JP4498657B2 - Ｄｎａサンプル中のシトシン−メチル化とｓｎｐ又は突然変異の同時検出方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲノムＤＮＡサンプル中の５−メチルシトシンの検出方法に関する。本発明は、ゲノムＤＮＡサンプルのメチル化状態の検出方法を記載する。この方法は、同時に点突然変異と一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出に利用することもできる。
【０００２】
【従来の技術】
近年の方法論的開発により分子生物学においてよく研究されている観察レベルは、遺伝子自体と、この遺伝子のＲＮＡへの翻訳と、そこから作製するタンパク質である。固体の発現の経過の中でどの遺伝子がいつスイッチが入れられ、特定の細胞および組織の中の特定の遺伝子の活性および阻害がどのように制御されるかは、遺伝子もしくはゲノムのメチル化の範囲と特性とによって相関関係をつけることができる。その限りにおいて、まず病源性の状態が個々の遺伝子またはゲノムの変性したメチル化マスターに顕現するという仮定が容易に考えられる。
【０００３】
５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡの中で最も頻繁に共有結合に変性した塩基である。この塩基は、たとえば転写の調節、遺伝子の刷り込みおよび腫瘍形成においてある役割を果たしている。従って、遺伝子情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定が非常に重要である。ところが、５−メチルシトシン位置は、５−メチルシトシンがシトシンと同じ塩基対挙動を有するので、配列決定によって同定することができない。さらに、ＰＣＲ−増幅において５−メチルシトシンを有する後生的な情報が完全に失われてしまう。
【０００４】
比較的新しく、かつ、この間に頻繁に適用されている５−メチルシトシンについてのＤＮＡの調査方法は、シトシンと重亜硫酸塩の特異反応に基づき、これはそれに続くアルカリ加水分解によって、その塩基対挙動においてチミジンに相当するウラシルに変換される。それに対して、５−メチルシトシンは前記条件下に変性されない。それにより元のＤＮＡは、当初そのハイブリダイゼーション挙動によってシトシンから区別できないメチルシトシンが、現在「普通の」分子生物学の技術によって唯一残るシトシンとして、たとえば増幅およびハイブリダイゼーションまたは配列決定によって検出できるように変換される。これらの技術は全て、現在完全に利用される塩基対に基づく。感度に関する先行技術は、被検査ＤＮＡをアガロース・マトリックスの中に封じ込める方法によって定義され、それによりＤＮＡの拡散および復元（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡにのみ反応する）を妨害し、全ての沈降ステップおよび洗浄ステップを速い透析で代用される（Ｏｌｅｋ, Ａ. ｅｔ ａｌ., Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ. Ｒｅｓ. １９９６, ２４, ５０６４-５０６６）。この方法によって個々の細胞を検査することができ、これがこの方法の可能性を具体的に示している。確かに、従来個々の部位のみが約３０００塩基対長まで調査されているが、可能なメチル化解析の数千の細胞の全体的な調査は不可能である。しかし、この方法も少ないプローブ量から非常に小さいフラグメントを確実に解析することができない。これは拡散防止にもかかわらずマトリックスによって失われる。
【０００５】
５−メチルシトシンを検出する別の公知の可能性に関する概要は、次の概要論文から読み取ることができる：Ｒｅｉｎ,Ｔ.,ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ,Ｍ.Ｌ.,Ｚｏｒｂａｓ,Ｈ.,Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.１９９８,２６,２２５５。
【０００６】
重亜硫酸塩技術は、従来幾つかの例外（たとえばＺｅｃｈｎｉｇｋ, Ｍ.ら,Ｅｕｒ. Ｊ. Ｈｕｍ. Ｇｅｎ. １９９７, ５, ９４-９８）を除き研究にのみ使用されている。しかし、常に既知の遺伝子の短い特異的断片を重亜硫酸塩処理によって増幅し、完全に配列決定（Ｏｌｅｋ, Ａ.およびＷａｌｔｅｒ, Ｊ., Ｎａｔ. Ｇｅｎｅｔ. １９９７, １７, ２７５-２７６）するか、または個々のシトシン位置を「プライマー拡張反応による個々のシトシンの位置」（Ｐｒｉｍｅｒ-Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ-Ｒｅａｋｔｉｏｎ）（Ｇｏｎｚａｌｇｏ, Ｍ. Ｌ.およびＪｏｎｅｓ, Ｐ. Ａ., Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. １９９７, ２５, ２５２９-２５３１, ＷＯ ９５００６６９）によって、または酵素切片（Ｘｉｏｎｇ, Ｚ.およびＬａｉｒｄ, Ｐ. Ｗ., Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. １９９７, ２５, ２５３２-２５３４）によって検出されている。特に、ハイブリダイゼーションによる検出も記載されている（Ｏｌｅｋ, ｅｔ ａｌ., ＷＯ ９９２８４９８）。
【０００７】
個々の遺伝子におけるメチル化検出のための重亜硫酸塩技術の適用を取り上げているその他の出版物は次のとおりである：Ｘｉｏｎｇ, Ｚ.およびＬａｉｒｄ, Ｐ. Ｗ. (１９９７), Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２５, ２５３２; Ｇｏｎｚａｌｇｏ, Ｍ. Ｌ.およびＪｏｎｅｓ, Ｐ. Ａ. (１９９７), Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２５, ２５２９; Ｇｒｉｇｇ, Ｓ.およびＣｌａｒｋ, Ｓ. (１９９４), Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １６, ４３１; Ｚｅｓｃｈｎｉｋ, Ｍ. ら (１９９７), Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６, ３８７; Ｔｅｉｌ, Ｒ. ら(１９９４), Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２２, ６９５; Ｍａｒｔｉｎ, Ｖ. ら (１９９５), Ｇｅｎｅ １５７, ２６１; ＷＯ ９７４６７０５、ＷＯ ９５１５３７３およびＷＯ ４５５６０.
