JP2000295993A - 二本鎖ｄｎａの特異的切断方法およびそのためのキット - Google Patents
二本鎖ｄｎａの特異的切断方法およびそのためのキットInfo
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- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
- C12N2310/153—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs with the aid of a protein, e.g. recombinase
Abstract
(57)【要約】
【課題】 二本鎖ＤＮＡの特異的切断方法に関する。
【解決手段】 切断箇所もしくはその近傍に二本鎖ＤＮ
Ａとオリゴヌクレオチドとからなる三重鎖部分を形成
し、次いでヌクレアーゼで処理する二本鎖ＤＮＡの特異
的切断方法。
Ａとオリゴヌクレオチドとからなる三重鎖部分を形成
し、次いでヌクレアーゼで処理する二本鎖ＤＮＡの特異
的切断方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、二本鎖ＤＮＡの特
異的切断方法および該切断方法に使用するためのキット
に関する。
異的切断方法および該切断方法に使用するためのキット
に関する。
【０００２】
【従来の技術】二本鎖ＤＮＡの特異的切断は、組換えＤ
ＮＡ実験やヒトゲノムプロジェクトをはじめとする生物
体ゲノムプロジェクトにおける遺伝子の解析において欠
くことのできない手段である。このような特異的切断の
有力なツールとしては、特定位置で二本鎖ＤＮＡを切断
するクラスＩＩ制限酵素が挙げられる。これらの酵素と
しては、個々にＤＮＡ上の約６０種を超える特異的塩基
（またはヌクレオチド）配列を切断するものが知られて
いる。特定位置でＤＮＡを切断する制限酵素はある面で
は上記組換えＤＮＡ実験やゲノムプロジェクトにおいて
有利に使用できるが、特定位置をもたないＤＮＡは切断
できず、逆に特定位置を複数もつＤＮＡは一箇所のみで
切断することが困難である。
ＮＡ実験やヒトゲノムプロジェクトをはじめとする生物
体ゲノムプロジェクトにおける遺伝子の解析において欠
くことのできない手段である。このような特異的切断の
有力なツールとしては、特定位置で二本鎖ＤＮＡを切断
するクラスＩＩ制限酵素が挙げられる。これらの酵素と
しては、個々にＤＮＡ上の約６０種を超える特異的塩基
（またはヌクレオチド）配列を切断するものが知られて
いる。特定位置でＤＮＡを切断する制限酵素はある面で
は上記組換えＤＮＡ実験やゲノムプロジェクトにおいて
有利に使用できるが、特定位置をもたないＤＮＡは切断
できず、逆に特定位置を複数もつＤＮＡは一箇所のみで
切断することが困難である。
【０００３】たとえば、上記のようなゲノムプロジェク
トから得られる遺伝子情報をより有効に活用するために
は、所望の位置で二本鎖ＤＮＡを特異的に切断する技法
を確立する必要がある。このような技法として、三重鎖
ＤＮＡの形成を介する化学的方法（S. A. Strobel et a
l., Science, ２４９，７３−７５（１９９０））、お
よび同様に三重鎖ＤＮＡの形成を介する酵素法が提案さ
れている。後者の酵素法のうち興味深いものとしては、
切断すべき箇所を相同組換え反応に関与するｒｅｃＡタ
ンパク質および二本鎖ＤＮＡと相同な配列を有する一本
鎖ＤＮＡを用いる三重鎖形成により保護し、三重鎖以外
の二重鎖ＤＮＡをメチラーゼで処理し次いで、三重鎖解
離後にこの部分だけを制限酵素で１箇所切断しようとす
るものが挙げられる（L. J. Ferrin, et al., Science,
２５４，１４９４−１４９７（１９９１））。さら
に、三重鎖形成の別法としては、ポリプリン・ポリピリ
ミジン配列を有する二本鎖ＤＮＡとポリピリミジンの一
本鎖ＤＮＡとの間でフーグスティーン（Hoogsteen）ま
たは逆フーグスティーン構造の三重鎖を形成する方法も
知られている。
トから得られる遺伝子情報をより有効に活用するために
は、所望の位置で二本鎖ＤＮＡを特異的に切断する技法
を確立する必要がある。このような技法として、三重鎖
ＤＮＡの形成を介する化学的方法（S. A. Strobel et a
l., Science, ２４９，７３−７５（１９９０））、お
よび同様に三重鎖ＤＮＡの形成を介する酵素法が提案さ
れている。後者の酵素法のうち興味深いものとしては、
切断すべき箇所を相同組換え反応に関与するｒｅｃＡタ
ンパク質および二本鎖ＤＮＡと相同な配列を有する一本
鎖ＤＮＡを用いる三重鎖形成により保護し、三重鎖以外
の二重鎖ＤＮＡをメチラーゼで処理し次いで、三重鎖解
離後にこの部分だけを制限酵素で１箇所切断しようとす
るものが挙げられる（L. J. Ferrin, et al., Science,
２５４，１４９４−１４９７（１９９１））。さら
に、三重鎖形成の別法としては、ポリプリン・ポリピリ
ミジン配列を有する二本鎖ＤＮＡとポリピリミジンの一
本鎖ＤＮＡとの間でフーグスティーン（Hoogsteen）ま
たは逆フーグスティーン構造の三重鎖を形成する方法も
知られている。
【０００４】しかし、化学的方法はＤＮＡの特異的切断
方法としてはすぐれているものの、一般に切断効率が低
く、一方、上記酵素法はＤＮＡを１箇所のみ切断すると
の観点ではすぐれているものの特定位置を切断する制限
酵素を使用するためメチラーゼ処理を必要とすると同時
に、そのような制限酵素が切断できる特定位置を有する
ＤＮＡにしか適用できない点で、適用範囲が限定され
る。
方法としてはすぐれているものの、一般に切断効率が低
く、一方、上記酵素法はＤＮＡを１箇所のみ切断すると
の観点ではすぐれているものの特定位置を切断する制限
酵素を使用するためメチラーゼ処理を必要とすると同時
に、そのような制限酵素が切断できる特定位置を有する
ＤＮＡにしか適用できない点で、適用範囲が限定され
る。
【０００５】したがって、ヌクレオチド配列に関係なく
所望の位置を特異的に簡易かつ効率よく切断しうる技法
の開発が待たれていた。
所望の位置を特異的に簡易かつ効率よく切断しうる技法
の開発が待たれていた。
【０００６】
【発明の構成】本発明者は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮ
ＡまたはＰＮＡとから形成された三重鎖ＤＮＡ部分を有
する二本鎖ＤＮＡが、メチラーゼ処理を要することな
く、直接一定のヌクレアーゼにより該二本鎖ＤＮＡにお
ける三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかの位置またはそれに隣
接する位置におけるホスホジエステル結合を特異的に切
断できることを見いだした。また逆に、二本鎖ＤＮＡも
しくは二本鎖ＤＮＡ部分は、三重鎖ＤＮＡの形成を促進
しうる相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リ
ン酸またはその類似体の共存下では、ヌクレアーゼによ
る切断に対する耐性が増強されることも見いだした。す
なわち、本発明はかかる知見に基づくものである。
ＡまたはＰＮＡとから形成された三重鎖ＤＮＡ部分を有
する二本鎖ＤＮＡが、メチラーゼ処理を要することな
く、直接一定のヌクレアーゼにより該二本鎖ＤＮＡにお
ける三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかの位置またはそれに隣
接する位置におけるホスホジエステル結合を特異的に切
断できることを見いだした。また逆に、二本鎖ＤＮＡも
しくは二本鎖ＤＮＡ部分は、三重鎖ＤＮＡの形成を促進
しうる相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リ
ン酸またはその類似体の共存下では、ヌクレアーゼによ
る切断に対する耐性が増強されることも見いだした。す
なわち、本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００７】したがって、本発明は、酸素を使用する二
本鎖ＤＮＡの特異的切断方法であって、（Ａ） 切断す
べき二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌク
レオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列
を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を
含むＰＮＡとの三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成
し、（Ｂ） こうして得られた複合体を、該二本鎖ＤＮ
Ａにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮ
Ａ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分のホスホジ
エステル結合を切断しうるヌクレアーゼにより切断し、
そして（Ｃ） 必要により、該ヌクレアーゼを不活化す
る、工程を含んでなることを特徴とする方法に関する。
本鎖ＤＮＡの特異的切断方法であって、（Ａ） 切断す
べき二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌク
レオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列
を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を
含むＰＮＡとの三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成
し、（Ｂ） こうして得られた複合体を、該二本鎖ＤＮ
Ａにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮ
Ａ部分のいずれかまたはそれに隣接する部分のホスホジ
エステル結合を切断しうるヌクレアーゼにより切断し、
そして（Ｃ） 必要により、該ヌクレアーゼを不活化す
る、工程を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【０００８】本発明の好適な態様としては、上記二本鎖
ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ分子との三重鎖ＤＮＡ部分を有す
る複合体の形成工程は、相同的組換えタンパク質および
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体の共存下で実施
される。
ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ分子との三重鎖ＤＮＡ部分を有す
る複合体の形成工程は、相同的組換えタンパク質および
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体の共存下で実施
される。
【０００９】別の態様の本発明は、二本鎖ＤＮＡ含有組
成物中に相同的組換えタンパク質およびヌクレオチド三
リン酸を共存させることを特徴とする二本鎖ＤＮＡのヌ
クレアーゼによる切断に対する耐性の増強方法に関す
る。
成物中に相同的組換えタンパク質およびヌクレオチド三
リン酸を共存させることを特徴とする二本鎖ＤＮＡのヌ
クレアーゼによる切断に対する耐性の増強方法に関す
る。
【００１０】また別の態様の本発明は、酵素を使用する
二本鎖ＤＮＡの特異的切断用のキットであって、（ａ）
二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレ
オチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列を
含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含
むＰＮＡとから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有する複
合体を該二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識
しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接
する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレア
ーゼ、（ｂ） 相同的組換えタンパク質、（ｃ） ヌク
レオシド三リン酸またはその類似体、および（ｄ） 場
合により、緩衝剤の組み合わせを含んでなるキットに関
する。
二本鎖ＤＮＡの特異的切断用のキットであって、（ａ）
二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域のヌクレ
オチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド配列を
含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を含
むＰＮＡとから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有する複
合体を該二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を認識
しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに隣接
する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌクレア
ーゼ、（ｂ） 相同的組換えタンパク質、（ｃ） ヌク
レオシド三リン酸またはその類似体、および（ｄ） 場
合により、緩衝剤の組み合わせを含んでなるキットに関
する。
【００１１】なお、本明細書において、核酸、ペプチド
核酸（ＰＮＡ）、ヌクレオチドおよびその他の化合物も
しくは試薬について略号を用いて記載している場合は、
当該技術分野で慣用されている様式に従っている。
核酸（ＰＮＡ）、ヌクレオチドおよびその他の化合物も
しくは試薬について略号を用いて記載している場合は、
当該技術分野で慣用されている様式に従っている。
【００１２】本発明に従い切断できる二本鎖ＤＮＡは、
その中にポリプリン・ポリピリミジン配列、具体的には
ポリアデニンとポリチミンの間、ポリグアニンとポリシ
トシンの間の結合により二本鎖を形成しているか、ある
いはクラスＩＩ制限酵素による切断部位を有するか否か
にかかわりなく、如何なる種類の配列を有するものであ
ってもよい。また、二本鎖ＤＮＡは直鎖状および環状の
いずれの形状をしているものであってもよく、さらに、
理論上それらの鎖長に上限は存在しない。すなわち、本
発明に従って、一本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡと三重鎖
ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうるのに必要な最低
鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであれば、３０００Ｍｂｐと
いわれるヒトゲノムの全長をもつものであっても、本発
明の特異的切断方法の対象とすることができる。勿論、
上記最低鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであればゲノムＤＮ
Ａクローンから取得されるもの、全もしくは半化学合成
的に生成されたものであるか否かを問うことなく、すべ
て上記の対象となりうる。
その中にポリプリン・ポリピリミジン配列、具体的には
ポリアデニンとポリチミンの間、ポリグアニンとポリシ
トシンの間の結合により二本鎖を形成しているか、ある
いはクラスＩＩ制限酵素による切断部位を有するか否か
にかかわりなく、如何なる種類の配列を有するものであ
ってもよい。また、二本鎖ＤＮＡは直鎖状および環状の
いずれの形状をしているものであってもよく、さらに、
理論上それらの鎖長に上限は存在しない。すなわち、本
発明に従って、一本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡと三重鎖
ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうるのに必要な最低
鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであれば、３０００Ｍｂｐと
いわれるヒトゲノムの全長をもつものであっても、本発
明の特異的切断方法の対象とすることができる。勿論、
上記最低鎖長を有する二本鎖ＤＮＡであればゲノムＤＮ
Ａクローンから取得されるもの、全もしくは半化学合成
的に生成されたものであるか否かを問うことなく、すべ
て上記の対象となりうる。
【００１３】さらにまた、切断の対象となる二本鎖ＤＮ
Ａは上記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうる
ものであるかぎり、該部分の二本鎖ＤＮＡ内に１以上の
不適正塩基対部位を有しうるものであってもよい。した
がって、本発明にいう「三重鎖ＤＮＡ」の語は、二本鎖
ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡとの間で、必ずし
も、ワトソン・クリック型塩基対もしくはフーグスティ
ーン型塩基対のような特定の構造をとっていることを意
味するものでなく、三重鎖の形成に関与する二本鎖ＤＮ
Ａにおける塩基配列と一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡにお
ける塩基配列の間で何等かの特異的な相互作用によって
三重鎖が形成されているものを意味する。
Ａは上記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうる
ものであるかぎり、該部分の二本鎖ＤＮＡ内に１以上の
不適正塩基対部位を有しうるものであってもよい。した
がって、本発明にいう「三重鎖ＤＮＡ」の語は、二本鎖
ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡとの間で、必ずし
も、ワトソン・クリック型塩基対もしくはフーグスティ
ーン型塩基対のような特定の構造をとっていることを意
味するものでなく、三重鎖の形成に関与する二本鎖ＤＮ
Ａにおける塩基配列と一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡにお
ける塩基配列の間で何等かの特異的な相互作用によって
三重鎖が形成されているものを意味する。
【００１４】本発明に従えば、上記のような二本鎖ＤＮ
Ａ中に切断を起こさせるためには、該二本鎖ＤＮＡと、
該二本鎖ＤＮＡ中に切断を起こさせるべき箇所（ホスホ
ジエステル結合部）を包含するかまたはその箇所に隣接
するヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を有す
る一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を有するＰＮ
Ａとの間で三重鎖（triplex）ＤＮＡ部分を有する複合
体を形成する必要がある。
Ａ中に切断を起こさせるためには、該二本鎖ＤＮＡと、
該二本鎖ＤＮＡ中に切断を起こさせるべき箇所（ホスホ
ジエステル結合部）を包含するかまたはその箇所に隣接
するヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を有す
る一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配列を有するＰＮ
Ａとの間で三重鎖（triplex）ＤＮＡ部分を有する複合
体を形成する必要がある。
【００１５】そのために、「一本鎖ＤＮＡ分子」は、二
本鎖ＤＮＡの一方の鎖に実質的に相同なヌクレオチド配
列を少なくとも分子中に有するものである。実質的に相
同な程度は、相同なヌクレオチド配列の鎖長によって若
干変動するが、少なくとも７０％、好ましくは９０％以
上のヌクレオチドが対応する二本鎖ＤＮＡのそれらと同
一であることが必要である。この相同性は、例えば、Li
on，Heidelberg により市販されているプログラム bio
SCOUT を用いて決定することもできる。しかし、切断箇
所により厳密な特異性をもたせるには、１００％のヌク
レオチドが二本鎖ＤＮＡと同一であることがより好まし
い。該一本鎖ＤＮＡ分子は上記相同なヌクレオチド配列
部分に加えて、追加のヌクレオチド配列を含んでいても
よく、さらにはペプチドが付加されていてもよい。ペプ
チドが付加されている一本鎖ＤＮＡの例としては、所
謂、ＰＮＡと称されている、Igloi GL，Proc．Natl．Ac
ad．Sci．USA．１９９８，９５(１５)：８５６２−７；
Kuhn H．et al.，J．Mol．Biol．１９９９．２８６
(５)：１３３７−１３４５に記載されているものを挙げ
ることができる。しかし、一本鎖ＤＮＡ分子は、その全
体が切断すべき（もしくは標的）二本鎖ＤＮＡの特定領
域のヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配
列からなるものが好ましい。この相同なヌクレオチド配
列部分の鎖長は、４ｍｅｒ以上、好ましくは１５ｍｅｒ
以上、さらに好ましくは２０ｍｅｒ以上であり、理論
上、上限はないが、好ましくは１５０ｍｅｒ以下であ
る。
本鎖ＤＮＡの一方の鎖に実質的に相同なヌクレオチド配
列を少なくとも分子中に有するものである。実質的に相
同な程度は、相同なヌクレオチド配列の鎖長によって若
干変動するが、少なくとも７０％、好ましくは９０％以
上のヌクレオチドが対応する二本鎖ＤＮＡのそれらと同
一であることが必要である。この相同性は、例えば、Li
on，Heidelberg により市販されているプログラム bio
SCOUT を用いて決定することもできる。しかし、切断箇
所により厳密な特異性をもたせるには、１００％のヌク
レオチドが二本鎖ＤＮＡと同一であることがより好まし
い。該一本鎖ＤＮＡ分子は上記相同なヌクレオチド配列
部分に加えて、追加のヌクレオチド配列を含んでいても
よく、さらにはペプチドが付加されていてもよい。ペプ
チドが付加されている一本鎖ＤＮＡの例としては、所
謂、ＰＮＡと称されている、Igloi GL，Proc．Natl．Ac
ad．Sci．USA．１９９８，９５(１５)：８５６２−７；
Kuhn H．et al.，J．Mol．Biol．１９９９．２８６
(５)：１３３７−１３４５に記載されているものを挙げ
ることができる。しかし、一本鎖ＤＮＡ分子は、その全
体が切断すべき（もしくは標的）二本鎖ＤＮＡの特定領
域のヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配
列からなるものが好ましい。この相同なヌクレオチド配
列部分の鎖長は、４ｍｅｒ以上、好ましくは１５ｍｅｒ
以上、さらに好ましくは２０ｍｅｒ以上であり、理論
上、上限はないが、好ましくは１５０ｍｅｒ以下であ
る。
【００１６】また、上述のように、三重鎖ＤＮＡ部分を
有する複合体には二本鎖ＤＮＡと、二本鎖ＤＮＡにおけ
る特定のヌクレオチド配列と相同な塩基（すなわち、ア
デニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）またはシ
トシン（Ｃ））配列をもつペプチド核酸（ＰＮＡ）とに
よって形成されたものも包含される。ＰＮＡは、核酸を
構成するＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの塩基がリン酸結合でなくペプ
チド結合によって連結された配列を有するものとして、
一般的に公知の化合物である。このようなＰＮＡは、塩
基の単位を少なくとも４個有するものでも本発明にいう
三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成できる。したが
って、ＰＮＡは比較的短い鎖長の二本鎖ＤＮＡの特定位
置（ホスホジエステル結合）を切断するのに好都合であ
ろう。ＰＮＡを用いる三重鎖（Triplex）ＤＮＡの形成
については、例えば、Frank-Kamenetskii et al.，の A
nn. Rev. Biochem. １９９５，６４：６５−９５参照さ
れたい。
有する複合体には二本鎖ＤＮＡと、二本鎖ＤＮＡにおけ
る特定のヌクレオチド配列と相同な塩基（すなわち、ア
デニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）またはシ
トシン（Ｃ））配列をもつペプチド核酸（ＰＮＡ）とに
よって形成されたものも包含される。ＰＮＡは、核酸を
構成するＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの塩基がリン酸結合でなくペプ
チド結合によって連結された配列を有するものとして、
一般的に公知の化合物である。このようなＰＮＡは、塩
基の単位を少なくとも４個有するものでも本発明にいう
三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成できる。したが
って、ＰＮＡは比較的短い鎖長の二本鎖ＤＮＡの特定位
置（ホスホジエステル結合）を切断するのに好都合であ
ろう。ＰＮＡを用いる三重鎖（Triplex）ＤＮＡの形成
については、例えば、Frank-Kamenetskii et al.，の A
nn. Rev. Biochem. １９９５，６４：６５−９５参照さ
れたい。
【００１７】本発明に従えば「三重鎖ＤＮＡ部分を有す
る複合体」は、本発明の目的に沿うものである限り、如
何なる様式もしくは技法によって形成されたものであっ
てもよい。しかし、三重鎖ＤＮＡの形成は、一般的に、
三重鎖ＤＮＡの形成を促進することが知られている相同
的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸または
その類似体の存在下で行うのが好ましい。相同的組換え
タンパク質（または普遍的組換えに関与する多機能性タ
ンパク質）は、その存在下で上記二本鎖ＤＮＡと上記一
本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡが、該タンパク質を介して
安定な複合体を形成しうるものであれば、起源を問うこ
となく、いかなるタンパク質であってもよい。しかし、
かようなタンパク質の具体的なものとしては、大腸菌
（Escherichia coli）に由来するｒｅｃＡタンパク質、
耐熱性細菌（Thermus thermophilus）、他の腸内細菌に
おいて、ｒｅｃＡ遺伝子によりコードされている多機能
性タンパク質、また、アグロバクテリウム ツメファシ
エンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacil
lus subtilis）、メチロフィルス メチロトローファス
（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio
cholerae）、ウスティラゴ メイディス（Ustilago ma
ydis）等に由来する、それ自体既知のｒｅｃＡ類似タン
パク質が挙げられる。その他、酵母（Saccharomyces ce
revisiae）やヒトに由来するｒｅｃＡ類似タンパク質
も、上記相同的組換えタンパク質に包含される。これら
のうち、入手容易性、安定性、機能性の観点から、大腸
菌に由来するｒｅｃＡタンパク質またはそれに類似する
機能を有するタンパク質（例えば、該タンパク質に由来
する改変タンパク質もしくはその断片）を使用すること
が好ましい。改変タンパク質としては、ｒｅｃＡ遺伝子
の部位特異的変異誘発等により作出されたｒｅｃＡ遺伝
子産物であって、ｒｅｃＡタンパク質において１もしく
は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつｒｅｃＡタンパク質と同様に上
記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうる機能を
有するものを挙げることができる。数個のアミノ酸が欠
失したものには、ｒｅｃＡタンパク質の一本鎖ＤＮＡへ
の結合ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドが包
含される。このようなペプチドの例としては、Voloshin
et al., Science, Vol. ２７２，１９９６：８６８−
８７２に記載されているものを挙げることができる。な
お、以上より理解できるように、本発明にいうタンパク
質の語は、ペプチドをも包含する概念で使用している。
る複合体」は、本発明の目的に沿うものである限り、如
何なる様式もしくは技法によって形成されたものであっ
てもよい。しかし、三重鎖ＤＮＡの形成は、一般的に、
三重鎖ＤＮＡの形成を促進することが知られている相同
的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸または
その類似体の存在下で行うのが好ましい。相同的組換え
タンパク質（または普遍的組換えに関与する多機能性タ
ンパク質）は、その存在下で上記二本鎖ＤＮＡと上記一
本鎖ＤＮＡ分子またはＰＮＡが、該タンパク質を介して
安定な複合体を形成しうるものであれば、起源を問うこ
となく、いかなるタンパク質であってもよい。しかし、
かようなタンパク質の具体的なものとしては、大腸菌
（Escherichia coli）に由来するｒｅｃＡタンパク質、
耐熱性細菌（Thermus thermophilus）、他の腸内細菌に
おいて、ｒｅｃＡ遺伝子によりコードされている多機能
性タンパク質、また、アグロバクテリウム ツメファシ
エンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacil
lus subtilis）、メチロフィルス メチロトローファス
（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio
cholerae）、ウスティラゴ メイディス（Ustilago ma
ydis）等に由来する、それ自体既知のｒｅｃＡ類似タン
パク質が挙げられる。その他、酵母（Saccharomyces ce
revisiae）やヒトに由来するｒｅｃＡ類似タンパク質
も、上記相同的組換えタンパク質に包含される。これら
のうち、入手容易性、安定性、機能性の観点から、大腸
菌に由来するｒｅｃＡタンパク質またはそれに類似する
機能を有するタンパク質（例えば、該タンパク質に由来
する改変タンパク質もしくはその断片）を使用すること
が好ましい。改変タンパク質としては、ｒｅｃＡ遺伝子
の部位特異的変異誘発等により作出されたｒｅｃＡ遺伝
子産物であって、ｒｅｃＡタンパク質において１もしく
は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつｒｅｃＡタンパク質と同様に上
記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうる機能を
有するものを挙げることができる。数個のアミノ酸が欠
失したものには、ｒｅｃＡタンパク質の一本鎖ＤＮＡへ
の結合ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドが包
含される。このようなペプチドの例としては、Voloshin
et al., Science, Vol. ２７２，１９９６：８６８−
８７２に記載されているものを挙げることができる。な
お、以上より理解できるように、本発明にいうタンパク
質の語は、ペプチドをも包含する概念で使用している。
【００１８】ヌクレオシド三リン酸またはその類似体と
しては、アデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）またはそ
の類似体、例えばアデノシン（γ−チオ）−三リン酸
（ＡＴＰ−γＳ）、あるいはｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ｄＵＴ
Ｐ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰまたはＧＴＰなどを挙げることが
できる。これらは、さらにヌクレオシド二リン酸（例え
ば、ＡＤＰ）と組み合わせて使用することもできる。な
お、上記複合体を形成する系において、ＡＴＰが生物学
的な分解を伴うような場合には、ヌクレオシド三リン酸
の類似体（例えば、ＡＴＰ−γＳ）を使用するのが好ま
