DE69133018T2

DE69133018T2 - Methoden zur zielrichtung von dna

Info

Publication number: DE69133018T2
Application number: DE69133018T
Authority: DE
Inventors: D. Camerini-Otero; S. Camerini-Otero; J. Ferrin; Margaret Mcintosh
Original assignee: GOVERNMENT OF US SECTRETAR; US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Government
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 2003-01-02
Anticipated expiration: 2011-11-09
Also published as: JP2739378B2; WO1992008791A1; AU9111691A; EP0556330A4; JPH06500926A; US5460941A; AU658386B2; EP0556330A1; CA2095624A1; ATE217906T1; EP0556330B1; DE69133018D1; CA2095624C

Description

Dies ist eine Teilfortführungsanmeldung der Anmeldung Nr. 07/611.268, die am 9. November 1990 eingereicht wurde und deren vollständiger Inhalt hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Bildung von Triplex- DNA und ein Verfahren zur Durchführung einer sequenzspezifischen Spaltung von Duplex- DNA unter Verwendung eines solchen Triplex.

Hintergrundinformation

Verschiedene Arbeitsgruppen haben vor kurzem die hoch effiziente Spaltung genomischer DNA an spezifischen Sequenzen beschrieben. Zum Beispiel haben Szybalski und Mitarbeiter die Genome von Saccharomyces cerevisiae und E. coli an einer einzigen eingeführten lac-Operator-Stelle gespalten (Koob et al., Science, 250, 271 (1990)). Diese Forscher methylierten zuerst die Hae II-Schnittstellen in der DNA, während sie den lac- Repressor verwendeten, um den lac-Operator vor Methylierung zu schützen. Nach der Inaktivierung der Methylase und des Repressors lag die einzige nicht-modifizierte und zur Spaltung verfügbare Hae II-Schnittstelle in dem lac-Operator. Die Vorteile dieses Ansatzes waren die hohe Ausbeute und die hohe Spezifität. Der Nachteil bestand darin, dass nur eine lac-Operator-Stelle gespalten werden konnte.
Ein zweiter Ansatz wurde von verschiedenen Forschern verwendet, um Genome von der Größe des S. cerevisiae-Genoms zu spalten. Dieser Ansatz nutzte die Fähigkeit von synthetischen Homopyrimidin-Oligonucleotiden sich an Duplex-Homopyrimidin-Homopurin- Bereiche anzulagern um tripel-helicale Strukturen zu bilden. Dieser Ansatz wurde zuerst von Moser und Dervan (Science 238, 645 (1987)) verwendet, um ein Plasmid durch Ausrüstung des Oligonucleotids mit einer EDTA-Fe-Spaltungseinheit zu spalten. Anschließend wurden andere Spaltungseinheiten an Homopyrimidin-Oligonucleotide angeheftet. Zum Beispiel hefteten Schultz und Mitarbeiter (Pei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9858 (1990)) die Staphylococcus-Nuclease an und Helene und Mitarbeiter (Francois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9702 (1989)) hefteten ein Phenanthrolin-Kupfer-Derivat als Spaltungseinheit an. Dervan und Mitarbeiter haben ebenfalls ein Guanin-reiches Spaltungs-Oligonucleotid verwendet um einen Triplex zu bilden (Beal et al., Science 251, 1360 (1991)), und haben die DNA unter Verwendung eines Triplex und der Methylierungsschutz-Strategie, die oben beschrieben wurde (Strobel et al., Nature 350, 172 (1991)), gespalten. Die Vorteile dieses Ansatzes zum zielgerichteten Ansteuern sind Wirksamkeit und die Fähigkeit, Oligonucleotide mit einer Vielzahl von Derivaten zu verwenden. Der Nachteil besteht darin, dass nur Homopyrimidin- oder Guanin-reiche Oligonucleotide erfolgreich verwendet wurden.
Der praktische Nutzen der vorangehend beschriebenen Strategien ist wegen der Seltenheit oder der sogar völligen Abwesenheit möglicher Spaltstellen in einer speziellen DNA-Sequenz stark eingeschränkt. Andererseits stellt die vorliegende Erfindung ein allgemeines Verfahren zur Spaltung von DNA an jeder gewünschten Stelle oder an einem Stellenpaar zur Verfügung. Stellenspezifische (ortspezifische) Spaltung ist jedoch nur eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. In einen breiteren Sinne betrifft die Erfindung ein Verfahren zum zielgerichteten Ansteuern irgendeiner gewünschten Sequenz in einer spezifischen und wirksamen Weise, sei es zum Zwecke der Spaltung, des Schutzes oder der Anreicherung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein allgemeines Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Spaltung von DNA an einer beliebigen gewünschten Stelle oder einem Stellenpaar verfügbar zu machen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die Bildung eines dreisträngigen DNA-Moleküls, wobei jeder Strang des dreisträngigen DNA-Moleküls an mindestens einen anderen Strang des dreisträngigen DNA-Moleküls hybridisiert ist (das heißt nicht-kovalent gebunden ist). Das Verfahren umfaßt:
das Inkontaktbringen eines Rekombinations-Proteins mit einem doppelsträngigen DNA-Molekül und mit einem einzelsträngigen DNA-Molekül, das zu einem Strang des doppelsträngigen DNA-Moleküls ausreichend komplementär ist, um damit zu hybridisieren, wobei das Inkontaktbringen unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass das einzelsträngige DNA-Molekül in der Weise an das doppelsträngige DNA-Molekül hybridsiert, dass das dreisträngige DNA-Molekül gebildet wird.
Weitere Ziele und Vorteile werden beim Durchlesen der folgenden Offenlegung deutlich werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Abb. 1 zeigt zwei mögliche verbundene Molekülstrukturen, die durch das Rekombinaseprotein zwischen einem linearen Duplex und einer homologen einzelsträngigen zirkulären DNA gebildet werden. Oben: ein verbundenes Molekül mit Heteroduplex-DNA und einem verdrängten Strang. Die Anwesenheit eines verdrängten Stranges ermöglicht eine Schenkelwanderung (branch migration) stattfinden zu lassen, die zu einer schnellen Dissoziation der verbunden Substrate führt, wenn die Heteroduplexbreiche kurz sind. Unten: ein stabiles verbundenes Molekül, bei dem die drei Stränge durch zusätzliche nicht-kovalente Wechselwirkungen verbunden sind und nicht an einer Schenkelwanderung teilnehmen können. Die Anordnung der drei Stränge ist nur schematisch dargestellt, und ein Aufbrechen des anfänglichen Duplex wurde nicht mit einbezogen.
Abb. 2 zeigt, dass Rekombinasen unter Verwendung von kurzen Homologiebereichen verbundene Moleküle bilden. A: Es wird ein Teil der Karte des linearen Duplexsubstrates pGEM-4 gezeigt, das bei den Testansätzen mit verbundenen Molekülen verwendet wurde. Die Kästchen stellen Bereiche mit Homologie zu M13mp18 dar. Die Zahlen in dem Polylinkerbereich am rechten Endes des Duplex geben die Längen der homologen Bereiche an, die zur Paarbildung mit einzelsträngiger M13mp18-DNA zur Verfügung stehen, wenn pGEM-4 an einer dieser Stellen linearisiert wird. B-D: Testansätze mit verbundenen Molekülen unter Verwendung eines linearen Duplex von pGEM-4 und eines viralen DNA-Stranges von M13mp18 und der Rekombinasefraktion aus HeLa-Zellen (Teilabbildung B), der Rekombinasefraktion aus Drosophila (Teilabbildung C) oder der RecA- und SSB-Proteine aus E. coli (Teilabbildung D) wurden wie in den Beispielen beschrieben durchgeführt und wurden durch Zugabe von SDS von Protein befreit. Die Länge der homologen Bereiche, die zur Paarbildung zur Verfügung stehen, sind angegeben. Bahn C: Kontrolle, die DNAs wurden alleine inkubiert; Bahn 1: Hind III-linearisierter pGEM-4; Bahn 2: Sal I-linearisierter Duplex; Bahn 3: BamH I-linearisierter Duplex; Bahn 4: Kpn I- linearisierter Duplex; Bahn 5: EcoR I-linearisierter Duplex; Bahn 6: Duplexe, die sowohl mit Hind III als auch mit EcoR I verdaut worden waren (Teilabbildungen B und D) oder eine Ligationskontrolle, Duplex alleine (Teilabbildung C).
Abb. 3 zeigt einen neuartigen Testansatz für verbundene Moleküle. A: Schema zur Bildung von verbundenen Molekülen zwischen einer linearen Duplex-DNA und einem homologen, ³²P-markierten Oligonucleotid. B: Die Testansätze mit verbundenen Molekülen wurden 10 Min. bei 37ºC mit der HeLa-Rekombinasefraktion, 100 ng eines Hind IIIlinearisierten pdel-9-Duplex und 5 ng eines homologen ³²P-markierten Oligonucleotids durchgeführt, das 33 Basen lang (Bahn 1), 20 Basen lang (Bahn 3) oder 13 Basen lang (Bahn 5) war. Die Proben wurden mit 1% SDS von Protein befreit. Die Kontrollexperimente in den Bahnen 2, 4 und 6 zeigen, dass die verbundenen Moleküle nicht durch möglicherweise verunreinigende Exonucleasen gebildet wurden. Die Duplexe und die Oligonucleotide (33- mer in Bahn 2, 20-mer in Bahn 4 und 13-mer in Bahn 6) wurden bei 37ºC getrennt mit Rekombinase inkubiert, auf 1% SDS eingestellt und dann zusammengegeben und bei 65ºC zusammengelagert, ohne vor der Elektrophorese bei Zimmertemperatur auf Eis abzukühlen. Unter diesen Zusammenlagerungsbedingungen können sich 33 oder 20 bp lange DNA- Duplexe bilden und stabil bleiben.
Abb. 4 stellt die Hitzestabilität der verbundenen Moleküle dar. A-C: Schema zur Bestimmung der relativen Hitzestabilitäten kurzer Duplexbereiche, I;
Schenkelwanderungsstrukturen, II; oder von Protein befreite verbundene Moleküle, die durch Rekombinase gebildet wurden, III. D-F: Repräsentative Ergebnisse aus Testansätzen zur Hitzestabilität für kurze Duplexe, Schenkelwanderungsstrukturen und verbundenen Molekülen, die einen Bereich gemeinsamer Homologie, der 38 Basenpaare lang ist, umfassen. Die verbundenen Moleküle wurden durch die HeLa-Rekombinasefraktion zwischen einzelsträngiger M13mp18-DNA und Sal I-linearisierter pGEM-4-Duplex-DNA gebildet und durch Zugabe von SDS von Protein befreit. Die Stabilität sowohl des Duplex als auch der Schenkelwanderungsstruktur wurde nach der Agarose-Gelelektrophorese als Verlust der ³²P- Markierung, die an der Position der einzelsträngigen M13mp19-DNA wandert, aufgezeichnet.
Abb. 5 fasst die Ergebnisse der Hitzestabilitätsuntersuchungen zusammen. Die Testansätze zur Hitzestabilität wurden wie in den Beispielen beschrieben für kurze Duplexe, Schenkelwanderungsstrukturen und verbundene Moleküle mit 13, 26, 38 oder 56 bp Homologie durchgeführt. Die angegebenen Temperaturen sind die, die zu einer Dissoziation von mehr als 50% der Strukturen nach einer 10-minütigen Inkubation führen. Wegen der Instabilität des 13 bp-Duplex bei 37ºC wurde die Stabilität der entsprechenden 13 bp langen Schenkelswanderungsstruktur nicht bestimmt.
Abb. 6 zeigt stabile verbundene Moleküle, die drei intakte DNA-Stränge besitzen. A: Verbundenes Molekül, das aus einem Hind III-Bgl I-Fragment von pGEM-4 gebildet wurde, das eine einzige ³²P-Markierung am 3'-Ende des Plus-Stranges besitzt und 56 bp Homologie mit M13mp18 gemeinsam hat. B: Hitzestabilitäts-Testansatz von ³²P- markierten verbundenen Molekülen, die durch das recA-Protein gebildet wurden. C: Vergleich der relativen Hitzestabilitäten von ³²P-markierten verbundenen Molekülen, die durch das recA-Protein aus E. coli (ausgefüllte Kreise), die HeLa-Rekombinasefraktion (offene Kreise) und die entsprechende 56 bp lange Schenkelwanderungsstruktur (Dreiecke) gebildet wurden.
Abb. 7 stellt stabile verbundene Moleküle bei Abwesenheit des recA-Proteins dar. A: Verbundene Moleküle, die durch recA gebildet worden waren, wurden wie in den Beispielen beschrieben von Protein befreit und auf restliches verbleibendes recA-Protein auf einem 12%-igen SDS-Polyacrylamidgel, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse mit einem Anti-recA-Antikörper und einem ¹²&sup5;I-markiertem sekundären Antikörper untersucht. Bahnen 1-5 : 5 ng, beziehungsweise 1 ng, 0,5 ng, 0,2 ng und 0,1 ng gereinigtes recA-Protein aus E. coli; Bahn 6: gesamte deproteinisierte verbundene Moleküle aus fünf Testansätzen; Bahn 7: 0,2 ng gereinigtes recA-Protein. B: Hitzestabilitäts-Testsansätze der deproteinisierten verbundenen Moleküle. Bahn 1: DNA-Substrate allein; Bahn 2: ein abgeschlossener Testansatz mit verbundenen Molekülen mit recA, der durch SDS und EDTA beendet wurde und direkt auf das Agarosegel geladen wurde; Bahnen 3-7: Hitzestabilitäts-Testsansätze von deproteinisierten verbundenen Molekülen, die wie in Abb. 4 beschrieben durchgeführt wurden. ds und ss bezeichnen die Wanderstrecken der doppelsträngigen, beziehungsweise einzelsträngigen DNA.
Abb. 8 ist ein Vorschlag für ein Paarbildungsschema für eine Tripel-Helix, die durch Rekombinase-Proteine gebildet wurde. A: Paarbildung eines dritten Stranges an einen homologen Duplex in der Hauptfurche. Die Duplexstränge behalten die Watson-Crick- Basenpaarung bei, die durch ununterbrochene Linien dargestellt ist. Die Nicht-Watson-Crick- Paarung, die den dritten Strang und ein Purin entweder im Watson (W)- oder im Crick (C)- Strang des Duplex umfaßt, wird durch die gestrichelte Linie dargestellt. Die schattierten (mit unterbrochenen Linien umgebenen) Bereiche stellen das Phosphatgerüst jedes Stranges dar. Man beachte, dass der dritte Strang parallel zu dem identischen Watson-Strang verläuft. B: Vorschlag für ein Bindungsschema der Wasserstoff(brücken) für alle vier möglichen Basentripletts. Die Cytosin-Reste im dritten Strang sind an der Position N&sub3; protoniert, um die Bildung von zwei Wasserstoff(brücken)bindungen zu ermöglichen.
Abb. 9: Schema zu Bildung synaptischer Komplexe und stabiler verbundener Moleküle. Eine Duplex-DNA und ein homologes Oligonucleotid werden in Gegenwart des recA-Proteins aus E. coli inkubiert, um einen synaptischen Komplex zu bilden, in dem die beiden DNAs innerhalb eines recA-Nucleoprotein-Fadens gepaart werden. Die Bildung von synaptischen Komplexen wird durch die Unfähigkeit einer Restriktionsendonuclease, den Duplex innerhalb des Bereiches der Paarbildung zu schneiden, aufgezeichnet. Wenn das recA-Protein aus dem synaptischen Komplex durch Zugabe des Detergenz SDS entfernt wird, ergeben sich stabile, von Protein befreite, verbundene Moleküle.