【０００８】
オリゴマーアレイ製造における先行技術に関する概要は、１９９９年に出版された自然発生学特別号（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ, Ｖｏｌｕｍｅ ２１, Ｊａｎｕａｒｙ １９９９）と、そこで引用されている文献とから読み取ることができる。
【０００９】
ＤＮＡを不動化するための様々な方法が存在する。よく知られている方法は、ビオチンで官能化されたＤＮＡのストレプトアビジン−コーティング表面への強固な結合である（Ｕｈｌｅｎ, Ｍ. ｅｔ ａｌ. １９８８, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. １６, ３０２５-３０３８）。このシステムの結合強度は、１個の結合もない共有結合の化学結合に相当する。標的ＤＮＡを共有結合で化学的に調製した表面に結合できるようにするために、対応する標的ＤＮＡの官能性を必要とする。ＤＮＡ自体は、好適である官能化をもたない。標的ＤＮＡに好適な官能化を導入する種々の変形がある：２種の容易に操作しうる官能化は、第一級脂肪族アミンおよびチオールである。このようなアミン類は、定量的にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって変換され、チオールが好適な条件下に定量的にアルキルヨウ化物と反応する。難点は、ＤＮＡの中へのこのような官能化の導入にある。最も簡単な変形は、ＰＣＲのプライマーによる導入である。前記変形は、５′変性プライマー（ＮＨ₂およびＳＨ）と二機能リンカーとを利用する。
【００１０】
ある表面上の不動化の本質的な構成要素はその性状である。今まで説明した系は、主にケイ素または金属からなる。標的ＤＮＡの結合のための別の方法は、標的ＤＮＡの中の短い識別配列（たとえば２０塩基）を表面不動化したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに使用することに基づく。標的ＤＮＡへの化学的活性の位置の導入に関する酵素の変形も記述されている。この場合、標的ＤＮＡに酵素的に５′−ＮＨ₂−官能化が実施される。
【００１１】
不動化したＤＮＡアレーの走査のために、幾度も蛍光的に標識されたプローブが使用されている。蛍光標識に特に好適なのは、各プローブの５′−ＯＨにＣｙ３およびＣｙ５色素の簡単な取り込みである。ハイブリッドしたプローブの蛍光の検出は、たとえば共焦点顕微鏡を介して行われる。色素Ｃｙ３およびＣｙ５は、その他の多くの色素と並んで商業的に入手することができる。
【００１２】
オリゴマーアレイ製造における先行技術に関する概要は、１９９９年１月に出版された自然発生学特別号（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ, Ｖｏｌｕｍｅ ２１, Ｊａｎｕａｒｙ １９９９）の、当該箇所で引用されている文献および減衰した非特異的バックグラウンドシグナルにおけるオリゴヌクレオチドのような標的分子のための固体担体の製造方法に関する米国特許第５９９４０６５号明細書から読み取ることができる。
【００１３】
突然変異の新規検出方法を以下に記載する：配列決定の特殊事例として、個別塩基プライマー拡張（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）が言及する価値がある（Ｈｅａｄ, ＳＲ., Ｒｏｇｅｒｓ, ＹＨ., Ｐａｒｉｋｈ, Ｋ., Ｌａｎ, Ｇ., Ａｎｄｅｒｓｏｎ, Ｓ., Ｇｏｅｌｅｔ, Ｐ., Ｂｏｙｃｅｊａｃｉｎｏ ＭＴ., Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２５(２４): ５０６５-５０７１, １９９７; Ｐｉｃｏｕｌｔ-Ｎｅｗｂｅｒｇ, Ｌ., Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ. ９(２): １６７-１７４, １９９９）。増幅と配列決定の組合せは、米国特許第５９２８９０６号明細書に記載されており、そこでは塩基特異的末端がマトリックス分子に使用されている。もう１つの方法は、ヌクレオチドの同定のためにリガーゼ／ポリメラーゼ反応を使用する（米国特許第５９５２１７４号明細書）。
【００１４】
マトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）は、生物分子を解析するための非常に有用な開発である（Ｋａｒａｓ, Ｍ.およびＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ, Ｆ. (１９８８), Ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓｅｓ ｅｘｅｅｄｉｎｇ １００００ ｄａｌｔｏｎｓ. Ａｎａｌ. Ｃｈｅｍ. ６０: ２２９９-２３０１）。解析体が吸光マトリックスの中へセットされる。短レーザーパルスによってマトリックスが蒸発され、解析体分子がこのようにフラグメント化されずに気相中へ輸送される。マトリックス分子との衝突によって、解析体のイオン化が達成される。印加した電圧がイオンを無電界の飛行管（Ｆｌｕｇｒｏｈｒ）の中へ加速する。前記イオンの質量が異なるために、イオンが様々な強さで加速される。より小さいイオンは、より大きいイオンよりも速く検出器に到達する。
【００１５】
