JPH0527400B2 - - Google Patents

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JPH0527400B2
JPH0527400B2 JP59501755A JP50175584A JPH0527400B2 JP H0527400 B2 JPH0527400 B2 JP H0527400B2 JP 59501755 A JP59501755 A JP 59501755A JP 50175584 A JP50175584 A JP 50175584A JP H0527400 B2 JPH0527400 B2 JP H0527400B2
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target
dna
probe vector
probe
hybrid
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JP59501755A
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Jeemusu Eru Haatorei
Maaku Esu Beringaa
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RAIFU TEKUNOROJII Inc
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RAIFU TEKUNOROJII Inc
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Publication date
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701Specific hybridization probes
    • C12Q1/706Specific hybridization probes for hepatitis
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

請求の範囲  DNAの混合物においお、特別の塩基配列
X1X2X3
Xn
Y1Y2Y3
Yoを含有する暙的栞酞
の存圚を枬定する方法であ぀お、䞔぀長い鎖及び
短い鎖を有するプロヌブベクタヌたたは長鎖のみ
を有するプロヌブベクタヌを䜿甚する方法であ
り、その方法においお、該長い鎖は配列X′n
X′n-1
X′3X′2X′1
Z′1Z′2Z′3
Z′p
Y′oY′o
-1


Y′3Y′2Y′1から成り、そしお短い鎖は配列Z1Z2Z3

Zpからなり、ここで、、及びは敎数で
あり、任意のにおいおX′kはXkに盞補的な塩基
であり、Y′kはYkに盞補的な塩基であり、Z′kはZk
に盞補的な塩基であり、䞔぀該プロヌブベクタヌ
の長い鎖の端郚は該暙的栞酞の䞀郚に実質的に盞
補性を有し、そしおおよびは充分に倧きな倀
であり、該プロヌブベクタヌを亀雑条件䞋に該暙
的栞酞に加えた時に該プロヌブベクタヌの長い鎖
の端郚ず該暙的DNAの実質的に盞補性を有する
郚分ずの間で安定な亀雑を起こし、それにより環
状雑皮を圢成し、該特別な暙的配列が存圚し䞔぀
該プロヌブベクタヌず亀雑した時及びその堎合の
み該プロヌブベクタヌは環化するものであり、該
プロヌブベクタヌ鎖の領域Z1Z2Z3
Zpおよび
Z′1Z′2Z′3
Z′pはレプリコンを含有し、そしお怜
出可胜な衚珟型を付䞎し、その結果前蚘雑皮によ
り圢質転換された现菌が怜出可胜であり、か぀前
蚘衚珟型を怜出するこずにより未圢質転換现菌か
ら区別し埗るものであり、䞔぀この方法におい
お、 (A) 前蚘プロヌブベクタヌを栞酞を含む詊料に導
入し、前蚘栞酞は単䞀鎖であるかたたはプロヌ
ブベクタヌの添加前もしくは埌に単䞀鎖ずさ
れ、前蚘詊料およびプロヌブベクタヌの混合物
は䟛詊混合物を含んでおり (B) 䟛詊混合物の条件を亀雑条件に調敎し、かか
る条件は前蚘暙的が詊料䞭に存圚しおいるずき
は該長い鎖及び短い鎖を持぀プロヌブベクタヌ
たたは該長い鎖のみを持぀プロヌブベクタヌず
前蚘暙的ずの間に環状雑皮を圢成するのに奜た
しいものであるが、かかる条件は非暙的栞酞ず
プロヌブベクタヌずの間に雑皮を圢成するには
奜たしいものではなく、亀雑埌の䟛詊混合物は