Abb. 10: Synaptische Komplexe und verbundene Moleküle, die durch recA gebildet wurden. Abb. 10A: Oligonucleotide mit 56, 38, 26 oder 20 Basen Homologie zur pUC18-Duplex-DNA, die eine Sac I-Schnittstelle überspannen. Abb. 10B: Synaptische Komplexe, die durch recA gebildet wurden. ³²P-markierte Oligonucleotide, superhelicale (supercoiled) pUC18-Plasmid-DNA und recA-Protein wurden zusammen inkubiert. Nach der Inkubation mit der geeigneten Restriktionsendonuclease wurden die Reaktions(gemische) auf 1% SDS eingestellt und auf einem 1%-igen Agarosegel, das Ethidiumbromid enthielt, elektrophoretisch aufgetrennt. Der Abdruck (footprint) der synaptischen Komplexe wird durch die Anwesenheit superhelicaler Plasmid-DNA, die nach Inkubation mit einer Restriktionsendonuclease verbleibt, dargestellt. Abb. 1ºC: Verbundene Moleküle, die durch recA gebildet wurden. Eine Autoradiographie des gleichen Agarosegels zeigt die Bildung von verbundenen Molekülen durch die Anwesenheit der ³²P-Markierung an, die auf der Position der superhelicalen Plasmid-DNA wandert. 1: linearer Duplex; sc: superhelicaler Duplex.
Abb. 11: Bildung von synaptischen Komplexen mit linearen Duplexen. Abb. 11A: Karte der DNA-Substrate, die das 33-Basen Oligonucleotid, das zu dem linearen pBR322-Duplex homolog ist, und die Lage der Cla I-Schnittstelle zeigt. Abb. 11B: Testansatz für (die Bildung von) synaptischen Komplexen mit einem linearen Duplex. Das nicht homologe Oligonucleotid ist eine Sequenz aus M13mp18, die den Positionen 6228-6260 entspricht. H: homologes 33-Basen Oligonucleotid; NH: nicht homologes 33-Basen Oligonucleotid.
Abb. 12: Ausmaß des Abdrucks der Restriktionsendonuclease an synaptischen Komplexen. Es wurden synaptische Komplexe bit einem homologen 20-Basen- Oligonucleotid und pUC18-Duplex-DNA in Gegenwart von recA gebildet. Die Komplexe wurden mit einer Vielzahl von Restriktionsendonucleasen inkubiert, deren Schnittstellen durch Pfeile angezeigt werden. Der Schutz vor der Spaltung, der durch den synaptischen Komplex bewirkt wird, dehnte sich bis zu den Sac I- und Sph I-Schnittstellen aus. An den EcoR I- und den Hind III-Schnittstellen wurde kein Schutz beobachtet. Die Zahlen geben die Länge vom Ende des Oligonucleotids bis zu den nächsten Schnittstellen an.
Abb. 13: Die Wirkung der Ausrichtung auf die Bildung der synaptischen Komplexe und verbundener Moleküle. Abb. 13A: Ein 56-Basen Oligonucleotid, das zu dem Polylinkerbereich von pUC 18 vollständig homolog war oder zusätzliche nicht-homologe Sequenzen entweder an einem oder an beiden der 5'- und 3'-Enden besaß. Abb. 13B: Die Bildung von synaptischen Komplexen durch recA kann entweder am 5'- oder am 3'-Ende des Einzelstranges oder an einer internen Stelle beginnen. Die Testansätze für synaptische Komplexe wurden mit ³²P-markierten Oligonucleotiden durchgeführt. Die Bande in Bahn 1, die gerade oberhalb des linearen pUC 18 wandert, stellt Duplexe mit Einzelstrangbruch dar, die im Ausgangssubstrat vorliegen. Abb. 13C: Der homologe Bereich am 5'-Ende des Einzelstranges wird bei der Bildung der verbundenen Moleküle bevorzugt. Die Testansätze für synaptische Komplexe wurden durch Zugabe von SDS von Protein befreit, darauf erfolgte die Elektrophorese und die Autoradiographie. Die Bahnen 1-8 entsprechen den Bahnen 4-11 in der obigen Teilabbildung B. 1: linearer Duplex; sc: superhelicaler Duplex.
Abb. 14. Die minimale Einheit zur Suche nach einer Stelle für die homologe Paarbildung. Abb. 14A: Die 33, 15 oder 13 Basen langen Oligonucleotide sind zu pBR322 homolog. Es sind die Positionen der EcoR I (E)-, Cla I (C)- und Hind III (H)-Schnittstellen im Duplex dargestellt. Abb. 14B: Die Nucleotidsequenz des 15-Basen-Oligonucleotids und der entsprechenden Duplexsequenz, die die Positionen der Cla I- und Hind III-Schnittstelle darstellt. Die Basen im Duplex, die die gesamte oder einen Teil der Erkennungssequenzen von Cla I und Hind III umfassen, sind fett dargestellt. Abb. 14C: Bildung von synaptischen Komplexen mit einem 15 Basen langen Oligonucleotid. Die synaptischen Komplexe wurden mit dem 15-Basen-Oligonucleotid wie oben beschrieben gebildet. Bahnen 2-4: Inkubation mit Hind III; Bahnen 5-7: Inkubation mit Cla I; Bahnen 8-10: Inkubation mit EcoR I.
Abb. 15: RecA paart sich mit weniger als einer Helixwindung der Duplex-DNA. Abb. 15A: Die Bildung von synaptischen Komplexen mit der L-Reihe der Oligonucleotide. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert aus drei unabhängigen Beobachtungen dar. Der Prozentsatz des Schutzes des Duplex wird auf eine Kontrollreaktion, die Duplex-DNA und recA enthält normalisiert. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes dar. Abb. 15B: Bildung von synaptischen Komplexen mit der R-Reihe (ununterbrochene Linie). Die Ergebnisse stellen den Mittelwert aus vier unabhängigen Beobachtungen dar. Zum Vergleich werden die entsprechenden Daten für die L-Reihe gezeigt (gestrichelte Linie). Der Nachweis und die Quantifizierung der geringen Anzahl der synaptischen Komplexe wurde bei diesen Experimenten durch die Verwendung von 200 ng Duplex-DNA erleichtert.
Abb. 16: Die Spezifität der recA-Paarbildungsreaktion. Abb. 16A: Ein 30- Basen-Oligonucleotid, das zu M13mp18 homolog ist, überspannt eine der drei Nde I- Restriktionsendonuclease-Schnittstellen (N) im Duplex. Die Sequenz des Oligonucleotids ist: 5'-TATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGC-3'. Die Nde I-Schnittstelle ist fett hervorgehoben. Abb. 16B: RecA richtet die Bildung des synaptischen Komplexes mit hoher Wirksamkeit gezielt an die homologe Stelle im Duplex. Das 30-Basen-Oligonucleotid wurde mit Duplex-DNA und recA in einem Testansatz (zur Bildung) eines synaptischen Komplexes inkubiert, darauf erfolgte die Inkubation mit Nde I. Die Größenmarker (M) sind Hind III- Fragmente des Lambda-(Phagen) und Hae III-Fragmente des Phi · 174-(Phagen). Bahn 6:
M13mp18-Duplex-DNA, die mit BamH I verdaut wurde und ein lineares 7,2 kb Volllängen- Fragment ergibt. Zur besseren Darstellung wird das Ethidiumbromid-gefärbte Gel in umgekehrtem Kontrast wiedergegeben.
Abb. 17: Schema der Strategie, die zur sequenzspezifischen Spaltung von DNA verwendet wurde. Diese Zeichnung stellt die Spaltung an einer einzigen Stelle dar.
Abb. 18. Abb. 18A: Eine schematische Darstellung der Positionen der Spaltung von Lambda-DNA unter Verwendung eines Oligonucleotids, das zu der Stelle homolog ist, die der fett gedruckte Pfeil markiert. Die Lambda-DNA enthält 5 EcoR I-Schnittstellen, einschließlich der, die durch den fett gedruckten Pfeil markiert ist. Abb. 18B: Mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel, das die sequenzspezifische Spaltung von Lambda- DNA darstellt. Die Bahn 2 zeigt die vollständige Spaltungsreaktion und die anderen Bahnen enthielten weggelassene Bestandteile wie angegeben. Nicht-methylierte Lambda-DNA wurde zuerst durch Inkubation mit dm recA-Protein und einem Oligonucleotid, das 30 Basen lang und identisch zu der Lambdasequenz von Position 31.734 bis 31.763 war, geschützt. Die Sequenz war: 5'-TCACGCCGGAAGTGAATTCAAACAGGGTTC-3'. Nach 10 Minuten bei 37ºC wurde ein kleines Volumen EcoR I-Methylase und 5-Adenosylmethionin zugegeben, und die Reaktion wurde 20 Minuten weiter laufen lassen. Das recA-Protein und die Methylase wurden dann durch 15 Minuten Erhitzen auf 65ºC inaktiviert. Es wurde EcoR I- Restriktionsenzym dem Reaktionsgefäß bei 37ºC zugegeben, und die Reaktion wurde 60 Minuten weiter laufen gelassen. Das Reaktionsvolumen betrug 40 ul und enthielt in der Reihenfolge der Zugabe: 25 mM Tris-Acetat (pH 7,5); 4 mM Mg-acetat; 0,4 mM Dithiothreit; 0,5 mM Spermidin; 10 ug recA-Protein; 100 uM EGTA; 1,1 mM ADP; 0,3 mM ATPgamma-S (Fluka BioChemica); 0,18 ug des Oligonucleotids; 0,9 ug Lambda-DNA; 4 ug acetyliertes Rinderserumalbumin (BSA); 3,8 Einheiten EcoR I-Methylase; 120 uM S- Adenosylmethionin und 20 Einheiten EcoR I-Restriktionsenzym (alle angeführten Reagenzien ab der Lambda-DNA waren von New England Biolabs). Das Tris-Acetat, Dithiothreit, Spermidin und die Puffer, die für die abschließenden recA-Protein- Reingungsschritte verwendet wurden, wurden über Chelex 100 (Bio-Rad)-Säulen gegeben, um Verunreinigungen durch Spurenmetalle zu entfernen. Die Reaktionen wurden mit 5 ul 6 %-igem Natriumdodecylsulfat (SDS), 90 mM EDTA und 0,1% Bromphenolblau beendet. 20 ul der endgültigen Reaktionsgemische wurden mit 60 ul 0,5%-iger InCert-Agarose bei 65ºC vermischt und in die Probenlöcher eines 1,5%-igen Agarosegels absitzen gelassen. Das Gel wurde über Pulsfeld-Elektrophorese auf einem CHIEF-DRII-System (Bio-Rad) bei 12ºC über 36 Stunden bei 180 V und Umschaltzeiten von 2,5 s laufen gelassen.
Abb. 19. Abb. 19A: Eine schematische Darstellung der Spaltpositionen des E. coli-Chromosoms unter Verwendung von zwei Oligonucleotiden, die zu Stellen in den uvrB- und topA-Genen homolog waren. Abb. 19B: Mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel, das die sequenzspezifische Spaltung der E. coli-DNA darstellt, die ein Fragment von 520 kb erzeugt. Die Kompressionszone (C) des Gels wird ebenfalls gezeigt. Bahn Y: Chromosomale Marker aus der Hefe 5. cerevisiae. Bahn Lambda: DNA-Leiter aus Lambda-Concatemeren. Bahn E: nicht-modifizierte E. coli-DNA nach einem vollständigen Verdau mit EcoR I. Bahnen 1-5: vollständige Spaltungsreaktionen mit unterschiedlichen Mengen' an Oligonucleotid in jeder Bahn. Die uvrB-Oligonucleotidsequenz war: 5'- TCATGAGTAAACCGTTCAAACTGAATTCCGCTTTTA-3' (36 Basen lang), und die topA-Sequenz war: 5'-CGAGATCGAAGAGGGCGAATTCCGCATTAA-3' (30 Basen lang). Die Reaktionsbedingungen waren ähnlich denen der Abb. 18, außer dass die folgenden Bedingungen modifiziert wurden, um gute Ergebnisse für in Agarose eingebettete DNA zu erhalten. Das recA-Protein und die Oligonucleotide wurden mit der DNA 15 Minuten bei 37ºC vorinkubiert; die Methylase und S-Adenosylmethionin wurden zugegeben, und die Methylierung wurde über 1 Stunde laufen gelassen. Die Methylierung wurde durch Zugabe von 100 ul 2%-igem SDS für 30 Minuten bei 37ºC beendet. Die Kügelchen wurden dann in 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 1,5 uM Dithiothreit und 200 ug/ml nichtacetyliertem BSA (Calbiochem-Behring) äquilibriert. Die Beobachtung von Wilson und Hoffman (Wilson et al., Anal. Biochem. 191, 370 (1990)), dass dieser Puffer sich ausgezeichnet zur Hemmung unspezifischer oder Star-Aktivität von EcoR I auf in Agarose eingebetteter DNA eignet, wurde bestätigt. Die Konzentrationen der anderen Reagenzien waren wie in Abb. 18 mit den Ausnahmen, dass jedes Reaktionsgefäß 20 ug recA- Protein, die angegebene Menge jedes Oligonucleotids, 30 ul (gepacktes Volumen) an Kügelchen, die E. coli-DNA enthielten, und 40 Einheiten Methylase enthielt, und der Verdau mit 40 Einheiten EcoR I-Restriktionsenzym erfolgte. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Kügelchen auf einem 1%-igen Agarosegel über 30 Stunden bei 12ºC, 160 V mit Umschaltzeiten, die im Bereich von 60-140 s lagen, laufen gelassen. Abb. 19C: Southern-Blot des Gels aus Teilabbildung (B). Das Gel wurde auf eine GeneScreen Plus-Nylonmembran (Dupont) nach den Angaben des Herstellers übertragen. Die Sonde wurde durch Amplifikation über Polymerasekettenreaktion (PCR) eines 600 Basenpaar-Fragmentes des tA-Gens aus E. coli unter Verwendung von 32P-Desoxycytidin-5'-triphosphat hergestellt. Das trpA-Gen liegt zwischen dem uvrB- und dem topA-Gen. Der Film wurde überexponiert, um untergeordnete Banden sichtbar zu machen, aber die Densitometrie wurde an kürzer exponierten Filmen durchgeführt. Bahn E, die die gleiche Menge an DNA wie die Bahnen 1-5 enthielt, zeigte die Hybridisierung der Sonde an das vorhergesagte Fragment von 40 kb, das durch einen vollständigen Verdau mit EcoR I erzeugt worden war (Kohara et al., Cell 50, 495 (1987)); die Intensität dieser Bande lieferte den als 100% gesetzten Wert, um die Ausbeute des 520 kb-Fragmentes zu berechnen.
Abb. 20. Abb. 20 A: Ein Schema, das die Spaltpositionen des menschlichen CF- Locus unter Verwendung von zwei Oligonucleotiden, die zu Stellen im Intron 1 und im Exon 19 homolog sind, darstellt. Das Gen enthält insgesamt 24 Exons. Abb. 20 B: Mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel, das die Entwicklung kleinerer DNA-Fragmente darstellt, wenn die Oligonucleotid-Konzentration vermindert wird. Bahn S: Sfi I-Verdau nicht-modifizierter DNA aus HeLa-Zellen. Bahn Lambda: DNA-Leiter aus Lambda- Concatemeren. Bahnen 1-6: vollständige Spaltungsreaktionen mit der angegeben Menge jedes Oligonucleotids. Die Oligonucleotidsequenz des Introns 1 war: 5'- TAAGTGCTCAGAAAACATTTCTTGACTGAATTCAGCCAACAAAAATTTTGGGGTA GGTAG-3' (60 Basen lang), und die Oligonucleotidsequenz des Exons 19 war: 5'- AATGGCCAACTCTCGAAAGTTATGATTATTGAGAATTCACACGTGAAGAAAGATG ACATCTGG-3'(63 Basen lang). Die Bedingungen waren identisch zu Abb. 19 mit den Ausnahmen, dass das Reaktionsvolumen bei allen Schritten verdoppelt wurde und 25 ul (gepacktes Volumen) an HeLa-(DNA)-Kügelchen pro Reaktion verwendet wurden. Es wurden 80 Einheiten Sfi I (New England Biolabs) in Bahn S gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet. Ein 1%-iges Agarosegel wurde über 32 Stunden bei 12ºC, 160 V, mit Umschaltzeiten, die von 40 auf 120 s verlängert wurden, laufen gelassen. Abb. 20C: Southern-Blot des Gels aus Teilabbildung (B). Die mit Sfi I verdaute Bande war 270 kb lang und wurde zur Berechnung der Ausbeute des 180 kb-Fragments verwendet. Die Sonde wurde über PCR des CF-cDNA-Plasmids T8-B3 (aus der American Type Culture Collection) hergestellt. Die Sonde war 550 Basen lang und enthielt 410 Basen des Exons 13, von denen 140 mit Basen des Exons 14 colinear sind.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Spaltung von DNA an jeder gewünschten Stelle, bei dem ein dreisträngiges DNA-Molekül zwischen einem DNA-Duplex und einem dritten DNA-Strang gebildet wird.
Der Triplex der vorliegenden Erfindung kann durch Inkontaktbringen eines Rekombinase-Proteins mit einem DNA-Duplex und einer einzelsträngigen DNA-Sequenz unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen dem Duplex und dem einzelsträngigen DNA-Molekül bewirken, gebildet werden. Rekombinase-Proteine ümfassen Proteine, die invitro biochemische Schritte ausführen können, die die homologe Rekombination in Zellen oder in-vivo nachbilden, und insbesondere (solche Proteine), die zwei DNAs, einzelsträngige und doppelsträngige, in einer Homologie-abhängigen Weise paaren. Beispiele für solche Proteine umfassen prokaryontische Proteine, wie das recA-Protein aus E. coli und andere bakterielle recA-Analoga und das uvsX-Protein des Bakteriophagen T4. Proteine aus eukaryontischen Quellen wurden ebenfalls beschrieben und es wurde oben auf sie verwiesen.