ＭＡＬＤＩは、ペプチドとタンパク質の解析に非常に良く適している。核酸の解析は、若干困難である（Ｇｕｔ, Ｉ. Ｇ.およびＢｅｃｋ, Ｓ. (１９９５), ＤＮＡ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ: Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ １: １４７-１５７）。核酸の場合は、感度がペプチドの場合より約１００倍悪く、フラグメントサイズの増加とともに過度に減少する。多量に負に帯電したバックボーンを有する核酸の場合、マトリックスによるイオン化プロセスは本質的に非効率的である。ＭＡＬＤＩの場合、マトリックスの選択は顕著に重要な役割を果たす。ペプチド類の脱着については、非常に微細な結晶化を生じる幾つかの非常に有用なマトリックスが見い出されている。ＤＮＡの場合は、確かにこの間に幾つかの興味をひくマトリックスが存在するが、それによって感度差は縮小されなかった。感度差は、ＤＮＡがペプチドに類似するように、前記ＤＮＡが化学的に変性されることによって縮小させることができる。
【００１６】
通常のバックボーンのリン酸塩がチオリン酸塩で置換されたホスホロチオエート核酸は、簡単なアルキル化化学によって電荷中性ＤＮＡに変換することができる（Ｇｕｔ, Ｉ. Ｇ.およびＢｅｃｋ, Ｓ. (１９９５), Ａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２３: １３６７-１３７３）。この変性ＤＮＡへの「電荷標識」（ｃｈａｒｇｅ ｔａｇｓ）のカップリングは、総量がペプチドの場合で見い出されるものと同じ総量分の感度の上昇で生じる。ｃｈａｒｇｅ ｔａｇｇｉｎｇ のもう１つの長所は、非変性基質の検出を非常に困難にする不純物に対する解析の安定性の増大である。
【００１７】
ゲノムＤＮＡは、細胞−、組織−またはその他の実験プローブのＤＮＡから標準的方法で得られる。この標準的方法は、「フリッチおよびマニアティス編、分子クローニング：実験マニュアル、１９８９年」（ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, １９８９）のような報告書に見い出される。
【００１８】
プロモータの間の共通性は、ＴＡＴＡボックスまたはＧＣボックスの存在にあるのみならず、どの転写因子に対して前記共通性が結合部位を有し、かつ、どの間隔で前記結合部位が互いに存在するかにもある。特定のタンパク質に対して存在する結合部位は、その配列において完全に一致しないが、「ゆらぎ」（Ｗｏｂｂｌｅｓ）の接合、すなわち各々様々な塩基が存在する位置によって、さらに伸長することができる少なくとも４個の塩基の保存順序が見い出される。さらに、前記結合部位は、互いに一定の間隔で存在する。
【００１９】
ところが、核体積の大部分を占めるインタフェース−クロマチンの中のＤＮＡの分布は、全く特異的な序列に従う。つまり、ＤＮＡは複数の部位で核マトリックスへ核膜の内側で糸状構造を付着させている。この領域は、「マトリックス付着領域（ＭＡＲ）」（ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ (ＭＡＲ)）または「骨格付着領域（ＳＡＲ）」（ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ (ＳＡＲ)）と呼ばれる。この付着は、転写もしくは複製に本質的な影響を及ぼす。このＭＡＲフラグメントは、保存配列をもたないが、７０％までＡもしくはＴからなり、転写を一般的に調節するｃｉｓ作用領域およびトポイソメラーゼＩＩ−識別部位の付近にある。
【００２０】
プロモータおよびエンハンサーのほかに、種々の遺伝子のための別の調節要素、いわゆるインシュレータが存在する。これらのインシュレータは、たとえば前記インシュレータがエンハンサーとプロモータとの間にある場合、あるいはまたヘテロクロマチンと、活性遺伝子をヘテロクロマチンの影響前に保護する遺伝子との間にある場合、プロモータへのエンハンサーの作用を阻害することができる。このようなインシュレータの例：１． ＤＮＡａｓｅ Ｉに対して高感受性の複数個の部位からなる、いわゆるＬＣＲ（ｌｏｃｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎｓ）、２． ＳＣＳ（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）もしくはＳＣＳ′のような特定の配列、３５０もしくは２００ｂｐ長さおよびＤＮＡａｓｅ Ｉによる変性に対して高抵抗性のおよび高感受性の部位の両側に並ぶ（１００ｂｐずつの間隔）。ＳＣＳ′にはタンパク質ＢＥＡＦ−３２が結合する。このインシュレータは当該遺伝子の両側に置くことができる。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ゲノムＤＮＡサンプル中のシトシン−メチル化およびＳＮＰｓの同時検出に特に適している方法を提供することである。その場合、有利には多数のフラグメントが同時に調査できなければならない。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
この課題は、本発明により、ゲノムＤＮＡサンプル中の５−メチルシトシンの検出方法によって解決され、その際に下記のステップが実施される： （ａ）ＤＮＡサンプルからゲノムＤＮＡを試薬で化学的に置換し、その際に５−メチルシトシンとシトシンとが異なって反応し、５−メチルシトシンとシトシンが上記試薬との反応後にＤＮＡ二重体の中で異なった塩基対挙動を示す。