しい。
しては、アデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）またはそ
の類似体、例えばアデノシン（γ−チオ）−三リン酸
（ＡＴＰ−γＳ）、あるいはｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ｄＵＴ
Ｐ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰまたはＧＴＰなどを挙げることが
できる。これらは、さらにヌクレオシド二リン酸（例え
ば、ＡＤＰ）と組み合わせて使用することもできる。な
お、上記複合体を形成する系において、ＡＴＰが生物学
的な分解を伴うような場合には、ヌクレオシド三リン酸
の類似体（例えば、ＡＴＰ−γＳ）を使用するのが好ま
しい。
【００１９】上記のような二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ
分子またはＰＮＡとの間における三重鎖形成反応条件に
ついて、本発明の好ましい態様である大腸菌由来のｒｅ
ｃＡタンパク質とＡＴＰ−γＳを使用する場合を例に説
明する。この反応は、適当な緩衝剤によって緩衝化され
ていてもよい水溶液中で行う。緩衝剤を使用する場合
は、例えばトリス［すなわち、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン］と適当な酸（例えば酢酸、塩酸、
等）とによりｐＨを６.５〜７.５、好ましくは約７.２
に調節したトリス系の緩衝液を使用する。緩衝剤は一般
に１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭで使用す
る。
分子またはＰＮＡとの間における三重鎖形成反応条件に
ついて、本発明の好ましい態様である大腸菌由来のｒｅ
ｃＡタンパク質とＡＴＰ−γＳを使用する場合を例に説
明する。この反応は、適当な緩衝剤によって緩衝化され
ていてもよい水溶液中で行う。緩衝剤を使用する場合
は、例えばトリス［すなわち、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン］と適当な酸（例えば酢酸、塩酸、
等）とによりｐＨを６.５〜７.５、好ましくは約７.２
に調節したトリス系の緩衝液を使用する。緩衝剤は一般
に１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭで使用す
る。
【００２０】このような緩衝液中に二本鎖ＤＮＡおよび
一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡを溶解する。これらの核酸
類を溶解する濃度は、それらが十分に溶解するものであ
ればよく、当業者であれば後述する実施例に従って小実
験を行うことにより最適濃度を決定できるであろう。二
本鎖ＤＮＡに対する一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡの使用
割合は、約２〜１０倍モルとするのがよい。ｒｅｃＡタ
ンパク質は、一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡの塩基３単位
当たりｒｅｃＡ １分子に相当するように加え、またＡ
ＴＰ−γＳはｒｅｃＡ反応緩衝液に０.５ｍＭ〜５ｍＭ
になるように加える。ｒｅｃＡタンパク質は、一本鎖Ｄ
ＮＡもしくはＰＮＡと複合体を形成するのに必要な割合
以上で使用されるのが好ましい。過剰なｒｅｃＡタンパ
ク質は三重鎖の形成に関与しない二本鎖ＤＮＡ部分をヌ
クレアーゼの攻撃に対して耐性にすることができる。こ
うして調製した反応液を、４〜５４℃、好ましくは約３
７℃において５分以上、一般に約３０分インキュベート
することにより、目的とする三重鎖ＤＮＡの複合体を形
成することができる。
一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡを溶解する。これらの核酸
類を溶解する濃度は、それらが十分に溶解するものであ
ればよく、当業者であれば後述する実施例に従って小実
験を行うことにより最適濃度を決定できるであろう。二
本鎖ＤＮＡに対する一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡの使用
割合は、約２〜１０倍モルとするのがよい。ｒｅｃＡタ
ンパク質は、一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡの塩基３単位
当たりｒｅｃＡ １分子に相当するように加え、またＡ
ＴＰ−γＳはｒｅｃＡ反応緩衝液に０.５ｍＭ〜５ｍＭ
になるように加える。ｒｅｃＡタンパク質は、一本鎖Ｄ
ＮＡもしくはＰＮＡと複合体を形成するのに必要な割合
以上で使用されるのが好ましい。過剰なｒｅｃＡタンパ
ク質は三重鎖の形成に関与しない二本鎖ＤＮＡ部分をヌ
クレアーゼの攻撃に対して耐性にすることができる。こ
うして調製した反応液を、４〜５４℃、好ましくは約３
７℃において５分以上、一般に約３０分インキュベート
することにより、目的とする三重鎖ＤＮＡの複合体を形
成することができる。
【００２１】本願発明によれば、上記のように形成され
た複合体が、二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を
認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに
隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌク
レアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼによる切断反
応に供される。上記三重鎖ＤＮＡ部分を認識するとは、
ヌクレアーゼが選択的に三重鎖ＤＮＡ部分に基づき作用
しうることを意味する。こうして、本発明で使用するヌ
クレアーゼは、三重鎖ＤＮＡ部分の５′末端側に隣接す
るもしくはその近傍の二本鎖ＤＮＡにおけるホスホジエ
ステル結合を優先的に切断し、また、場合によって、三
重鎖ＤＮＡ部分の３′末端側に隣接するもしくはその近
傍の二本鎖ＤＮＡにおけるホスホジエステル結合もしく
は三重鎖ＤＮＡ部分の二本鎖ＤＮＡ内のいずれかのホス
ホジエステル結合をも切断することができるものであ
る。
た複合体が、二本鎖ＤＮＡにおける三重鎖ＤＮＡ部分を
認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそれに
隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうるヌク
レアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼによる切断反
応に供される。上記三重鎖ＤＮＡ部分を認識するとは、
ヌクレアーゼが選択的に三重鎖ＤＮＡ部分に基づき作用
しうることを意味する。こうして、本発明で使用するヌ
クレアーゼは、三重鎖ＤＮＡ部分の５′末端側に隣接す
るもしくはその近傍の二本鎖ＤＮＡにおけるホスホジエ
ステル結合を優先的に切断し、また、場合によって、三
重鎖ＤＮＡ部分の３′末端側に隣接するもしくはその近
傍の二本鎖ＤＮＡにおけるホスホジエステル結合もしく
は三重鎖ＤＮＡ部分の二本鎖ＤＮＡ内のいずれかのホス
ホジエステル結合をも切断することができるものであ
る。
【００２２】本発明で使用するヌクレアーゼには上記の
機能を有するヌクレアーゼのすべてが包含される。かり
に、ヌクレアーゼが上記機能以外に三重鎖以外の二本鎖
ＤＮＡ部分を切断する能力を有する場合には、上述した
ように、ｒｅｃＡタンパク質をはじめとする相同的組換
えタンパク質を一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡとの複合体
を形成するのに必要とされる以上の量存在させ、そし
て、必要によりヌクレオシド三リン酸またはその類似体
を共存させることにより、ヌクレアーゼの攻撃から二本
鎖ＤＮＡ部分を防ぐことができるので、かようなヌクレ
アーゼも本発明にいうヌクレアーゼに包含される。限定
されるものでないが、ヌクレアーゼとしてはアスペルギ
ルス オリーゼ（Aspergillus oryzae）を起源とするヌ
クレアーゼＳ１、Mung bean sprouts を起源とするマン
グビーンヌクレアーゼ、アルテロモナス エスペジアナ
（Alteromonas espejiana）ＢＡＬ３１を起源とするＢ
ＡＬ３１ヌクレアーゼを挙げることができる。
機能を有するヌクレアーゼのすべてが包含される。かり
に、ヌクレアーゼが上記機能以外に三重鎖以外の二本鎖
ＤＮＡ部分を切断する能力を有する場合には、上述した
ように、ｒｅｃＡタンパク質をはじめとする相同的組換
えタンパク質を一本鎖ＤＮＡもしくはＰＮＡとの複合体
を形成するのに必要とされる以上の量存在させ、そし
て、必要によりヌクレオシド三リン酸またはその類似体
を共存させることにより、ヌクレアーゼの攻撃から二本
鎖ＤＮＡ部分を防ぐことができるので、かようなヌクレ
アーゼも本発明にいうヌクレアーゼに包含される。限定
されるものでないが、ヌクレアーゼとしてはアスペルギ
ルス オリーゼ（Aspergillus oryzae）を起源とするヌ
クレアーゼＳ１、Mung bean sprouts を起源とするマン
グビーンヌクレアーゼ、アルテロモナス エスペジアナ
（Alteromonas espejiana）ＢＡＬ３１を起源とするＢ
ＡＬ３１ヌクレアーゼを挙げることができる。
【００２３】以上のようなエンドヌクレアーゼによる二
本鎖ＤＮＡの切断反応は、使用する酵素の種類に応じて
最適条件が変動するが、例示したヌクレアーゼはいずれ
も市販されており、各種研究で使用されているので、本
発明においてもそれらに準じた条件下または改善した条
件下で使用することができる。参考までに、ヌクレアー
ゼＳ１を使用する場合について、説明を加える。先行す
る三重鎖ＤＮＡを形成した反応液を、例えば酢酸を加え
て、ｐＨを４.０〜４.６に調節した後、ヌクレアーゼＳ
１を添加するか、あるいはヌクレアーゼＳ１を含む溶液
を別途調製しておき、これに上記反応液を加えて、必要
により、ｐＨを４.０〜４.６に調節する。さらにこれら
の混合液には、適当濃度のＮａＣｌ水溶液およびＺｎＳ
Ｏ4水溶液を加え、次いで２５℃〜８５℃、好ましくは
４５℃以上、より好ましくは約５５℃において混合液を
インキュベートする。インキュベートする時間は、上記
条件下で６０分以上を選ぶことにより、二本鎖ＤＮＡの
上述したホスホジエステル結合を少なくとも４０％、さ
らには約８０％もしくはそれ以上切断することができ
る。
本鎖ＤＮＡの切断反応は、使用する酵素の種類に応じて
最適条件が変動するが、例示したヌクレアーゼはいずれ
も市販されており、各種研究で使用されているので、本
発明においてもそれらに準じた条件下または改善した条
件下で使用することができる。参考までに、ヌクレアー
ゼＳ１を使用する場合について、説明を加える。先行す
る三重鎖ＤＮＡを形成した反応液を、例えば酢酸を加え
て、ｐＨを４.０〜４.６に調節した後、ヌクレアーゼＳ
１を添加するか、あるいはヌクレアーゼＳ１を含む溶液
を別途調製しておき、これに上記反応液を加えて、必要
により、ｐＨを４.０〜４.６に調節する。さらにこれら
の混合液には、適当濃度のＮａＣｌ水溶液およびＺｎＳ
Ｏ4水溶液を加え、次いで２５℃〜８５℃、好ましくは
４５℃以上、より好ましくは約５５℃において混合液を
インキュベートする。インキュベートする時間は、上記
条件下で６０分以上を選ぶことにより、二本鎖ＤＮＡの
上述したホスホジエステル結合を少なくとも４０％、さ
らには約８０％もしくはそれ以上切断することができ
る。
【００２４】必要により、この混合液におけるヌクレア
ーゼを不活化するには、混合液を適当な緩衝剤でｐＨ
８.８付近に高めるか、該混合液にキレート剤（例、エ
チレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）を加えるか、またはタンパク質分解酵
素（例、プロティナーゼＫ）を加え、あるいはこれらの
処置を組み合わせて行った後、例えば、３７℃で１０分
以上インキュベートすればよい。こうして得られる反応
混合から切断された二本鎖ＤＮＡの回収は、それ自体公
知の溶媒（例、フェノール、クロロホルム等）抽出によ
り除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマト
グラフィーを使用して行うことができる。
ーゼを不活化するには、混合液を適当な緩衝剤でｐＨ
８.８付近に高めるか、該混合液にキレート剤（例、エ
チレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）を加えるか、またはタンパク質分解酵
素（例、プロティナーゼＫ）を加え、あるいはこれらの
処置を組み合わせて行った後、例えば、３７℃で１０分
以上インキュベートすればよい。こうして得られる反応
混合から切断された二本鎖ＤＮＡの回収は、それ自体公
知の溶媒（例、フェノール、クロロホルム等）抽出によ
り除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマト
グラフィーを使用して行うことができる。
【００２５】上述したように、部分的に三重鎖ＤＮＡ構
造を有する二本鎖ＤＮＡの二本鎖部分は、ヌクレアーゼ
による処理に際して、相同的組換えタンパク質およびヌ
クレオシド三リン酸またはその類似体の共存下が該酵素
による作用を実質的に受けなくなる。このことは、本発
明に従う、二本鎖ＤＮＡの切断の特異性を高めるのに寄
与する。本発明者は、このような相同的組換えタンパク
質およびヌクレオシド三リン酸の奏する効果が、三重鎖
ＤＮＡ部分の有無にかかわりなく、広く二本鎖ＤＮＡに
おいて達成され、また、エンドヌクレアーゼのみなら
ず、エキソヌクレアーゼに対しても発揮されることを見
い出した。
造を有する二本鎖ＤＮＡの二本鎖部分は、ヌクレアーゼ
による処理に際して、相同的組換えタンパク質およびヌ
クレオシド三リン酸またはその類似体の共存下が該酵素
による作用を実質的に受けなくなる。このことは、本発
明に従う、二本鎖ＤＮＡの切断の特異性を高めるのに寄
与する。本発明者は、このような相同的組換えタンパク
質およびヌクレオシド三リン酸の奏する効果が、三重鎖
ＤＮＡ部分の有無にかかわりなく、広く二本鎖ＤＮＡに
おいて達成され、また、エンドヌクレアーゼのみなら
ず、エキソヌクレアーゼに対しても発揮されることを見
い出した。
【００２６】したがって、別の態様の本発明として、二
本鎖ＤＮＡ含有組成物中に相同的組換えタンパク質およ
びヌクレオチド三リン酸またはその類似体を共存させる
ことを特徴とする二本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼによる切
断に対する耐性の増強方法が提供される。ここにいう相
同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸また
はその類似体の具体例な説明は上記に同じである。
本鎖ＤＮＡ含有組成物中に相同的組換えタンパク質およ
びヌクレオチド三リン酸またはその類似体を共存させる
ことを特徴とする二本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼによる切
断に対する耐性の増強方法が提供される。ここにいう相
同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸また
はその類似体の具体例な説明は上記に同じである。
【００２７】また、別の態様の本発明として、上記二本
鎖ＤＮＡの特異的切断に使用することのできる試薬類の
組み合わせからなるキットも提供される。かかるキット
は、（ａ）二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域
のヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチ
ド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基
配列を含むＰＮＡから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有