Der Triplex der Erfindung ist sogar nach der Entfernung des Rekombinase-Proteins stabil. Die komplementären Stränge des Duplex können jede beliebige Basensequenz besitzen und das einzelsträngige Molekül braucht nur bis zu 13 Basen der Duplex-Stränge komplementär sein, um einen stabilen Triplex zu bilden. Eine mit dem Fachgebiet vertraute Person wird wissen, dass die minimale Anzahl an Basenpaaren-Homologie, die erforderlich ist, in Abhängigkeit von dem verwendeten Rekombinase-Protein variieren kann. Zum Beispiel werden durch die menschliche und die Drosophila-Rekombinase bereits 13 bp- Homologie erkannt und durch recA aus E. coli 38 bp.
Das Rekombinase-Protein, das zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren geeignet ist, kann in gereinigter oder teilweise gereinigter Form vorliegen. Wie oben erwähnt wurde, kann das Enzym unter Verwendung von Verfahren, die in den Beispielen belegt sind, aus Quellen, die menschliche Zellen und Zellen von Drosophila umfassen, isoliert werden. Andere Quellen umfassen E. coli. Die optimale Konzentration an Rekombinase, die verwendet werden sollte, kann durch eine mit dem Fachgebiet vertraute Person rasch bestimmt werden. In dem Verfahren der Erfindung wird die Spaltung der DNA in einer sequenzspezifischen Weise bewirkt. Gegenwärtig wird diese Technologie durch den biologischen Bestand an verfügbaren Restriktionsendonucleasen beschränkt. Um den Spielraum an sequenzspezifischen Spaltungen zu erweitern, haben verschiedene Arbeitsgruppen versucht, durch die Verwendung von Homopyrimidin-Oligonucleotiden, die chemische Spaltungseinheiten für die DNA tragen, die Spaltung auf eine Zielsequenz hinzulenken. Das Prinzip dieses Ansatzes besteht darin, dass die Bildung der Triplex-DNA leicht erfolgen kann, wenn der dritte Strang ausschließlich aus Pyrimidinen und die Ziel- Duplex-Sequenz aus einer "komplementären" Strecke von Homopurin- und Homopyrimidin- Strängen besteht. Wenn erst einmal diese dreisträngige Hybridisierung vollzogen ist, führt eine chemische Einheit, wie Fe-EDTA oder Cu-Phenanthrolin, am Ende des dritten Stranges die Spaltung der Ziel-Duplex-DNA durch (siehe Dreyer et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 968-972).
Das Gebiet der sequenzspezifischen Spaltung wird durch die Entdeckung der Anmelder, dass ein dritter Strang einer beliebigen Sequenz (d. h. einem, der Purine und Pyrimidine auf einem Strang in einer beliebigen Reihenfolge enthält) bei Anwesenheit von Rekombinationsproteinen eine Triple-Helix mit einer homologen Duplex-Sequenz bilden kann, deutlich erweitert. Wenn Rekombinaseproteine verwendet werden, um eine Tripel- Helix-DNA zu bilden, die ein Oligonucleotid als dritten Strang enthält, das eine chemische Spaltungseinheit (zum Beispiel Fe-EDTA, Cu-Phenanthrolin oder 2-Methoxy-6-chloro-9- aminoacridin) trägt, kann die Spaltung jedes beliebigen Duplex an jeder vorgegebenen Sequenz erreicht werden. Es wird erwartet, dass diese Technologie die wirksame sequenzspezifische Spaltung von, zum Beispiel, einer 20 Basen langen Sequenz erlaubt, die, zum Beispiel, nur einmal im gesamten Säugergenom auftritt. Eine Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, wird wissen, dass eine häufigere Spaltung des Genoms durch Veränderung der Stringenz der Rekombinase für die Homologie zur DNA (Sequenzidentität, die das Oligonucleotid und der Duplex gemeinsam haben) erreicht werden kann, um Sequenzen, die ähnlich aber nicht identisch sind, mit einzubeziehen, oder die Spaltung zu repetitiven Sequenzmotiven hinzulenken.
Die Fähigkeit, eine sequenzspezifische Spaltung nach Wunsch durchführen zu können, hat verschiedene Konsequenzen. Zuerst stellt sie ein wertvolles Werkzeug für die molekulare Clonierung von DNA zur Verfügung. Zweitens wird die Genkartierung über lange Strecken DNA im Größenbereich von einer Million Basenpaaren relativ einfach gemacht. Drittens erleichtert die Fähigkeit, einen einzigen Schnitt im Säugergenom durchführen zu können, insbesondere, wenn dies innerhalb einer Zelle durchgeführt wird, das zielgerichtete Ansteuern von Genen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verwendung der Bildung dieser dreisträngigen DNAs bei der Clonierung und der Kartierung von DNAs, die multiple Restriktionsenzym-Schnittstellen besitzen. Es ist oft wünschenswert eine begrenzte Untergruppe von Restriktionsschnittstellen zu spalten. Gegenwärtig werden "teilweise Spaltungs"-Vorschriften der Art: "Triff und Verfehl" verwendet, oder es werden Methylasen verwendet, die die Spaltung an allen Stellen blockieren, die durch bestimmte Restriktionsenzyme erkannt werden. Unglücklicherweise ist der Bestand an Methylasen äußerst begrenzt, und in dem Maße in dem sie verfügbar sind, führen sie zu der Veränderung aller Stellen, die durch ein bestimmtes Restriktionsenzym erkannt werden. Die Arbeiten aus verschiedenen Laboratorien haben gezeigt, dass Tripel-Helices, die Polypurin/Polypyrimidin- Sequenzen umfassen, die Spaltung durch ein Restriktionsenzym innerhalb des Bereiches der Tripel-Helix-DNA aufheben können. Die hierin offen gelegte Technologie, die auf der Verwendung von Rekombinaseproteinen basiert, kann einen solchen Schutz vor Spaltung auf praktisch jede Restriktionsenzym-Erkennungsequenz erweitern.
Das Verfahren, auf das sich die Erfindung bezieht, besitzt eine breite Anwendbarkeit. Es kann verwendet werden, um eine spezifische Sequenz (das heißt die Sequenz, die mit dem Oligonucleotid einen Komplex bildet) vor einer Modifikation, zum Beispiel durch eine Methylase, oder alternativ vor einer Spaltung, zum Beispiel durch ein Restriktionsenzym, zu schützen. Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung auch verwendet werden, um die ortsspezifische Spaltung durch Anheften einer Spaltungseinheit an das Oligonucleotid zu bewirken, zum Beispiel einer chemischen Spaltungseinheit. Weiterhin kann das vorliegende Verfahren verwendet werden, um eine ortsspezifische Spaltung in einem Zwei-Schritte- Vorgang durchzuführen, erstens, durch den Schutz der spezifischen Sequenz vor Modifikation (durch die Bildung des dreisträngigen Moleküls) und dann durch die Entfernung des Oligonucleotids, wodurch die vorher geschützte Stelle für die Spaltung verfügbar gemacht wird (andere solcher Stellen bleiben vor Spaltung durch die vorangehende Modifikation geschützt). In noch einer anderen Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um eine DNA-Sammlung mit einer gewünschten Sequenz anzureichern, durch Derivatbildung des Oligonucleotids mit einem Mitglied eines bindenden Paars, zum Beispiel Biotin, und der anschließenden Selektion des dreisträngigen Moleküls, das sich aus der Komplexbildung des Oligonucleotids mit dem gewünschten Duplex-DNA-Molekül ergibt, unter Verwendung des anderen Mitglieds des bindenden Paars, in diesem Beispiel Avidin. Auf diese Weise kann die Reinigung spezifischer Duplex-DNA-Moleküle erreicht werden. Andere Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Verwendung von Oligonucleotiden, die mit nachweisbaren Markierungen verknüpft sind, um spezifische Duplex-Moleküle mit einer Markierung zu versehen, und die Verwendung von Oligonucleotiden, die an vernetzende Reagenzien gebunden sind, die, wenn sie aktiviert werden, zur Bildung eines stabilen dreisträngigen Moleküls führen. Andere Anwendungen des vorliegenden Verfahrens werden für die Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, beim Durchlesen dieser Offenlegung deutlich werden.
Oligonucleotide, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, können in der Weise entworfen werden, dass die gewünschten Ergebnisse optimiert werden. Zum Beispiel kann die Länge der Oligonucleotide für bestimmte Vorschriften zum zielgerichteten Ansteuern ohne übermäßige experimentelle Untersuchungen angepasst werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung in einigen Einzelheiten mit Bezug auf die oben beschriebenen Schutz- und Restriktions/Modifikations-Ausführungsformen beschrieben wird, wird die Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, die breitere Anwendbarkeit dieser Verfahrenstechnologie sowohl für in-vitro- als auch für in-vivo-Systeme erkennen.
Der Aspekt des Schutzes in der Erfindung, wird in einigen Einzelheiten im Beispiel 12 nachstehend beschrieben. Wie beim Durchlesen dieses Beispiels deutlich wird, kann recA verwendet werden, um den Schutz, zum Beispiel vor der Spaltung einer bestimmten Stelle in einem Duplex-DNA-Molekül durch die Bildung eines synaptischen Komplexes an dieser Stelle zu bewirken. Die Bildung des Komplexes zwischen dem Oligonucleotid und der homologen Duplex-DNA erfolgt sowohl schnell als auch wirkungsvoll.
Zum Zwecke der Deutlichkeit wird die spezifische Abfolge der Reaktionen, die in die Restriktions/Modifikations-Ausführungsform einbezogen sind, in den Beispielen 13-15 nachstehend in Einzelheiten dargestellt. Bei Ziel-DNA, die nicht leicht geschert wird, wie Lambda-DNA, die 48,5 Kilobasen lang ist (Daniels et al., in: Lambda II, Hendrix et al., Hrsg., (Cold Spring Harbor, N. Y., 1983) S. 519-676), werden die Reaktionen günstigerweise in Lösung durchgeführt. Größere Genome können jedoch in Agarose-Minikügelchen eingebettet werden. (Siehe Beispiele 14 und 15).
Der erste Schritt zur Erlangung einer sequenzspezifischen Spaltung von Duplex-DNA bei der im Beispiel dargestellten RestriktionslModifikations-Ausführungsform besteht in der Auswahl der bestimmten EcoR I-Schnittstelle, die gespaltet werden soll. Es wird ein homologes Oligonucleotid, im Allgemeinen 30 bis 60 Basen lang, synthetisiert, so dass die EcoR I-Stelle günstigerweise in der Mitte des Oligonucleotids liegt. Oligonucleotide, die die Erkennungsequenz an dem 5'- oder an dem 3'-Ende tragen, können ebenfalls verwendet werden, es könnte jedoch eine verminderte Wirksamkeit beobachtet werden (siehe Beispiel 14). Das Oligonucleotid und das recA-Protein werden mit der Duplex-DNA inkubiert, und der Komplex an dem Ort der Homologie gebildet. Dann werden EcoR I-Methylase und 5- Adenosylmiethionin zugegeben, und es werden alle verfügbaren Stellen bis auf die Stelle, die in den Oligonucleotid- und recA-Proteinkomplex einbezogen ist, methyliert. Dann werden der Komplex und die Methylase inaktiviert, und es wird EcoR I-Restriktionsenzym zugegeben, um die nun unbedeckte EcoR I-Schnittstelle zu spalten.
Das Schneiden einer einzigen Stelle ist in Abb. 17 abgebildet, es können jedoch zwei unterschiedliche Oligonucleotide gleichzeitig zugegeben werden. Dies erlaubt die Isolierung eines Fragments aus langen oder zirkulären Genomen. Die folgende Gleichung beschreibt die Ausbeute eines solchen Fragments:
Ausbeute (%) = (PC)²[1-(1-M)C]x (1-N) · 100
wobei
P die Wirksamkeit des Schutzes vor Methylierung von homologen Stellen durch das recA-Protein darstellt (ein Wert von 1 bedeutet vollständigen Schutz),
C die Wirksamkeit der Spaltung durch das Restriktionsenzym darstellt,
M die Wirksamkeit der Methylierung ungeschützter Stellen darstellt,
X die Anzahl der EcoR I-Schnittstellen, die sich im Fragment befinden, darstellt und
N der Anteil der Fragmente, die durch unspezifische Nuclease oder durch Scherung zerstört wurden, darstellt.
Die drei Ausdrücke der Gleichung enthalten wichtige Parameter der Reaktion. Aus dem ersten Ausdruck wird deutlich, dass der Schutz der homologen Stelle maximiert werden sollte, und dass Verminderungen der Wirksamkeit des Schutzes quadriert werden, wenn zwei Stellen einbezogen sind. Es wird angenommen, dass die Wirksamkeit des Schutzes für beide Stellen gleich ist. Wegen des zweiten Ausdrucks, der in die X-ste Potenz erhoben wird, sollte die Methylierung günstigerweise sehr nahe bis zur Vollständigkeit, besonders bei langen Fragmenten mit vielen internen EcoR I-Schnittstellen, durchgeführt werden. Aus dem dritten Ausdruck wird deutlich, dass unspezifische Nucleasen minimiert werden sollten, und in der Tat werden Proteine mit hoher Reinheit bevorzugt.
Eine Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, wird aus dem Durchlesen des Vorangegangenen ersehen, dass obwohl nicht-derivatisierte Oligonucleotide verwendet werden können, die Vielseitigkeit der zielgerichteten Ansteuerung durch Bildung von Oligonucleotidderivaten erhöht werden kann. Mögliche Derivate umfassen Proteine, Biotin (wie vorstehend erwähnt), Fluoreszenzfarbstoffe, chemisch reaktive Einheiten (zum Beispiel zur Spaltung) oder photochemisch reaktive Einheiten. Die Derivatbildung kann unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, vorgenommen werden.
Das Verfahren, auf das sich die Erfindung bezieht, hat viele Anwendungsmöglichkeiten, von denen eine die Genomkartierung darstellt. Der physikalische Abstand zwischen zwei Genorten (Loci) wird einfach durch die Fragmentgröße dargestellt. Wenn ein Fragment erst isoliert ist, zum Beispiel unter Verwendung der Pulsfeld- Gelelektrophorese, wird die Komplexität des Auffindens eines bestimmten gewünschten Gens um einige Größenordnungen vermindert, verglichen mit der Arbeit mit nicht-fraktionierter genomischer DNA.
Eine Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, wird aus dem Vorangegangenen ersehen, dass Oligonucleotide zum zielgerichteten Ansteuern an jede beliebige Stelle einer DNA-Sequenz, einschließlich Stellen innerhalb großer Genome, entworfen werden können. Demgemäß können Oligonucleotide entworfen werden, die in einer intrazellulären Umgebung verwendet werden können, um die Spaltung, Rekombination oder Repression spezifischer Gene gezielt anzusteuern.
Bestimmte Aspekte der Erfindung werden mit größerer Ausführlichkeit in den folgenden nicht-begrenzenden Beispielen beschrieben.

