BRPI0618152A2 - métodos para avaliar a resistência ao carrapato em um animal bovino e para selecionar um animal bovino com resistência ao carrapato aumentada dentre uma população de animais bovinos, superfìcie ou substrato sólido, kit para avaliar a resistência ao carrapato em um animal bovino, e, sonda de oligonucleotìdeo, iniciador ou par de iniciadores - Google Patents

Abstract

<b>MéTODOS PARA AVALIAR A RESISTêNCIA AO CARRAPATO EM UM ANIMAL BOVINO E PARA SELECIONAR UM ANIMAL BOVINO COM RESISTêNCIA AO CARRAPATO AUMENTADA DENTRE UMA POPULAçãO DE ANIMAIS BOVINOS, SUPERFìCIE OU SUBSTRATO SóLIDO, KIT PARA AVALIAR A RESISTêNCIA AO CARRAPATO EM UM ANIMAL BOVINO, E, SONDA DE OLIGONIJCLEOTìDEO, INICIADOR OU PAR DE INICIADORES<d> Um método para avaliar a resistência aos carrapatos em um animal bovino, compreendendo as etapas de: (1) prover um ácido nucleico do animal bovino; (2) ensaiar quanto à ocorrência de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) identificado em qualquer uma das SEQ ID NO~ s~: 1 a 210, em que a identificação da referida ocorrência de nucleotídeo é associada com a resistência aumentada aos carrapatos no animal.

Description

"MÉTODOS PARA AVALIAR A RESISTÊNCIA AO CARRAPATO EMUM ANIMAL BOVINO E PARA SELECIONAR UM ANIMAL BOVINOCOM RESISTÊNCIA AO CARRAPATO AUMENTADA DENTRE UMAPOPULAÇÃO DE ANIMAIS BOVINOS, SUPERFÍCIE OU SUBSTRATOSÓLIDO, KIT PARA AVALIAR A RESISTÊNCIA AO CARRAPATO EMUM ANIMAL BOVINO, E5 SONDA DE OLIGONUCLEOTÍDEO,INICIADOR OU PAR DE INICIADORES"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção diz respeito a métodos e sondas de ácidonucleico para determinar a resistência ao carrapato em gado bovino. Osmétodos da invenção são úteis na seleção do gado bovino quanto à resistênciaao carrapato.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Os marcadores de DNA para resistência ao carrapato (aresistência do hospedeiro do gado vacum Bos taurus ao carrapato Boophilusmicroplus) do gado bovino têm sido principalmente dirigidos ao ComplexoPrincipal de Histocompatibilidade e embora algumas associações sugestivasentre a resistência ao carrapato e os marcadores de DNA tenham sidorelatadas, nenhuma destas foram convertidas em um teste genético,principalmente por causa da inconsistência e do efeito de pequenasproporções. Além disso, a hereditariedade da resistência ao carrapato é baixaa moderada, dependendo da raça e da experiência, o que torna a procura demarcadores de DNA para seleção dos traços, de alguma importância, se ocontrole da infestação dos carrapatos por meios genéticos tiver de seralcançado em um período razoável de tempo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção identificou vários polimorfismos denucleotídeo único (SNP) que atuam como marcadores genéticos pararesistência aos carrapatos. Assim, a invenção possibilita um teste rápido epreciso quanto à variação genética quanto aos traços, o que pode permitir quemuitos gados bovinos sejam testados durante um curto período de tempo, deuma maneira não dispendiosa quanto ao custo, para estabelecer estacaracterística.

Em um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido ummétodo para avaliar a resistência ao carrapato em um animal bovino,compreendendo as etapas de:

(1) providenciar um ácido nucleico do animal bovino;

(2) ensaiar quanto à ocorrência de um polimorfismo denucleotídeo único (SNP) identificado em qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a210,

em que a identificação da referida ocorrência de nucleotídeo éassociada com a resistência aumentada ao carrapato no animal.

Observar-se-á que a associação de um alelo ou genótipo comvalor aumentado freqüentemente se aplicará através das espécies e dasfamílias dentro das espécies. Entretanto, um alelo ou genótipo particularespodem nem sempre estar associados com valores aumentados através dasespécies; em uma espécie, o alelo ou genótipo podem estar associados comum valor aumentado, mas em outra espécie podem estar associados com valorreduzido ou não estar associados com diferença no valor. A pessoa versada natécnica será capaz de estabelecer a direção da associação.

Vantajosamente o ensaio é um ensaio quantitativo que é capazde determinar o número de cópias de cada forma do SNP na amostra de ácidonucleico. Em uma forma de realização, o ensaio é uma reação em cadeia dapolimerase (PCR) que emprega iniciadores únicos designados para amplificaras moléculas de DNA apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 a 210 ou uma porçãodestas que contenha o SNP, e seus complementos. Entretanto, outros métodoscom base no DNA, tais como os ensaios de extensão dos iniciadores e deligação dos oligonucleotídeos, podem ser usados. Métodos adequados paraamplificação do DNA de seqüência conhecida, são bem entendidos pelapessoa habilitada na técnica, e a aplicação de tais técnicas é amplamentedescrita, por exemplo, na WO 03/031592 (cujo conteúdo fica aquiincorporado como referência).

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, éfornecido um método para selecionar um animal bovino com resistênciaaumentada ao carrapato, dentre uma população de animais bovinos,compreendendo as etapas de:

(1) prover uma amostra de ácido nucleico do animal bovino;

(2) ensaiar quanto à ocorrência de um polimorfismo denucleotídeo único (SNP) identificado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a210, em que a identificação da referida ocorrência de nucleotídeo é associadacom a resistência aumentada ao carrapato no animal; e

(3) selecionar um animal bovino apresentando resistênciaaumentada ao carrapato.

Os polimorfismos de nucleotídeo único da invenção sãoapresentados nas Tabelas que seguem, e uma listagem de seqüênciasfornecendo uma descrição do polimorfismo e dando a seqüência deflanqueamento 3' e 5', foram enchidos eletronicamente. As SEQ ED NOsseguem a ordem dos polimorfismos apresentados na Tabela 1, com a SEQ IDNO: 1 igualando-se à primeira entrada na Tabela 1 (identificada pelodesignador de locus 349624), a SEQ ID NO: 2 correspondente à segundaentrada (designador de locus 352775), e assim por diante. Portanto, em umaforma de realização, a presente invenção envolve a detecção da seqüênciaapresentada nas SEQ ID NOs: 1 a 210, ou um fragmento destas de pelomenos 10 nucleotídeos contíguos que contêm o polimorfismo.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, éfornecido um substrato sólido ou superfície compreendendo uma pluralidadede ácidos nucleicos em localizações físicas separadas, incluindo pelo menosum ácido nucleico como apresentado nas SEQ ED NOs: 1 a 210, oufragmentos de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos que contêm opolimorfismo, imobilizados sobre elas. Por exemplo, os ácidos nucleicos dapresente invenção, ou parte de sua seqüência, podem ser usados como umaparte ou o todo de uma micro-série.