する複合体を該二本鎖ＤＮＡにおける該三重鎖ＤＮＡ部
分を認定しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそ
れに隣接する部分もしくは近傍のホスホジエステル結合
を切断しうるヌクレアーゼ、（ｂ）相同的組換えタンパ
ク質、（ｃ）ヌクレオシド三リン酸またはその類似体、
および（ｄ）場合により、緩衝剤の組み合わせを含んで
なる。
鎖ＤＮＡの特異的切断に使用することのできる試薬類の
組み合わせからなるキットも提供される。かかるキット
は、（ａ）二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域
のヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチ
ド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基
配列を含むＰＮＡから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有
する複合体を該二本鎖ＤＮＡにおける該三重鎖ＤＮＡ部
分を認定しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそ
れに隣接する部分もしくは近傍のホスホジエステル結合
を切断しうるヌクレアーゼ、（ｂ）相同的組換えタンパ
ク質、（ｃ）ヌクレオシド三リン酸またはその類似体、
および（ｄ）場合により、緩衝剤の組み合わせを含んで
なる。
【００２８】ここに記載されているエンドヌクレアー
ゼ、相同的組換えタンパク質、ヌクレオシド三リン酸
は、前述の二本鎖ＤＮＡの特異的切断について説明した
とおりである。また、「組み合わせ」とは、上記の各試
薬類が同一の場所で組み合わされるか、または異なる場
所（例えば、試薬の一部がある供給業者から、そして他
の試薬が別の供給業者から）提供され、使用者の実験室
等で組み合わされる場合をも包含される概念として使用
されている。さらに、本発明に従うキットには、二本鎖
ＤＮＡの特異的切断方法についての説明書、該方法を実
施するための実験器具等（例えば、除タンパク質のクロ
マトグラフィー用カラム、タンパク質吸着フィルター付
きチューブ）を含めることができる。
ゼ、相同的組換えタンパク質、ヌクレオシド三リン酸
は、前述の二本鎖ＤＮＡの特異的切断について説明した
とおりである。また、「組み合わせ」とは、上記の各試
薬類が同一の場所で組み合わされるか、または異なる場
所（例えば、試薬の一部がある供給業者から、そして他
の試薬が別の供給業者から）提供され、使用者の実験室
等で組み合わされる場合をも包含される概念として使用
されている。さらに、本発明に従うキットには、二本鎖
ＤＮＡの特異的切断方法についての説明書、該方法を実
施するための実験器具等（例えば、除タンパク質のクロ
マトグラフィー用カラム、タンパク質吸着フィルター付
きチューブ）を含めることができる。
【００２９】本発明によれば、如何なるヌクレオチド配
列を含む二本鎖ＤＮＡであっても、その特定のホスホジ
エステル結合を１箇所、所望により複数箇所切断するこ
とができ、また、二本鎖ＤＮＡの鎖長は、理論上、無限
大のものであっても特異的に切断できる。したがって、
本発明は、遺伝子組換え実験、特定のタンパク質をコー
ドするＤＮＡ断片の調製、ゲノムからの目的とするエキ
ソン部位の切り出しとその部位のクローニング、ゲノム
ライブラリーの解析、等の技術分野において有用であ
る。
列を含む二本鎖ＤＮＡであっても、その特定のホスホジ
エステル結合を１箇所、所望により複数箇所切断するこ
とができ、また、二本鎖ＤＮＡの鎖長は、理論上、無限
大のものであっても特異的に切断できる。したがって、
本発明は、遺伝子組換え実験、特定のタンパク質をコー
ドするＤＮＡ断片の調製、ゲノムからの目的とするエキ
ソン部位の切り出しとその部位のクローニング、ゲノム
ライブラリーの解析、等の技術分野において有用であ
る。
【００３０】
【実施例】以下、具体例を挙げて本発明をさらに説明す
るが、これらの具体例の提示は本発明の範囲をこれらに
限定することを意図するものでない。
るが、これらの具体例の提示は本発明の範囲をこれらに
限定することを意図するものでない。
【００３１】実施例１：反応の酵素依存性 プローブとして、長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ド１（配列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮ
Ａ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ−具体的な配列については、Ｓ
ｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｐｌａｓｍｉｄ
ｐＢＲ３２２”、ＪＯＵＲＮＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．
４３Ｐｔ １，７７−９０（１９７９）参照−を制限酵
素ＥａｇＩで直鎖状にしたもの）との間でｒｅｃＡ組み
換え三本鎖形成反応を行った。 オリゴヌクレオチド１： 5′-actcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacag
taag agaattatgc agtg-3′ その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレ
オチド１、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク（エピセンタ
ーテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃
度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベー
リンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ
７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜ
た。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点で
の、反応液量は２０μｌである。次にその全量を、１０
００ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、３０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を含むＳ１ヌクレアーゼ反応液
に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキ
ュベートした。
ド１（配列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮ
Ａ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ−具体的な配列については、Ｓ
ｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｐｌａｓｍｉｄ
ｐＢＲ３２２”、ＪＯＵＲＮＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．
４３Ｐｔ １，７７−９０（１９７９）参照−を制限酵
素ＥａｇＩで直鎖状にしたもの）との間でｒｅｃＡ組み
換え三本鎖形成反応を行った。 オリゴヌクレオチド１： 5′-actcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacag
taag agaattatgc agtg-3′ その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレ
オチド１、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク（エピセンタ
ーテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃
度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベー
リンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ
７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜ
た。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点で
の、反応液量は２０μｌである。次にその全量を、１０
００ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、３０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を含むＳ１ヌクレアーゼ反応液
に混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキ
ュベートした。
【００３２】その後、その反応液に、１５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチ
レンジアミン四酢酸）、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤ
Ｓ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫをこの順に加
え、３７℃で１０分間インキュベートし、Ｓ１ヌクレア
ーゼを失活させた。さらに、フェノール・クロロフォル
ム抽出を１回、クロロフォルム抽出をI回行うことによ
り、除タンパク質処理を行った。
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチ
レンジアミン四酢酸）、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤ
Ｓ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫをこの順に加
え、３７℃で１０分間インキュベートし、Ｓ１ヌクレア
ーゼを失活させた。さらに、フェノール・クロロフォル
ム抽出を１回、クロロフォルム抽出をI回行うことによ
り、除タンパク質処理を行った。
【００３３】その反応液全量に対し、１／１０倍量３Ｍ
酢酸ナトリウム、２倍量のエタノールを加え、冷却・遠
心を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した後、ＤＮ
Ａ沈殿を１０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶かし、その
全量について、１％アガロースゲル電気泳動を行った。
泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記
録した。
酢酸ナトリウム、２倍量のエタノールを加え、冷却・遠
心を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した後、ＤＮ
Ａ沈殿を１０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶かし、その
全量について、１％アガロースゲル電気泳動を行った。
泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記
録した。
【００３４】その結果を図１のレーン１に示す。レーン
Ｍはサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。
レーン２は、ｒｅｃＡタンパクを入れないで、レーン１
と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ＡＴＰ−
γＳを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を
示す。レーン４は、オリゴヌクレオチドを入れないで、
レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン５は、
オリゴヌクレオチド２（配列番号：２；６０Ｃ−ＭＢｔ
2）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示
す。 オリゴヌクレオチド２： 5′-gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ct
ttagtcct caaagcctct-3′ レーン６は、オリゴヌクレオチド２を用いて、標的ＤＮ
Ａを制限酵素Ｈｉｎｃｌｌで切断したＭ１３ｍｐ１８Ｒ
Ｆに代えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦの塩基配列に関する情報は、Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ
３３（１），１０３−１１９（１９８５）参照。
Ｍはサイズマーカーで、そのサイズを図の左端に示す。
レーン２は、ｒｅｃＡタンパクを入れないで、レーン１
と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ＡＴＰ−
γＳを入れないで、レーン１と同じ反応を行った結果を
示す。レーン４は、オリゴヌクレオチドを入れないで、
レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン５は、
オリゴヌクレオチド２（配列番号：２；６０Ｃ−ＭＢｔ
2）を用いて、レーン１と同じ反応を行った結果を示
す。 オリゴヌクレオチド２： 5′-gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ct
ttagtcct caaagcctct-3′ レーン６は、オリゴヌクレオチド２を用いて、標的ＤＮ
Ａを制限酵素Ｈｉｎｃｌｌで切断したＭ１３ｍｐ１８Ｒ
Ｆに代えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦの塩基配列に関する情報は、Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ
３３（１），１０３−１１９（１９８５）参照。
【００３５】図１によれば、全ての反応成分が加えてあ
るときのみ、標的ＤＮＡが切断されることがわかる。
るときのみ、標的ＤＮＡが切断されることがわかる。
【００３６】 実施例２：反応に必要なオリゴヌクレオチドの長さ 図２を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、１００
−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド３（配列番
号：３；１００−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と
同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、８０−ｍｅ
ｒの長さをもつオリゴヌクレオチド４（配列番号：４；
８０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を
行った結果を示す。レーン３は、６０−ｍｅｒの長さを
もつオリゴヌクレオチド５（配列番号：５；６０−ｐＢ
Ｒ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果
を示す。レーン４は、４０−ｍｅｒの長さをもつオリゴ
ヌクレオチド６（配列番号：６；４０-ｐＢＲ）を用い
て、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レ
ーン５は、３０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチ
ド７（配列番号：７；３０−ｐＢＲ）を用いて、図１の
レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン６は、
２０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド８（配列