BEISPIELE

Experimentelle Einzelheiten, die die Beispiele 1-5 betreffen.

Rekombinase-Proteine:

Eine teilweise gereinigte HeLa-Rekombinasefraktion wurde aus Kernextrakten hergestellt, wie anderenorts beschrieben (Hsieh und Camerini-Otero, 1989, J. Biol. Chem. 264, 5089-5097). Die teilweise gereinigte Drosophila-Rekombinase, Fraktion IV, wurde aus 24 h alten Embryos wie vorher beschrieben (Eisen und Camerini-Otero, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7481-7485) hergestellt. Das menschliche Rekombinase-Präparat war frei von jeglicher 3'-5'-Exonucleaseaktivität, wie durch Zählung des mit Trichloressigsäure fällbaren Material bestimmt wurde. Es wurden keine ³²P-cpm (Zählereignisse pro Minute) aus ³²P-3'-endmarkierter Duplex-DNA nach Inkubation mit der menschlichen Rekombinasefraktion unter Verwendung von Bedingungen der Testansätze für die Bildung von verbundenen Molekülen freigesetzt (die Daten werden nicht gezeigt). Wie vorher beschrieben entfernte die Rekombinasefraktion aus Drosophila < 10% der ³²P-cpm in einem ähnlichen Testansatz (Eisen und Camerini-Otero, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7481-7485). Obwohl nicht von Bedeutung für die Testansätze für die Bildung von verbundenen Molekülen, die hier beschrieben werden, waren die 5'-3'-Exonucleaseaktivitäten in den Präparaten der Rekombinasefraktionen äußerst niedrig; es wurden < 5% ³²P-cpm und 10-15% szP-cpm als Trichloressigsäure-lösliche Zählereignisse bei der Drosophila-, beziehungsweise der menschlichen Rekombinasefraktion freigesetzt (Eisen und Camerini-Otero, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7481-7485). Gereinigtes recA- und SSB-Protein aus E. coli wurden großzügigerweise von Dr. Stephen C. Kowalczykowski, Northwestern University Medical School (Kowalczykowski und Krupp, 1987, J. Mol. Biol. 193, 97-113) zur Verfügung gestellt. Beide Proteine aus E. coli wandern als einzelne homogene Polypeptide in der SDS- PAGE und enthalten keine nachweisbaren Exonucleaseaktivitäten, wie durch Freisetzung von Trichloressigsäure-löslichen Zählereignissen beurteilt wurde (persönliche Mitteilung von S. Kowalczykowski und nicht gezeigte Daten).

DNA-Substrate:

pGEM-4-Plasmid-DNA wurde von Promega Biotec bezogen. Die virale DNA von Ml3mpl8 und die Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs bezogen. Die virale DNA von M13mp19 und die pdel-9-Plasmid-DNA, ein Derivat von pBR322, in dem die Nucleotide 1745 bis 2505 deletiert sind (Brenner et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 684-691) wurden gemäß Standardverfahren hergestellt. Die Oligonucleotide wurden wie an anderer Stelle beschrieben (Hsieh und Camerini-Otero, 1989, J. Biol. Chem. 264, 5089-5097) synthetisiert und gereinigt. Oligonucleotide, die zu dem Plus-Strang von pdel-9 homolog waren, überspannten die pBR322-Positionen 17-29, 10-29 und 4359-29 (Sutcliffe, 1978, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 77-90) für das 13-mer, beziehungsweise das 20-mer und das 33-mer. Oligonucleotide, die zu dem Polylinkerbereich von pGEM-4 homolog waren, wurden aus dem Negativ-Strang von M13mp19 abgeleitet und auf die M13mp19-Positionen, die unten aufgelistet sind, kartiert (Yannisch-Perron et al., 1985, Gene 33, 103-119). Oligonucleotide, die für die Teil-Duplexe verwendet wurden, überspannten die Positionen 6278-6290, 6265-6290, 6253-6290 und 6235-6290 für 13 bp, beziehungsweise 26 bp, 38 bp und 56 bp; solche, die für Schenkelwanderungsstrukturen verwendet wurden, überspannten 6278-6300, 6265-6300, 6253-6300 und 6235-6300 für 23 bp, beziehungsweise 36 bp, 48 bp und 66 bp. Die Oligonucleotide wurden mit ³²P-gamma-ATP (New England Nuclear) und T4- Polynucleotid-Kinase (Pharmacia) markiert und durch Passage über G25- Zentrifugationssäulen (Boehringer Mannheim) oder über Dialyse entsalzt. Die Herstellung von ³²P-markierten Teil-Duplexen aus markierten Oligonucleotiden und der DNA des viralen Stranges von M13mp19 erfolgte wie an anderer Stelle beschrieben (Hsieh und Camerini- Otero, 1989, J. Biol. Chem. 264, 5089-5097). Die Schenkelwanderungsstruktur wurde durch Inkubation des Teil-Duplex-Moleküls mit einem nicht-markierten Oligonucleotid gebildet, dessen Sequenz identisch zur der des ³²P-markierten angelagerten Oligonucleotids war, das aber eine zusätzliche 10 Basen lange Anlagerungsseqeunz gleich 5' zu dem ³²P-markierten Fragment besaß. Die DNA-Konzentrationen werden als Mol Nucleotide oder durch das Gewicht ausgedrückt.
Die Länge der Homologie, die zwischen einem einzelsträngigen und doppelsträngigen Substrat besteht, wird als die maximale Anzahl an Basen definiert, die sich zwischen der einzelsträngigen DNA und dem komplementären Strang des linearen Duplex-Substrates in einem verbundenen Molekül paaren können. Es wurden zwei signifikante Homologiebereiche zwischen pGEM-4 und M13mp18 unter Verwendung des BESTFIT-Programmes der Univ. von Wisconsin gefunden. Sie befinden sich in pGEM-4 in entgegengesetzten Orientierungen zueinander. Die Kartenpositionen des 59 bp-Bereiches aus dem lac i-Gen sind: M13mp18: 6001-6059 (Yannisch-Perron et al., 1985, Gene 33, 103-119) und pGEM-4: 104-162. Der 57 bp-Polylinkerbereich umfaßt in M13mp18 die Positionen 6231-6287 und in pGEM-4 die Positionen 10-66.
Linearer Duplex von pGEM-4 mit einer einzigen 3'-³²P-Markierung pGEM-4-DNA wurde mit Hind III linearisiert und durch Auffüllen der 3'-Enden mit ³²P-alpha-dATP (New England Nuclear) und kalten (nicht-markierten) Desoxynucleotiden unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase (Pharmacia) markiert. Die Reaktion wurde durch 10 Min. Erhitzen auf 65ºC beendet, wurde dann auf 100 mM NaCl eingestellt und mit Bgl I verdaut. Das 1.635 bp Bgl I-Hind III-Fragment, das den Polylinker- Bereich enthielt, wurde über ein Gel gereinigt und ausgiebig gegen 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA dialysiert. Wenn dieses ³²P-markierte Fragment mit Pst I verdaut wurde und durch Densitometrie nach der Elektrophorese auf einem 8%-igen denaturierenden Polyacrylamidgel oder einem 1%-igen Agarosegel untersucht wurde, wurden > 99% der Markierung aus dem 1,6 kb-Fragment entfernt. Somit befindet sich die ³²P-Markierung innerhalb der 10 Basen des 3'-Endes des Plus-Stranges des Duplex-Substrats.

Testansätze für verbundene Moleküle

Die 20 ul-Testansätze für verbundene Moleküle wurden 10 Min. bei 37ºC wie beschrieben (Hsieh und Camerini-Otero, 1989, J. Biol. Chem. 264, 5089-5097) unter Verwendung von 150 umol (50 ng) viraler M13mp18-DNA und 150 umol (50 ng) linearer pGEM-4-DNA oder 300 umol (100 ng) linearer pdel-9-DNA und 5 ng ³²P-markiertem Oligonucleotid mit 100 ng HeLa-Protein oder 40 ng Drosophila-Protein durchgeführt. Die Testansätze, die 7 ug recA-Protein und 700 ng SSB-Protein enthielten, wurden 10 Min. bei 37 ºC mit einer Vorinkubation wie beschrieben durchgeführt (Hsieh und Camerini-Otero, 1989, J. Biol. Chem. 264, 5089-5097). Die Testansätze wurden vor der Elektrophorese bei Zimmertemperatur auf 0,7%-igen Agarosegelen in TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, pH 8, 1 mM EDTA), die Ethidiumbromid enthielten, über 12-16 h bei 0,6 V/cm, auf 1% SDS und 10 mM EDTA eingestellt. Die Quantifizierung erfolgte durch Densitometrie. Die Elektronenmikroskopie wurde unter Verwendung der modifizierten Kleinschmidt-Technik durchgeführt.

Hitzestabilitäts-Testansätze

P-markierte Teil-Duplexe (150 umol), die aus einen ³²P-markierten Oligonucleotid bestanden, das an den viralen Strang der M13mp19-DNA angelagert ist, wurden 10 Min. bei den angegebenen Temperaturen oder auf Eis in Strang-Austausch-Puffer, der 1% SDS und 10 mM EDTA enthielt, inkubiert. Es wurde TAE-Puffer, der 0,1% Bromphenolblau und 50% Glycerin enthielt zugegeben, und die Gemische wurden über 12-16 h mit 0,6 V/cm auf 0,7%- igen Agarosegelen in TAE-Puffer, der Ethidiumbromid enthielt, elektrophoretisch aufgetrennt, danach erfolgte eine Autoradiographie. Bei den Stabilitäts-Testansätzen der Schenkelwanderungsstrukturen, wurden 150 umol der ³²P-markierten Teil-Duplexe und 4 ng eines zweiten Oligonucleotids, das eine 10 Basen lange Anlagerungssequenz für M13mp19 besaß, 10 Min. bei den angegebenen Temperaturen oder auf Eis in Strang-Austausch-Puffer, der 1% SDS, 10 mM EDTA und 10 Gewichts-% Polyethylenglycol enthielt, inkubiert. Die Reaktionen wurden auf Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt, darauf erfolgte eine Autoradiographie wie oben beschrieben. Es wurden verbundene Moleküle durch die Rekombinasen gebildet. Die Reaktionen wurden in 1% SDS und 10 mM EDTA beendet, weitere 10 Min. bei den angegebenen Temperaturen oder auf Eis inkubiert und auf Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt.

Deproteinisierung der verbundenen Moleküle

Abgeschlossene Testansätze mit verbundenen Molekülen, die recA- und SSB-Proteine enthielten, wurden auf 1% SDS, 10 mM EDTA und 20 ug/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) eingestellt und weitere 20 Min. bei 37ºC inkubiert. Die Testansätze wurden nacheinander mit Phenol, Phenol-Chloroform und Chloroform extrahiert. Die Proben wurden viermal mit wasserfreiem Ethylether, der kurz vor der Verwendung mit Wasser gesättigt wurde, extrahiert. Der restliche Ether wurde unter Stickstoff entfernt. Die von Protein befreiten verbundenen Moleküle wurden durch SDS-PAGE (Laemmli, 1970) auf 12%-igen Polyacrylamidgelen (Novex) untersucht, darauf erfolgte eine Silberfärbung (Hochstrasser et al. 1988, Anal. Biochem. 173, 412-423) oder eine Western-Blot-Analyse. Die Elektrophorese und das Übertragen (Transfer) auf Nitrocellulose unter Verwendung einer Miniblot-Apparatur von Schleicher und Schuell erfolgten nach Vorschriften des Herstellers. Nach dem Übertragen wurden die Nitrocellulosefilter in 10% Milch in physiologischer Kochsalzlösung, PBS, für 1 h blockiert (abgesättigt). Die Filter wurden 1 h mit 20 ml einer 1 : 500 Verdünnung von Kaninchen-Antiserum, das gegen das gereinigte recA-Protein erzeugt worden war (Hazelton Biotechnology), in 5% Milch, 0,1% (Vol./Vol.) Tween-20 in PBS inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen wurden die Filter 1 h mit 20 ml 5% Milch, 0,1% Tween-20 in PBS, das 15 uCi ¹²&sup5;I-markiertes Anti-Kaninchen-IgG aus Eseln enthielt (3000 Ci/mmol, Amersham), inkubiert, darauf erfolgte eine ausgiebige Waschung. Die Autoradiographie erfolgte für 3 Tage unter Verwendung von Verstärkerfolien.