（ｂ）ポリメラーゼと、プライマーとして少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ａ）との使用下に前記（ａ）の処理を行ったＤＮＡを増幅する。
（ｃ）増幅したゲノムＤＮＡを少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ｂ）とハイブリッドし、二重体の形成し、前記のハイブリッドした（Ｂ）のオリゴヌクレオチドはその３′末端で直接的にまたは１０塩基までの距離で、ゲノムＤＮＡサンプルの中でメチル化に関して調査するべき位置に隣接する。
（ｄ）オリゴヌクレオチド（Ｂ）がｎヌクレオチドの既知の配列で少なくとも１個のヌクレオチド分だけポリメラーゼによって伸長され、その際このヌクレオチドは検出可能の標識を有し、この伸長はゲノムＤＮＡサンプル中の各シトシンのメチル化状態に依存する。
（ｅ）伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査される。
【００２３】
本発明により、その際一定の部位のオリゴヌクレオチド（Ｂ）が固相に結合され、または一定の部位の増幅体を固相に結合することが有利である。
【００２４】
その際本発明によりさらに、様々なオリゴヌクレオチド配列を平滑な固相上に直角格子または六角格子の形態で配列することが有利である。その際、伸長したオリゴヌクレオチドに取り込まれた標識が、オリゴヌクレオチド配列が存在する固相の各位置で同定可能であることが有利である。
【００２５】
さらに、本発明により、増幅する際に少なくとも１個のプライマー（Ａ）が固相に結合されていることが有利である。
【００２６】
さらに、特定の場合において、様々な増幅体を固相上に直角格子または六角格子の形態で配列することが有利である。
【００２７】
さらに、本発明により、ＤＮＡの処理を増幅する前に重亜硫酸塩溶液（＝ジ亜硫酸塩、水素亜硫酸塩）で実施することが有利である。
【００２８】
さらに、本発明により、増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われることが有利である。
【００２９】
さらに、本発明により、使用した（Ａ）のオリゴヌクレオチドが塩基Ｔ、ＡおよびＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみを含有し、および／または使用した（Ｂ）のオリゴヌクレオチドが塩基Ｔ、ＡおよびＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみを含有することが有利である。
【００３０】
さらに、本発明により、ヌクレオチドの標識が蛍光標識であることが有利である。
【００３１】
その際、ヌクレオチドの標識が放射性核種であることが特に有利である。
【００３２】
また、本発明により、ヌクレオチドの標識が質量分析計で検出される解離可能の質量標識であることも有利である。
【００３３】
さらに、本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドが全て一緒に質量分析計で検出され、それによって前記オリゴヌクレオチドの質量によって明確に標識されていることが有利である。
【００３４】
また、伸長したオリゴヌクレオチドの各々１個のフラグメントが質量分析計で検出されることも有利である。
【００３５】
本発明により、伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントが１個または複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水分解によって作製されることが特に有利である。
【００３６】
さらに、本発明により、質量分析計におけるよりよい検出可能性のために作製されたフラグメントが個々の正または負の正味電荷を有することが有利である。
【００３７】
伸長したオリゴヌクレオチドの検出がマトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ）によって実施され、かつ、視覚化されることが特に有利である。
【００３８】
本発明による方法は、ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡ−ポリメラーゼである場合にも有利である。
【００３９】
本発明による方法は、ＤＮＡ−メチル化に補足してＳＮＰｓも検出され、かつ、視覚化される場合も同様に有利である。
【００４０】
また相応に、使用したヌクレオチドが終結ヌクレオチド（Ｃ２）および／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１）である方法も有利である。
【００４１】
また、鎖終結ヌクレオチド（Ｃ２）が、塩基ＴおよびＣまたは塩基ＧおよびＡのいずれかの塩基を包含する群から選ばれ、および／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１）が、ヌクレオべースＡ、ＴおよびＣまたは塩基ＧおよびＡおよびＴのいずれかを包含する群から選ばれる本発明による方法も有利である。
【００４２】
さらに、本発明により、増幅が反応容器中の複数のＤＮＡ−切片によって実施されることが有利である。
【００４３】
さらに、蛍光標識ｄＣＴＰ誘導体がＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰであることが有利である。