番号：８；２０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と
同じ反応を行った結果を示す。 オリゴヌクレオチド３： 5′-gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gt
tcccaacg atcaaggcgagttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaa
a gcggttagct-3′ オリゴヌクレオチド４： 5′-cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg at
caaggcga gttacatgatcccccatgtt gtgcaaaaaa-3′ オリゴヌクレオチド５： 5′-tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gt
tacatgat cccccatgtt-3′ オリゴヌクレオチド６： 5′-ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat-
3′ オリゴヌクレオチド７： 5′-ctccg gttcccaacg atcaaggcga gttac-3′ オリゴヌクレオチド８： 5′-gttcccaacg atcaaggcga-3′ これらの結果によれば、切断に必要なオリゴヌクレオチ
ドの長さは、２０−ｍｅｒ以上が好ましく、６０−ｍｅ
ｒ以上がより好ましいことがわかる。
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、１００
−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド３（配列番
号：３；１００−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と
同じ反応を行った結果を示す。レーン２は、８０−ｍｅ
ｒの長さをもつオリゴヌクレオチド４（配列番号：４；
８０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を
行った結果を示す。レーン３は、６０−ｍｅｒの長さを
もつオリゴヌクレオチド５（配列番号：５；６０−ｐＢ
Ｒ）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結果
を示す。レーン４は、４０−ｍｅｒの長さをもつオリゴ
ヌクレオチド６（配列番号：６；４０-ｐＢＲ）を用い
て、図１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レ
ーン５は、３０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチ
ド７（配列番号：７；３０−ｐＢＲ）を用いて、図１の
レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン６は、
２０−ｍｅｒの長さをもつオリゴヌクレオチド８（配列
番号：８；２０−ｐＢＲ）を用いて、図１のレーン１と
同じ反応を行った結果を示す。 オリゴヌクレオチド３： 5′-gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gt
tcccaacg atcaaggcgagttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaa
a gcggttagct-3′ オリゴヌクレオチド４： 5′-cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg at
caaggcga gttacatgatcccccatgtt gtgcaaaaaa-3′ オリゴヌクレオチド５： 5′-tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gt
tacatgat cccccatgtt-3′ オリゴヌクレオチド６： 5′-ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat-
3′ オリゴヌクレオチド７： 5′-ctccg gttcccaacg atcaaggcga gttac-3′ オリゴヌクレオチド８： 5′-gttcccaacg atcaaggcga-3′ これらの結果によれば、切断に必要なオリゴヌクレオチ
ドの長さは、２０−ｍｅｒ以上が好ましく、６０−ｍｅ
ｒ以上がより好ましいことがわかる。
【００３７】 実施例３：反応に必要なｒｅｃＡタンパク濃度 図３を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は８μｇの
ｒｅｃＡタンパク質を、レーン２は６μｇのｒｅｃＡタ
ンパク質を、レーン３は４μｇのｒｅｃＡタンパク質
を、そしてレーン４は２μｇのｒｅｃＡタンパク質を、
それぞれ用いて図１のレーン１と同じ反応を行った結果
を示す。レーン５はｒｅｃＡタンパク質を用いないで同
様の反応を行った結果を示す。この結果によれば、切断
に必要なｒｅｃＡタンパク質濃度は、２０μｌの三本鎖
形成反応液量当たり、４μｇ以上のｒｅｃＡタンパク量
が望ましいことがわかる。
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は８μｇの
ｒｅｃＡタンパク質を、レーン２は６μｇのｒｅｃＡタ
ンパク質を、レーン３は４μｇのｒｅｃＡタンパク質
を、そしてレーン４は２μｇのｒｅｃＡタンパク質を、
それぞれ用いて図１のレーン１と同じ反応を行った結果
を示す。レーン５はｒｅｃＡタンパク質を用いないで同
様の反応を行った結果を示す。この結果によれば、切断
に必要なｒｅｃＡタンパク質濃度は、２０μｌの三本鎖
形成反応液量当たり、４μｇ以上のｒｅｃＡタンパク量
が望ましいことがわかる。
【００３８】 実施例４：反応に必要なＳ１ヌクレアーゼ濃度 図４を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は１０００
ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン２は８００ユニ
ットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン３は６００ユニット
のＳ１ヌクレアーゼを、レーン４は４００ユニットのＳ
１ヌクレアーゼを、そしてレーン５は２００ユニットの
Ｓ１ヌクレアーゼを、それぞれ用いて、図１のレーン１
と同じ反応を行った結果を示す。レーン６はＳ１ヌクレ
アーゼを用いないで同様の反応を行った結果を示す。
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は１０００
ユニットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン２は８００ユニ
ットのＳ１ヌクレアーゼを、レーン３は６００ユニット
のＳ１ヌクレアーゼを、レーン４は４００ユニットのＳ
１ヌクレアーゼを、そしてレーン５は２００ユニットの
Ｓ１ヌクレアーゼを、それぞれ用いて、図１のレーン１
と同じ反応を行った結果を示す。レーン６はＳ１ヌクレ
アーゼを用いないで同様の反応を行った結果を示す。
【００３９】これらの結果によれば、切断に必要なＳ１
ヌクレアーゼ濃度は、１２０μｌのＳ１ヌクレアーゼ反
応液量当たり、好ましくは、６００ユニット以上である
ことがわかる。
ヌクレアーゼ濃度は、１２０μｌのＳ１ヌクレアーゼ反
応液量当たり、好ましくは、６００ユニット以上である
ことがわかる。
【００４０】 実施例５：切断に必要なＳ１ヌクレアーゼ反応温度 図５を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は３７℃
で、レーン２は４５℃で、レーン３は５５℃で、レーン
４は６５℃で、そしてレーン５は７５℃で、それぞれ図
１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は３７℃
で、レーン２は４５℃で、レーン３は５５℃で、レーン
４は６５℃で、そしてレーン５は７５℃で、それぞれ図
１のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００４１】これらの結果によれば、切断に必要なＳ１
ヌクレアーゼ反応温度は、好ましくは４５℃以上である
ことがわかる。
ヌクレアーゼ反応温度は、好ましくは４５℃以上である
ことがわかる。
【００４２】 実施例６：変異を入れたオリゴヌクレオチドの使用 図６を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、図１の
レーン１はオリゴヌクレオチド５を、レーン２は、変異
が１個入ったオリゴヌクレオチド９（配列番号：９）
を、レーン３は変異が３個入ったオリゴヌクレオチド１
０（配列番号：１０）を、レーン４は変異が５個入った
オリゴヌクレオチド１１（配列番号：１１）を、そして
レーン５は変異が７個入ったオリゴヌクレオチド１２
（配列番号：１２）を、それぞれ用いて図１のレーン１
と同じ反応を行った結果を示す。 オリゴヌクレオチド９： 5′-tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg gtcaaggcga gt
tacatgat cccccatgtt-3′ オリゴヌクレオチド１０： 5′-tatggcttca ttcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga at
tacatgat cccccatgtt-3′ オリゴヌクレオチド１１： 5′-tatggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga at
tacatgat accccatgtt-3′ オリゴヌクレオチド１２： 5′-catggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga at
tacatgat accccatgtg-3′ これらの結果によれば、オリゴヌクレオチド中の５個以
内の変異では、切断が可能であることがわかる。
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、図１の
レーン１はオリゴヌクレオチド５を、レーン２は、変異
が１個入ったオリゴヌクレオチド９（配列番号：９）
を、レーン３は変異が３個入ったオリゴヌクレオチド１
０（配列番号：１０）を、レーン４は変異が５個入った
オリゴヌクレオチド１１（配列番号：１１）を、そして
レーン５は変異が７個入ったオリゴヌクレオチド１２
（配列番号：１２）を、それぞれ用いて図１のレーン１
と同じ反応を行った結果を示す。 オリゴヌクレオチド９： 5′-tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg gtcaaggcga gt
tacatgat cccccatgtt-3′ オリゴヌクレオチド１０： 5′-tatggcttca ttcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga at
tacatgat cccccatgtt-3′ オリゴヌクレオチド１１： 5′-tatggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga at
tacatgat accccatgtt-3′ オリゴヌクレオチド１２： 5′-catggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga at
tacatgat accccatgtg-3′ これらの結果によれば、オリゴヌクレオチド中の５個以
内の変異では、切断が可能であることがわかる。
【００４３】実施例７：ｒｅｃＡタンパク質の、ターゲ
ットＤＮＡブロッキング効果 標的ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡを制限酵素Ｈ
ｉｎｃ ＩＩで直鎖状にしたもの）を、ｒｅｃＡタンパ
ク質で覆う反応を行った。その反応は、６.０μｇのｒ
ｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノロジー社）、６
００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるよ
うに加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）
を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢
酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。この時点での、反応液量は２０μｌ
である。次に、その全量を、１０００ユニットＳ１ヌク
レアーゼ（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を
含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌと
し、５５℃で６０分間インキュベートした。その後、そ
の反応液に、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢
酸）、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌ
プロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベ
ートし、Ｓ１ヌクレアーゼを失活させた。さらに、フェ
ノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽
出を１回行うことにより、除タンパク質処理を行った。
その反応液全量に対し、１／１０倍量５Ｍ酢酸ナトリウ
ム、２倍量のエタノールを加え、冷却・遠心を行い、含
まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した後、ＤＮＡ沈殿を１
０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かし、その全量につい
て、１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエ
チジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。
ットＤＮＡブロッキング効果 標的ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡを制限酵素Ｈ
ｉｎｃ ＩＩで直鎖状にしたもの）を、ｒｅｃＡタンパ
ク質で覆う反応を行った。その反応は、６.０μｇのｒ
ｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノロジー社）、６
００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４８ｍＭになるよ
うに加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガーマンハイム社）
を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢
酸マグネシウム緩衝液中に混ぜた。３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。この時点での、反応液量は２０μｌ
である。次に、その全量を、１０００ユニットＳ１ヌク
レアーゼ（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を
含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２０μｌと
し、５５℃で６０分間インキュベートした。その後、そ
の反応液に、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢
酸）、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌ
プロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベ
ートし、Ｓ１ヌクレアーゼを失活させた。さらに、フェ
ノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽
出を１回行うことにより、除タンパク質処理を行った。
その反応液全量に対し、１／１０倍量５Ｍ酢酸ナトリウ
ム、２倍量のエタノールを加え、冷却・遠心を行い、含
まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した後、ＤＮＡ沈殿を１
０.０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かし、その全量につい
て、１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエ
チジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。
【００４４】その結果を図７のレーン１に示す。レーン
２は、標的ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にした、
ｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いて、レーン１と同じ反応を行
った結果を示す。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを入れない
で、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４
は、ＡＴＰ−γＳを入れないで、レーン２と同じ反応を
行った結果を示す。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズを図の左端に示す。
２は、標的ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にした、
ｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いて、レーン１と同じ反応を行
った結果を示す。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを入れない
で、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４
は、ＡＴＰ−γＳを入れないで、レーン２と同じ反応を
行った結果を示す。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズを図の左端に示す。
【００４５】これらの結果によれば、活性型、つまり、
ＤＮＡに結合能のあるｒｅｃＡタンパク質が、標的ＤＮ
Ａを、ヌクレアーゼによる非特異的な切断から保護して
いることがわかる。
ＤＮＡに結合能のあるｒｅｃＡタンパク質が、標的ＤＮ
Ａを、ヌクレアーゼによる非特異的な切断から保護して
いることがわかる。
【００４６】実施例８：オリゴヌクレオチドの末端塩基
による、切断の影響 図８を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、５′
末端がＡである、オリゴヌクレオチド１３（配列番号：
１３）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結
果を示す。レーン２は、５′末端がＧである、オリゴヌ
クレオチド１４（配列番号：１４）を用いて、図１のレ
ーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、
５′末端Ｃである、オリゴヌクレオチド１５（配列番
号：１５）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行っ
た結果を示す。レーン４は、５′末端がＴである、オリ
ゴヌクレオチド１６（配列番号：１６）を用いて、図１
のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。 オリゴヌクレオチド１３： 5′-agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gt
tgttgcca ttgctgcagg-3′ オリゴヌクレオチド１４： 5′-gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg tt
gttgccat tgctgcaggc-3′ オリゴヌクレオチド１５： 5′-ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tg
ttgccatt gctgcaggca-3′ オリゴヌクレオチド１６： 5′-tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gt
tgccattg ctgcaggcat-3′ これらの結果によれば、標的ＤＮＡの切断は、オリゴヌ
クレオチドの末端塩基に影響されないことがわかる。
による、切断の影響 図８を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、５′
末端がＡである、オリゴヌクレオチド１３（配列番号：
１３）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行った結
果を示す。レーン２は、５′末端がＧである、オリゴヌ
クレオチド１４（配列番号：１４）を用いて、図１のレ
ーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、
５′末端Ｃである、オリゴヌクレオチド１５（配列番
号：１５）を用いて、図１のレーン１と同じ反応を行っ
た結果を示す。レーン４は、５′末端がＴである、オリ
ゴヌクレオチド１６（配列番号：１６）を用いて、図１
のレーン１と同じ反応を行った結果を示す。 オリゴヌクレオチド１３： 5′-agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gt
tgttgcca ttgctgcagg-3′ オリゴヌクレオチド１４： 5′-gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg tt
gttgccat tgctgcaggc-3′ オリゴヌクレオチド１５： 5′-ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tg
ttgccatt gctgcaggca-3′ オリゴヌクレオチド１６： 5′-tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gt
tgccattg ctgcaggcat-3′ これらの結果によれば、標的ＤＮＡの切断は、オリゴヌ
クレオチドの末端塩基に影響されないことがわかる。
【００４７】実施例９：ＡＴＰ−γＳに代え、ＡＴＰ−
γＳ・ＡＤＰ混合液の使用 図９を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、図１の
レーン１と同じ結果を示す。レーン２は、ＡＴＰ−γＳ
のかわりに、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液（濃度比：
１：３）を用いて、レーン１と同じ実験を行った結果を
示す。
γＳ・ＡＤＰ混合液の使用 図９を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカー
で、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、図１の
レーン１と同じ結果を示す。レーン２は、ＡＴＰ−γＳ
のかわりに、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液（濃度比：
１：３）を用いて、レーン１と同じ実験を行った結果を
示す。
【００４８】これらの結果によれば、ＡＴＰ−γＳのか
わりに、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液を用いることで、
切断が可能である。また、その効率は、ＡＴＰ−γＳの
みで反応させる場合にくらべて、多少高い効率が得られ
る傾向にある。
わりに、ＡＴＰ−γＳ・ＡＤＰ混合液を用いることで、
切断が可能である。また、その効率は、ＡＴＰ−γＳの
みで反応させる場合にくらべて、多少高い効率が得られ
る傾向にある。
【００４９】実施例１０：良好なＤＮＡ切断効率が得ら
れる、反応条件 図１０を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカ
ーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、Ｓ１
ヌクレアーゼを加えないで、図１のレーン１と同じ反応
を行った結果を示す。レーン２は、図１のレーン１と同
じ反応を行った結果を示す。レーン３は、以下の反応条
件により、標的ＤＮＡを切断した結果を示す。プローブ
として、長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配
列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢ
Ｒ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にしたも
の）との間でｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行っ
た。その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチド、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセ
ンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最
終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ
（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス
（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中
に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この
時点での反応液量は２０μｌである。次にその全量を、
１０００ユニットＳ１ヌクレアーゼ（ＭＢl Fermentas
社）、４０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ４.６）、３３８ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１.３５ｍＭ ＺｎＳＯ4、６.８％グリセ
ロールを含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２
０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。そ
の後の実験操作は、図１のレーン１と同じである。
れる、反応条件 図１０を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカ
ーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、Ｓ１
ヌクレアーゼを加えないで、図１のレーン１と同じ反応
を行った結果を示す。レーン２は、図１のレーン１と同
じ反応を行った結果を示す。レーン３は、以下の反応条
件により、標的ＤＮＡを切断した結果を示す。プローブ
として、長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配
列番号：１；６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢ
Ｒ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にしたも
の）との間でｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行っ
た。その反応は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチド、６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセ
ンターテクノロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最
終濃度０.４８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ
（ベーリンガーマンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス
（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中
に混ぜた。３７℃で３０分間インキュベートした。この
時点での反応液量は２０μｌである。次にその全量を、
１０００ユニットＳ１ヌクレアーゼ（ＭＢl Fermentas
社）、４０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ４.６）、３３８ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１.３５ｍＭ ＺｎＳＯ4、６.８％グリセ
ロールを含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量１２
０μｌとし、５５℃で６０分間インキュベートした。そ
の後の実験操作は、図１のレーン１と同じである。
【００５０】これらの結果によれば、反応に用いるＳ１
ヌクレアーゼの購入先、または、Ｓ１ヌクレアーゼの反
応液組成を至適化することで、標的ＤＮＡの切断効率８
０％以上を達成することができることがわかる。
ヌクレアーゼの購入先、または、Ｓ１ヌクレアーゼの反
応液組成を至適化することで、標的ＤＮＡの切断効率８
０％以上を達成することができることがわかる。
【００５１】実施例１１：中性付近で作用する、ヌクレ
アーゼによる切断 図１１を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカ
ーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、ヌク
レアーゼを加えないで、図１のレーン１と同じ反応を行
った結果を示す。レーン２は、図１のレーン１と同じ反
応を行った結果を示す。レーン３は、反応の至適ｐＨが
中性付近である、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼを用いて下記
に示す反応を行った結果を示す。プローブとして、長さ
６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配列番号：１；
６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ Ｄ
ＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にしたもの）との間で
ｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行った。その反応
は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、
６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノ
ロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４
８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガー
マンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.