Beispiel 1. Verbundene Moleküle mit kurzen Homologiebereichen

Um die Bildung dreisträngiger DNA zu untersuchen, wurden die Rekombinaseproteine auf ihre Fähigkeit hin überprüft, stabile verbundene Moleküle mit kurzen Homologiebereichen zu bilden. Die Rekombinaseproteine wurden mit einer linearen Duplex-DNA und einer homologen zirkulären Einzelstrang-DNA inkubiert, um ein verbundenes Molekülprodukt zu bilden, in dem die beiden Substrate nicht-kovalent verbunden sind. Eine stabile Bildung eines verbundenen Moleküls beginnt an den Enden des linearen Duplex. Das zirkuläre einzelsträngige DNA-Substrat ist der virale (Plus)-Strang des M13mp18-Phagen. Das lineare Duplex-Substrat ist das Plasmid pGEM-4 (Abb. 2A). pGEM-4 und M13mp18 besitzen zwei bedeutende Bereiche mit gemeinsamer Homologie, einen Bereich von 59 bp aus dem E. coli lac i-Gen und einen homologen Bereich von 57 bp, der die Polylinker-Clonierungsstelle sowohl von pGEM-4 als auch von M13mp18 bildet. Diese beiden homologen Bereiche sind bei pGEM-4 durch 37 bp nicht-homologer Sequenz getrennt. Wenn pGEM-4 in dem Polylinkerbereich linearisiert wird, bestimmt die Polarität des Strangaustausches durch die menschliche (HeLa) und die Drosophila-Rekombinasefraktion, dass nur eine homologe Sequenz am rechten Ende des linearen Duplex von pGEM-4, wie in Abb. 2A gezeigt wird, verwendet wird (Hsieh et al., 1986, Cell 44, 885-894; Eisen und Camerini-Otero, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7481-7485). Das rechte Ende von pGEM-4 exponiert wie gezeichnet das 3'-Ende des Plus-Stranges der Polylinker-Sequenz von M13mp18.
Die HeLa-Rekombinasefraktion bildete verbundene Moleküle zwischen der einzelsträngigen M13mp18-DNA und der linearisierten doppelsträngigen pGEM-4-DNA (Abb. 2B). Die Proben wurden vor der Elektrophorese von Protein befreit. Überraschenderweise waren bereits 13 Basen gemeinsamer Homologie für die Bildung von stabilen verbundenen Molekülen ausreichend (Bahn 4). Homologe Sequenzen von 5 Basen Länge am rechten Ende des linearen Duplex und von 52 Basen Länge am linken Ende des Duplex wurden nicht verwendet (Bahn 5). Dieses Ergebnis bestätigt die Ausrichtung des Strangaustausches durch die menschliche Rekombinasefraktion. Kontrollexperimente unter Verwendung einzelsträngiger M13mp19-DNA, die den Negativ-Strang des Polylinker- Bereiches enthielt, führte zu dem Auftreten von stabilen verbundenen Molekülen, wenn pGEM-4 mit EcoR I, aber nicht mit Hind III linearisiert worden war. Die Deletion aller bis auf 5 bp Homologie in Testansätzen unter Verwendung von pGEM-4, der sowohl mit Hind III als auch mit EcoR I verdaut worden war (Bahn 6), führte ebenfalls zu keinem Produkt, was anzeigt, dass der zweite gemeinsame Homologiebereich, der an einer internen Stelle, die 37 bp vom linken Ende des Duplex entfernt ist, durch die HeLa-Rekombinasefraktion zur Bildung von verbundenen Molekülen nicht verwendet wird. Der Testansatz für verbundene Moleküle unter Verwendung von sehr kurzen Sequenzhomologien war mit 16-26% der Duplex-Moleküle, die zu verbundenen Molekülen umgewandelt wurden, überraschend wirkungsvoll. Bei ähnlichen Testansatz-Bedingungen unter Verwendung vollständig homologer DNAs wandelt die menschliche Rekombinasefraktion ein Drittel bis die Hälfte der linearen Duplexe zu verbundenen Molekülen um (Hsieh et al., 1986, Cell 44, 885-894; Hsieh und Camerini-Otero, 1989, J. Biol. Chem. 264, 5089-5097).
Ähnlich wie die menschliche Rekombinasefraktion bildete auch die Rekombinasefraktion aus Drosophila verbundene Moleküle mit nur 13 bp Homologie (Abb. 2C, Bahn 4), verwendete 5 bp-Homologie nicht und zeigte die erwartete Ausrichtung bei der Bildung von verbundenen Molekülen (Bahn 5). Etwa 20% der linearen Duplexe wurden zu verbundenen Molekülen in den Bahnen 1-3 umgewandelt. Bei ähnlichen Testansatz- Bedingungen unter Verwendung vollständig homologer DNAs wandelt die Rekombinasefraktion aus Drosophila zwei Drittel der Duplexe zu verbundenen Molekülen um (Eisen und Camerini-Otero, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7481-7485).
Testansätze mit verbundenen Molekülen unter Verwendung des linearen pGEM-4- Duplex, der einzelsträngigen M13mp18-DNA, des recA-Proteins und des SSB-Proteins aus E. coli werden in Abb. 2D gezeigt. Die Testansatz-Bedingungen waren die, von denen von Anderen gezeigt wurde, dass sie den ausgedehnten Strangaustausch durch recA über Tausende von Basenpaaren fördern (zusammengefaßt in Radding, 1982, Ann. Review Genetics 16, 405-437). Es wurde beobachtet, dass 56 oder 38 bp-Homologie (Bahn 1 und 2) für die Bildung von verbundenen Molekülen durch recA ausreichend sind; es wurden 28% beziehungsweise 19% der linearen Duplexe zu verbundenen Molekülen umgewandelt. Es wurden jedoch keine verbundenen Moleküle beobachtet, wenn die Homologie auf 26 bp begrenzt wurde (Bahn 3). Bei ähnlichen Reaktionsbedingungen unter Verwendung vollständig homologer Substrate wurde beobachtet, dass recA im Wesentlichen alle der Duplexe zu Strukturen höherer Ordnung umwandelte. Bei diesem Testansatz ward die Ausrichtung von recA identisch zu der der eukaryotischen Rekombinasefraktionen, d. h. nur die Homologie am rechten Ende des linearen Duplex wurde durch das recA-Protein verwendet (vergleiche die Bahnen 1 und 5). Wie bei der menschlichen Rekombinasefraktion beobachtet wurde, wurden verbundene Moleküle wirkungsvoll mit EcoR I-linearisiertem pGEM-4, aber nicht mit Hind III-linearisiertem Duplex gebildet, wenn recA- und SSB- Proteine mit einzelsträngiger M13mp19-DNA inkubiert wurden. Gegenwärtig ist es unbekannt, warum die Polarität der Strangpaarbildung durch recA mit kurzen Homologiebereichen verschieden von der ist, die durch Andere mit Substraten, die umfassende gemeinsame Homologiebereiche besitzen, beobachtet wurde (zusammengefasst in Radding, 1982). Es wurde jedoch beobachtet, dass die Ausrichtung des Strangaustausches durch recA, nicht wie die der eukaryotischen Rekombinasen, Substrat-abhängig ist (Konforti und Davis, 1990, J. Biol. Chem. 265, 6916-6920).
Die Elektronenmikroskopie verbundener Moleküle, die durch recA gebildet wurden bestätigte, dass die Paarung eines linearen Duplex mit einer einzelsträngigen zirkulären DNA am Ende des Duplex stattfindet. Obwohl kein verdrängter Strang beobachtet wurde, war die Auflösung unzureichend, um die Konfiguration des dritten Stranges im Bereich der Paarung zu bestimmen. Darüber hinaus erforderte die Bildung verbundener Moleküle durch alle drei Rekombinasen die gleichzeitige Anwesenheit von sowohl der DNAs als auch der Rekombinaseproteine und war nicht auf exonucleolytischen Abbau des Duplex und anschließende Anlagerung der einzelsträngigen DNA zurückzuführen (siehe Abb. 6). Wenn einzelsträngige M13mp18-DNA und Hind III-linearisierte pGEM-4-DNA (56 bp Homologie) mit Rekombinase getrennt inkubiert wurden und darauf mit den behandelten Substraten zusammen 10 Min. bei 65ºC in Gegenwart von 1% SDS und 10% (Gew./Vol.) Polyethylenglycol zusammen inkubiert wurden, um die nicht-enzymatische Anlagerung zu fördern, wurden keine verbundenen Moleküle gebildet.

Beispiel 2. Ein neuartiger Testansatz für verbundene Moleküle

Eine Erklärung für die Stabilität dieser verbundenen Moleküle ist, dass der zirkuläre Einzelstrang unspezifisch am Platz gehalten wird oder durch den Duplex an der Verbindung der Bereiche der Homologie und der Nicht-Homologie "eingeklemmt" wird. Um diese und andere Formen des Einfangens auszuschließen, wurde ein neuartiger Testansatz entworfen, bei dem der Einzelstrang zwei Enden besitzt, sehr kurz ist und zu dem Duplex vollständig homolog ist. Weiterhin zeigt dieser Testansatz, dass die Erkennung kurzer Homologien nicht auf die Polylinker-Sequenz von M13mp18 beschränkt ist. Ein neuartiger Testansatz zur Bildung von verbundenen Molekülen zwischen einer linearen Duplex-DNA und einem 5'-³²P- markiertem Oligonucleotid, das identisch zu dem 3'-Ende eines Stranges des linearen Duplex ist, wird in Abb. 3A gezeigt. Die Bildung stabiler verbundener Moleküle wurde durch das Auftreten von Markierung überprüft, die an der Position der linearen Duplex-DNA in Agarosegelen wandert.
Es wurden stabile verbundene Moleküle zwischen linearer pdel-9-Duplex-DNA und einem Oligonucleotid von 33 Basen oder 20 Basen Länge durch die menschliche Rekombinasefraktion gebildet (Abb. 3B, Bahn 1 und 3). Es wurden keine verbundenen Moleküle mit einem 13 Basen langen Oligonucleotid (Bahn 5) oder mit einem nichthomologen Oligonucleotid gebildet. Etwa 50% des linearen Duplex in Bahn 1 wurde zu verbundenen Molekülen umgewandelt. Die Kontrollexperimente in den Bahnen 2, 4 und 6 zeigen, das die verbundenen Moleküle nicht durch Abbau des Duplex durch mögliche Exonucleasen in den Präparationen der Rekombinasefraktionen gebildet werden, wobei der Duplex-Strang exponiert wird, der sich an das Oligonucleotid anlagern könnte; wenn die beiden DNA-Substrate mit der Rekombinasefraktion getrennt inkubiert wurden und dann 10 Min. bei 65ºC in Gegenwart von SDS, um die Aktivität zu beenden, zusammen inkubiert wurden, wurden tatsächlich keine verbundenen Moleküle beobachtet. Es wurden keine verbundenen Moleküle gebildet, wenn ein Oligonucleotid verwendet wurde, das dem Negativ-Strang von pdel-9 entspricht, was die 3'-5'-Ausrichtung der menschlichen Reekombinasefraktion widerspiegelt, d. h. die Paarbildung des Oligonucleotids beginnt an dem 3'-Ende des nicht-komplementären Stranges des Duplex.

Beispiel 3. Hitzestabilität der verbundenen Moleküle

Wenn die von Protein befreiten verbundenen Moleküle mit kurzen Homologiebereichen, die vorstehend diskutiert wurden, einen verdrängten Strang besitzen würden, würde die Schenkelwanderung zur ihrer schnellen Dissoziation führen. Die Schenkelwanderung ist ein zufälliger Wanderungvorgang, bei dem in Abhängigkeit von der Geometrie der untersuchten DNAs die Zeit, die erforderlich ist, um ein Basenpaar zu durchlaufen zwischen 12-200 Mikrosekunden beträgt (Thompson et al., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2299-2303; Radding et al., 1977, J. Mol. Biol. 116, 825-839; Green und Tibbetts, 1981, Nucl. Acids. Res. 9, 1905-1918). Somit ist die Zeit, die erforderlich ist, um das Ende des Duplex zu erreichen, gleich dem quadrierten Abstand (56 bp) multipliziert mit der Zeit für einen Schritt (0,2 ms) geteilt durch 2 oder (anders gesagt) etwa 300 Millisekunden (Feller, 1957, Vol. 1. S. 325, John Wiley & Sons, New York). Überraschenderweise wurde beobachtet, dass diese deproteinisierten verbundenen Moleküle bei Zimmertemperatur über Stunden (> 10&sup4; Sek.) sehr stabil waren.
Die Stabilität der verbundenen Moleküle bei Zimmertemperatur spiegelt die Bildung zusätzlicher Wechselwirkungen zwischen dem dritten Strang und dem Duplex wider. Um die Stärke dieser Wechselwirkungen zu ermitteln und kovalente Wechselwirkungen (Bindungen) auszuschließen, wurde die Hitzestabilität der verbundenen Moleküle untersucht und mit den Stabilitäten von Teil-Duplex-Molekülen und Molekülen verglichen, die einer nichtenzymatischen Schenkelwanderung unterliegen können (siehe Abb. 4A). Die kurzen Duplexbereiche des Teil-Duplex-Moleküls I entsprechen in Sequenz und Länge genau den angenommenen gepaarten Bereichen der verbundenen Moleküle, die durch die Rekombinase zwischen linearen pGEM-4-Duplexen, die mit Hind III (56 bp), Sal I (38 bp), BamH I (26 bp) und Kpn I (13 bp) verdaut worden waren, und der einzelsträngigen Ml3mpl8-DNA, die in Abb. 2 gezeigt wird, gebildet wurden. Die Schenkelwanderungsstruktur II entspricht in Sequenz, Länge und Richtung der möglichen Schenkelwanderung den verbundenen Molekülen, die durch die Rekombinasen gebildet wurden (siehe Materialien). Die nichtenzymatische Schenkelwanderung würde zu der Verdrängung des ³²P-markierten Oligonucleotids führen. Bei diesem Testansatz fand die Verdrängung des angelagerten Fragments über Homologie-abhängige Schenkelwanderung statt, da keine Verdrängung eines ³²P-markierten Fragments beobachtet wurde, wenn das zweite Oligonucleotid eine 10 Basen lange Anlagerungssequenz enthielt, die an eine Sequenz, die zu dem Duplexbereich nicht homolog war, angeheftet worden war.
Repräsentative Daten aus dem Stabilitätsexperimenten für einen homologen Bereich von 38 bp in den verbundenen Molekülen, die zwischen Sal I-linearisiertem pGEM-4- und M13mp18-DNA gebildet wurden, werden in Abb. 4B gezeigt. Obwohl die Duplexe (58% G- C) nach 10 Min. bei 65ºC stabil waren und bei 75ºC schmolzen, dissoziierten die Schenkelwanderungsstrukturen nach 10 Min. bei 45ºC. Verbundene Moleküle, die durch die menschliche Rekombinasefraktion gebildet worden waren, waren nach 10 Min. bei 65ºC stabil und dissoziierten bei 75ºC. Dies stellt eine Differenz von 30ºC in der relativen Stabilität zwischen den verbundenen Moleküle, die durch die Rekombinase gebildet würden, gegenüber Schenkelwanderungsstrukturen mit identischer Länge, Sequenz und Richtung der Schenkelwanderung dar. Die schwache Bande, die langsamer als die verbundenen Moleküle in dem Ethidiumbromid-gefärbten Gel wandert, ist ein Dimer von pGEM-4, das durch eine verunreinigende Ligaseaktivität entstand.
Ähnliche Daten der Hitzestabilität für Duplexe, Schenkelwanderungsstrukturen und verbundene Moleküle, die durch die drei Rekombinasen bei vier unterschiedlichen Längen Homologie gebildet wurden, werden in Abb. 5 zusammengefaßt. Die verbundenen Moleküle waren äußerst stabil und dissoziierten bei Temperaturen, die 20 bis 30 Grad höher waren, als die der Schenkelwanderungsstrukturen. In allen Fällen befanden sich die beobachteten Schmelztemperaturen der Duplexe in enger Übereinstimmung mit den berechneten Tm Werten, die auf der Sequenzlänge und dem G-C-Gehalt basierten (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor). Darüber hinaus macht es die Beobachtung, dass die Dissoziationstemperaturen der verbundenen Moleküle zu der Länge der Homologie proportional sind, sehr unwahrscheinlich, dass eine kovalente Bindung für die Stabilität verantwortlich ist. Die verbundenen Moleküle wurden nicht durch unspezifisches Einfangen oder durch Einklemmen der DNA-Substrate, die sich aus der Verwendung großer, zirkulärer einzelsträngiger DNA ergibt, stabilisiert, z. B. ein verbundenes Molekül, das einen strukturellen Block gerade am Punkt des Austausches besitzt, der von normaler Duplex-DNA flankiert wird (siehe auch Abb. 3). Die verbundenen Moleküle, die durch die menschliche Rekombinasefraktion zwischen einem linearen M13mp18-Duplex und einem homologen ³²P- markierten Oligonucleotid, das 26 Basen lang ist, gebildet wurden, waren ebenfalls deutlich stabiler als die entsprechenden Schenkelwanderungsstrukturen. Die von Protein befreiten verbundenen Moleküle dissoziierten bei 55ºC wie die entsprechenden Duplexe (42% G-C), während die Schenkelwanderungsstrukturen bei Zimmertemperatur instabil waren (die Daten werden nicht gezeigt).
Die nicht-enzymatische Rekonstitution verbundener Molekülstrukturen wurde durchgeführt, um ihre Stabilität relativ zu verbundenen Molekülen, die durch Rekombinasen gebildet worden waren, zu untersuchen. Hitze-denaturierte lineares pGEM-4 und einzelsträngige M13mp18-DNA wurden bei neutralem pH-Wert oder bei einen pH-Wert von 5,5 (Voloshin et al., 1988, Nature 333, 475-476) bei Anwesenheit von 10 Gewichts-% Polyethylenglycol aneinander angelagert und auf Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Es wurden keine verbundenen Moleküle beobachtet. In ähnlicher Weise scheiterte die Anlagerung von hitze-denaturiertem linearem pdel 9 mit ³²P-markierten Oligonucleotiden bei der Bildung von stabilen verbundenen Molekülen.