Adicionalmente, os iniciadores ou sondas podem serdesignados como descrito neste relatório para hibridizar a qualquer uma dasSEQ ID NOs: 1 a 210 ou uma seqüência a elas complementar.

Em conformidade com um outro aspecto da presente invenção,é fornecido um kit para avaliar a resistência ao carrapato em um animalbovino através da detecção da ocorrência de um polimorfismo de nucleotídeoúnico (SNP), em que a identificação da referida ocorrência como apresentadoem qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 210, é associada com a resistênciaaumentada ao carrapato, compreendendo uma sonda, iniciador ou par deiniciadores de oligonucleotídeos, ou combinações destes, para determinar aocorrência de nucleotídeos do SNP.

Vantajosamente, o kit ainda compreende um ou mais rótulosdetectáveis.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, éfornecida uma sonda, iniciador ou par de iniciadores de oligonucleotídeospara detectar a ocorrência de um polimorfismo de nucleotídeo único comoapresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 210.

Em conformidade ainda com um outro aspecto da invenção, éfornecido um método para avaliar a resistência ao carrapato em um animalbovino, compreendendo as etapas de:

(1) prover um ácido nucleico do animal bovino;

(2) ensaiar quanto à ocorrência de um polimorfismo em umgene, incluindo nas seqüências codificadoras, nos íntrons, nos promotores eem outras seqüências reguladoras do referido gene, ou um polimorfismo emdesequilíbrio de articulação com um polimorfismo no referido gene, em que oreferido gene é selecionado do grupo consistindo de COL1A2, SSFA2,ITGA4, TSTA, TSTA3, RPS13, RDHlO, ELTD1, RNASE1, SEMA3C,FLJ12572, NELL1, RIPK2, GPR39, LAMP2 e ARL6, em que a identificaçãoda ocorrência do referido nucleotídeo se acha associada com a resistênciaaumentada ao carrapato.

De acordo ainda com um outro aspecto da invenção, éfornecido um método para selecionar um animal bovino com resistênciaaumentada ao carrapato, dentre uma população de animais bovinos,compreendendo as etapas de:

(1) prover uma amostra de ácido nucleico do animal bovino;

(2)ensaiar quanto à ocorrência de um polimorfismo em umgene, incluindo nas seqüências codificadoras, nos íntrons, nos promotores eem outras seqüências reguladoras do referido gene, ou um polimorfismo emdesequilíbrio de articulação com um polimorfismo no referido gene, em que oreferido gene é selecionado do grupo consistindo de COL1A2, SSFA2,ITGA4, TSTA, TSTA3, RPS13, RDHl0, ELTD1, RNASE1, SEMA3C,FLJ12572, NELL1, RIPK2, GPR39, LAMP2 e ARL6, e em que aidentificação da ocorrência do referido nucleotídeo se acha associada com aresistência aumentada ao carrapato; e

(3) selecionar um animal bovino que apresente resistênciaaumentada ao carrapato.

De acordo ainda com um outro aspecto da invenção, éfornecido um kit para avaliar a resistência ao carrapato em um animal bovinoatravés da detecção da ocorrência de um polimorfismo de nucleotídeo único(SNP) em um gene, inclusive nas seqüências codificadoras, nos íntrons,promotores e outras seqüências reguladoras do referido gene, ou umpolimorfismo em desequilíbrio de articulação com um polimorfismo noreferido gene, em que o referido gene é selecionado do grupo consistindo emCOL1A2, SSFA2, ITGA4, TSTA, TSTA3, RPS13, RDH10, ELTD1,RNASE1, SEMA3C, FLJ12572, NELL1, RIPK2, GPR39, LAMP2 e ARL6, eem que a identificação da ocorrência do referido nucleotídeo se achaassociada com a resistência aumentada ao carrapato, compreendendo umasonda de oligonucleotídeos, iniciador ou par de iniciadores, ou combinaçõesdestes, para determinar referida ocorrência de nucleotídeos.

O animal selecionado pelos métodos da invenção pode serescolhido para fins de procriação do referido animal, ou uma célulaprogenitora de um animal que apresente esta característica pode ser usada emum método para clonar animais bovinos. A invenção, portanto, também trata,em outros aspectos, de animais quando selecionados pelos métodos dainvenção, sua progênie e do uso tanto dos animais selecionados quanto de suaprogênie para procriação.

Os métodos da invenção são aplicáveis a animais bovinos,incluindo, porém sem limitar, gado vacum, búfalo-da-índia e bisão.

Este relatório descritivo contém informações das seqüências denucleotídeos e de aminoácidos preparadas com o uso de PatentIn Versão 3.3.Cada seqüência de nucleotídeos é identificada na listagem de seqüências peloindicador numérico <210> seguido pelo identificador de seqüências (porexemplo, <210>1, <210>2, <210>3 etc.). O comprimento e o tipo daseqüência [DNA, proteína (PRT) etc.], e o organismo fonte para cadaseqüência de nucleotídeos, são indicados pela informação fornecida noscampos do indicador numérico <211>, <212> e <213>, respectivamente. Asseqüências de nucleotídeos referidas no relatório descritivo são definidas pelaexpressão "SEQ ID NO:", seguida pelo identificador de seqüências (porexemplo, SEQ ID NO: 1 refere-se à seqüência na listagem de seqüênciasdesignadas como <210> 1 e a informação da seqüência imediatamente segueo identificador <400> 1). Nas seqüências, os símbolos Y, R, Μ, K, S e Wforam usados para indicar o polimorfismo. Assim, o símbolo "M" representaum polimorfismo, e assim por diante. A seqüência flanqueando opolimorfísmo é derivada da informação de seqüência publicamentedisponível. Na maioria dos casos, 250 resíduos para qualquer lado dopolimorfismo foram apresentados, daí o polimorfísmo residir na posição 251.

A presente invenção não fica restrita à detecção da seqüência inteira denucleotídeos ou de qualquer forma restrita ao uso da seqüência inteira denucleotídeos. Esta informação é apresentada para auxiliar no projeto dosiniciadores e sondas de oligonucleotídeos, mas a pessoa habilitada na técnicareconhecerá que tal seqüência pode conter erros e ajustará seu projetoconformemente.