２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜ
た。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点で
の、反応液量は２０μｌである。次にその全量を、２５
ユニットＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＮＣｌ（ｐＨ８.０）、６００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１２ｍＭ ＣａＣｌ2、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、を含むＢＡＬ３１ヌクレアーゼ反応液に
混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュ
ベートした。その後の実験操作は、図１のレーン１と同
じである。
アーゼによる切断 図１１を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカ
ーで、そのサイズを図の左端に示す。レーン１は、ヌク
レアーゼを加えないで、図１のレーン１と同じ反応を行
った結果を示す。レーン２は、図１のレーン１と同じ反
応を行った結果を示す。レーン３は、反応の至適ｐＨが
中性付近である、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼを用いて下記
に示す反応を行った結果を示す。プローブとして、長さ
６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１（配列番号：１；
６０Ｃ−ｐＢＲｔ）と、標的ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ Ｄ
ＮＡを制限酵素Ｅａｇｌで直鎖状にしたもの）との間で
ｒｅｃＡ組み換え三本鎖形成反応を行った。その反応
は、５ｐｍｏｌの６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、
６.０μｇのｒｅｃＡタンパク質（エピセンターテクノ
ロジー社）、６００ｎｇの標的ＤＮＡ、最終濃度０.４
８ｍＭになるように加えたＡＴＰ−γＳ（ベーリンガー
マンハイム社）を、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.
２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウム緩衝液中に混ぜ
た。３７℃で３０分間インキュベートした。この時点で
の、反応液量は２０μｌである。次にその全量を、２５
ユニットＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（宝酒造社）、２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＮＣｌ（ｐＨ８.０）、６００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１２ｍＭ ＣａＣｌ2、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、を含むＢＡＬ３１ヌクレアーゼ反応液に
混ぜ、全量１２０μｌとし、５５℃で６０分間インキュ
ベートした。その後の実験操作は、図１のレーン１と同
じである。
【００５２】これらの結果によれば、ｒｅｃＡ反応液の
ｐＨと同じｐＨに至適反応条件をもつ、ＢＡＬ３１ヌク
レアーゼでも二本鎖ＤＮＡが切断が可能であることがわ
かる。このことより、三本鎖形成とヌクレアーゼの反応
を同時に行うことも可能であり、それにより、切断の効
率も向上させることができる。また、この実験データで
は、標的ＤＮＡの切断効率は若干低いが、用いるＢＡＬ
３１ヌクレアーゼの量を増やすことで、Ｓ１ヌクレアー
ゼと同程度の切断効率を得ることができる。
ｐＨと同じｐＨに至適反応条件をもつ、ＢＡＬ３１ヌク
レアーゼでも二本鎖ＤＮＡが切断が可能であることがわ
かる。このことより、三本鎖形成とヌクレアーゼの反応
を同時に行うことも可能であり、それにより、切断の効
率も向上させることができる。また、この実験データで
は、標的ＤＮＡの切断効率は若干低いが、用いるＢＡＬ
３１ヌクレアーゼの量を増やすことで、Ｓ１ヌクレアー
ゼと同程度の切断効率を得ることができる。
【００５３】 実施例１２：標的ＤＮＡの切断箇所の検討１ オリゴヌクレオチド１７（配列番号：１７）を用いて、
図１のレーン１と同じ反応を行った。次に、電気泳動を
行う前のＤＮＡを、制限酵素Ｐｓｔｌで切断することに
より小断片化した。フェノール・クロロフォルム抽出を
１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール
沈殿法により、含まれるＤＮＡ分子を濃縮した。常法に
従い、［γ−32Ｐ］ＡＴＰによりＤＮＡの５′末端標識
反応を行った後、再度、エタノール沈殿法により、含ま
れるＤＮＡ分子を濃縮した。ＤＮＡ沈殿を１０.０μｌ
のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.
０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした後、その適量につい
て、４.０％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し
た。そのゲルのオートラジオグラフィーの結果を図１２
のレーン１に示す。レーン２は、オリゴヌクレオチド１
（配列番号：１）を用いて、レーン１と同じ反応を行っ
た結果を示す。レーン３は、４０−ｍｅｒの長さをも
つ、オリゴヌクレオチド（配列番号：１８）を用いて、
レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、
４０−ｍｅｒの長さをもつ、オリゴヌクレオチド１９
（配列番号：１９）を用いて、レーン１と同じ反応を行
った結果を示す。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、
そのサイズを図の左端に示す。 オリゴヌクレオチド１７： 5′-cact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgct
tt tctgtgactg gtgat-3′ オリゴヌクレオチド１８： 5′-ttct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtg-
3′ オリゴヌクレオチド１９： 5′-cacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaa-
3′ これらの結果によれば、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で、６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いたとき
は、約２７７ｂｐと２１７ｂｐの長さのシグナルが、４
０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いたときは、約２６
７ｂｐと２０７ｂｐの長さのシグナルが出現しているこ
とから、切断される部位は、オリゴヌクレオチドの５′
末端付近であることがわかる。
図１のレーン１と同じ反応を行った。次に、電気泳動を
行う前のＤＮＡを、制限酵素Ｐｓｔｌで切断することに
より小断片化した。フェノール・クロロフォルム抽出を
１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール
沈殿法により、含まれるＤＮＡ分子を濃縮した。常法に
従い、［γ−32Ｐ］ＡＴＰによりＤＮＡの５′末端標識
反応を行った後、再度、エタノール沈殿法により、含ま
れるＤＮＡ分子を濃縮した。ＤＮＡ沈殿を１０.０μｌ
のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.
０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶かした後、その適量につい
て、４.０％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し
た。そのゲルのオートラジオグラフィーの結果を図１２
のレーン１に示す。レーン２は、オリゴヌクレオチド１
（配列番号：１）を用いて、レーン１と同じ反応を行っ
た結果を示す。レーン３は、４０−ｍｅｒの長さをも
つ、オリゴヌクレオチド（配列番号：１８）を用いて、
レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、
４０−ｍｅｒの長さをもつ、オリゴヌクレオチド１９
（配列番号：１９）を用いて、レーン１と同じ反応を行
った結果を示す。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、
そのサイズを図の左端に示す。 オリゴヌクレオチド１７： 5′-cact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgct
tt tctgtgactg gtgat-3′ オリゴヌクレオチド１８： 5′-ttct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtg-
3′ オリゴヌクレオチド１９： 5′-cacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaa-
3′ これらの結果によれば、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で、６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いたとき
は、約２７７ｂｐと２１７ｂｐの長さのシグナルが、４
０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いたときは、約２６
７ｂｐと２０７ｂｐの長さのシグナルが出現しているこ
とから、切断される部位は、オリゴヌクレオチドの５′
末端付近であることがわかる。
【００５４】実施例１３：標的ＤＮＡの切断箇所の検討
２ ゲルから切り出し抽出したＤＮＡ断片の解析結果［下線
を引いた配列はベクターＤＮＡの配列であり、その後に
続く配列は、インサートＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ）
の配列である］を示す図１３を参照されたい。図１のレ
ーン１と同じ反応を行い、アガロースゲル電気泳動した
後のＤＮＡ切断をゲルから切り出し抽出した。その切り
出したＤＮＡ断片を、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ Vecto
r（Promega 社）のＨｉｎｃ ＩＩ部位にサブクローニン
グした後、断片の含まれるプラスミドＤＮＡに対して、
塩基配列の決定を行った。その結果、標的ＤＮＡが切断
されている部位は、大部分がオリゴヌクレオチドの５′
末端の一カ所、もしくは、５′末端付近であることが判
明した。
２ ゲルから切り出し抽出したＤＮＡ断片の解析結果［下線
を引いた配列はベクターＤＮＡの配列であり、その後に
続く配列は、インサートＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ）
の配列である］を示す図１３を参照されたい。図１のレ
ーン１と同じ反応を行い、アガロースゲル電気泳動した
後のＤＮＡ切断をゲルから切り出し抽出した。その切り
出したＤＮＡ断片を、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ Vecto
r（Promega 社）のＨｉｎｃ ＩＩ部位にサブクローニン
グした後、断片の含まれるプラスミドＤＮＡに対して、
塩基配列の決定を行った。その結果、標的ＤＮＡが切断
されている部位は、大部分がオリゴヌクレオチドの５′
末端の一カ所、もしくは、５′末端付近であることが判
明した。
【００５５】これらの結果によれば、切断されたＤＮＡ
断片の塩基配列を決定した結果、標的ＤＮＡの切断され
る部位は、１カ所であることがわかる。
断片の塩基配列を決定した結果、標的ＤＮＡの切断され
る部位は、１カ所であることがわかる。
【００５６】実施例１４：２本のオリゴヌクレオチドの
使用（その１） 図１４を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカ
ーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、標
的ＤＮＡとしてｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａｌ
で切断したものを用いて、かつ、下記のオリゴヌクレオ
チドを加えないで、図１のレーン１と同様の反応を行っ
た。レーン２は、オリゴヌクレオチド２０（配列番号：
２０，６０−ｐＢＲｔｅｔ１）を加えて、レーン１と同
じ反応を行った結果を示す。レーン３は、オリゴヌクレ
オチド２１（配列番号：２１，６０−ｐＢＲｔｅｔ２）
を加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レ
ーン４は、オリゴヌクレオチド２０と、オリゴヌクレオ
チド２１を同時に加えて、レーン１と同じ反応を行った
結果を示す。
使用（その１） 図１４を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカ
ーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、標
的ＤＮＡとしてｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａｌ
で切断したものを用いて、かつ、下記のオリゴヌクレオ
チドを加えないで、図１のレーン１と同様の反応を行っ
た。レーン２は、オリゴヌクレオチド２０（配列番号：
２０，６０−ｐＢＲｔｅｔ１）を加えて、レーン１と同
じ反応を行った結果を示す。レーン３は、オリゴヌクレ
オチド２１（配列番号：２１，６０−ｐＢＲｔｅｔ２）
を加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レ
ーン４は、オリゴヌクレオチド２０と、オリゴヌクレオ
チド２１を同時に加えて、レーン１と同じ反応を行った
結果を示す。
【００５７】オリゴヌクレオチド２０： 5'-atgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg caccgtca
cc ctggatgctg taggc-3' オリゴヌクレオチド２１： 5'-tcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg caacgcg
ggg aggcagacaa ggta-3' この結果から、２本のオリゴヌクレオチドを用いること
で、標的ＤＮＡを２カ所同時に切断することができるこ
とがわかる。
cc ctggatgctg taggc-3' オリゴヌクレオチド２１： 5'-tcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg caacgcg
ggg aggcagacaa ggta-3' この結果から、２本のオリゴヌクレオチドを用いること
で、標的ＤＮＡを２カ所同時に切断することができるこ
とがわかる。
【００５８】実施例１５：２本のオリゴヌクレオチドの
使用（その２） 図１５を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカ
ーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、標
的ＤＮＡとして、環状ｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いて、か
つ、オリゴヌクレオチドを加えないで、図１のレーン１
と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、オリゴヌ
クレオチド２１を加えて、レーン１と同じ反応を行った
結果を示す。レーン４は、オリゴヌクレオチド と、
オリゴヌクレオチド を同時に加えて、レーン１と同
じ反応を行った結果を示す。
使用（その２） 図１５を参照されたい。レーンＭはＤＮＡサイズマーカ
ーで、そのサイズをデータの左に示す。レーン１は、標
的ＤＮＡとして、環状ｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いて、か
つ、オリゴヌクレオチドを加えないで、図１のレーン１
と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、オリゴヌ
クレオチド２１を加えて、レーン１と同じ反応を行った
結果を示す。レーン４は、オリゴヌクレオチド と、
オリゴヌクレオチド を同時に加えて、レーン１と同
じ反応を行った結果を示す。
【００５９】この結果から、プラスミドのような環状Ｄ
ＮＡを標的とした場合でも、２本のオリゴヌクレオチド
を用いることで、標的ＤＮＡを２カ所同時に切断するこ
とができることがわかる。
ＮＡを標的とした場合でも、２本のオリゴヌクレオチド
を用いることで、標的ＤＮＡを２カ所同時に切断するこ
とができることがわかる。
【００６０】
