が２種
類のプライマーによって実施され、それぞれがこの状態の１つで完全な相補性と
、それにより鎖伸長のための可能性とがそれぞれ両方の可能な場合の一方で生じ
る。

【００５６】 まだ増幅体が固相に結合していないときは、この増幅体にハイブリッドしたオ
リゴヌクレオチドをその５’−末端でまたは別の塩基でまたはそのバックボーン
を介して固相と結合することができるが、その３’−末端を介しては結合できな
い。有利には５’−末端を介して結合が行われる。有利な変形において、様々な
オリゴヌクレオチド配列（Ｂ型）が直角または六角の格子の形態で配列されてい
る固相が平滑である。

【００５７】 この固相表面は、有利には、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、
鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。

【００５８】 第４方法ステップで、作製したオリゴヌクレオチドが熱安定性ポリメラーゼに
よって少なくとも１個のヌクレオチド、最大で１０個のヌクレオチドまで伸長さ
れ、少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有する。伸長の方式は、
この場合、ゲノムＤＮＡ−プローブの中の各シトシンのメチル化状態に依存し、
さらにまた場合により存在するＳＮＰｓ、点突然変異または欠失、挿入および逆
位にも依存する。

【００５９】 基本的に、末端オリゴヌクレオチド（Ｃ２型）のみが必要である。ところが、
それぞれの配列に応じて、各配列コンテキストで可能である場合、鎖伸長オリゴ
ヌクレオチドも使用してよい。

【００６０】 この方法の有利な変形において、使用したヌクレオチドが末端ヌクレオチド（
Ｃ２型）および／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１型）である。特に有利なこの
方法の変形において、Ｃ１型および／またはＣ２型のヌクレオべースは、塩基Ｔ
、ＡおよびＣまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧを含有する群から選ばれる。

【００６１】 伸長されたＢ型のオリゴヌクレオチドの標識は、有利には吸収色素および／ま
たは化学蛍光剤および／または放射性同位元素および／または第４方法ステップ
で接合されたヌクレオチドを介して導入される蛍光標識を介して行われる。有利
には、同様にこの標識が伸長したオリゴヌクレオチドの分子量を介して行われる
。好ましくは、蛍光マーカーが、たとえばＣｙ５−ｄＣＴＰのような蛍光標識ヌ
クレオチドによって導入される。

【００６２】 第５方法ステップにおいて、伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在につい
て調査される。平滑な固相が使用されるとき、解析は、当初オリゴヌクレオチド
が不動化された固相上の各箇所で行われる。

【００６３】 特に有利なこの方法の変形において、その蛍光を介して伸長したオリゴヌクレ
オチドの検出が行われる。

【００６４】 この方法の有利な変形において、伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメント
は１個または複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水
分解によって作製される。

【００６５】 特に有利なこの方法の変形において、ヌクレオチドの標識は、質量分析計で検
出可能である解離可能の質量標識である。

【００６６】 解離可能の質量標識、伸長したオリゴヌクレオチド全部またはそのフラグメン
トは、特に有利なこの方法の変形において、マトリックス介助レーザー脱着／イ
オン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）またはエレクトロスプレー質量分析法（
ＥＳＩ）によってそれらの明確な質量を利用して検出され、かつ、視覚化される
。

【００６７】 好ましくは、質量分析計で検出されたフラグメントは、個々の正または負の正
味電荷を有する。

【００６８】 特に有利なこの方法の変形において、ＳＮＰｓ（単一ヌクレオチド多型）とシ
トシン−メチル化とが１回の実験で解析される。

【００６９】 特に有利なこの方法の変形において、ＤＮＡ−プローブの下流鎖および上流鎖
が、内部での実験コントロールを保証するために、化学的前処理後に１回の実験
で解析される。

【００７０】 本発明の別の目的は、重亜硫酸塩反応の実施および／または増幅、ハイブリッ
ド化、伸長反応および／またはポリメラーゼの実施のための化学薬品および補助
剤および／またはこの方法の実施のための整備資料を含むキットである。