A designação de resíduos de nucleotídeos referida nesterelatório descritivo é aquela recomendada pela Comissão de NomenclaturaBioquímica IUPAC-IUB, em que A representa Adenina, C representaCitosina, G representa Guanina, T representa Timina, Y representa umresíduo de pirimidina, R representa um resíduo de purina, M representaAdenina ou Citosina, K representa Guanina ou Timina, S representa Guaninaou Citosina, W representa Adenina ou Timina, H representa um nucleotídeodiferente de Guanina, B representa um nucleotídeo diferente de Adenina, Vrepresenta um nucleotídeo diferente de Timina, D representa um nucleotídeodiferente de Citosina, e N representa qualquer resíduo de nucleotídeo.

Na totalidade deste relatório descritivo, a menos queespecificamente se estabeleça de outra maneira ou o contexto requeira deoutra maneira, a referência a uma etapa única, composição de matéria, grupode etapas ou grupo de composições de matéria, deve ser interpretada comoincluindo uma e uma pluralidade (isto é, uma ou mais) daquelas etapas,composições de matéria, grupos de etapas ou grupo de composições dematéria.

Como aqui usado, qualquer faixa de numerais inclui tudodentro da faixa, e a expressão "pelo menos um" significa um, dois, três,quatro etc. até o máximo possível. Portanto, uma referência a um ou maisSNPs inclui um SNP ou qualquer quantidade de SNPs de dois ao número totalde SNPs aqui apresentados podem ser usados isoladamente ou em qualquercombinação, e portanto a invenção considera a detecção de qualquer dascombinações possíveis de SNPs apresentadas neste relatório.

Como aqui usado, o termo 'vaca' é usado para referir-se a umanimal individual sem a intenção de limitar pelo sexo, e não deve serinterpretado como sendo assim, a menos que seja necessário a partir docontexto para concluir que se está referindo a um animal fêmea. O termo devetambém ser interpretado como incluindo um animal jovem de qualquer sexo.

A presente invenção não fica limitada no escopo pelas formasde realização específicas aqui descritas, as quais de destinam aos fins deexemplificação apenas. Produtos, composições e métodos funcionalmenteequivalentes acham-se claramente dentro do escopo da invenção, conformeaqui descrito.

A presente invenção pode ser realizada seguindo-se adescrição deste relatório, sem a indevida experimentação, usando-se, a menosque de outra forma indicado, técnicas convencionais da biologia molecular.Tais procedimentos são descritos em várias publicações referidas natotalidade do relatório descritivo, e o conteúdo de cada uma de taispublicações fica aqui incorporado como referência.

Na totalidade deste relatório descritivo e das reivindicações, aspalavras "compreendem", "compreende" e "compreendendo" são usadas emum sentido não exclusivo, exceto quando o contexto requeira de outramaneira.

Será claramente entendido que, embora várias das publicaçõesda técnica anterior sejam aqui referidas, esta referência não constitui aaceitação de que qualquer destes documentos façam parte do conhecimentogeral comum na técnica, na Austrália ou em qualquer outro país.Aqueles experientes na técnica observarão que a invenção aquidescrita é suscetível a variações e modificações outras que não aquelasespecificamente descritas. Deve ficar entendido que a invenção inclui todasessas variações e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo,individual ou coletivamente, e qualquer e todas as combinações, ou quaisquerduas ou mais das referidas etapas ou aspectos.

Observar-se-á que os animais podem ser selecionados pelamaior ou menor resistência aos carrapatos, com o uso dos métodos dainvenção.

MODOS DE REALIZAR A INVENÇÃO

Os polimorfismos de nucleotídeos únicos são variantes alélicasque ocorrem em uma população em que uma diferença de nucleotídeos únicosse acha presente em um locus. Os métodos da invenção podem envolver adetecção de um polimorfismo de nucleotídeos únicos ou mais do que umpolimorfismo de nucleotídeos únicos, e podem envolver a detecção depolimorfismos de nucleotídeos únicos que façam ou sejam uma parte de umhaplótipo que, como aqui usado, refira-se a agrupamentos de dois ou maispolimorfismos de nucleotídeos únicos que estejam fisicamente presentes nomesmo cromossoma e tendam a ser herdados juntos, exceto quando arecombinação ocorra. Métodos para identificar os alelos de haplótipos emamostras de ácido nucleico são conhecidos da pessoa habilitada na técnica.Estes métodos para a haplotipagem são descritos na WO 2005/040400, cujosconteúdos são aqui incorporados como referência.

Uma amostra preferida para realizar os métodos da invenção éuma amostra facilmente acessível que compreenda o DNA genômico. Porexemplo, testes genéticos do gado são freqüentemente realizados com o usode um folículo piloso, por exemplo, isolado da cauda de um animal a sertestado.

Outros exemplos de amostras facilmente acessíveis incluem,por exemplo, os fluidos corpóreos ou um extrato destes ou uma fração destes.Por exemplo, um fluido corpóreo facilmente acessível inclui, por exemplo, osangue integral, a saliva, o sêmen ou a urina.

Em outra forma de realização, uma amostra biológicacompreende uma célula ou extrato de células ou mistura destes, derivados deum tecido tal como, por exemplo, a pele.

Preferivelmente, uma amostra biológica deve ser isolada ouderivada previamente de um paciente mediante, por exemplo, cirurgia, oucom o uso de uma seringa ou mecha.

As preparações celulares ou a preparação de ácido nucleicoderivadas de tais tecidos ou células não devem ser excluídas. A amostra podeser preparada sobre uma matriz sólida para análises histológicas, ou,alternativamente, em uma solução adequada como, por exemplo, um tampãode extração ou tampão de suspensão, e a presente invenção evidentemente seestende aos testes de soluções biológicas assim preparadas.

A análise da amostra pode ser realizada por vários métodos. Apresente invenção identificou vários SNPs associados com a resistência aoscarrapatos em animais bovinos, e subseqüentemente detectando-se a presençaou ausência da forma alélica favorável de cada SNP, ou uma pluralidadedestes SNPs pode ser produzida com o uso de métodos conhecidos na técnica.Tais métodos podem empregar uma ou mais sondas de oligonucleotídeos ouiniciadores incluindo, por exemplo, um par de iniciadores de amplificação queseletivamente hibridizem a um polinucleotídeo alvo que compreenda umaparte ou a totalidade da seqüência apresentada em qualquer uma das SEQ IDNOs: 1 a 210. Sondas de oligonucleotídeos úteis em uma forma de realizaçãoda invenção compreendem um oligonucleotídeo que seja complementar eabranja uma porção do polinucleotídeo incluindo o SNP em questão. Portanto,a presença de um nucleotídeo específico na posição (isto é, uma das formasalélicas do SNP) é detectada pela capacidade ou de outra maneira para asonda hibridizar-se. Um tal método pode ainda incluir o contato dopolinucleotídeo alvo e do oligonucleotídeo hibridizado com umaendonuclease, e detectando-se a presença ou ausência de um produto declivagem da sonda.