【００４４】
固相表面はケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることが特に有利である。
【００４５】
さらに、ゲノムＤＮＡがＤＮＡサンプルから得られており、ＤＮＡのためのソース、たとえば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液が、パラフィンに植え込まれた組織、組織学的スライドおよび全ての可能なこれらの組合せを包含する方法が有利である。
【００４６】
最後に、上流および下流のＤＮＡ−鎖のメチル化解析が同時に実施される方法が完全に特に有利である。
【００４７】
ゲノムＤＮＡサンプル中のメチルシトシンの検出方法が記載されている。
【００４８】
この方法は、全ＤＮＡまたはそのフラグメントの増幅、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応を含む。この方法は、メチルシトシンと同時に一塩基多型（ＳＮＰｓ）および突然変異の検出に利用することができる。
【００４９】
解析されるゲノムＤＮＡは、有利にはＤＮＡの通常のソース、たとえば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液が、パラフィンに植え込まれた組織、組織学的スライドおよび全ての可能なこれらの組合せから得られる。
【００５０】
この方法の第１ステップで、使用したＤＮＡが有利には重亜硫酸塩（＝ジ亜硫酸塩、水素亜硫酸塩）またはさらに別の化学薬品によって、塩基対挙動に関して様々な塩基を作製するように塩基の５位にメチル化されていない全てのシトシン塩基が変化されるように処理され、他方、５位にメチル化したシトシンが不変のままに残る。重亜硫酸塩を使用するときは、非メチル化シトシン塩基に添加される。次いで、その後のアルカリ加水分解はウラシル中の非メチル化シトシン−ヌクレオべースの変換に供される。使用したゲノムＤＮＡは、有利には化学処理前に制限エンドヌクレアーゼにより切断される。
【００５１】
この方法の第２ステップで、前処理されたＤＮＡが有利には熱安定性のポリメラーゼと少なくとも１個のプライマー（Ａ）の使用下に増幅される。このプライマーは、有利には１０〜４０個の塩基対を含有することができる。
【００５２】
この方法の特に有利な変形において、（Ａ）のプライマーによる増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される。
【００５３】
この方法の有利な一変形において、複数個のＤＮＡ−フラグメントの増幅が１つの反応容器の中で実施される。これは、種々のプライマーがそれぞれ一定のフラグメントを作製する、いわゆるマルチプレックスＰＣＲとすることができる。種々の定義された増幅が１つの反応容器の中で実施される。もう１つの特に有利なこの方法の変形において、プライマーが目標を定めてかつ再現可能にその都度複数個のフラグメントを増幅する。これは、前記フラグメントがたとえばゲノム中の反復要素に結合することによって達成することができる。特に有利なこの方法の変形において、プライマーが転写因子結合サイト、プロモータまたは遺伝子中のその他の調節要素に結合する。特に有利なこの方法の変形において、増幅が固相に結合しているプライマーの伸長によって行われる。別の意味でのマルチプレックス−ＰＣＲは、様々なプライマーが固相の種々の定義された箇所に結合していることによって実施することができる。
【００５４】
第２方法ステップのさらに有利な変形において、様々なオリゴヌクレオチド配列が直角格子または六角格子の形態で配列されている固相が平滑である。これは結果的に、様々な増幅体も固相上に直角または六角の格子の形態で配列されていることになる。上述のように、この場合には複数個の増幅体が直接固相上で作製される。
【００５５】
固相表面は、有利には、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。
【００５６】
特に有利なこの方法の変形において、（Ａ）のオリゴヌクレオチドは、塩基Ｔ、ＡおよびＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみのいずれかの塩基を含有する。
【００５７】
第３方法ステップにおいて、少なくとも１個のプライマー（Ｂ）に、増幅されたゲノムＤＮＡがハイブリッドされ、二重体を形成する。オリゴヌクレオチド（Ｂ）は、有利には１０〜３５個の塩基対を含有する。（Ｂ）のハイブリッドしたオリゴヌクレオチドは、その３′−末端で直接的にまたは１０塩基までの距離で、そのメチル化に関してゲノムＤＮＡサンプルの中で調査されるべき位置に隣接する。
【００５８】
この増幅体にハイブリッドしたオリゴヌクレオチドをその５′−末端でまたは別の塩基でまたはそのバックボーンを介して固相と結合することができるが、その３′−末端を介しては結合できない。有利には５′−末端を介して結合が行われる。有利な変形において、様々なオリゴヌクレオチド配列（Ｂ）が直角格子または六角格子の形態で配列されている固相が平滑である。
【００５９】
この固相表面は、有利には、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。
【００６０】
特に有利なこの方法の変形において、（Ｂ）のオリゴヌクレオチドは、塩基Ｔ、ＡおよびＣのみまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのみのいずれかの塩基を含有する。