【００７１】

【発明の実施の形態】

以下の例が本発明を説明する。

【００７２】

【実施例】

実施例１： 以下の例は、特定のＣＧ位置がメチル化について調査される第VIII−因子遺伝
子のエクソン２３のフラグメントに関する。

【００７３】 第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴ
ＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（配列番号１）
およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（
配列番号２）によって増幅される。増幅されたＤＮＡはＢ型のオリゴヌクレオチ
ド（例えばＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＣＧ（配列番号３））にハ
イブリッドされ、ポリメラーゼ反応で標識された２’，３’，−ジデスオキシチ
ミジントリフォスフェート（Ｃ２型）により伸長される。ＣＧが１個の場合のみ
、すなわち当初のゲノムＤＮＡ−プローブの中にメチル化されたシトシンを有す
る場合にのみ、前記伸長を行うことができ、それ以外は欠損対がプライマーの３
’−末端でポリメラーゼ反応を阻害する。従って、それぞれ調査するべきシトシ
ンのメチル化状態がプライマーの伸長を決定する。

【００７４】 コントロールのために、この反応はプライマーＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧ
ＡＧＡＡＡＴＧ（配列番号４）で実施することができる。この場合には、被調査
ＤＮＡ−プローブの中で前記位置に非メチル化シトシンが共されている場合にの
み、伸長が行われる。ラベルは、たとえばｄｄＴＴＰまたはＲｅｄｉｐｒｉｍｅ
ＩＩ（登録商標）のためのＭｅｇａｐｒｉｍｅ（登録商標）のような吸収色素と
してよい。

【００７５】 実施例２： 以下の例は、特定のＣＧ位置がメチル化について調査される第VIII−因子遺伝
子のエクソン２３のフラグメントに関する。

【００７６】 第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴ
ＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（配列番号１）
およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（
配列番号２）によって増幅される。増幅されたＤＮＡは、その５’末端で固相表
面に不動化されたＢ型のオリゴヌクレオチド（たとえばＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧ
ＴＴＧＡＧＡＡＡＣＧ（配列番号３））にハイブリッドされ、ポリメラーゼ反応
で標識された２’，３’，−ジデスオキシチミジントリフォスフェート（Ｃ２型
）により伸長される。ＣＧが１個の場合のみ、すなわち当初のゲノムＤＮＡプロ
ーブの中にメチル化されたシトシンを有する場合にのみ、前記伸長を行うことが
でき、それ以外は欠損対がプライマーの３’−末端でポリメラーゼ反応を阻害す
る。従って、それぞれ調査するべきシトシンのメチル化状態がプライマーの伸長
を決定する。

【００７７】 コントロールのために、この反応はプライマーＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧ
ＡＧＡＡＡＴＧ（配列番号４）で実施することができる。この場合には、被調査
ＤＮＡ−プローブの中で前記位置に非メチル化シトシンが共されている場合にの
み、伸長が行われる。ラベルは、たとえばｄｄＴＴＰまたはＲｅｄｉｐｒｉｍｅ
ＩＩ（登録商標）のためのＭｅｇａｐｒｉｍｅ（登録商標）のような吸収色素と
してよい。