Beispiel 4. Verbundene Moleküle, die stabil sind, besitzen drei intakte Stränge

Die überraschende Stabilität dieser verbundenen Moleküle könnte erklärt werden, wenn das 3'-Ende des Plus-Stranges des linearen Duplex exonucleolytisch abgebaut worden wäre und nur Heteroduplex-DNA in dem verbundenen Molekül verblieben wäre (siehe Abb. 1 oben). Das folgende Experiment zeigt, dass stabile verbundene Moleküle einen intakten dritten Strang (den Plus-Strang des Polylinkerbereiches) besitzen.
Testansätze für verbundene Moleküle unter Verwendung der HeLa- Rekombinasefraktion oder der reck- und SSB-Proteine wurden zwischen einzelsträngiger M13mp18-DNA und einem Fragment von pGEM-4 durchgeführt, das am äußeren 3'-Ende des Plus-Stranges des linearen Duplex mit 32P markiert worden war (Abb. 6A). Die Restriktionsenzym-Verdauansätze der markierten Duplexe bestätigten, das > 99% der ³²P- Markierung auf die 10 3'-terminalen Basen des Plus-Stranges des pGEM-4-Fragments beschränkt waren (siehe Methoden). Somit würde die Bildung von ³²P-markierten verbundenen Molekülen anzeigen, dass der dritte Strang intakt ist, da Heteroduplexe mit 9 bp oder weniger sehr instabil sind und es unmöglich ist, sie unter diesen Bedingungen wieder rückzugewinnen (vgl. Abb. 5). Da bei diesen Testansätzen 15-20% des markierten Duplex zu verbundenen Molekülen umgewandelt wird, müssen tatsächlich alle der ³²P-markierten verbundenen Moleküle intakte dritte Stränge besitzen. Die Hitzestabilität der ³²P-markierten verbundenen Moleküle, die durch recA gebildet wurden (Abb. 6B) war ein Anzeichen dafür, dass die Moleküle, die drei intakte Stränge besitzen, bei relativ hohen Temperaturen dissoziieren (vgl. Abb. 5). Die schnell wandernde untere Bande stellt den nichtenzymatischen Verlust der ³²P-Markierung aus dem ³²P-markierten Duplex dar, der bei höheren Temperaturen bei Abwesenheit des Rekombinaseproteins stattfindet.
Die Quantifizierung der relativen Stabilitäten der ³²P-markierten verbundenen Moleküle, die durch recA- und die HeLa-Rekombinasefraktion gebildet wurden, und die entsprechende 56 Basen lange Schenkelwanderungsstruktur werden in Abb. 6C gezeigt. Die ³²P-markierten verbundenen Moleküle, die durch die menschliche Rekombinasefraktion gebildet wurden, waren, ähnlich wie die, die durch das recA-Protein gebildet wurden, äußerst stabil. Diese Ergebnisse unter Verwendung eines verkürzten linearen pGEM-4-Duplex zeigten auch, dass die Stabilität der verbundenen Moleküle sich aus der Paarbildung ableitet, die ausschließlich auf den Homologiebereich im Polylinker am rechten Ende des linearen Duplex beschränkt ist.

Beispiel 5. Stabile verbundene Moleküle enthalten kein Protein

Eine mögliche Erklärung für die Stabilität der verbundenen Moleküle besteht darin, dass sie mit dem Rekombinaseprotein bei Anwesenheit von 1% SDS miteinander verbunden bleiben. Das Beispiel, das in Abb. 7 abgebildet ist, zeigt, dass den stabilen verbundenen DNA-Molekülen, die durch das recA-Protein gebildet wurden, jegliche gebundenen recA- Moleküle nach der Behandlung mit verschiedenen deproteinisierenden Mitteln fehlen. Verbundene Moleküle mit 56 bp Homologie wurden mit Proteinase K in Gegenwart von 1% SDS von Protein befreit und mit Phenol/Chloroform wie vorstehend beschrieben extrahiert. Die Menge an restlichem recA-Protein wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gegen das recA-Protein ermittelt (Abb. 7A). Identisch behandelte verbundene Moleküle wurden ebenfalls auf ihre Hitzestabilität hin untersucht und dissoziierten zwischen 75ºC und 85ºC (Abb. 7B).
Aufgrund der experimentellen Beschränkungen beim Nachweis des recA-Proteins durch Western-Blot-Analyse (0,1 ng oder 2,5 fmol, Abb. 7A, Bahn 5) und der Rückgewinnung der deproteinisierten verbundenen Moleküle (30 fmol, Abb. 7B, Bahn 3) wurde abgeschätzt, dass über 90% der verbundenen Moleküle kein recA-Protein enthielten (Abb. 7A, Bahn 6). Es wurden keine nachweisbaren recA-Polypeptide nach Silberfärbung beobachtet. Im Blot wurde kein recA beobachtet, das an der Position der recA-Polypeptide oder der einzelsträngigen oder der doppelsträngigen DNA wanderte.
Es wurde auch beobachtet, dass, sogar wenn aktive Rekombinasen anwesend waren, diese die Schenkelwanderung und die anschließende Dissoziation des DNA-Moleküls nicht störten. Die ³²P-markierte Teil-Duplex-Strukturen, die in Abb. 4A gezeigt werden, wurden bei 37ºC mit einem zweiten Oligonucleotid, das eine 10 Basen lange Anlagerungssequenz enthielt, bei Anwesenheit von recA- und SSB-Proteinen oder der HeLa-Rekombinasefraktion unter Testansatzbedingungen für verbundene Moleküle inkubiert. Es wurden die Schenkelwanderungsstrukturen gebildet, darauf erfolgte die Verdrängung des ³²P-markierten Oligonucleotids innerhalb von 10 Minuten.
Experimentelle Einzelheiten, die die Beispiele 6-12 betreffen.

RecA-Protein:

Gereinigtes recA-Protein aus E. coli wurde von Dr. Stephan C. Kowalczykowski, Northwestern University Medical School, zur Verfügung gestellt.

DNA-Substrate:

pBR322- und pUC18-Plasmid-DNA und die replikative Form der M13mp18-DNA waren von Pharmacia. Die Oligonucleotide wurden synthetisiert und durch Passage über eine Mono Q-Säule (Pharmacia) wie vorher beschrieben gereinigt (Hsieh und Camerini-Otero, J. Biol. Chem. 264: 5089 (1989)). Die Oligonucleotide wurden mit ³²P-gamma-ATP (New England Nuclear) und T4-Polynucleotidkinase (Pharmacia) wie vorher beschrieben 5'- endmarkiert (Hsieh und Camerini-Otero, J. Biol. Chem. 264: 5089 (1989).
Oligonucleotide, die zu dem Plus-Strang von pBR322 vollständig homolog waren (Abb. 11 und 14), überspannten die pBR322-Positionen 15-29, 10-29 und 4359-29 für die 15, beziehungsweise 20 und 33 Basen langen Oligonucleotide (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 49, 561 (1978)). Die 20L-Reihe der Oligonucleotide (Abb. 15) besaß am 3'-Ende unterschiedliche Grade der Homologie zu dem Plus-Strang von pBR322 und überspannte die Positionen 10-29, 20-29, 22-29, 24-29 und 26-29 für 20, beziehungsweise 10, 8, 6 und 4 Basen. Die 20R-Reihe (Abb. 15) besaß am 5'-Ende Homologie zu dem Plus-Strang von pBR322 und überspannte die Positionen 20-39, 20-29, 20-27. 20-25 und 20-23 für 20, beziehungsweise 10, 8, 6 und 4 Basen. Oligonucleotide, die zu dem Plus-Strang von pUC18 homolog waren (Abb. 10) überspannten die Positionen 230-285, 230-267, 230-255 und 230-249 für die 56, beziehungsweise 38, 26 und 20 Basen langen Oliogonucleotide (Norrander et al., Gene 26, 101 (1983)). Das 33 Basen lange Oligonucleotid, das zu den Positionen 4359-29 von pBR322 homolog war, wurde nicht an den Polylinkerbereich von pUC18 gepaart. Das 20 Basen lange Oligonucleotid, das in dem Experiment verwendet wurde, das in der Abb. 12 gezeigt ist, war zu den Positionen 248- 267 des Negativ-Stranges von pUC18 homolog. Die Oligonucleotide, die in Abb. 13 gezeigt werden, enthielten 56 Basen, die zu dem Plus-Strang von pUC18, der den Positionen 230-285 entspricht, homolog waren. Das 30 Basen lange Oligonucleotid, das zu dem Plus- Strang von M13mp18 homolog war (Abb. 16) überspannte die Positionen 6831-6860 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 (1985)). Die DNA-Konzentrationen werden als Mol Nucleotide oder durch das Gewicht ausgedrückt.

Bildung von synaptischen Komplexen:

Synaptische Komplexe wurden durch die Inkubation von 1,8 uM (15 ng) Oligonucleotid, 18 uM Duplex-DNA (150 ng) und 1,5 uM (1,5 ug) recA-Protein in einem Puffer, der 20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,4 mM Dithiothreit; 12,5 mM MgCl&sub2;; 0,3 mM ATP- gamma-S (Fluka) und 1, 1 mM ADP (Sigma) in einem Gesamtvolumen von 25 ul enthielt, bei 37ºC für 15 Min. gebildet. Nach der Bildung der synaptischen Komplexe wurden 10-20 Einheiten der geeigneten Restriktionsendonuclease (New England Biolobs) zugegeben und die Inkubation für weitere 5 Min. fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von SDS und EDTA bis zu Endkonzentrationen von 1% beziehungsweise 10 mM gestoppt. Die Reaktions(gemische) wurden auf 1%-igen Agarosegelen in 40 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 1 mM EDTA und 1 ug/ml Ethidiumbromid mit 0,6 V/cm über 14-16 Stunden bei Zimmertemperatur elektrophoretisch aufgetrennt. Die Quantifizierung wurde durch Vergleich der beendeten Testansätze mit 150 ng nicht-reagierter Duplex-DNA unter Verwendung einer densitometrischen Messung der Negative des Polaroid 665 durchgeführt. Der Grad der Rückgewinnung intakter Duplex-DNA bei den Testansätzen synaptischer Komplexe wurde mit einem Standard verglichen, der 150 ng nicht-reagierter Duplex-DNA enthielt. In einigen Fällen wurden die Testansätze synaptischer Komplexe durch die Zugabe von 1% SDS gestoppt und auf 1%-igen Agarosegelen in 89 mM Tris-Borat, pH 8,3, 5 mM MgCl&sub2; mit 0,6 V/cm über 14-16 h bei Zimmertemperatur elektrophoretisch aufgetrennt.

Deproteinisierte verbundene Moleküle:

Es wurden synaptische Komplexe wie oben beschrieben gebildet, mit der Ausnahme, dass 5'-³²P-markierte Oligonucleotide verwendet wurden. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS und EDTA gestoppt und wie beschrieben elektrophoretisch aufgetrennt. Dann wurden die Gele fixiert und auf Kodak XAR-2-Film exponiert. In einigen Fällen wurden die verbundenen Moleküle durch Behandlung mit Proteinase K (Boehringer Mannheim) und Phenol : Chloroform-Extraktion, wie vorher beschrieben, vor der Elektrophorese von Protein befreit (Hsieh et al., Genes Devel. 4, 1951 (1990)). Die Quantifizierung der verbundenen Moleküle wurde durch ein Rekonstitutionsexperiment durchgeführt, bei dem ein ³²P-markiertes 56 Basen langes Oligonucleotid an bekannte Mengen einzelsträngiger M13mp19-DNA bei 65ºC oder in Gegenwart von recA angelagert wurden. (Es wurden keine Unterschiede in der Wirksamkeit der Anlagerung beobachtet). Nach der Elektrophorese und der Autoradiographie wurden die relativen Intensitäten dieser angelagerten Standards mit denen von verbundenen Molekülen verglichen.