Um ensaio de ligação de oligonucleotídeos também pode serusado para identificar uma ocorrência de nucleotídeos em uma posiçãopolimórfica, em que um par de sondas que seletivamente hibridizem amontante e adjacente, e a jusante e adjacente ao sítio do SNP, é preparado, eem que uma das sondas inclui um nucleotídeo terminal complementar a umaocorrência de nucleotídeos do SNP. Quando o nucleotídeo terminal da sondafor complementar à ocorrência dos nucleotídeos, a hibridização seletiva incluio nucleotídeo terminal de tal modo que, na presença de uma ligase, osoligonucleotídeos de montante e jusante sejam ligados. Como tal, a presençaou ausência de um produto de ligação é indicativo da ocorrência denucleotídeos no sítio de SNP.

Um oligonucleotídeo também pode ser útil como um iniciador,por exemplo para uma reação de extensão do iniciador, em que o produto (ouausência de um produto) da reação de extensão seja indicativo da ocorrênciade nucleotídeos. Além disso, um par de iniciadores úteis para amplificar umaporção do polinucleotídeo alvo incluindo o sítio de SNP, pode ser útil, em queo produto de amplificação é examinado para determinar a ocorrência denucleotídeos no sítio de SNP. Métodos particularmente úteis incluem aquelesque são facilmente adaptáveis a um formato de produção elevada, a umformato de multiplexação, ou a ambos. A extensão do iniciador ou produto deamplificação pode ser detectada direta ou indiretamente e/ou pode serseqüenciada com o uso de vários métodos conhecidos na técnica. Produtos deamplificação que abrangem um locus de SNP podem ser seqüenciados com ouso de metodologias tradicionais de seqüências [por exemplo, o método determinação de cadeia mediado por dideóxi", também conhecido como o"Método de Sanger" (Sanger, F., et al. J. Molec. Biol. 94: 441 (1975); Proberet al. Science238: 336-340 (1987)] e o "método de degradação química","também conhecido como o "método de Maxam-Gilbert" [Maxam, A. M. etal. Proc. Natl5 Acad. Sci (U.S.A.) 74: 560 (1977)], cujos conteúdos são aquiincorporados como referência para determinar a ocorrência de nucleotídeosno locus de SNP.

Como será evidente à pessoa habilitada na técnica, a sonda ouiniciador específicos usados em um ensaio da presente invenção dependerá doformato do ensaio usado. Métodos de projetar sondas e/ou iniciadores, porexemplo PCR ou hibridização, são conhecidos na técnica e descritos, porexemplo, em Dieffenbach e Dveksler (Eds.) (Em: PCR Primer: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbour Laboratories, NY, 1995) e mais recentementeem P.-Y. Kwok (Ed.) (Em: Methods in Molecular Biology Vol. 212 HumanPress, Totowa New Jersey, 2003). As várias categorias de polimorfismoforam sistematizadas e os vários métodos usados para detectá-los foramsubmetidos completamente a uma vista geral (Barendse e Fries 1999). Emresumo, existem apenas duas espécies de polimorfismo, aqueles devidos àsmudanças de bases de DNA e aqueles devidos à inserção e deleção de bases.Além disso, a detecção destes polimorfismos usa essencialmente a mesmatecnologia e é uma técnica rara que pode ser usada para apenas uma ou outradestas espécies de polimorfismo. Os polimorfismos podem também serdivididos naqueles que se acham dentro ou perto de uma seqüência que sejatranscrita em RNA (polimorfismos do tipo I) e aqueles que se acham no DNAque nunca é transladado em RNA (polimorfismos do tipo II). Entretanto,todos estes polimorfismos podem ser detectados com o uso das mesmasespécies de métodos. Os métodos para detectar os polimorfismos de DNAgira ao redor de 3 aspectos principais, nem todos dos quais sendo usados emcada método de detecção, e alguns métodos usam técnicas que não sãonenhuma destas 3 espécies principais. Existe uma grande e sempre crescentefaixa de métodos para detectar polimorfismos, e uma seqüência de DNAparticular prestar-se-á a um ou outro método de detecção. A maior partedestes métodos é altamente dependente da reação em cadeia da polimerase(PCR)5 não obstante seja possível detectar diferenças de seqüênciasfacilmente sem usar a PCR. As três tecnologias são 1) separação do DNA portamanho ou por composição, 2) hibridização de oligonucleotídeo parareconhecer as seqüências de DNA específicas, e 3) visualização do DNA. Aseparação do DNA pode ser realizada sobre matrizes sólidas, mas poderealizada em matrizes líquidas. O reconhecimento da seqüência de DNA éusualmente realizado por oligonucleotídeos de seqüência pré-definida, maspode ser realizado enzimaticamente, desde que algumas enzimas reconheçamos motivos de seqüências de DNA específicos. A visualização do DNA podeser realizada diretamente sobre o DNA que se ligue a alguns elementos taiscomo a prata, quando ela seja visível na luz comum, ela pode fluorescer sob aluz ultravioleta quando ela é ligada a algumas moléculas tais como o brometode etídio, ou ela pode ser visualizada através de auto-radiografia quandonucleotídeos radiativos sejam incorporados na seqüência. Mais usualmente, oDNA é visualizado quando ele seja ligado a um oligonucleotídeo de DNA quetenha uma molécula repórter previamente ligada que possa, então, serdetectada após a excitação a laser. Muitos métodos dependem de se relatar oresultado de uma reação específica sobre o DNA, e podem nem mesmodetectar o próprio DNA, mas os remanescentes da detecção bem sucedida.Estas descrições são meramente para indicar a ampla faixa e as muitaspermutações possíveis de detecção do DNA, e não excluem os métodos aosquais não se tenha especificamente referido.

Alguns dos métodos que podem ser usados para detectar ospolimorfismos são descritos abaixo, mas eles não são os únicos métodospossíveis. Embora a hibridização específica da sonda ou iniciador, ou outrométodo para detectar a variabilidade a qualquer ácido nucleico, possa serprevista com o uso de regras bem conhecidas, a sonda ou iniciador pode nãoser única, se ela for projetada para ligar-se a seqüência de DNA repetitiva oua seqüência comum aos membros de uma família de genes, e assim a triagemprecautória das sondas e iniciadores deve ser realizada com o uso, porexemplo, de BLAST em relação a genoma de vacas e outros. Em muitoscasos, isto não será suficiente e a adequação das sondas ou iniciadores podenecessitar ser confirmada empiricamente com o uso de métodos conhecidosna técnica. Esta mesma condição se aplicará a todos os métodos de detectarDNA que usem sondas e iniciadores curtos, como deve ser observado porqualquer pessoa habilitada na técnica.