【００７８】 実施例３： 以下の例は、特定のＣＧ位置がメチル化について調査される第VIII −因子遺
伝子のエクソン２３のフラグメントに関する。

【００７９】 第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴ
ＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（配列番号１）
およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（
配列番号２）によって増幅される。この増幅のために、重亜硫酸塩で処理したＤ
ＮＡを５分間９６℃でインキュベートして、その後４０サイクルで各々５０秒間
９６℃で変性し、７５秒間６１．７℃でインキュベート（アニーリング）し、１
００秒間７２℃でインキュベート（伸長）した。それに続く反応（最終伸長）で
、反応試薬を１５分間７２℃でインキュベートする。増幅したＤＮＡは、オリゴ
ヌクレオチドＡＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号５）（図１のス
ポット１）およびＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴ（配列番号６）（図１
のスポット２）にハイブリッドし、これを固相で不動化した。伸長反応のために
、２’−デスオキシチミジントリフォスフェート（ｄＴＴＰ、Ｃ１型として）、
２’−デスオキシグアノシントリフォスフェート（ｄＧＴＰ、Ｃ１型として）、
２’−デスオキシアデノシントリフォスフェート（ｄＡＴＰ、Ｃ１型として）お
よび２’−デスオキシシチジントリフォスフェート（ｄＣＴＰ、Ｃ１型として）
が必要であり、その際補足して蛍光標識２’−デスオキシシチジントリフォスフ
ェートが３：１の比率（非標識２’−デスオキシシチジントリフォスフェートを
基準）で添加される。増幅体と、デスオキシヌクレオチド混合物と１０ｘ緩衝液
とからなる反応試薬を１５分間９６℃でインキュベートする。それにつづくプラ
イマー伸長反応のために、ＤＮＡポリメラーゼ、ここではクレナウ・フラグメン
ト、を添加し、この反応混合物を夜通し３７℃で固相上にインキュベートする。
下図に識別されるように、実施したプライマー伸長はＤＮＡのメチル化状態を推
測させる。スポット１とスポット２の比較は、図１に示したように、このメチル
化状態に関する言表を可能にする：本発明の場合において、スポット１のシグナ
ルの強さによって非メチル化ＣｐＧが検出される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、スポット１とスポット２との比較を示す説明図である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 FA34 FB02 FB07 FB08 FB12 4B024 AA11 CA03 CA09 CA20 HA08 HA09 HA14 HA20 4B063 QA01 QQ03 QQ08 QQ62 QR08 QR14 QR31 QR56 QR62 QR66 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02 QX07 QX10