【００６１】
第４方法ステップで、作製したオリゴヌクレオチドが熱安定性ポリメラーゼによって少なくとも１個のヌクレオチド、最大で１０個のヌクレオチドまで伸長され、少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有する。伸長の方式は、この場合、ゲノムＤＮＡサンプルの中の各シトシンのメチル化状態に依存し、さらにまた場合により存在するＳＮＰｓ、点突然変異または欠失、挿入および逆位にも依存する。
【００６２】
（Ｂ）のオリゴヌクレオチドの調査するべき位置への直接的な隣接においては、終結オリゴヌクレオチド（Ｃ２）のみが必要である。ところが、それぞれの配列に応じて、各配列コンテキストで可能である場合、鎖伸長オリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【００６３】
この方法の有利な変形において、使用したヌクレオチドが終結ヌクレオチド（Ｃ２）および／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１）である。その際、終結ヌクレオチド（Ｃ２）は２′，３′−ジデスオキシヌクレオチド、および鎖伸長ヌクレオチドは２′−デスオキシヌクレオチドである。特に有利なこの方法の変形において、（Ｃ１）のヌクレオべースは、塩基Ｔ、ＡおよびＣまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧを含有する群から選ばれる。さらに特に有利なこの方法の変形において、（Ｃ２）のヌクレオべースは、塩基ＴおよびＣまたは塩基ＧおよびＡのいずれかの塩基を含有する群から選ばれる。
【００６４】
伸長された（Ｂ）のオリゴヌクレオチドの標識は、有利には吸収色素および／または化学蛍光剤および／または放射性同位元素および／または第４方法ステップで接合されたヌクレオチドを介して導入される蛍光標識を介して行われる。有利には、同様にこの標識が伸長したオリゴヌクレオチドの分子量を介して行われる。好ましくは、蛍光マーカーが、たとえばＣｙ５−ｄＣＴＰのような蛍光標識ヌクレオチドによって導入される。
【００６５】
第５方法ステップにおいて、伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査される。平滑な固相が使用されるとき、解析は、当初オリゴヌクレオチドが不動化された固相上の各箇所で行われる。
【００６６】
特に有利なこの方法の変形において、その蛍光を介して伸長したオリゴヌクレオチドの検出が行われる。その場合、有利には様々な伸長生成物が様々な蛍光性質を有し、たとえば様々な色素を用いて標識されて組み込まれたヌクレオチドによって達成することができる。
【００６７】
この方法の有利な変形において、伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントは１個または複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水分解によって作製される。
【００６８】
特に有利なこの方法の変形において、ヌクレオチドの標識は、質量分析計で検出可能である解離可能の質量標識である。
【００６９】
解離可能の質量標識、伸長したオリゴヌクレオチド全部またはそのフラグメントは、特に有利なこの方法の変形において、マトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）またはエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ）によってそれらの明確な質量を利用して検出され、かつ、視覚化される。
【００７０】
好ましくは、質量分析計で検出されたフラグメントは、個々の正または負の正味電荷を有する。
【００７１】
特に有利なこの方法の変形において、ＳＮＰｓ（一塩基多型）とシトシン−メチル化とが１回の実験で解析される。
【００７２】
特に有利なこの方法の変形において、ＤＮＡサンプルの下流鎖および上流鎖が、内部での実験コントロールを保証するために、化学的前処理後に１回の実験で解析される。
【００７３】
本発明の別の目的は、重亜硫酸塩反応の実施および／または増幅、ハイブリダイゼーション、伸長反応および／またはポリメラーゼの実施のための化学薬品および補助剤および／またはこの方法の実施のための整備資料を含むキットである。
【００７４】
【発明の実施の形態】
以下の例が本発明を説明する。
【００７５】
【実施例】
実施例１： 配列例として、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン２３のフラグメントが挙げられている。
【００７６】