BEISPIEL 6

Die Bildung von synaptischen Komplexen und verbundenen Molekülen

Das experimentelle Schema zur Bildung von synaptischen Komplexen und stabilen verbundenen Molekülen durch recA ist in Abb. 9 dargestellt. Die Bildung von synaptischen Komplexen wird durch die Inkubation einer Duplex-DNA, wie einer supergeknäulten Plasmid-DNA, einem homologen Oligonucleotid und dem recA-Protein vollzogen. Das Oligonucleotid überspannt eine Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle in der Duplex-DNA. Die Bildung eines synaptischen Komplexes, der das recA-Protein, das Oligonucleotid und die Duplex-DNA umfaßt, macht den Duplex gegenüber Spaltung durch die Restriktionsendonuclease resistent. Der Abdruck (footprint) der Restriktionsendonuclease, der einem synaptischen Komplex entspricht, kann auf Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegelen als supergeknäulte Plasmid-DNA, die nach der Inkubation der Komplexe mit der geeigneten Restriktionsendonuclease verbleibt, sichtbar gemacht werden. Das recA- Protein kann von diesen synaptischen Komplexen durch Zugabe von EDTA und des Detergenz SDS abdissoziiert werden, und es ergeben sich von Protein befreite verbundene Moleküle, in denen das Oligonucleotid (5'-endmarkiert mit 32P) mit dem Duplex stabil gepaart ist. Die Anwesenheit von verbundenen Molekülen kann durch Testen des Erscheinens von ³²P-Markierung bestimmt werden, die in Agarosegelen an der Position der Duplex-DNA wandert.
Die Bildung von verbundenen Molekülen durch recA in Gegenwart von ATP und einem ATP-regenerierenden System wurde untersucht. Es wurde vorher beobachtet, dass unter diesen Reaktionsbedingungen stabile, deproteinisierte verbundene Moleküle durch recA zwischen einem linearen Duplex und einer einzelsträngigen zirkulären DNA, die weniger als 60 bp Homologie gemeinsam haben, gebildet wurden (Hsieh et al., Genes Devel. 4, 1951 (1990)). Es wurden stabile deproteinisierte verbundene Moleküle durch das recA-Protein zwischen supergeknäulter pUC18-DNA und einem homologen 56 Basen langen Oligonucleotid gebildet. Bei Anwesenheit von ATP-Hydrolyse wurden deproteinisierte verbundene Moleküle nach 1 Min. erhalten, waren aber sehr instabil; nach 3 Min. war die Hälfte der verbundenen Moleküle dissoziiert, und nach einer Inkubation von 15 Min. konnten keine deproteinisierten verbundenen Moleküle rückgewonnen werden. Wenn erst einmal die anfängliche Runde der Paarbildung und der Dissoziation stattgefunden hatte, erschien es so, dass der Duplex nicht mehr in der Lage war an weiteren Runden der Paarbildung teilzunehmen. Wegen der vorübergehenden Natur dieser Paarbildung war der Nachweis von Abdrücken der synaptischen Komplexe in Gegenwart von ATP nicht möglich. Es wurde beobachtet, dass der Ersatz von ATP mit einem nicht-hydrolysierbaren Analogon von ATP, ATP-gamma-S, und mit ADP das Einfrieren der Paarbildungsreaktion und die Anhäufung der Zwischenformen möglich machte.
Die Bildung von synaptischen Komplexen und stabilen verbundenen Molekülen durch das recA-Protein in Gegenwart von 0,3 mM ATP-gamma-S und 1,1 mM ADP wird in Abb. 10 gezeigt. Es wurden ³²P-markierte Oligonucleotide, die zu der Polylinkersequenz des pUC 18-Plasmids homolog waren, mit supergeknäulter pUC18- Plasmid-DNA in Gegenwart des recA-Proteins inkubiert, darauf erfolgte die Zugabe der Sac I-Restriktionsendonuclease. Wie in Abb. 10 A dargestellt ist, überspannten alle Oligonucleotide die einzige Sac I-Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle des pUC18- Plasmids.
Es wurden synaptische Komplexe mit 20 Basen Homologie gebildet, die das Oligonucleotid und die Duplex-DNA gemeinsam hatten (siehe Abb. 10B, Bahn 9). Die Quantifizierung der Menge der supergeknäulten DNA, die vor dem Verdau durch Sac I geschützt wurde, zeigte an, dass 70-75% der Duplex-DNA als synaptische Komplexe vorlagen, wenn das Oligonucleotid 56 oder 38 Basen Homologie besaß (Bahn 3 und 5). Bei 26 und 20 Basen Homologie wurden 55%, beziehungsweise 20% der Duplexe zu synaptischen Komplexen umgewandelt. Die Bildung der synaptischen Komplexe erforderte die Anwesenheit sowohl des recA-Proteins als auch des homologen Oligonucleotids. Eine Kontrolle in Bahn 1 zeigt an, dass die supergeknäulte DNA intakt blieb, wenn der Duplex mit dem Oligonucleotid und recA, aber ohne das Restriktionsenzym inkubiert wurde. Wie in Bahn 10 gezeigt wird, dehnte sich der Abdruck des synaptischen Komplexes nicht wesentlich über den Bereich des Duplexes aus, der kolinear mit dem Oligonucleotid verlief, da synaptische Komplexe keinen Schutz gegen die Spaltung durch Hind III verleihen, das an einer Stelle spaltet, die 14 bp von dem Bereich entfernt ist, den das 38-Basen Oligonucleotid überspannt. Darüber hinaus führt in diesem Testansatz ein nicht homologes Oligonucleotid nicht zur Bildung eines synaptischen Komplexes durch recA.
RecA kann verbundene Moleküle zwischen einem homologen ³²P-markierten Oligonucleotid und pUC 19-Plasmid-DNA bilden, die stabil sind, wenn sie von Protein befreit sind (Abb. 10C). Es sind nur 26 Basen Homologie zwischen dem Oligonucleotid und der Duplex-DNA für die Bildung von verbundenen Molekülen in diesem Testansatz nötig, wohingegen zwanzig Basen Homologie nicht ausreichen. Die Quantifizierung der Rückgewinnung stabiler verbundener Moleküle zeigt an, dass etwa 20-50% des pUC18- Duplex mit einem homologen 56 Basen langen Oligonucleotid gepaart wurde, wenn die Komplexe in TAE-Puffer (siehe Beschreibung der Abb. 10) elektrophoretisch aufgetrennt wurden. Wie für synaptische Komplexe beobachtet wurde, steigt die Wirksamkeit der Bildung verbundener Moleküle durch recA als Funktion der Länge der zur Paarbildung verfügbaren Homologie an. Diese deproteinisierten verbundenen Moleküle dissoziieren, wenn die superhelicale Spannung bei der Linearisierung an einer Restriktionsendonuclease- Schnittstelle gelöst wird die sich außerhalb des Bereiches der Paarbildung befindet (Abb. 10C, Bahn 10).
Die verbundenen Moleküle, die zwischen einer Duplex-DNA und einem Oligonucleotid gebildet werden, werden nicht durch restliches verbleibendes recA-Protein stabilisiert. Wenn die synaptischen Komplexe durch Behandlung mit SDS, Proteinase K und Phenol/Chloroform-Extraktion von Protein befreit wurden, blieb die Anzahl der wiedergewonnenen, stabilen verbundenen Moleküle unverändert.
Die Testansatzbedingungen, die zur Bildung von synaptischen Komplexen verwendet wurden, waren die, die sich als optimal bei der Bildung von verbundenen Molekülen mit 56 bp Homologie herausgestellt hatten. Die Bildung von verbundenen Molekülen zeigte ein scharfes Optimum bei einer Oligonucleotid-Konzentration von 1, 2 uM, wobei 0,9 uM Oligonucleotide keine verbundenen Moleküle ergaben; die Erhöhung der Oligonucleotid- Konzentration auf 1,8 uM ergab keine weitere Steigerung der Ausbeute an verbundenen Molekülen. Die Menge an recA, die bei diesen Testansätzen verwendet wurde (1,5 uM), ist in Bezug auf die Konzentration an einzelsträngigen Oligonucleotiden sättigend. Der schnelle Nachweis von synaptischen Komplexen und verbundenen Molekülen war von der Anwesenheit sowohl von ATP-gamma-S und ADP in einem molaren Verhältnis von 1 : 3 abhängig. Eine Veränderung des Verhältnisses von ATP-gamma-S zu ADP oder den Konzentrationen dieser beiden Kofaktoren verminderte die Wirksamkeit der Bildung sowohl der synaptischen Komplexe als auch der verbundenen Moleküle.
Es ist bekannt, dass zweiwertige Kationen für die Aktivität von recA in-vitro essentiell sind. Es wurde eine Untersuchung durchgeführt, um zu bestimmen, ob Mg²&spplus; erforderlich ist, um verbundene Moleküle zu stabilisieren. Es wurden synaptische Komplexe in Gegenwart von recA gebildet, wie in der Abb. 10 beschrieben. Die Reaktions(gemische) wurden nur durch die Zugabe von SDS von Protein befreit, und die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese in Agarosegelen untersucht, die 5 mM MgCl&sub2; enthielten. Obwohl die Rückgewinnung von verbundenen Molekülen bei Anwesenheit von Mg²&spplus; 2-4-fach höher ist als bei einer Elektrophoresese, die ohne Mg²&spplus; durchgeführt wurde, wurden keine qualitativen Unterschiede beobachtet, d. h. es wurden stabile verbundene Moleküle mit Oligonucleotiden gebildet, die 26 Basen, aber nicht solchen, die 20 Basen, Homologie aufwiesen.
Die Daten, die in Abb. 10 dargestellt werden, zeigen an, dass die Bildung synaptischer Komplexe bei Anwesenheit von ATP-gamma-S einen Zwischenschritt auf dem Weg darstellt, der zu der Bildung von stabilen, deproteinisierten verbundenen Molekülen führt. Die Bildung deproteinisierter verbundener Moleküle und synaptischer Komplexe, die recA enthalten, weisen eine Abhängigkeit von der Länge der Homologie auf, die für die Paarbildung verfügbar ist. Außerdem findet die Bildung sowohl von synaptischen Komplexen als auch von verbundenen Molekülen mit relativ hoher Wirksamkeit bei 56 Basen Homologie statt; das bedeutet, nach der Deproteinisierung dieser synaptischer Komplexe ist der größte Teil der Duplex-DNA-Moleküle in Gegenwart von Mg²&spplus; noch mit dem Oligonucleotid in stabilen verbundenen Molekülen gepaart.

BEISPIEL 7

Synaptische Komplexe, die lineare Duplex-DNA enthalten

Die superhelicale Spannung ist für die Bildung synaptischer Komplexe, die sehr kurze Homologiebereiche umfassen, nicht essentiell. Die Bildung synaptischer Komplexe umfaßt recA, einen linearen Duplex und ein homologes 33 Basen langes Oligonucleotid (Abb. 11A). Aus Abb. 11B ist schnell erkennbar, dass recA zwischen diesen beiden Substraten synaptische Komplexe bildet, die einen Schutz des linearen Duplex gegen die Spaltung durch Cla I zur Folge hat (Bahn 4). Bei Abwesenheit entweder von recA oder des Oligonucleotids (Bahn 2 beziehungsweise 6) oder bei Anwesenheit eines nichthomologen Oligonucleotids (Bahn 5) wurden keine synaptischen Komplexe gebildet.

BEISPIEL 8

Herstellen von Abdrücken (footprints) von synaptischen Komplexen

Das Ausmaß des Schutzes gegenüber der Spaltung durch Restriktionsendonucleasen, das einem synaptischen Komplex durch recA verliehen wird, wurde kartiert (Abb. 12). Ein 20 Basen langes Oligonucleotid, das zu einem Bereich in der Polylinkersequenz der pUC18-Plasmid-DNA homolog war, wurde in Gegenwart des supergeknäulten pUC18 und recA inkubiert, um die Bildung von synaptischen Komplexen zu ermöglichen. Der Schutz wurde an den Schnittstellen der Restriktionsendonucleasen BamH I, Kpn I, Pst I, Sac I und Sph I beobachtet. Die Spaltung durch EcoR I und Hind III war jedoch durch die Anwesenheit der synaptischen Komplexe nicht beeinträchtigt. Demgemäß dehnt sich der Abdruck des synaptischen Komplexes offensichtlich 13-14 Basen hinter die 5'-und 3'-Enden des gepaarten Oligonucleotids aus und ist symmetrisch.

BEISPIEL 9

Ausrichtung der Bildung des synaptischen Komplexes und der verbundenen Moleküle

Die offensichtliche Ausrichtung der Bildung von verbundenen Molekülen wird durch die Wahl des DNA-Substrates, der Länge der gemeinsamen Homologie und den relativen Stabilitäten der verbundenen Moleküle, die mit entgegengesetzten Polaritäten gebildet werden, beeinflußt (Konforti et al., J. Biol. Chem. 265, 6916 (1990); Rao et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88, 2984, (1991)). Deshalb wurde die Ausrichtung sowohl der Bildung synaptischer Komplexe als auch der Bildung verbundener Moleküle untersucht, die einen supergeknäulten Duplex und ein Oligonucleotid umfassen. Die Bildung synaptischer Komplexe, die 56 bp Homologie umfassen, zeigte keine Ausrichtung. Die synaptischen Komplexe wurden durch recA unabhängig von der Positionierung der homologen Sequenz im Hinblick auf die Enden des Oligonucleotids gebildet. Im Experiment in Abb. 13 wurde ein 56 Basen langes Oligonucleotid verwendet, das zu dem Polylinkerbereich von pUC18 homolog war, oder eines der verschiedenen anderen Oligonucleotide, die die gleiche Sequenz von 56 Basen plus 20 Basen nicht-homologer Sequenz am 5'-Ende, am 3'-Ende oder sowohl am 5'-Ende als auch am 3'-Ende des Oligonucleotids besaßen (Abb. 13A). In allen Fällen wurden synaptische Komplexe mit in etwa gleichen Wirksamkeiten gebildet (Abb. 13B, Bahnen 5, 7, 9, 11). Im Gegensatz dazu zeigte die Bildung von stabilen verbundenen Molekülen durch recA eine Polarität mit einer starken Präferenz für die Homologie am 5'-Ende des Oligonucleotids; die Anzahl der verbundenen Moleküle, die mit dem 76R-Oligonucleotid gebildet wurden, war halb so groß wie die mit dem 56 Basen langen Oligonucleotid (Abb. 13C, Bahn 2 und 6), wohingegen das 76L-Oligonucleotid (Bahn 4) oder das 96-Oligonucleotid (Bahn 8) zehnfach weniger verbundene Moleküle ergaben.

BEISPIEL 10

Minimale Strukturanforderungen zur Homologiesuche

Es wurden drei Oligonucleotide von 33, 15 oder 13 Basen Länge und mit Homologie zu einer pBR322-Sequenz (Abb. 14A) mit supergeknäulter pBR322-Plasmid-DNA in Gegenwart von recA inkubiert. Die möglichen Spaltstellen für das Oligomer von 15 Basen werden in der Abb. 14B gezeigt, und der Abdruck wird in Abb. 14C gezeigt. Das 15 Basen lange Oligomer besaß eine ausreichende Länge, um synaptische Komplexe zu bilden, wie durch den Widerstand gegenüber der Spaltung durch die Endonucleasen Hind III und Cla I belegt wird (Bahnen 4 und 7). Bei diesem Testansatz führte die Verwendung eines 33 Basen langen Oligomers zur Bildung synaptischer Komplexe, aber ein 13 Basen langes Oligomer tat dies nicht. Kontrollexperimente zeigen an, dass die Bildung von synaptischen Komplexen die Anwesenheit sowohl des Oligonucleotids als auch von recA erforderte. Der Abdruck des synaptischen Komplexes dehnte sich nicht in nennenswerter Weise hinter den Bereich der Paarbildung aus (siehe Abb. 14C, Bahn 10). Dieses Experiment zeigte auch, dass die Bildung synaptischer Komplexe durch recA nicht auf irgendeine besondere Sequenz beschränkt war, da recA homologe DNAs paarte, die entweder eine pUC18- (Abb. 10) oder eine pBR322-Sequenz (Abb. 11) enthielten.

BEISPIEL 11

Die Nucleation (Einleitung) der Paarbildung bezieht eine Hälfte einer Helixwindung des Nucleoprotein-Fadens mit ein

Um die minimale Homologie zu bestimmen, die durch recA in einem synaptischen Komplex erkannt wird, wurde eine Reihe von 20 Basen langen Oligonucleotiden verwendet, die unterschiedliche Grade der Homologie am 5'- oder 3'-Ende zu einem Bereich von pBR322 besaßen, der eine Cla I-Schnittstelle flankiert (siehe Tabelle I). Dieses Experiment bestimmt nicht nur die minimale Homologie, die durch recA in diesem Testansatz erkannt wird, sondern bestimmt auch endgültig, ob der Beginn der Paarbildung durch recA eine Ausrichtung aufweist. Die Ergebnisse, die in Abb. 15 gezeigt werden, zeigen an, dass recA bereits schon 8 Basen Homologie, entweder am 5'- oder am 3'-Ende paaren kann, allerdings mit niedriger Wirksamkeit (10% beziehungsweise 12%). Diese Ergebnisse belegen, dass die Schwellenwerte zur Bildung des Nucleoprotein-Fadens und der homologen Paarbildung verschieden sind, und dass entweder das 5'- oder das 3'-Ende einer einzelsträngigen DNA die Paarbildung einleiten kann. Um die Struktur zu bilden, die die Homologiesuche durchführen kann, sind fünfzehn Basen erforderlich, aber es müssen nur die Hälfte der Basen in dieser Struktur durch recA erkannt und gepaart werden. Tabelle 1. SEQUENZEN VON OLIGONUCLEOTIDEN, DIE ABNEHMENDE GRADE DER HOMOLOGIE ZU pBR322 BESITZEN
Die fettgedruckten Sequenzen entsprechen den Basen, die zu pBR322 homolog sind.
Die unterstrichenen Sequenzen entsprechen den Positionen der Clal- Restriktionsschnittstelle im Duplex.

BEISPIEL 12

Zielgerichtetes Anliefern eines Oligonucleotids durch recA

Es wurde eine Studie durchgeführt, um zu bestimmen, in welchem Ausmaß recA zwischen verschiedenen ähnlichen, aber unterschiedlichen Zielsequenzen, die sich innerhalb eines einzelnen Duplex-Moleküls befinden, unterscheiden kann. Die supergeknäulte replikative Form von M13mp18-DNA, die drei Nde I-Erkennungsstellen besitzt, wurde in Gegenwart von recA mit einem 30 Basen langen Oligonucleotid inkubiert, das die Nde I- Erkennungssequenz, sowie die benachbarte Sequenz aus einer der drei Nde I-Schnittstellen in M13mp18 (Schnittstelle I, siehe Abb. 16A) besaß. Die ausschließliche Bildung eines synaptischen Komplexes an der Schnittstelle I wurde durch das Erscheinen eines 6170 bp Fragmentes von M13mp18 nach dem Verdau der synaptischen Komplexe mit der Nde I- Endonuclease aufgezeichnet. Ein solches Fragment kann nur durch die Spaltung an den beiden Schnitttstellen II und III entstehen, (ohne dass) an der Schnittstelle I gespalten wird.
RecA war bei den meisten der DNA-Moleküle in der Lage, die Paarbildung ausschließlich an der Schnittstelle I zielzurichten (Abb. 16B, Bahn 5). Eine solches zielgerichtetes Ansteuern erforderte die Anwesenheit sowohl des - Oligonucleotids als auch von recA (Bahn 3 und 4). Die Anwesenheit eines 1080 bp Fragments in allen Proben, die mit Nde I inkubiert worden waren, ist eine Kontrolle für das Ausmaß der Spaltung durch Nde I an den beiden ungeschützten Schnittstellen II und III. Die Quantifizierung der Mengen jeder (Fragment)-Art in Bahn 5 zeigte an, dass der Grad der Unterscheidung durch recA zur Paarbildung an der Ziel-Schnittstelle I gegenüber den Schnittstellen II und III unter diesen Bedingungen etwa 7-8-fach beträgt.
Experimentelle Einzelheiten, die die Bespiele 13-15 betreffen.