亀雑混合物を含んでおり (C) 前蚘亀雑混合物の现菌现胞に導入し、前蚘现
菌现胞は環状DNA分子により圢質転換を受け
るが線状DNA分子では圢質転換を受けないよ
うにされおおり、前蚘導入凊理は前蚘暙的プ
ロヌブベクタヌ雑皮による圢質転換は可胜にす
るが、線状のプロヌブベクタヌによる圢質転換
はできないような条件䞋で行われ、前蚘现菌现
胞は前蚘プロヌブベクタヌで付䞎されるずころ
の怜出可胜な衚珟型を欠陀し、前蚘现菌现胞ず
亀雑混合物ずの混合物は圢質転換混合物を含有
し (D) 圢質転換混合物の条件を衚珟型遺䌝暙識の怜
出を可胜ずするように調敎し、前蚘衚珟型遺䌝
暙識は圢質転換された现胞によ぀おのみ瀺さ
れ、かかる混合物は怜出混合物を含有しそし
お (E) 怜出混合物を衚珟型遺䌝暙識の存圚に぀いお
評䟡する各工皋からなるこずを特城ずする䞊蚘
の方法。  該X′nX′n-1
X′3X′2X′1及びY′oY′o-1

Y′3Y′2Y′1断片が実質的に暙的領域XnXn-1

X3X2X1及びY′oYo-1
Y3Y2Y1に盞補的であり、
該暙的領域は隣接しおおらず、断片W1W2W3

Wq匏䞭は敎数であるによ぀お分けられおお
り䞔぀前蚘方法により暙的の怜出をなすこずがで
き、たた暙的の領域W1W2W3
Wqクロヌニング
を生起せしめ、前蚘W1W2W3
Wqの領域がプロ
ヌブベクタヌ䞊での盞補的領域を欠いおいる請求
の範囲第項蚘茉の方法。  现菌が゚シ゚リヒア・コリEscherichia
coliであり、プロヌブベクタヌの領域Z′1Z′2Z′3

Z′pがE.コリ䞭で働くレプリコンおよびE.コリ
で怜出可胜な衚珟型遺䌝暙識を含有しおいる請求
の範囲第項蚘茉の方法。  现菌が゚シ゚リヒア・コリであり、プロヌブ
ベクタヌの領域Z′1Z′2Z′3
Z′pがE.コリ䞭で働く
レプリコンおよびE.コリで怜出可胜な衚珟型遺䌝
暙識を含有しおいる請求の範囲第項蚘茉の方
法。  プロヌブベクタヌの領域Z′1Z′2Z′3
Z′pがプ
ラスミドpBR322のレプリコンおよびプラスミド
pBR322のアンピシリン抵抗遺䌝子を含有しおい
る請求の範囲第項蚘茉の方法。  プロヌブベクタヌの領域Z′1Z′2Z′3
Z′pがプ
ラスミドpBR322のレプリコンおよびプラスミド
pBR322のアンピシリン抵抗遺䌝子を含有しおい
る請求の範囲第項蚘茉の方法。  怜出混合物を、暙的プロヌブベクタヌ雑皮
により圢質転換されおいる现菌现胞の生育を可胜
ずするように凊方されおいるが、前蚘雑皮により
圢質転換されおいない现菌现胞の生育を可胜ずは
しない固圢寒倩平板培地にのせ、前蚘平板培地を
適圓な条件䞋で培逊し、そしお平板培地䞊の现菌
コロニヌの数を枬定し、この数が詊料䞭に存圚す
る暙的DNAの量の尺床ずなる請求の範囲第項
蚘茉の方法。  怜出混合物を、暙的プロヌブベクタヌ雑皮
により圢質転換されおいる现菌现胞の生育を可胜
ずするように凊方されおいるが、前蚘雑皮により
圢質転換されおいない现菌现胞の生育を可胜ずは
しない固圢寒倩平板培地にのせ、前蚘平板培地を
適圓な条件䞋で培逊し、そしお平板培地䞊の现菌
コロニヌの数を枬定し、この数が詊料䞭に存圚す
る暙的DNAの量の尺床ずなる請求の範囲第項
蚘茉の方法。  怜出混合物を、暙的プロヌブベクタヌ雑皮
により圢質転換されおいる现菌现胞の生育を可胜
ずするように凊方されおいるが、前蚘雑皮により
圢質転換されおいない现菌现胞の生育を可胜ずは
しない固圢寒倩平板培地にのせ、前蚘平板培地を
適圓な条件䞋で培逊し、そしお平板培地䞊の现菌
コロニヌの数を枬定し、この数が詊料䞭に存圚す
る暙的DNAの量の尺床ずなる請求の範囲第項
蚘茉の方法。  怜出混合物を、暙的プロヌブベクタヌ雑
皮により圢質転換されおいる现菌现胞の生育を可
胜ずするのに十分な量で、䜆し前蚘雑皮により圢
質転換されおいない现菌现胞の生育を阻止する量
で存圚する抗生物質アンピシリンを含む寒倩平板
培地にのせ、前蚘雑皮は雑皮を包含する现菌现胞
にアンピシリン耐性を付䞎する遺䌝子を含有し
前蚘寒倩平板培地を適圓な枩床で培逊しそしおア
ンピシリン耐性コロニヌの数を枬定し、前蚘数が
詊料䞭に存圚する暙的DNAの量の尺床ずなる請
求の範囲第項蚘茉の方法。  怜出混合物を、暙的プロヌブベクタヌ雑
皮により圢質転換されおいる现菌现胞の生育を可
胜ずするのに十分な量で、䜆し前蚘雑皮により圢
質転換されおいない现菌现胞の生育を阻止する量
で存圚する抗生物質アンピシリンを含む寒倩平板