O seguinte é uma lista de alguns dos mais úteis métodos dealta produção correntes de detectar polimorfismos no gado, mas esta não deveser considerada como uma lista exaustiva ou ser usada para excluir novosmétodos a serem ainda desenvolvidos, quando eles estejam essencialmentesendo usados para identificar a seqüência de DNA subjacente. A esserespeito, se a seqüência de DNA tiver sido transcrita para RNA, e o RNA fortestado quanto à variação, ou se o RNA tiver sido transladado na proteína e aproteína for testada quanto à variação, estes métodos de detecção de RNA ede proteínas também serão métodos de detectar a seqüência de DNAsubjacente. Como indicado acima, algumas vezes o método de detecção relatao resultado de uma reação bem sucedida sem detectar-se diretamente amolécula de DNA5 e obviamente isto deve aplicar-se quanto ao RNA e àproteína também.

Alguns dos métodos úteis à base de DNA, de detectarpolimorfismos, são o ensaio de Taqman (Livak 2003), o qual usa hibridizaçãocompetitiva das sondas específicas para as seqüências de DNA alternativas eem que uma reação bem sucedida é detectada através da liberação de umcorante repórter, o ensaio de SNPlex (Applied Biosystems Incorporated,Foster City, CA) que usa o ensaio de ligação de oligonucleotíudeos e em queuma reação bem sucedida é relatada através de sondas Zipchute que sãoseparadas sobre um seqüenciador capilar de DNA, sondas de inversãomolecular de alta produção associadas com tecnologias genéricas demicrodisposições (Hardenbol et al. 2003; Hardenbol et al. 2005), oMASSextend (Storm et al. 2002) ou as tecnologias de extensão de iniciadoresgenéricas (Chen et al. 1997) que usa a espectrometria de massa ou afluorescência a laser da sonda modificada por uma reação enzimática,respectivamente.

A presente invenção também diz respeito a kits que podem serusados nos métodos descritos acima. Tais kits tipicamente contêm uma sondade oligonucleotídeo, iniciador ou par de iniciadores, ou combinações destes,dependendo do método a ser empregado. Tais oligonucleotídeos são úteis, porexemplo, para identificar um SNP como apresentado neste relatóriodescritivo. Além disso, o kit pode conter um controle compreendendooligonucleotídeos correspondentes à seqüência de nucleotídeos da formaalélica não desejada. Além disso, o kit pode conter reagentes para realizar ummétodo da invenção, tais como tampões, rótulos detectáveis, uma ou maispolimerases, as quais podem ser úteis para um método que inclua umaextensão de iniciador ou procedimento de amplificação, e são nucleases paradigerir os produtos de hibridização ou uma ligase que possa ser útil pararealizar um ensaio de ligação de oligonucleotídeos. Os iniciadores ou sondaspodem ser incluídos no kit na forma rotulada.

O kit pode também incluir instruções para uso.

O controle da prevenção de carrapatos e as estratégias detratamento, tais como o tratamento químico e/ou a vacinação dos animais,podem ser ajustados para adequar-se ao animal individual com base em umaavaliação com o uso dos métodos da invenção.

Assim como o controle do animal individual, a presenteinvenção leva em conta a seleção dos animais para programas de reprodução.Assim, um rebanho pode ser desenvolvido com resistência aumentada aoscarrapatos. A progênie de acasalamento de ancestrais selecionados é provávelconter os traços, assim criando uma linhagem de animais com característicasespecíficas. A progênie pode então ser usada para procriar e assim por diantede modo a continuar a linhagem, o que pode ser monitorado quanto à pureza,com o uso de marcadores originais de SNP.

Além disso, os métodos da invenção levam em conta métodosin vitro de produzir animais. Em termos gerais, o método envolve aidentificação de um ou mais SNPs, como apresentado nas SEQ ID NOs: 1 a210, em um animal bovino, isolando-se uma célula progenitora do animal egerando-se um animal da célula progenitora. Métodos de clonar animaisbovinos são bem conhecidos da pessoa habilitada na técnica. Quanto aosmétodos envolvidos na clonagem do gado, os métodos conhecidos podem serusados diretamente. Como apresentado, por exemplo, em Willadsen "Cloningof sheep and cow embryos," Genome 31: 956 (1989), cujo conteúdo é aquiincorporado como referência.

Em uma forma de realização, em seguida ao desenvolvimentode um embrião, uma ou mais células são dele isoladas e testadas comodescrito acima. Um embrião tendo, ou provável de ter, resistência aumentadaao carrapato, é então selecionado e implantado em um receptor adequado.

Em uma forma de realização, os animais selecionados sãousados para produzir prole com o uso de fertilização in vitro. Neste processo,os óvulos são colhidos de uma vaca compreendendo um ou mais SNPs dainvenção, mediante, por exemplo, coleta do óvulo (OPU) transvaginal ou poraspiração laparoscópica. O óvulo recuperado é então amadurecido antes dafertilização. Os zigotos são então cultivados por um tempo e sob condiçõesadequadas para o desenvolvimento dos embriões. Por exemplo, os zigotos sãocultivados em um oviduto ligado de um receptor temporário (carneiro oucoelho). Alternativamente, os zigotos são co-cultivados in vitro com célulassomáticas (por exemplo, células epiteliais do oviduto, células da granulosa,etc.) em um meio definido. Alternativamente, os zigotos são cultivados invitro em um meio simples tal como o fluido ovidutal sintético sem qualquersuporte de células somáticas.

O método é sensível à triagem de embriões produzidos com ouso de qualquer tecnologia de reprodução assistida e/ou para a triagem dosembriões produzidos com o uso de um óvulo e/ou esperma de um animal quenão tenha sido examinado com o uso dos métodos da invenção.

EXEMPLO 1

Os fazendeiros foram inteiramente abordados de Queensland,Austrália, para fazerem parte do estudo. Os carrapatos foram contados,principalmente no período de janeiro a maio de 2004 e 2005. Os carrapatosforam contados na faixa de tamanho de 4,5 a 8 mm. Os carrapatos foramcontados por dois indivíduos, e 10 ml de sangue foram coletados emvacutainers de EDTA. As contagens dos carrapatos e os registros dosrebanhos foram coletados em um banco de dados que incluiu as seguintesinformações: Identidade Nacional do Rebanho, Propriedade n°, IdentidadeNacional da Vaca, Data do Nascimento, Genitor, Fêmea, Raça, Data do Parto,Data da Observação (quanto aos CARRAPATOS), Paridade, Data de registrodo último rebanho. Até aqui, 824 vacas têm grupos de dados completosrepresentando 316 reprodutores e 582 fêmeas de 63 raças ou cruzamentos deraças taurinas. Nos cruzamentos das raças, cada raça de avós é especificadacomo segue:

AAIIAAUU BBBB BBBF BBFF BBJFBBUF BBXX EEXX FFFF FFFG FFFIFFFX FFGG FFIF FFJF FFSF FFUIFFUU FFXF FFXX GGFF GGGF GGGGIIAXIIFF IIIIIIIX IIUUIIUXIIXIISII JJBF JJFF JJFG JJGGJJIF JJJF JJJJ JJJX JJXJ JJXXTTJJ UUBB UUBF UUFF UUFX UUIIUUIU UUIX UUJJ UUUI UUUU UUUXUUXIUUXX WWFF WWJJ XXBX XXJFXXJJ XXXF XXXX

O código da raça requerido é uma fileira de quatro caracteres,capazes de definir as raças parentais, isto é, XX XXRaça do GenitorRaça da FêmeaXXXX

PaternalPaternalMaternal Maternal

AvôAvóAvôAvó

RaçaRaçaRaçaRaça

Os códigos das raças de caráter único ADHIS são:

A A YRSHIRE

B BROWN SWISS

C AUSTRALIAN COMMERCIAL DAIRY COW

D DAIRY SHORTHORN

E BEEF BREEDS

F HOLSTE1N

G GUERNSEY

H SAHIWAL

I ILLAWARRA

J JERSEY

M MEUSE-RHINE-ISSEL

R RED POLL

S SIMMENTAL

U AUSTRALLAN RED BREED

W AUSTRALIAN FRIESIAN SAHIWAL

Z AUSTRALIAN MILKING ZEBUXDESCONHECIDO

Exemplo dos quatro códigos de raça de caráter alfa requeridospela ADHIS.

FFFF 'PURE' Holstein, resultante do acasalamento de umtouro Holstein com uma vaca Holstein.

FFJJ Cruzamento de Holstein-Jersey, resultante doacasalamento de um touro Holstein com uma vaca Jersey.

JJFFCruzamento de Jersey-Holstein, resultante doacasalamento de um touro Jersey com uma vaca Holstein.

FFFJ Três Quartos de Holstein, resultante do acasalamento deum touro Holstein com uma vaca do cruzamento de Holstein-Jersey.

FFXX Cruzamento de Holstein, resultante do acasalamento deum touro Holstein com uma vaca de raça desconhecida.

FFFX Três Quartos de Holstein, resultante do cruzamento deum touro Holstein com uma vaca de cruzamento de Holstein cujo genitor eraum Holstein e cuja fêmea era de raça desconhecida.

Houve 20 dias de testes de rebanhos, 73 paridades de rebanhose 431 dias diferentes em ordenha (com uma faixa de 0 a 1463). As contagensdos carrapatos foram transformadas usando-se uma transformação logarítmicadas contagens de carrapatos +1. Os traços foram analisados com o uso daanálise monovariada primeiro e depois a análise bivariada para derivarmatrizes de variância-covariância para a estimativa do parâmetro genético.Modelos Misturados Lineares Gerais de ASReml v.1.99 com o uso de ummodelo de animal com a matriz de relacionamento, foram aplicados nasanálises. As contagens dos carrapatos foram modeladas com o uso daequação:

loga - um + animal + fêmea + ide(animal) + raça + data doteste da raça + testage + erro.

em que o animal, a fêmea, ide(animal) e a raça tiveram efeitosaleatórios, o ide(animal) é um efeito ambiental permanente, a data do teste daraça foi um efeito fixado, e a testage foi uma co-variada.

Nem todos os animais foram escolhidos para a genotipagem.Dos animais disponíveis, 189 foram escolhidos para genotipagemrepresentando números semelhantes de cada uma das 5 propriedades, para138 progenitores, 174 fêmeas e 40 das combinações de raças. Os animais nãoforam escolhidos com base em seus valores de traço, mas principalmente paraminimizar o relacionamento para aumentar a resolução de mapa.

O DNA foi extraído de 200 microlitros de sangue e purificadoatravés de uma coluna QIAGEN seguindo-se as instruções dos fabricantes. ODNA foi genotipado com o uso do painel de SNP padrão ParAllele 10K. Ométodo da genotipagem de SNP acha-se documentado em Hardenbol, P.,Baner, J., Jain, M., Nilsson, M., Namsaraev, Ε. A., Karlin-Neumann, G. A.,Fakhrai-Rad, H., Ronaghi, M., Willis, T. D., Landegren, U. e Davis, R. W."Muliplex genotyping with sequence-tagged molecular inversion probes"Nature Biotechnology 5 de maio de 2003. O painel de aproximadamente10.000 SNP bovinos foi derivado da seqüência de DNA publicamentedisponível e é denominado o Painel de SNP de 10K Bovino de GenotipagemMegAllele. Os SNPs permitem que os pesquisadores realizem estudos demapeamento de articulações sobre as raças bovinas sem nenhum preconceitoquanto ou à carne ou ao leite. O Painel de SNP de 10K Bovino deGenotipagem MegAllele é projetado para trabalho com o AffymetrixGeneChip Scanner 3000. ParAllele Part #8-0015". A contagem residual doscarrapatos para cada indivíduo foi comparada com todos os seus genótipos.Os valores médios para cada genótipo foram computados e as médias foramcomparadas com o uso de um teste-t e o significado estatístico foi avaliadocom o uso de 100.000 permutações.

A Tabela 1 contém dados que mostram as associações quantoà resistência ao carrapato, e a Tabela 2 contém associações correlatas quanto àresistência ao carrapato com as localizações do SNP sobre o genoma bovino.

Para se determinar qual o genótipo favorável, quanto àresistência aos carrapatos, o genótipo, ou grupo de genótipos, com valoresmais baixos deve ser escolhido. Os genótipos podem ser claramenteidentificados desde que as bases de seqüências de DNA sejam classificadas naordem alfabética quanto ao SNP, isto é, C/G, A/C, G/T, A/T etc., então ogenótipo O será sempre o primeiro na ordem alfabética, enquanto o genótipo 2será sempre o último na ordem alfabética no locus.

Nós observamos vários SNPs que estão quase juntos, queapresentam associações com altos níveis de significado estatístico. Isto podemuito facilmente ser observado olhando-se para a localização do cromossoma(andaime-v2). O andaime-v2, os andaimes de versão 2 do genoma bovino,apresentam o número de cromossomas bovinos e o andaime dentro docromossoma, por exemplo o andaime-v2 1.112 significa o andaime 112 docromossoma bovino 1. Algum andaime pode apenas ser atribuído a umcromossoma humano, ver HumChr na Tabela 2. Quando combinadas com ainformação do andaime-v2, estas localizações apresentam bem claramenteagrupamentos de marcadores em uma região para cada traço. Estesagrupamentos podem ser usados para selecionar os animais.