第１ステップで、このフラグメントがＡ型のプライマーによって、しかもＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：１）およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：２）によって増幅される。増幅されたＤＮＡは、（Ｂ）のオリゴヌクレオチド（たとえばＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：３））にハイブリッドされる。それに続き、伸長反応が、２′，３′−ジデスオキシシチジントリフォスフェート（ｄｄＣＴＰ、（Ｃ２）として）、２′，３′−ジデスオキシチミジントリフォスフェート（ｄｄＴＴＰ、（Ｃ２）として）および２′−デスオキシアデノシントリフォスフェート（ｄＡＴＰ、（Ｃ１）として）によって実施される。メチル化されたシトシンが存在する場合、伸長生成物ＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＣ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：４）が生じ、他方、調査するべき配列の中に非メチル化シトシンが存在するときは、伸張生成物ＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：５）が生じる。それによって、各々のシトシンのメチル化状態に依存する様々な伸長生成物が生じる。
【００７７】
（Ｃ２）の末端三リン酸塩は、たとえば２種類の色素を用いてラベルを付けることができる。これは伸長生成物を区別可能にする。この様々なラベルは、たとえばｄｄＴＴＰのためのＭｅｇａｐｒｉｍｅ（登録商標）またはｄｄＣＴＰのためのＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ（登録商標）のような吸収色素としてよい。
【００７８】
実施例２： 配列例として、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン２３のフラグメントが挙げられている。
【００７９】
第１ステップで、このフラグメントが（Ａ）のプライマーによって、しかもＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：１）およびＡＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：２）によって増幅される。増幅されたＤＮＡは、固相に不動化された（Ｂ）のオリゴヌクレオチド（たとえばＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：３））にハイブリッドされる。それに続き、伸長反応が２′，３′−ジデスオキシシチジントリフォスフェート（ｄｄＣＴＰ、（Ｃ２）として）、２′，３′−ジデスオキシチミジントリフォスフェート（ｄｄＴＴＰ、（Ｃ２）として）および２′−デスオキシアデノシントリフォスフェート（ｄＡＴＰ、（Ｃ１）として）によって実施される。メチル化されたシトシンが存在する場合、伸長生成物ＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＣ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：４）が生じ、他方、調査するべき配列の中に非メチル化シトシンが存在するときは、伸張生成物ＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴ（ＳＥＱ−ＩＤ Ｎｏ．：５）が生じる。それによって、各々のシトシンのメチル化状態に依存する様々な伸長生成物が生じる。
【００８０】
（Ｃ２）の末端三リン酸塩は、たとえば２種類の色素を用いてラベルを付けることができる。これは伸長生成物を区別可能にする。この様々なラベルは、たとえばｄｄＴＴＰのためのＭｅｇａｐｒｉｍｅ（登録商標）またはｄｄＣＴＰのためのＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ（登録商標）のような吸収色素としてよい。
【配列表】

Claims (29)

1. ゲノムＤＮＡサンプル中の５−メチルシトシンと一塩基多型（ＳＮＰ）又は突然変異とを同時に検出する方法であって、
   （ａ）ＤＮＡサンプルからゲノムＤＮＡを試薬で化学的に置換し、その際に５−メチルシトシンとシトシンとが異なって反応し、５−メチルシトシンとシトシンが上記試薬との反応後にＤＮＡ二重体の中で異なった塩基対挙動を示すステップと、
   （ｂ）ポリメラーゼと、プライマーとして少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ａ）との使用下に前記（ａ）の処理を行ったＤＮＡを増幅するステップと、
   （ｃ）増幅したゲノムＤＮＡを少なくとも１個のオリゴヌクレオチド（Ｂ）とハイブリッドし、二重体を形成し、前記のハイブリッドした（Ｂ）のオリゴヌクレオチドがその第３’−末端で直接的にまたは１０塩基までの距離で、ゲノムＤＮＡサンプルの中でメチル化に関して調査するべき位置に隣接するステップと、
   （ｄ）前記（ｃ）の処理を行ったオリゴヌクレオチド（Ｂ）がｎヌクレオチドの既知の配列で少なくとも１個のヌクレオチド分だけポリメラーゼによって伸長され、その際このヌクレオチドは検出可能の標識を有し、この伸長はゲノムＤＮＡサンプル中の各シトシンのメチル化状態に依存するステップと、
   （ｅ）伸長したオリゴヌクレオチドが標識の存在について調査されるステップと、が実施されることを特徴とする方法。
2. オリゴヌクレオチド（Ｂ）が定義された箇所で固相に結合することを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 増幅体が定義された箇所で固相に結合することを特徴とする、請求項１記載の方法。
4. 様々なオリゴヌクレオチド配列が平滑な固相上に直角格子または六角格子の形態で配列されることを特徴とする、請求項２記載の方法。