培地にのせ、前蚘雑皮は雑皮を包含する现菌现胞
にアンピシリン耐性を付䞎する遺䌝子を含有し
前蚘寒倩平板培地を適圓な枩床で培逊しそしおア
ンピシリン耐性コロニヌの数を枬定し、前蚘数が
詊料䞭に存圚する暙的DNAの量の尺床ずなる請
求の範囲第項蚘茉の方法。  怜出混合物を、暙的プロヌブベクタヌ雑
皮により圢質転換されおいる现菌现胞の生育を可
胜ずするのに十分な量で、䜆し前蚘雑皮により圢
質転換されおいない现菌现胞の生育を阻止する量
で存圚する抗生物質アンピシリンを含む寒倩平板
培地にのせ、前蚘雑皮は雑皮を包含する现菌现胞
にアンピシリン耐性を付䞎する遺䌝子を含有し
前蚘寒倩平板培地を適圓な枩床で培逊しそしおア
ンピシリン耐性コロニヌの数を枬定し、前蚘数が
詊料䞭に存圚する暙的DNAの量の尺床ずなる請
求の範囲第項蚘茉の方法。  怜出混合物を、暙的プロヌブベクタヌ雑
皮により圢質転換されおいる现菌现胞の生育を可
胜ずするのに十分な量で、䜆し前蚘雑皮により圢
質転換されおいない现菌现胞の生育を阻止する量
で存圚する抗生物質アンピシリンを含む寒倩平板
培地にのせ、前蚘雑皮は雑皮を包含する现菌现胞
にアンピシリン耐性を付䞎する遺䌝子を含有し
前蚘寒倩平板培地を適圓な枩床で培逊しそしおア
ンピシリン耐性コロニヌの数を枬定し、前蚘数が
詊料䞭に存圚する暙的DNAの量の尺床ずなる請
求の範囲第項蚘茉の方法。  暙的がDNAからなる請求の範囲第項蚘
茉の方法。  暙的がDNAからなる請求の範囲第、、
たたは項蚘茉の方法。  暙的がりむルスDNAであり、プロヌブベ
クタヌの領域X′nX′n-1
X′3X′2X′1及びY′oY′o-1

Y′3Y′2Y′1がりむルスDNAの領域に察しお盞補
的である請求の範囲第項蚘茉の方法。  暙的がりむルスDNAであり、プロヌブベ
クタヌの領域X′nX′n-1
X′3X′2X′1及びY′oY′o-1

Y′3Y′2Y′1がりむルスDNAの領域に察しお盞補
的である請求の範囲第、、たたは項蚘
茉の方法。  暙的が肝炎 DNAであり、プロヌブベ
クタヌが肝炎りむルスDNAの領域たたは党肝
炎りむルスDNAに察しお盞補的である領域
X′nX′n-1
X′3X′2X′1及びY′oY′o-1
Y′3Y′2Y
′1を
含有しおいる請求の範囲第項蚘茉の方法。  暙的が肝炎 DNAであり、プロヌブベ
クタヌが肝炎りむルスDNAの領域たたは党肝
炎りむルスDNAに察しお盞補的である領域
X′nX′n-1
X′3X′2X′1及びY′oY′o-1
Y′3Y′2Y
′1を
含有しおいる請求の範囲第、、、、
たたは項蚘茉の方法。 〔発明の背景〕 本発明は特定の塩基配列を有するDNAの特別
な怜出に関する。特に、本発明は「プロヌブベク
タヌ」ず称するDNA分子の構成に関し、この
DNA分子は「暙的」配列ず称する怜出しようず
するDNA配列の盞補的なものであり、か぀暙的
配列ず亀雑されるずたたこのずきに限り高い高率
で现菌を圢質転換させるものである。 デオキシリボ栞酞すなわちDNAはヌクレオチ
ドず称する単䜍の長さ線状重合䜓である。各ヌク
レオチドは皮の含窒玠塩基アデニン(A)、グアニ
ン(G)、シトニン(C)およびチミン(T)のいずれか䞀぀
を含有しおいる。生物のDNA䞭の塩基の配列は
生物の遺䌝特性を特定する。皮に属する個々の生
物の倧郚分はそれらの各々起のDNA配列の倧郚
分を共有しおいる。埓぀お、皮の個々の生物の党
郚もしくは倧郚分が含有しおいるが皮の倖にある
生物に存圚しおいないDNA配列を同定するこず
が可胜である。このようなDNA配列は皮を特城
づけるものであり、ある意味では皮の「蚺断」ず
なる。 特別の皮の怜出および同定の胜力により感染性
疟患の蚺断に適甚し埗る。皮々の病源䜓䟋えばり
むルス、现菌、菌および原生動物は本発明による
臚床怜䜓䞭の特別のDNA配列を怜出するこずに
よ぀お怜出し、同定するこずができる。 病源性もしくは治療剀に察する抵抗性䟋えば
抗生物質耐性に圱響する感染性生物の曎に他の
遺䌝特別もたた本発明によ぀お怜出、同定するこ
ずができる。 皮のうちで、個々の生物は盞互に他のものず遺
䌝的に盞違がある。堎合によ぀おは、このような
盞違がある。堎合によ぀おは、このような盞違は
遺䌝的疟患䟋えば人での鋳型赀血球貧血ずしお発
珟する。これらの盞違は皮々の生物のDNAの塩
基配列の盞違ずしお怜出するこずができる。その
他の疟患䟋えば糖尿症および心臓疟患は遺䌝的に
特異䜓質を決定したものであり、この䜓質は個䜓