O método para determinar se um alelo ou genótipo medidotem um valor aumentado em comparação com os outros naquele locus oumais amplamente dentro do gene ou região genética, deve ser familiar àpessoa habilitada na técnica, mas será descrito resumidamente. Em essência,nós separamos a variação associada com o traço naquele devido aocomponente Mendeliano associado com o locus sob exame, bem como umcomponente poligênico à família compartilhada. Antes que isto seja feito, osvalores de traço devem ser ajustados para efeitos ambientais e genéticosfixados, para co-variações, e para efeitos genéticos aleatórios tais como oprogenitor ou a fêmea. Isto é usualmente realizado com o uso de um ModeloMisto Linear Geral. Então os genótipos podem ser comparados com o uso deum teste-t ou uma análise unidirecional da variância, e o significadoestatístico pode ser avaliado com o uso de testes de permutação,particularmente quando a distribuição de traço seja não normal. O efeitomédio da substituição de alelo no locus é derivado da freqüência do alelo, dadiferença entre os homozigotos e do grau de dominância, em que alfa = a[l +k(p - (1-p)], em que a é metade da diferença entre os homozigotos, ρ é afreqüência do alelo, e k é d/a, em que d é a diferença entre o heterozigoto emetade da distância entre os homozigotos. Boerwinkle et al. 1986 Ann. Hum.Genet. 50, 181-194 e Lynch e Walsh, 1997 (Sinauer Associates).

A associação de um alelo ou genótipo com valor aumentado seaplicará freqüentemente através das raças e das famílias dentro das raças.Entretanto, um alelo ou genótipo particulares podem nem sempre estarassociados com valor aumentado através das raças, em uma raça o alelo ougenótipo podendo estar associado com valor aumentado, mas em outra raçapodem estar associado com valor reduzido ou não estar associado comdiferenças no valor. Os resultados aqui apresentados são as associaçõesagregadas através das raças, o que representa os alelos ou genótipos que serãoassociados com valor aumentado para a maioria das raças. Uma vez que osvalores tenham sido ajustados para as raças, as associações podem serreunidas através das raças, e as diferenças na freqüência dos alelos nas raçasnão causarão a geração de associações espúrias por causa do Paradoxo deSimpsons.

Quando apresentado desta maneira, primeiramente, asestatísticas agregadas dão valores mais realísticos porque eles são baseadosem números maiores, e, em segundo lugar, existem muitas raças de gado e,assim, é importante obter-se a associação geral entre o alelo ou o genótico eos traços, o que terá aplicabilidade em muitas ou em todas as raças.Evidentemente, a pessoa versada na técnica saberá que algumas raças podemter associações diferentes entre o alelo ou genótipo e o traço devido a uma dasvárias causas biológicas reais. Em primeiro lugar e, provavelmente, o maiscomum, é que o alelo ou genótipo medido não seja causativo, de modo queele esteja em desequilíbrio de articulação com o alelo ou genótipo causativo.

Haverá casos em que o alelo ou genótipo que esteja sendo medido esteja nafase genética oposta ao alelo ou genótipo causativo, e isto pode ser refletidoem algumas diferenças de raça. O segundo lugar é que pode haver mais doque uma mutação causativa no gene, com freqüências diferentes em raçasdiferentes, daí o alelo ou genótipo medido podendo apresentar diferenteseficiências previsíveis nas diferentes raças e apresentar relacionamentos defase genética opostos por causa das associações complexas entre o alelo ougenótipo medido e as diferentes mutações causativas. Em terceiro lugar, umamutação causativa em um gene pode ser afetada por genes em qualquer outrolugar no genoma. Estes efeitos epistáticos ou de segundo plano sãoconhecidos há décadas, e alguns destes podem ter um impacto sobre aassociação entre o alelo ou genótipo medidos e o valor do traço.<table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table>Tabela 2 Os genes e as regioes genicas associadas com certos SNP listados na Tabela 1, associados com a resistencia aos carrapatos. O locus e o identificador de SNPPerAllele, o andaime-v2 e a localizacao que da a localizacao cromossomica bovina (4.14 significa cromossoma 4 bovino, andaime 14),bp e a localizacao com o andaime, ibiss4 e a referencia ibiss4, andaime-v1 e a designacao original sobre os andaimes de versao 1, tmax e o teste t quanto a diferenca maxima entre os genotipos, PermP e o valor P derivado de 100.000 testes de permutacao, HumChr mais proximo do SNP no andaime.

<table>table see original document page 30</column></row><table><table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table>REFERÊNCIAS:

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THE STATE OF QUEENSLAND THROUGH ITS DEPARTMENT OF PRIMARYINDUSTRIES

THE UNIVERSITY OF NEW ENGLAND

THE STATE OF NEW SOUTH WALES THROUGH ITS DEPARTMENT OF

AGRICULTURE

DAIRY AUSTRALIA

MARCADORES PARA RESISTÊNCIA A CARRAPATOSFP247 4 6AU 20059060582005-11-02AU 20059060592005-11-02210

PatentIn versão 3.31

501DNABos1

<120><130><150><151><150><151><160><170><210><211><212><213><400>acttttcttaaatcccaaaagtgggagatataatttacctgcacacgtttcattcctggaagagtttgaaatgaggatggttttttacac<210> 2<211> 501<212> DNA<213> Bos<400> 2tagccactgatttttagaaattccaaaagtsp.

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<213> Bos sp.<400> 15

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aacctttcag ctgtagataa tagtggatatgagatggtat taatcttctc tgtaaattatatgacagaag ggggaaaggt gggctcatgtcacgtgccaa atacttagca caatgcacaggaattcaaga rttcaatttg aggaatttagcactccagta ctcttacctg gaaaatcccaatggggtcgc taggagtcag acacgactgacattggagaa ggaaatggca acccactccagggagcctgg tgggcttccg t<210> 17<211> 501<212> DNA<213> Bos sp.<400> 17

aaaaaggatt gagctaggtt ctagttataa

aggaagtcgt aatctattat ggtacatctt

ttttcattag aagcaacata ctctttacgt

ataaatgata catgtggaca gaccacacac

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501

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81

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501

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501

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<210> 20

<211> 501<212> DNA

<213> Bos sp.<400> 20

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tgcagcacgc caggcttccc tgtccctcac

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501

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<400> 33

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<213> Bos sp.<400> 66

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60120180240300360420480501

60120180240300360420480501

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60120180240300360420480501<212> DNA<213> Bos sp.<220>

<221> misc_feature<222> (499)..(501)

<223> η is a, c, g, or t<400> 67

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<210> 70

<211> 501<212> DNA<213> Bos sp.<4 00> 70

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501gtttgacagc tgttcattcg atcttgaagtagtgtgatgt ttatttattt attttttaatcatgtattag tatgagattt tgaaaataaaaggtagaagg gagaattttc tcttataaggatatgttctg ygtactgcca agagtgaattgattcgggga aaaaagcaat acttcaataaaatcaaaagt gtgacatagc tttgtattttgcattacaaa tgtggtagga tctaggtttacttgttccat gtttgggggt c<210> 12<211> 501<212> DNA<213> Bos sp.<400> 72