Oligonucleotide:

Die Oligonucleotide wurden über eine FPLC Mono Q-Säule (Pharmacia) unter Verwendung eines NaCl-Gradienten von 100 mM bis 1 M in 20 mM NaOH gereinigt. Aliquote der Fraktionen, die die Maxima enthielten, wurden mit ³²P markiert und auf Polyacrylamidgelen laufen gelassen. Die saubersten Fraktionen wurden vereinigt, mit Ethanol gefällt und in Wasser gelöst. Die Konzentrationen wurden unter der Annahme bestimmt, dass 1 Einheit Optischer Dichte bei 260 nm 33 ug entspricht.

RecA:

Das recA-Protein wurde unter Verwendung eines Stammes und einer genauen Vorschrift, die freundlicherweise von Stephen Kowalczykowski von der Medical School der Northwestern University in Chicago zu Verfügung gestellt wurde, gereinigt. Der verwendete Stamm war JC12772 (Uhlin et al., J. Bacteriol. 148, 386 (1981)). Die Reinigung basierte auf dem Spermidin-Fällungsverfahren (J. Griffith et al., Biochemistry 24, 158 (1985)) und verwendete eine Einzelstrang-DNA-Agarosesäule mit ATP-Elution (Cox et al., J. Biol. Chem. 256, 4676 (1981)) und eine Mono Q-Säule, um verunreinigende Spuren von Nucleasen weitestgehend zu vermindern. Die Entfernung solcher Verunreinigungen ist wichtig, um unspezifische Einzelstrangbrüche in der DNA zu vermeiden. Die Konzentration des recA- Proteins wurde unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1%E&sub2;&sub8;&sub0; = 5,9 (Craig et al., J. Biol. Chem. 256, 8039 (1981)) gemessen.

BEISPIEL 13

Sequenzspezifische Spaltung von Lambda-DNA

Ein Beispiel für die sequenzspezifische Spaltung von Lambda-DNA an einer einzigen Stelle wird in Abb. 18 gezeigt. Die Länge der Lambda-DNA beträgt 48,5 kb und sie enthält 5 EcoR I-Schnittstellen (Daniels et al., in: Lambda II, Hendrix et al., Hrsg. (Cold Spring Harbor, N.Y. 1983), S. 519-678). Die Schnittstelle, die sich an der Nucleotidposition 31.747 befindet, wurde zur Spaltung ausgewählt, um Lambda in zwei Fragmente von 31,7 und 16,8 kb zu spalten. Ein 30 Basen langes Oligonucleotid, das zu dieser Position homolog war, wurde synthetisiert, und die Abb. 18B zeigt das Ergebnis der Spaltung unter Verwendung dieses Oligonucleotids. Die Bahn 1 zeigt ungeschnittene Lambda-DNA und die Bahn 2 zeigt ein Experiment mit vollständiger Spaltung.
Die Densitometrie der Bahn 2 zeigte, dass 79% der DNA in die beiden gewünschten Fragmente gespalten war, und dass 19% der DNA ungeschnitten blieb. Insgesamt 2% der DNA wurde an einer der vier anderen EcoR I-Schnittstellen geschnitten, die in der Lambda- DNA vorhanden sind, verursacht entweder durch unspezifischen Schutz gegenüber Methylierung durch das recA-Protein und den Oligonucleotid-Komplex oder unvollständige Methylierung. Die Kontrollen in den Bahnen 3, 4 und 5 zeigen das Ergebnis des Weglassens des recA-Proteins, beziehungsweise des Oligonucleotids oder der Methylase. Bemerkenswert ist, dass in Bahn 3 das Weglassen des recA-Proteins zu einer unvollständigen Methylierung führte, möglicherweise aufgrund der Hemmung der Methylase durch freie Oligonucleotide, die nicht mit dem recA-Protein bedeckt sind. Die Bahn 4 zeigt ebenfalls eine leicht unvollständige Methylierung, möglicherweise weil ein geringer unspezifischer Schutz durch freies recA-Protein auftrat, das an den Lambda-DNA-Duplex band. Diese Wirkung wurde in den Abb. 19 und 20, bei denen eine Titration des Oligonucleotids durchgeführt wurde, viel deutlicher beobachtet.

BEISPIEL 14

Sequenzspezifische Spaltung der DNA aus E. coli

Experimentelle Einzelheiten:

Der Wildtyp-Stamm W3110 von E. coli wurde aus der American Type Culture Collection bezogen und wurde über Nacht in Luria-Bertani-Nährmedium bis zu einer Optischen Dichte (OD) von 5 bei 600 nm angezogen. Es wurden 5 ml Zellen sedimentiert (30 mg Feuchtgewicht), einmal mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,2), 20 mM NaCl und 100 mM EDTA gewaschen und in 1 ml dieses Puffers resuspendiert. Die Suspension wurde auf 65ºC erhitzt und zu 1 ml 1,6%-iger niedrig-schmelzender Agarose (InCert Agarose, FMC Bioproducts) und 4 ml Paraffinöl bei 65ºC zugegeben. Durch kräftiges Mischen der Suspension wurden Mikrokügelchen mit 25 bis 100 um Durchmesser wie beschrieben (M. McClelland, Methods Enzymol. 155, 22 (1987)) erzeugt. Die Kügelchen wurden mit Lysozym und Proteinase K unter Verwendung des ImBed-Kits nach den Vorschriften des Herstellers (New England Biolabs) verdaut. Andere Lysozym- und Proteinase K-Präparate lieferten gleich gute Ergebnisse. Die Kügelchen wurden bei 4ºC aufbewahrt und wurden bei 50 mM EDTA für 30 Min. inkubiert und kurz vor Gebrauch in 25 mM Tris-Acetat (pH 7,5), 4 mM Mg-acetat, 0,4 mM Dithiothreitol und 0,5 mM Spermidin äquilibriert.

Ergebnisse:

Die Anwendung der Spaltreaktion auf die DNA von E. coli wird in Abb. 19 gezeigt. In diesem Fall wird ein Oligonucleotid-Paar zugegeben, um ein Fragment durch Spaltung an zwei Stellen zu erhalten. Es wurde ein großes Fragment erzeugt, um die Stärke des Verfahrens zu untersuchen. Wie in Abb. 19A gezeigt wird, war ein Oligonucleotid homolog zu dem uvrB-Gen und das andere zu dem topA-Gen. Die Oligonucleotide überspannten EcoR I-Schnittstellen in jedem dieser Gene. Die beiden Gene liegen auf dem Chromosom 520 kb voneinander entfernt (Rudd et al., Nucl. Acids Res. 18, 313 (1990)), und es befinden sich mindestens 67 EcoR I-Schnittstellen zwischen diesen beiden Zielsequenzen (Kohara et al., Cell 50, 495 (1987)). Abb. 19B zeigt die erwartete Bande von 520 kb. Es wurde ein ziemlich scharfes Optimum der Oligonucleotidkonzentration bei 5 Nucleotidresten pro recA-Protein beobachtet (Bahn 2). Dies war bei der Southern-Blot-Analyse in Abb. 19C noch deutlicher erkennbar. Die Densitometrie des Blots ergab eine Fragmentausbeute von 40%. Wie bei der Spaltung der Lambda-DNA bestand bei niedrigeren Oligonucleotidkonzentrationen ein unspezifischer Schutz vor Methylierung durch das recA- Protein, und das 520 kb-Fragment wurde in kleinere Fragmente gespalten. Bei höheren Oligonucleotidkonzentrationen wurde das 520 kb-Fragment ebenfalls in kleinere Fragmente gespalten, wie man aus den Ergebnissen mit der Lambda-DNA in Bahn 3 der Abb. 18B erwarten konnte. Ein identisches Muster mit einem Optimum bei 5 Nucleotidresten pro recA- Protein-Monomer wurde beobachtet, wenn die Länge der Oligonucleotide von 30 auf 60 Basen erhöht wurde, nur in diesem Fall erhöhte sich die Ausbeute des (5)20 kb-Fragments auf 60%. Die Ausbeuten von 40 und 60% für die verschiedenen Oligonucleotidpaare entsprechen minimalen Schneidewirksamkeiten (Schnittausbeuten) an einer Schnittstelle von 63, beziehungsweise 77%. Dies liegt nahe an der Schneidewirksamkeit (Schnittausbeute) für Lambda-DNA, die 79% betrug.
Bei bestimmten Anwendungen könnte die Sequenzinformation auf beiden Seiten einer EcoR I-Schnittstelle schwer zu ermitteln sein. Daher wurde die Fragmentausbeute gemessen, wenn sich die EcoR I-Erkennungssequenz GAATTC am 5'- oder am 3'-Ende eines Oligonucleotidpaars befand, statt in der Mitte, wie in der vorangegangenen Untersuchung. Wenn sich die Erkennungssequenz am 5'-Ende der Oligonucleotide (30 Basen Länge) befand, fiel die Ausbeute zwei- bis vierfach. Wenn sich die Sequenz am 3'-Ende befand, fiel die Ausbeute noch einmal zweifach.

BEISPIEL 15

Sequenzspezifische Spaltung menschlicher DNA

Experimentelle Einzelheiten:

Kügelchen, die DNA aus HeLa-Zellen enthielten, wurden durch zweimalige Waschung von 1 · 10&sup8; Zellen (150 mg Feuchtgewicht) mit phosphatgepufferter isotonischer Kochsalzlösung hergestellt und wie in Beispiel 9 für die E. coli-Kügelchen weiter verarbeitet, mit der Ausnahme, dass der Verdau mit Lysozym weggelassen wurde.

Ergebnisse:

Die Spaltreaktion wurde mit ähnlichem Erfolg an menschlicher DNA durchgeführt. Da der Genort (Locus) für die Cystische Fibrose (CF) ausführlich kartiert und sequenziert worden ist (Rommons et al., Science 245, 1059 (1989); Riordan et al., Science 245, 1066 (1989); Zielenski et al., Genomics 10, 214 (1991)), wurde er als ein Genort verwendet, um das Verfahren zu testen. Die Abb. 20A stellt eine einfache schematische Darstellung des CF-Genortes dar. Im Intron 1 befindet sich eine EcoR I-Schnittstelle, und ist 180 kb von einer anderen EcoR I-Schnittstelle im Exon 19 entfernt. Es befinden sich mindestens 41 weitere EcoR I-Schnittstellen in diesem 180 kb-Bereich genomischer DNA (Rommons et al., Science 245, 1059 (1989)). Ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel wird in Abb. 20B gezeigt, und zeigt wie die Bildung kleinerer Fragmente auftrat, wenn die Oligonucleotidkonzentration erniedrigt wurde. Dieses Muster war gut reproduzierbar und konnte als Richtschnur verwendet werden, um die optimale Konzentration an Oligonucleotiden ohne Southern-Blot- Analyse herauszufinden. Der Southern-Blot des Gels ist in Abb. 20C dargestellt. Die höchste Fragmentausbeute wurde in Bahn 3 (86%) gefunden. Eine geringere Ausbeute (32 %) wurde in Bahn 2 gefunden, aber der Hintergrund der Spaltung in Bahn 2 war viel niedriger als in Bahn 3. Daher war die DNA des 180 kb-Bereiches in Bahn 2 vermutlich am stärksten mit der DNA des CF-Genorts angereichert. Eine Kontrolle, die in Bahn 5 gezeigt wird, stellt das 270 kb-Fragment dar, das durch Verdau mit Sfi I entsteht (Rommons et al., Science 245, 1059 (1989)). Es konnte ebenfalls ein vorhergesagtes Fragment von 48 kb durch spezifische Spaltung in den Exons 13 und 19 erzeugt werden.
In Abb. 20C wurde auch bemerkt, dass in den Bahnen 3-6 das 180 kb-Fragment weiter in kleinere Fragmente zerlegt wurde. Diese Fragmente wurden wahrscheinlich durch eine spezifische Spaltung im Intron 1 oder im Exon 19 und eine unspezifische interne Spaltung des Fragmentes erzeugt. Da die verwendete Sonde 50 kb von der Schnittstelle im Exon 19 entfernt ist, hybridisierten keine Fragmente mit geringerer Länge als 50 kb, obwohl sie vermutlich vorlagen.
Die gesamten Inhalte aller vorstehend zitierten Literaturstellen sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung wurden in einigen Einzelheiten zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses beschrieben. Eine Person, die mit dem Fachgebiet vertraut ist, wird verstehen, dass vielfältige Veränderungen in der Form und in den Einzelheiten vorgenommen werden können, ohne von dem eigentlichen Schutzbereich der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung des Spaltens eines doppelsträngigen DNA- Moleküls an einer spezifischen Stelle, die Schritte umfassend:

1) Inkontaktbringen eines homologen Rekombinations-Proteins mit einem doppelsträngigen DNA-Molekül und einem einzelsträngigen DNA- Molekül, das ausreichend komplementär zu einem Teil des doppelsträngigen DNA-Moleküls ist, um damit zu hybridisieren, wobei das Inkontaktbringen unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen das einzelsträngige DNA-Molekül mit dem doppelsträngigen DNA- Molekül hybridisiert, so daß eine DNA-Triplex gebildet wird, wobei, wenn die Hybridisierung stattfindet, jeder Strang der DNA- Triplex mit mindestens einem anderen Strang der DNA-Triplex hybridisiert ist,

wobei an ein Ende des einzelsträngigen DNA-Moleküls eine Spaltungseinheit angebracht ist, wobei das Ende zu der spezifischen Schnittstelle benachbart ist; und

ii) Unterwerfen der Spaltungseinheit unter Bedingungen, so daß die Spaltungseinheit das Spalten an der spezifischen Schnittstelle bewirkt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Protein ein bakterielles oder Bakteriophagen-Protein ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Protein E. coli recA ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Rekombinations-Protein eine eukaryontische Rekombinase ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Rekombinase-Protein ein menschliches Rekombinase-Protein ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Spaltungseinheit ein Chelatbildner ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Spaltungseinheit ein Licht-aktivierter Farbstoff ist.

8. Verfahren zum Durchführen des Spaltens eines doppelsträngigen DNA- Moleküls, das mindestens zwei Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen enthält, an einer ersten der Stellen durch ein Restriktionsenzym, das spezifisch für diese Stellen ist, umfassend:

i) Inkontaktbringen eines Rekombinations-Proteins mit dem doppelsträngigen DNA-Molekül und einem einzelsträngigen DNA- Molekül, wobei das einzelsträngige DNA-Molekül ausreichend komplementär zu einem Teil eines Strangs des doppelsträngigen DNA-Moleküls ist, das die erste der Restriktionsendonuclease- Erkennungsstellen einschließt, um damit zu hybridisieren, wobei das Inkontaktbringen unter Bedingungen durchgeführt wird, so daß das einzelsträngige DNA-Molekül mit dem doppelsträngigen DNA- Molekül an der ersten der Restriktionsendonuclease- Erkennungsstellen hybridisiert, so daß ein dreisträngiges DNA-Molekül gebildet wird;

ii) Modifizieren der mindestens einen anderen der Stellen, um sie so zu verändern, daß sie vor dem Restriktionsenzym geschützt ist;

iii) Dissoziation des einzelsträngigen DNA-Moleküls von dem doppelsträngigen DNA-Molekül; und

iv) Spalten des aus Schritt (iii) folgenden doppelsträngigen Moleküls an der ersten der Restriktionsstellen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Inkontaktbringen des Schritts (i) in Gegenwart von ATP-gamma-S und ADP durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei ATP-gamma-S und ADP während des Inkontaktbringens von Schritt (i) in einem molaren Verhältnis von etwa 1 : 3 vorliegen.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei ADP während des Inkontaktbringens von Schritt (1) mit einer Konzentration von etwa 1, 1 mM vorliegt.

12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei ATP-gamma-S während des Inkontaktbringens von Schritt (i) mit einer Konzentration von etwa 0,3 mM vorliegt.

13. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Inkontaktbringen von Schritt (i) in Gegenwart von Mg²&spplus; und Spermidin durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Magnesiumkonzentration 4 mM beträgt.

15. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Inkontaktbringen von Schritt (i) in Gegenwart von Mg²&spplus; durchgeführt wird.