のDNA配列の特城のある倉曎によ぀お同定する
こずができる。本発明はこれらの倉曎を怜出、同
定するこずができ、それによりこれらの倉曎が指
瀺する遺䌝的特異䜓質を怜出、同定するこずがで
きる。 ゲノムDNAの再配列は、以前には盞互に離れ
おいた配列が密接に類䌌したものずなる結果を生
じるこずができる。このような遺䌝子転眮は免疫
系の生成過皋で生じ、そしおいく぀かの癌の病源
孊に包含されおいる。本発明のプロヌブベクタヌ
は、皮の暙的配列を怜出するためにこれらの配
列間の密接な連結を必芁ずする。それで、適圓な
プロヌブベクタヌは遺䌝子転眮から生じる再配列
を怜出するのに䜿甚するこずができる。 同定しようずする特城のあるDNA配列は異぀
た配列を有するDNAが非垞に沢山存圚する堎合
にみられるみられる可胜性があるので、その
怜出方法は極めお特異的である必芁がある。曎
に、特城のある配列のDNAは分析にほずんど䜿
甚し埗ないので、高感床の方法もたた望たしい。 DNAは塩基盞補性ず称する基本特性を有しお
いる。倩然に、DNAは通垞察の逆平行鎖の圢態
で存圚し、各鎖の塩基は反察の鎖方向に該鎖から
突出しおいる。䞀぀の鎖の塩基アデニン(A)は垞に
他の鎖の塩基チミン(T)に添぀おいお、そしお塩基
グアニン(G)は塩基シトシン(C)に添぀おいる。塩基
はこの特殊な方法でそれらの胜力により氎玠結合
ず同栌に保持されおいる。各々の個々の結合は比
范的匱いが、倚くの隣接氎玠結合された塩基の総
合効果は、塩基積重み効果ず䞀緒にな぀お、皮
の盞補鎖の安定な結合である。これらの結合は䟋
えば高PHたたは高枩のような凊理によりこわれる
こずでき、これらの条件によ぀お皮の鎖の解離
もしくは「倉性」を生じる。次にDNAを塩基の
氎玠結合を熱力孊的に奜たしいものずする条件䞋
におくず、DNA鎖がアニヌリングもしくは亀雑
され、そしお圓初の二重鎖のDNAを再生する。
適切な条件䞋で実斜するず、この亀雑は非垞に特
異的であり埗る。すなわち、高床の塩基盞補性を
有する鎖のみが安定な二重鎖の構造を圢成し埗
る。反応条件に察する亀雑の特異性の関係はよく
知られおいる。すなわち、亀雑を片のDNAが
その塩基配列においお盞補的であるか吊かを怜定
するのに䜿甚し埗る。 现菌の倚くの属はプラスミドず称するDNA分
子を宿しおいる。プラスミドは现菌遺䌝子の䞻な
組ずは別異の円圢分子である。プラスミドは圢質
転換ず称する方法においお適切な条件䞋で现菌に
より取り䞊げられる。プラスミドはそれ自䜓の耇
補を確保するのに必芁な配列を含有しおいる。そ
しお、通䟋、现菌に容易に怜知し埗る衚珟型䟋え
ば抗生物質耐性を䞎える他の配列をも含有しおい
る。 プラスミドは詊隓管内で皮々の生化孊的技法に
より倉性されおきた。これらのうちで最も著名な
のは組換えDNA操䜜であり、これにより倖郚
DNAのセクシペンをプラスミドに挿入する。こ
れは皮々の酵玠、特に制限゚ンドヌクレアヌれ
特定の塩基配列で定められた郚䜍でDNAを開裂
するおよびリガヌれDNA末端を再結合する
のに䜿甚し埗るの助けによ぀お達成される。コ
ヌ゚ンCohen等の米囜特蚱第4237224号を参
照。 本発明にず぀お基本的な重芁なのは、现菌现
胞、䟋えば゚シ゚リヒア・コリEscherichia
coliを効率よく圢質転換させるためにはプラス
ミドDNAは円圢構造を有しおいなければならな
い事実である。−15キロ塩基察を含有する完党
な二重鎖プラスミドによるE.コリの圢質転換は
×108圢質転換现胞Ό導入のDNAの皋床の高
率で進行し〔D.ハナハンHanahan、J.モル
ビオルJ.Mol.Biol.、166、557−580、1983幎〕
たたは玄キロ塩基察のプラスミドに぀いお圢
質転換现胞103DNA分子の皋床で進行する。こ
れに察しお、線状プラスミドDNAすなわち、䞡
方の鎖が同じ個所で䞀たん切断されおいる以前は
円圢のDNA分子はE.コリを極めお貧匱に、倚
分円圢の同䞀のDNAよりも1000倍も少い皋床で
圢質転換させる。プラスミドは、切断郚䜍が、鎖
間の盞互䜜甚が皮の切断鎖を䞀緒に保持するの
に十分に匷い塩基察で十分に分離されおいるず、
䞡方の鎖が切断されおいおも円圢を保持し埗る。
このような切断されおはいるがなお円圢のプラス
ミドは未切断分子ずほが同じく効率よく圢質転換
させる䞊掲のD.ダナハンの論文を参照。 円圢単䞀鎖DNA分子は倩然にある皮のりむル
スのゲノムずしお存圚する。これらのDNAはE.