5. 伸長したオリゴヌクレオチドに取り込まれた標識が、オリゴヌクレオチド配列が存在する固相の各位置で同定可能であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
6. 増幅時に少なくとも１個のプライマー（Ａ）が固相に結合していることを特徴とする、請求項１記載の方法。
7. 様々な増幅体が固相上に直角格子または六角格子の形態で配列されることを特徴とする、請求項１、３または６記載の方法。
8. ＤＮＡの処理が増幅前に重亜硫酸塩溶液（＝ジ亜硫酸塩、水素亜硫酸塩）によって実施されることを特徴とする、上記請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法。
9. 増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われることを特徴とする、上記請求項１ないし８のいずれか１項記載の方法。
10. 使用した（Ａ）のオリゴヌクレオチドが、塩基Ｔ、ＡおよびＣまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのいずれかの塩基を含有することを特徴とする、上記請求項１ないし９のいずれか１項記載の方法。
11. 使用した（Ｂ）のオリゴヌクレオチドが、塩基Ｔ、ＡおよびＣまたは塩基Ｔ、ＡおよびＧのいずれかの塩基を含有することを特徴とする、上記請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
12. ヌクレオチドの標識が蛍光標識であることを特徴とする、上記請求項１ないし１１のいずれか１項記載の方法。
13. ヌクレオチドの標識が放射性核種であることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
14. ヌクレオチドの標識が、質量分析計で検出される解離可能の質量標識であることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
15. 伸長したオリゴヌクレオチドが全て一緒に質量分析計で検出され、それによって前記オリゴヌクレオチドの質量により明確に標識されることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
16. 伸長したオリゴヌクレオチドの各々１個のフラグメントが質量分析計で検出されることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
17. 伸長したオリゴヌクレオチドのフラグメントが１個または複数個のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる加水分解によって作られることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
18. 質量分析計におけるよりよい検出可能性のために、作製されたフラグメントが個別的に正または負の正味電荷を有することを特徴とする、請求項１６記載の方法。
19. 伸長したオリゴヌクレオチドの検出がマトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ）を利用して実施され、かつ、視覚化されることを特徴とする、上記請求項１ないし１８のいずれか１項記載の方法。
20. ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡ−ポリメラーゼである、上記請求項１ないし１９のいずれか１項記載の方法。
21. ＤＮＡ−メチル化に補足してＳＮＰｓも検出され、かつ、視覚化される、上記請求項１ないし２０のいずれか１項記載の方法。
22. オリゴヌクレオチド（Ｂ）の伸長のために用いたヌクレオチドが終結ヌクレオチド（Ｃ２）および／または鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１）である、上記請求項１ないし２１のいずれか１項記載の方法。
23. 鎖終結ヌクレオチド（Ｃ２）が塩基ＴおよびＣまたは塩基ＧおよびＡのいずれかの塩基を包含する群から選ばれる、請求項２２記載の方法。
24. 鎖伸長ヌクレオチド（Ｃ１）がヌクレオベースＡ、ＴおよびＣまたは塩基ＧおよびＡおよびＴのいずれかを包含する群から選ばれる、請求項２２または２３記載の方法。
25. 増幅が反応容器の中で複数個のＤＮＡ切片によって実施されることを特徴とする、上記請求項１ないし２４のいずれか１項記載の方法。
26. 蛍光標識ｄＣＴＰ−誘導体がＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰであることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
27. 固相表面が、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることを特徴とする、請求項２または３記載の方法。
28. ＤＮＡのためのソースが、細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液がパラフィンに植え込まれた組織、組織学的スライドおよび全ての可能なそれらの組合せを包含するものであり、そのソースから選択されるＤＮＡサンプルからゲノムＤＮＡを得る、請求項１記載の方法。
29. 上流および下流のＤＮＡ−鎖のメチル化解析が同時に実施される、上記請求項１ないし２８のいずれか１項記載の方法。