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ゲノムＤＮＡ−プローブの中の５−メチルシトシンの検出方
   法であって、 （ａ）ＤＮＡ−プローブからゲノムＤＮＡを試薬で化学的に置換し、その際に
   ５−メチルシトシンとシトシンとが様々に反応し、これらがそれによって反応後
   にＤＮＡ二重体の中で様々な塩基対挙動を示すステップと （ｂ）ポリメラーゼと、プライマーとして少なくとも１個のオリゴヌクレオチ
   ド（Ａ型）との使用下に前処理したＤＮＡを増幅するステップと （ｃ）増幅したゲノムＤＮＡを少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ｂ型）
   で二重体の形成下にｎヌクレオチドの既知の配列によってハイブリッドし、前記
   のハイブリッドしたＢ型のオリゴヌクレオチドをその第３’−末端で部分的また
   は完全に、そのメチル化に関してゲノムＤＮＡ−プローブの中で調査するべき位
   置にハイブリッドするステップと （ｄ）オリゴヌクレオチド（Ｂ型）がその第３’末端であらかじめ塩基欠損対
   なしに調査するべき位置にハイブリッドした場合に、前記オリゴヌクレオチドが
   少なくとも１個のヌクレオチド分だけポリメラーゼによって伸長され、その際に
   少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有し、この伸長がゲノムＤＮ
   Ａ−プローブの中の各シトシンのメチル化状態に依存するステップと （ｅ）伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査されるステップ
   と が実施されることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 オリゴヌクレオチド（Ｂ型）が定義された箇所で固相に結合
   することを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 増幅体が定義された箇所で固相に結合することを特徴とする
   、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 様々なオリゴヌクレオチド配列が平滑な固相上に直角格子ま
   たは六角格子の形態で配列されることを特徴とする、請求項２記載の方法。
5. 【請求項５】 固相表面が、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム
   、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることを特徴とする、請求項２ない
   し４のいずれか１項記載の方法。
6. 【請求項６】 伸長したオリゴヌクレオチドに取り込まれた標識が、オリゴ
   ヌクレオチド配列が存在する固相の各位置で同定可能であることを特徴とする、
   請求項２ないし５のいずれか１項記載の方法。
7. 【請求項７】 増幅時に少なくとも１個のプライマー（Ａ型）が固相に結合
   していることを特徴とする、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 様々な増幅体が固相上に直角格子または六角格子の形態で配
   列されることを特徴とする、請求項１、３または７記載の方法。
9. 【請求項９】 ＤＮＡの処理が増幅前に重亜硫酸塩溶液（＝ジ亜硫酸塩、水
   素亜硫酸塩）によって実施されることを特徴とする、上記請求項１ないし８のい
   ずれか１項記載の方法。
10. 【請求項１０】 増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる
    ことを特徴とする、上記請求項１ないし９のいずれか１項記載の方法。
11. 【請求項１１】 請求項１で使用したＡ型のオリゴヌクレオチドが、塩基Ｔ
    、ＡおよびＣまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのいずれかの塩基を含有することを特徴
    とする、上記請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
12. 【請求項１２】 ヌクレオチドの標識が蛍光標識であることを特徴とする、
    上記請求項１ないし１１のいずれか１項記載の方法。
13. 【請求項１３】 ヌクレオチドの標識が放射性核種であることを特徴とする
    、請求項１ないし１１のいずれか１項記載の方法。
14. 【請求項１４】 ヌクレオチドの標識が、質量分析計で検出される解離可能
    の質量標識であることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項記載の
    方法。
15. 【請求項１５】 伸長したオリゴヌクレオチドが全て一緒に質量分析計で検
    出され、それによって前記オリゴヌクレオチドの質量により明確に標識されるこ
    とを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項記載の方法。
16. 【請求項１６】 伸長したオリゴヌクレオチドの各々１個のフラグメントが
    質量分析計で検出されることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項
    記載の方法。
17. 【請求項１７】 伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントが１個または
    複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水分解によって
    作られることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 質量分析計におけるよりよい検出可能性のために、作製さ
    れたフラグメントが個別的に正または負の正味電荷を有することを特徴とする、
    請求項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 伸長したオリゴヌクレオチドの検出がマトリックス介助レ
    ーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレー質量
    分析法（ＥＳＩ）を利用して実施され、かつ、視覚化されることを特徴とする、
    上記請求項１ないし１８のいずれか１項記載の方法。
20. 【請求項２０】 ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡ−ポリメラーゼである、上
    記請求項１ないし１９のいずれか１項記載の方法。
21. 【請求項２１】 ＤＮＡ−メチル化に補足してＳＮＰｓも検出され、かつ、
    視覚化される、上記請求項１ないし２０のいずれか１項記載の方法。
22. 【請求項２２】 使用したヌクレオチドが末端ヌクレオチド（Ｃ２型）およ
    び／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１型）である、上記請求項１ないし２１のい
    ずれか１項記載の方法。
23. 【請求項２３】 ヌクレオチド（Ｃ１型およびＣ２型）がヌクレオべースＡ
    、ＴおよびＣまたは塩基ＧおよびＡおよびＴのいずれかを含有する群から選ばれ
    ている、上記請求項１ないし２２のいずれか１項記載の方法。
24. 【請求項２４】 増幅が反応容器の中で複数個のＤＮＡ−切片によって実施
    されることを特徴とする、上記請求項１ないし２３のいずれか１項記載の方法。
25. 【請求項２５】 ＤＮＡのためのソース、たとえば細胞株、血液、痰、便、
    尿、脳脊髄液がパラフィンに植え込まれた組織、組織学的スライドおよび全ての
    可能なそれらの組合せを包含するＤＮＡ−プローブからゲノムＤＮＡを得た、請
    求項１記載の方法。
26. 【請求項２６】 上流および下流のＤＮＡ−鎖のメチル化解析が１回の実験
    で同時に実施されることを特徴とする、上記請求項１ないし２５のいずれか１項
    記載の方法。