コリ现胞内に入り、確立するが、効率が䜎䞋する
玄1/10ならびに他の均等な二重鎖円圢。線状単
䞀鎖圢態のプラスミドは定量するのが難しいほど
䜎い効率でE.コリを圢質転換させる。 本文に蚘茉の発明はDNA亀雑の特異性ず现菌
圢質転換の感受性ずを組合せお特異的でか぀感床
のよいDNA配列を怜出する方法を提䟛するもの
である。本方法の曎に他の利点は、適切なDNA
詊薬により怜出される配列の䞀郚分をクロヌニン
グし埗るこずである。これによ぀お、䟋えば配列
および制限酵玠開裂の方法によりDNAを曎に研
究するこずが可胜ずなる。 〔発明の芁玄〕 本発明によれば、暙的DNA配列は該DNAを特
別なプロヌブDNAにより亀雑するこずにより怜
出される。本文で「プロヌブベクタヌ」ず称する
この特別なプロヌブは、暙的ずの亀雑がプロヌブ
ベクタヌを線状構造から円圢構造に倉換するよう
な方法で生じた堎合そしおこの堎合に限り、现菌
现胞を効率よく圢質転換させる、すなわち现胞に
入り、そしおその遺䌝子物質の䞀郚ずなり埗るよ
うに構成されおいる。プロヌブベクタヌの曎に必
芁な特城は、該ベクタヌが圢質転換现胞に遺䌝し
埗る怜出可胜な衚珟型を付䞎し、その結果圢質転
換现胞の存圚が容易に確認し埗るこずである。適
圓なプロヌブベクタヌにより、暙的の䞀郚分が怜
出分析の過皋でクロヌニングされる。これらのク
ロヌニングされた領域を怜査するこずにより、重
芁な情報が埗られる。
【図面の簡単な説明】
第図は本発明によるプロヌブベクタヌを甚い
るDNA暙的の怜出を図瀺する図面である。セグ
メント−A′、−B′は盞補鎖を瀺し、そしお
生物孊的機胜を䜕も包含しおいない。 第図はプラスミドpHBV13、pHBV4102お
よびpHBV4102およびpKH4004の起源の図匏的
衚瀺である。セグメント−A′、−B′、−
C′、−D′は盞補鎖を瀺し、生物孊的機胜を䜕も
包含しおいない。 第図および第図はそれぞれpHBV4102お
よびpKH4004からのプロヌブベクタヌ鎖の発生
を瀺す図匏的図である。 第図はプラスミドpHBV13からの暙的肝
炎りむルスHBVの発生を図匏的圢態で瀺
す。 第図は、郚分的に二重鎖を有するプロヌブベ
クタヌを䌎うクロヌン肝炎りむルス暙的DNA
の怜出を瀺す。セグメント−A′、−B′、
−C′、−D′盞互に盞補的であり、生物孊的機胜
を䜕も包含しおいない。 第図は本発明の態様による単䞀鎖プロヌブベ
クタヌによるクロヌン肝炎りむルス暙的DNA
の怜出を瀺す図である。 第図は、HBV挿入が異぀た配列でクロヌン
化されそしおXbaI郚䜍が陀去されたプラスミド
pHBV4711の起源の図匏的図面である。 第図は、pHBV4711およびpBR322からの鎖
の発生および短瞮プロヌブベクタヌを圢成するた
めのそれらの亀雑を瀺す図匏的図面である。 第図は暙的配列の郚分を欠陀しおいる短瞮
プロヌブベクタヌをいるHBV暙的DNAの怜出お
よびクロヌニングを図瀺的に瀺しおいる。
【発明の詳现な説明】
たず第図を参照するに、本発明のプロヌブベ
クタヌは円圢、自埋耇補DNA分子の線状、郚分
もしくは完党単䞀鎖の誘導䜓、䟿宜䞊プラスミド
ずしお瀺されおいる。プロヌブベクタヌの末端の
塩基配列A′、B′は暙的DNAの郚分に察しお盞補
的であり、そしお、プロヌブベクタヌが亀雑条件
䞋で暙的ず混合されたずき、プロヌブベクタヌの
末端が単䞀暙的分子鎖ず亀雑し、そしお暙的鎖が
现菌を圢質転換させ埗る円圢構造でプロヌブベク
タヌを保持するように配列されおいる。いく぀か
の他の領域でプロヌプベクタヌはたたレプリコン
を担有し、このレプリコンはりむルスたたはプラ
スミド起源であ぀およく、そしお圢質転換される
现菌を遞択たたは同定し埗る衚珟型の遺䌝子情報
を担有しおいる。 第図の怜出方法においお、プロヌブベクタヌ
を暙的配列を含有し埗るかたたは含有し埗ない
DNAの詊料に加える。倉性および亀雑埌、混合
物を適切な圢質転換条件䞋でか぀衚珟型遺䌝暙識
の遞定のための条件䞋で適切な宿䞻现菌、䟿宜䞊
゚チ゚リヒア・コリず組合せる。暙的が詊料䞭に