【配列表】 ＜110＞ アイシン精機株式会社 AISIN SEIKI CO.，LTD ＜120＞ 標識されたＤＮＡの調製方法 ＜130＞ ＜160＞ １９ ＜210＞ １ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２のＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参考 にして合成 ＜400＞ １ actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 60 ＜210＞ ２ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ファージベクターＭ１３ｍｐ１８ＲＦの、ＳｎａＢｌ認識部位に近接 したヌクレオチド配列を参考にして合成 ＜400＞ ２ gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct caaagcctct 60 ＜210＞ ３ ＜211＞ １００ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ ３ gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 60 gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 40 ＜210＞ ４ ＜211＞ ８０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ ４ cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 60 cccccatgtt gtgcaaaaaa 20 ＜210＞ ５ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ ５ tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 60 ＜210＞ ６ ＜211＞ ４０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ ６ ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 40 ＜210＞ ７ ＜211＞ ３０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ ７ ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 30 ＜210＞ ８ ＜211＞ ２０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ ８ gttcccaacg atcaaggcga 20 ＜210＞ ９ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ ９ tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg gtcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 60 ＜210＞ １０ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １０ tatggcttca ttcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga attacatgat cccccatgtt 60 ＜210＞ １１ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １１ tatggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga attacatgat accccatgtt 60 ＜210＞ １２ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １２ catggcttca ctcagctcca gttcccaacg gtcaaggcga attacatgat accccatgtg 60 ＜210＞ １３ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １３ agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg 60 ＜210＞ １４ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １４ gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc 60 ＜210＞ １５ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １５ ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca 60 ＜210＞ １６ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １６ tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctgcaggcat 60 ＜210＞ １７ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １７ cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 60 ＜210＞ １８ ＜211＞ ４０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １８ ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 40 ＜210＞ １９ ＜211＞ ４０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２の、ＳｃａＩ認識部位に近接したヌクレオチド配列を参 考にして合成 ＜400＞ １９ cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 40 ＜210＞ ２０ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子の片末端配列を参考にし て合成 ＜400＞ ２０ atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc 60 ＜210＞ ２１ ＜211＞ ６０ ＜212＞ ＤＮＡ ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子の片末端配列を参考にし て合成 ＜400＞ ２１ tcaggtcgag gtggcccggc tccatgcacc gcgacgcaac gcggggaggc agacaaggta 60
【図１】三重鎖ＤＮＡ形成反応の酵素依存性を調べた実
施例１のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図面に代
わる写真である。
施例１のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図面に代
わる写真である。
【図２】三重鎖ＤＮＡ形成反応に必要なオリゴヌクレオ
チドの長さを調べた実施例２のゲル電気泳動の結果を示
す図面に代わる写真である。
チドの長さを調べた実施例２のゲル電気泳動の結果を示
す図面に代わる写真である。
【図３】三重鎖ＤＮＡ形成反応に用いられるｒｅｃＡタ
ンパク質の濃度の影響について調べた実施例３のゲル電
気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
ンパク質の濃度の影響について調べた実施例３のゲル電
気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断
に用いられるヌクレアーゼの濃度の影響について調べた
実施例４のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真
である。
に用いられるヌクレアーゼの濃度の影響について調べた
実施例４のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真
である。
【図５】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切断
反応温度について調べた実施例５のゲル電気泳動の結果
を示す図面に代わる写真である。
反応温度について調べた実施例５のゲル電気泳動の結果
を示す図面に代わる写真である。
【図６】置換変異を有するオリゴヌクレオチドを用いる
三重鎖ＤＮＡ形成反応について調べた実施例６のゲル電
気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
三重鎖ＤＮＡ形成反応について調べた実施例６のゲル電
気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】ｒｅｃＡタンパク質を用いる二本鎖ＤＮＡのヌ
クレアーゼ作用のブロッキング効果について調べた実施
例７のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真であ
る。
クレアーゼ作用のブロッキング効果について調べた実施
例７のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真であ
る。
【図８】三重鎖ＤＮＡ形成に用いるオリゴヌクレオチド
の両末端の変化が、切断反応に影響を及ぼすか、否かを
調べた実施例８のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わ
る写真である。
の両末端の変化が、切断反応に影響を及ぼすか、否かを
調べた実施例８のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わ
る写真である。
【図９】三重鎖ＤＮＡ形成反応におけるヌクレオシド三
リン酸（ＡＴＰ−γＳ）とヌクレオシド二リン酸（ＡＤ
Ｐ）の組み合わせ使用の効果について調べた実施例９の
ゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
リン酸（ＡＴＰ−γＳ）とヌクレオシド二リン酸（ＡＤ
Ｐ）の組み合わせ使用の効果について調べた実施例９の
ゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡのさ
らなる切断条件について調べた実施例１０のゲル電気泳
動の結果を示す図面に代わる写真である。
らなる切断条件について調べた実施例１０のゲル電気泳
動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切
断反応におけるｐＨの影響を調べた実施例１１のゲル電
気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
断反応におけるｐＨの影響を調べた実施例１１のゲル電
気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１２】三重鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切
断箇所について調べた実施例１２のゲル電気泳動の結果
を示す図面に代わる写真である。
断箇所について調べた実施例１２のゲル電気泳動の結果
を示す図面に代わる写真である。
【図１３】三本鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡの切
断箇所の塩基配列を調べた実施例１３の塩基配列表の結
果を示す図面である。
断箇所の塩基配列を調べた実施例１３の塩基配列表の結
果を示す図面である。
【図１４】三本鎖ＤＮＡ形成反応によって、二本のオリ
ゴヌクレオチドを用いて直鎖状標的ＤＮＡの任意の部位
を切り出した実施例１４のゲル電気泳動の結果を示す図
面に代わる写真である。
ゴヌクレオチドを用いて直鎖状標的ＤＮＡの任意の部位
を切り出した実施例１４のゲル電気泳動の結果を示す図
面に代わる写真である。
【図１５】三本鎖ＤＮＡ形成反応によって、二本のオリ
ゴヌクレオチドを用いて環状標的ＤＮＡの任意の部位を
切り出した実施例１５のゲル電気泳動の結果を示す図面
に代わる写真である。
ゴヌクレオチドを用いて環状標的ＤＮＡの任意の部位を
切り出した実施例１５のゲル電気泳動の結果を示す図面
に代わる写真である。
Claims (11)
- 【請求項１】 酸素を使用する二本鎖ＤＮＡの特異的切
断方法であって、 （Ａ） 切断すべき二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける
特定領域のヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌ
クレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相
同な塩基配列を含むＰＮＡとの三重鎖ＤＮＡ部分を有す
る複合体を形成し、 （Ｂ） こうして得られた複合体を、該二本鎖ＤＮＡに
おける三重鎖ＤＮＡ部分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部
分のいずれかまたはそれに隣接する部分のホスホジエス
テル結合を切断しうるヌクレアーゼにより切断し、そし
て （Ｃ） 必要により、該ヌクレアーゼを不活化する、 工程を含んでなることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 複合体の形成が相同的組換えタンパク質
およびヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在す
る水性溶液中でのインキュベーションにより行われる請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 相同的組換えタンパク質が大腸菌（Esch
erichia coli）のｒｅｃＡタンパク質およびｒｅｃＡタ
ンパク質に類似する機能を有するタンパク質からなる群
より選ばれる請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 ヌクレオシド三リン酸またはその類似体
がＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰおよびＡＴ
Ｐ−γＳからなる群より選ばれる１種以上である請求項
２または３記載の方法。 - 【請求項５】 ヌクレアーゼがヌクレアーゼＳ１、マン
グビーンヌクレアーゼおよびＢＡＬ３１ヌクレアーゼか
らなる群より選ばれる１種以上である請求項１〜４のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体が一本
鎖ＤＮＡ分子を用いて形成される請求項１〜５のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項７】 切断すべき二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡに
おける特定領域のヌクレオチド配列に対して実質的に相
同なヌクレオチド配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子
が、１００％相同な配列のみからなり、かつ約１５ｍｅ
ｒ以上である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 二本鎖ＤＮＡ含有組成物中に相同的組換
えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸またはその類
似体を共存させることを特徴とする二本鎖ＤＮＡのヌク
レアーゼによる切断に対する耐性の増強方法。 - 【請求項９】 酵素を使用する二本鎖ＤＮＡの特異的切
断用のキットであって、 （ａ） 二本鎖ＤＮＡと、該ＤＮＡにおける特定領域の
ヌクレオチド配列に対して実質的に相同なヌクレオチド
配列を含んでなる一本鎖ＤＮＡ分子または相同な塩基配
列を含むＰＮＡとから形成される三重鎖ＤＮＡ部分を有
する複合体を該二本鎖ＤＮＡにおける該三重鎖ＤＮＡ部
分を認識しかつ該三重鎖ＤＮＡ部分のいずれかまたはそ
れに隣接する部分のホスホジエステル結合を切断しうる
ヌクレアーゼ、 （ｂ） 相同的組換えタンパク質、 （ｃ） ヌクレオシド三リン酸またはその類似体、およ
び （ｄ） 場合により、緩衝剤 の組み合わせを含んでなるキット。 - 【請求項１０】 ヌクレアーゼがヌクレアーゼＳ１、マ
ングビーンヌクレアーゼおよびＢＡＬ３１ヌクレアーゼ
からなる群より選ばれる請求項９記載のキット。 - 【請求項１１】 相同的組換えタンパク質が大腸菌（Es
cherichia coli）のｒｅｃＡタンパク質およびｒｅｃＡ
タンパク質に類似する機能を有するタンパク質からなる
群より選ばれ、そしてヌクレオシド三リン酸またはその
類似体がＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰおよ
びＡＴＰ−γＳからなる群より選ばれる請求項９または
１０記載のキット。
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| JP10671099A JP4265028B2 (ja) | 1999-04-14 | 1999-04-14 | 二本鎖ｄｎａの特異的切断方法およびそのためのキット |
| US09/549,949 US6541226B1 (en) | 1999-04-14 | 2000-04-14 | Method for specifically cleaving double-stranded DNA and kit for the method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10671099A JP4265028B2 (ja) | 1999-04-14 | 1999-04-14 | 二本鎖ｄｎａの特異的切断方法およびそのためのキット |
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|---|---|
| JP2000295993A true JP2000295993A (ja) | 2000-10-24 |
| JP4265028B2 JP4265028B2 (ja) | 2009-05-20 |
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Family Applications (1)
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| JP10671099A Expired - Fee Related JP4265028B2 (ja) | 1999-04-14 | 1999-04-14 | 二本鎖ｄｎａの特異的切断方法およびそのためのキット |
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| JP (1) | JP4265028B2 (ja) |
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- 1999-04-14 JP JP10671099A patent/JP4265028B2/ja not_active Expired - Fee Related
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2000
- 2000-04-14 US US09/549,949 patent/US6541226B1/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
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| JP4265028B2 (ja) | 2009-05-20 |
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