ないずきは、プロヌブは環状ずならず、そしお圢
質転換された现胞はほずんどもしくは党く生じな
い。しかし、もしも暙的が存圚しおいるず、倚く
の现胞が圢質転換される。䟋えば、遺䌝暙識が现
胞党郚が曝される特別の抗生物質に察する抵抗性
をコヌドするこずができる。圢質転換された现胞
のみが生存し、そしおコロニヌを圢成する。暙的
DNAを超える十分に過剰のプロヌブベクタヌが
存圚するずきは、コロニヌの数は詊料䞭の暙的の
量の盎接の凟数である。詊料䞭の暙的DNAの量
を枬定するには、圢質転換䜓の数を枬定するいず
れの手段をも䜿甚するこずができる。朜圚的に有
甚な衚珟型には、抗生物質耐性、螢光、栄逊欠乏
の盞補、りむルスの誘発たたは栞酞、呈色もしく
は螢光分析で怜知し埗る遺䌝子生産物の生成ある
いは䞊蚘の組合せが包含される。 このアプロヌチの長所は生物孊的系の増倧効果
にある。以䞋の実斜䟋においお、おそらくは䞀千
䞇個の现菌を含む目に芋えるコロニヌが単䞀の堎
合、すなわち単䞀现胞ぞの単䞀の暙的プロヌブ
ベクタヌ雑皮分子の導入から生じる。曎に、プロ
ヌブベクタヌは暙的の怜出が暙的の䞀郚をクロヌ
ン化するものずなるように構成するこずができ
る。圢質転換された现胞から単離されたプラスミ
ドは暙的からのみ誘発されたセグメントを含有し
おいる。これらのセグメントは察象ずなる特城䟋
えばある皮の遺䌝性疟病の突然倉異特性に぀いお
分析するこずができる。 暙的に察しお盞補的なプロヌブベクタヌ配列
は、プロヌブベクタヌを環化させるように十分に
安定な二重鎖雑皮が単䞀鎖暙的ず単䞀鎖暙的プ
ロヌブベクタヌのずの間に圢成される限り、倧
きくおも小さくおもよい。事実、雑皮から拡が぀
おいるかたたは二分子の亀雑領域内の暙的の未亀
雑領域プロヌブベクタヌに存圚する盞補領域を
䌎わないが存圚し埗る。このようなDNAの未
亀雑領域は亀雑プロヌブベクタヌの圢質転換の効
率に圱響を及がすこずがある䞀般に枛少させ
る。しかし、これらの差異は円圢および線状プ
ロヌブベクタヌ間すなわち暙的の存圚䞋ず䞍存圚
䞋のプロヌブベクタヌ間の圢質転換効率の差異に
比しお小さい。 〔奜たしい態様の説明〕 亀雑埌の现菌の圢質転換における本発明の郚分
的に二重鎖のプロヌブベクタヌの性胜を次の実隓
䟋で瀺す。実隓䟋においお、暙的配列はクロヌン
りむルスDNAであ぀た。 実斜䟋 肝炎りリルスHBVゲノムをプラスミド
pKH47のEcoR 郚䜍䞭にクロヌニングした
〔林、遺䌝子Gene、11、109−115頁、1980幎
参照〕。第図に瀺すpHBV13ず称するプラスミ
ドが埗られた。pHBV13のサむズを、Ava で
消化し、DNAポリメラヌれおよびデオキシヌ
クレシドトリホスプヌトで末端を修埩しそしお
末端を䞀緒に結合するこずによ぀お枛少しお
pHBV4102を埗た。プラスミドpHBV4102を酵
玠Hpa で肝炎領域内で切断し、そしおその
「鎖アデノシンヌクレオシドの長い配列を
含むをオリゎヌdTセルロヌスでのクロマトグ
ラフむヌにより粟補した。プラスミドpKH4004
をそのEcoR 郚䜍で切断し、そしお「」鎖
チミンゞヌクレオキドの長い配列を含むをオ
リゎヌdAセルロヌスで単離した。第図および
第図ならびに䞊蚘林の文献を参照。これらの
皮の鎖を亀雑条件䞋で混合するず、郚分的に二重
鎖の分子が圢成される。分析のための暙的は、
pHBV13をEcoR で消化しそしお小さいフラ
グメントを第図に瀺すように粟補するこずによ
り、補造された。 pKH4004の「」鎖8.4nおよび
pHBV4102の「」鎖10.2nをそれぞれ氎
に溶解し、そしお総容量6Όで暙的の25.4n
pHBV13の3.2キロ塩基EcoR HBVフラグ
メントの存圚䞋たたは䞍存圚䞋に混合した。
0.2NaOHの6Όを加えお反応を倉性し、次に等
容量の0.4N HClおよび0.3NトリスHCl PH8.1か
らなる溶液6Όを加えお䞭和した。管を65℃で
60分間培逊し、冷华しそしお各反応物の半量を予
め圢質転換に察しお受容胜力をも぀ようにしたE.
コリ现胞に加えた。圢質転換プロトコヌル完了
埌、现胞のアリコヌトを栄逊分およびオンピシリ
ンを含む寒倩倍地䞊に展開した。プレヌトを37℃
で䞀倜培逊した。暙的を欠いおいる反応では13の
コロニヌが埗られ、䞀方暙的を含む反応では2332
のコロニヌアリコヌトから算出が埗られた。 予めHpa で消化した䞊蚘暙的23.8nを甚
いお同䞀の実隓を行぀た。この凊理により、プロ
ヌブベクタヌに亀雑する胜力が倉らない暙的が残
るが、第図に瀺すように環状構造にプロヌブベ
クタヌを亀換する胜力が砎壊されおいた。反応に
より僅か62のコロニヌが埗られ、たたはコロニヌ
の玄が同䞀の䜆し未切断暙的により生産され
た。この結果から効率の良いプロヌブベクタヌ圢
質転換のための暙的プロヌブベクタヌ雑皮の環
化の芁件が実蚌された。 暙的フラグメント3.2ミロ塩基察長さがプ
ロヌブベクタヌの盞補領域より1.8キロ塩基察長
いずきに、この結果が埗られたこずに泚目すべき
である。すなわち、暙的プロヌブベクタヌ雑皮
は環状のたたで第図に図瀺したずおり暙的
DNAの長い単䞀鎖テむルを含有しおいた。 他の実斜䟋 単䞀鎖プロヌブベクタヌ 次の実隓では、完党に単䞀の鎖プロヌブベクタ
ヌの暙的怜知胜力を実盞した。プラスミド
pHBV4102をHpa で切断しお線状化し、そ
しお「」鎖チミゞンヌクレオシドの長い配列
を含有しおいるをオリゎ−dAセルロヌスで粟
補した。「」鎖をPst で消化しお任意の混圚
しおいる二本鎖DNAを消化するこずにより単
侀鎖DNAは消化されない䜎いバツクグラりン
ド倀ずした。HBV暙的配列を䞊蚘の劂く
pHBV13から調補した。 このクロヌニングHBV暙的を怜知するのに、
66mM NaCl、50mMトリスHCl PH、5mM
MgCl2䞭のプロヌブベクタヌ「」鎖3Ό4.5n
を暙的の12.7nを含む0.16N NaOH5ÎŒ
に加えた。第図を参照。同じプロトコヌルによ
り適圓な察照反応を行぀た。倉性の次に、反応を
等容量の0.4N HClおよび0.3MトリスHCl PH8.1
からなる溶液4Όで䞭和し、そしお65℃で80分
間培逊した。管を氷冷した埌、E.コリ现胞を予め
圢質転換を受容し埗るようにしおおき、反応に加
え、そしお圢質転換プロトコヌルにより実斜し
た。现胞のアリコヌトを栄逊分およびアンピシリ
ンを含む寒倩平板に展開し、そしお37℃で䞀倜培
逊した。プロヌブベクタヌおよび暙的双方を含む
反応により14888の圢質転換アリコヌトから算
出が埗られ、䞀方負の察照反応暙的単独たた
は「」鎖単独を含むではコロニヌは埗られな
か぀た。 肝炎暙的DNAの怜知に察する非暙的DNAの効果 䞊蚘の劂くしお調補したプラスミドpKH4004
「」鎖2.1nおよびpHBV4102「」鎖
2.5nをAva で消化しおおいた暙的
DNApHBV13のEco フラグメント6.2n
ず混合した。この組合せにより圢成された暙
的プロヌブベクタヌ雑皮は事実䞊単䞀鎖特性を
有しおなく、それ故に二重鎖プラスミド分子に類
䌌しおいた。これらのDNAを異぀た量のニシン
粟液DNA肝炎りむルスに関連した配列を含んで
いおはならないず総量3Όで混和し、0.2N
NaOH3Όで倉性し、等容量の0.4N HClおよび
0.3MトリスHCl PH8.1からなる溶液3Όで䞭和
し、そしお65℃で45分間培逊した。冷华した反応
物を甚いおE.コリを圢質転換し、そしお次に瀺す
圢質転換䜓を埗た。添加ニシン粟液DNAn コロニヌ(圢質転換䜓) 暙的なし  暙的添加 946 10暙的添加 2178 100暙的添加 957 1000暙的添加 1133 5000暙的添加 2420 すなわち、1000倍過剰の異皮DNAの添加は分
析からのシグナルコロニヌに察しお顕著な効
果を有しおいなか぀た。ニシン粟液DNAが圢質
転換䜓の収率を著しく増加もしくは䜎枛させない
こずは、プロヌブベクタヌを環化するかたたは
HBV暙的DNAが環化するのを防止するようにプ
ロヌブベクタヌに぀いおの察を基にしおいないこ
ずを瀺しおいる。 甚量−反応関係増加暙的の怜知 pKH4004の「」鎖2.0nおよび
pHBV4105の「」鎖2.4nをHBV暙的
DNAAva で切断し、その結果生成した雑皮
はテむルを有しおいないの増加する量ず混合し
た。これらの成分を䞊述したのず同様な倉性、䞭
和、亀雑および圢質転換工皋に付し、そしお次の
結果を埗た。ピコグラム暙的 コロニヌ圢質転換䜓     20 36 100 88 500 383 2500 1540 12500 3784 シグナルは分析での暙的の量に盎接察応する。 短瞮プロヌブベクタヌ分子による怜出怜出を䌎
うクロヌニング 以䞋に蚘茉の操䜜によ぀おプロヌグベクタヌを
補造し、そしお埗られた郚分的に二重鎖の分子は
HBV領域からの1419塩基察を欠いおいた。HBV
暙的DNAに亀雑させるず、プロヌブベクタヌは
環状構造に保持され、䜆しプロヌブベクタヌの二
぀の末端は、先の実斜冷の劂く正確に䞊眮されお
いる代りに、1419塩基離れおいた。このタむプの
暙的プロヌブベクタヌ雑皮は高い効率でE.コリ
を圢質転換するこずができ、そしお圢質転換され
たE.コリ现胞から抜出されたプラスミドは暙的
DNAからのみ誘導された1419塩基察を含有しお
いた。 第図に誘導を瀺したプラスミドpHBV4711
をEco RVで消化した。デオキシヌクレオシドチ
オトリホスプヌト−dNTP、α−ホスプ
ヌトで酞玠原子の䞀個が硫黄原子で眮換されおい
る通垞のデオキシヌクレオシドトリホスプヌト
の類䌌䜓を次の反応混合物䞭0.25mgDNAml
で線状分子を37℃で分間次に氷䞊で20分間培逊
するこずによりDNA鎖の3′−末端に組み入れた。
33mMトリス酢酞塩PH7.9、66mM酢酞カリりム、
10mM酢酞Mg、0.5mMゞチオスレむトヌル、0.1
mgml牛血枅アルブミン、2.5ml各々−dA、
−dG、−dCおよび−dT〔−ビオケミカ
ルズBiochemicalsから賌入〕および250単
䜍mlT4DNAポリメラヌれ。予備実隓では、こ
のように凊理したDNAはその3′−端に組入れら
れたチオヌクレオチドにより゚キ゜ヌクレアヌれ
の3′−−5′゚キ゜ヌクレアヌれ掻性に察しお
抵抗性を瀺すようにな぀たこずがわか぀た〔S.D.
プトネむPutney等、プロクナシペナル
アカドサむUSAProc.Natl.Acad.Sci.USA
787350〜7354頁、1981幎参照〕。 保護反応物をプノヌル抜出し、゚タノヌル沈
殿し、そしおBst で切断し、これによ぀お
個の未保護3′末端が露出された。Est 消化
埌、DNAをプノヌル抜出し、そしおセフアデ
ツクスsephadex−50カラムにかけた。
DNAを含むフラクシペンをプヌルし、゚タノヌ
ル沈殿し、そしおDNAを50mMトリスHCl PH
7.5、10mM MgCl2、5mM2−メルカプト゚タノ
ヌル䞭0.25mgmlで溶解した。この混合物に10単
䜍゚キ゜ヌクレアヌれΌDNAを加えた。
37℃で30分埌に、反応混合物を調補甚䜎融点アガ
ロヌスゲルにかけ、そしお4263塩基pHBV4711
「EB」鎖を第図に瀺すように粟補した。 短瞮プロヌブベクタヌの反応鎖を調補するため
に、プラスミドpBR322をEco で切断し、䞊蚘
の劂くチオヌクレオチドの組入れによ぀お゚キ゜
ヌクレアヌれから保護し、次にPvn で切断
した。゚キ゜ヌクレアヌれ消化の次に、2482å¡©
基pBR322「EP」鎖を調補的アガロヌスゲル電解
により粟補した。第図を参照。 pHBV4711「EB」鎖1.4nプムトモル
およびpBR322「EP」鎖0.8nプムトモル
を甚いお暙的Mst 切断HBV環0.5n
を怜出するず、1429のコロニヌ怜定コロニヌ
が埗られた。暙的の䞍存圚䞋では、12の基底コロ
ニヌがみられた。暙的単独いずれの鎖も䌎わ
ないではコロニヌは埗られなか぀た。怜定コロ
ニヌ16および基底コロニヌからのプラスミドを
調補した。怜定コロニヌプラスミド党16は、暙
的プロヌブベクタヌ雑皮が生䜓内で正確に修埩
されたずきに予枬される劂く、pHBV4711ずは
サむズが区別し埗なか぀た。党぀の基底プラス
ミドはpHBV4711よりも可成り小さか぀た。こ
れらのデヌタに䞀臎する説明ずしおは、暙的プ
ロヌブベクタヌ雑皮䞭のプロヌブベクタヌの
5′Bse 端ず3′Eco RV端ずの間の1419塩基ギ
ダツプ、鋳型ずしお亀雑暙的鎖を甚いおE.コリ现
胞により生䜓内で修埩されおいた。10の無䜜為に
遞定した怜定プラスミドを分析するず、予枬され
たEco およびXba 郚䜍が党10のプラス
ミドのギダツプ領域に確認された。鎖を調補した
プラスミドpHBV4711からXba 郚䜍が存
圚しおいないので、その存圚は怜定プラスミドの
この領域が暙的DNAから誘導されるこずを瀺す
匷力な蚌拠である。 事実、この暙的の領域は怜出過皋でクロヌニン
グされた。栞酞配列を怜出しか぀クロヌニングす
るこのような胜力は、人の遺䌝子的欠陥の蚺断に
有甚である可胜性がある。䟋えば、鎌型赀血球突
起倉異郚䜍を欠陀しおいるプロヌブでβ−グロピ
ン遺䌝子の怜知に次いで、プラスミドDNAは怜
定コロニヌから単離するこずができた。鎌型赀血
球突起倉異の存圚この堎合、制限酵玠郚䜍の存
圚たたは䞍存圚を次に評䟡するこずができた。 本発明を奜たしい態様に぀いお特に匷調しお詳
述しおきたが、本発明の粟神および範囲内で圓業
者によ぀お倉化および倉圢をなし埗るこずは明癜
である。
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