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tactcagaag ttatgtctac ttgtgccctctttgtgctaa taacacaagc tcttttgttcaccaaagaac aaagaaaata aagaaagatataatataatt gggttttctt taaagatgaaagtttattgt ragtaagaca ctgaactgtccagtattctt ggcatacatt gaatttattttgacaactga caggattttt attcttaactgcttttgatg ctgttactct atattaatgt<210> 74<211> 501<212> DNA<213> Bos sp.<400> 74

ctatatgaat ttttagaaaa acaagacggaataattatat tttaacccca taaagtattatgaaaaacaa aaaggtgaag agaagagaaataaacataag aatgtctatg caggaatgccaagatcacag raaatggaga taaagaagtaaattttcagg ttgaaaagac ccactgaggagacattaagt gatatcataa tgatatttcattccagaaag aaaaaagtcc catcacaaacaactgcaata ctggaggtca g

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tgaagttact tatccaaagc tatagaacactaaattacat gttagttgtt atattagcaatttttctcac caaaatcact gttgtttaatcatttgtctg gaagttcttc atttgtctggtgttcattat rtgaagttac ttatccaaaggtcttaaaat ataaattaca tgttagttgttctggagcat ttttttctca ccaaaatcacgtttgttttt ccatttgtct ggaagttctttaaaagaaaa atgttcatta t<210> 77<211> 501<212> DNA<213> Bos sp.<400> 77

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<210> 78

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<211> 501

<212> DNA

<213> Bos sp.<400> 79

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18

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Claims (15)

1. Método para avaliar a resistência ao carrapato em umanimal bovino, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(1) prover um ácido nucleico do animal bovino;(2) ensaiar quanto à ocorrência de um polimorfismo denucleotídeo único (SNP) identificado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 210,em que a identificação da referida ocorrência de nucleotídeo éassociada com a resistência aumentada aos carrapatos no animal.

2. Método para selecionar um animal bovino com resistênciaao carrapato aumentada dentre uma população de animais bovinos,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(1) prover uma amostra de ácido nucleico do animal bovino;(2) ensaiar quanto à ocorrência de um polimorfismo denucleotídeo único (SNP) identificado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a210, em que a identificação da referida ocorrência de nucleotídeo é associadacom a resistência aumentada ao carrapato no animal; e(3) selecionar um animal bovino que apresente resistênciaaumentada ao carrapato.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1ou 2, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é DNA.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que um ensaio de hibridização de DNA é usado para detectar aocorrência de nucleotídeo.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que um ensaio de amplificação é usado para detectar a ocorrência denucleotídeo.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o ensaio de amplificação é PCR.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a-6, caracterizado pelo fato de que o DNA compreende a seqüência apresentadaem qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 210, ou um seu fragmento de pelomenos 10 nucleotídeos contíguos que contenham o polimorfismo.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, caracterizado pelo fato de que o animal bovino é uma vaca.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a vaca é de uma linhagem pura selecionada do grupo consistindode Ayrshire, Brown Swiss, vaca leiteira comercial australiana, Durhamleiteira, Holstein, Guernsey, Sahiwal, Illawarra, Jersey, Meuse-Rhine-Issel,Red Poli, Simmental, Linhagem Vermelha Australiana, Australian FriesianSahiwal e zebu de ordenha Australiano, ou seus cruzamentos.

10. Superfície ou substrato sólido, caracterizadafo) pelo fatode que compreendem uma pluralidade de ácidos nucleicos em localizaçõesfísicas separadas, incluindo pelo menos um ácido nucleico conformeapresentado nas SEQ ID NOs: 1 a 210, ou um fragmento deste de pelo menos-10 nucleotídeos contíguos que contenham o polimorfismo, sobre elesimobilizado.

11. Kit para avaliar a resistência ao carrapato em um animalbovino, através da detecção da ocorrência de um polimorfismo de nucleotídeoúnico (SNP), em que a identificação da referida ocorrência de nucleotídeocomo apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 210 é associadacom a resistência aumentada ao carrapato, caracterizado pelo fato de quecompreende uma sonda de oligonucleotídeo, iniciador ou par de iniciadores,ou combinações destes, para determinar a ocorrência de nucleotídeos do SNP.

12. Sonda de oligonucleotídeo, iniciador ou par de iniciadores,caracterizadafo) pelo fato de ser para detectar a ocorrência de umpolimorfismo de nucleotídeo único como apresentado em qualquer uma dasSEQ ED NOs: 1 a 210.

13. Método para avaliar a resistência ao carrapato em umanimal bovino, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(1) prover um ácido nucleico do animal bovino;(2) ensaiar quanto à ocorrência de um polimorfismo em umgene, inclusive nas seqüências codificadoras, os íntrons, os promotores eoutras seqüências reguladoras do referido gene, ou um polimorfismo emdesequilíbrio da articulação com um polimorfismo no referido gene, em que oreferido gene é selecionado do grupo consistindo de COL1A2, SSFA2,ITGA4, TSTA, TSTA3, RPS13, RDH10, ELTD1, RNASE1, SEMA3C,FLJ12572, NELL1, RIPK2, GPR39, LAMP2 e ARL6, em que a identificaçãoda referida ocorrência de nucleotídeo é associada com a resistência aumentadaao carrapato.

14. Método para selecionar um animal bovino com resistênciaao carrapato aumentada dentre uma população de animais bovinos,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:-1. prover uma amostra de ácido nucleico do animal bovino;-2. ensaiar quanto à ocorrência de um polimorfismo em umgene, inclusive nas seqüências codificadoras, os íntrons, os promotores eoutras seqüências reguladoras do referido gene, ou um polimorfismo emdesequilíbrio da articulação com um polimorfismo no referido gene, em que oreferido gene é selecionado do grupo consistindo de COL1A2, SSFA2,ITGA4, TSTA, TSTA3, RPS13, RDHl0, ELTD1, RNASE1, SEMA3C,FLJ12572, NELL1, RIPK2, GPR39, LAMP2 e ARL6, em que a identificaçãoda referida ocorrência de nucleotídeo é associada com a resistência aumentadaao carrapato; e-3. selecionar um animal bovino apresentando resistênciaaumentada ao carrapato.

15. Kit para avaliar a resistência ao carrapato em um animalbovino através da detecção da ocorrência de um polimorfismo de nucleotídeoúnico (SNP) em um gene, inclusive nas seqüências codificadoras, os íntrons,promotores e outras seqüências reguladoras do referido gene, ou umpolimorfismo em desequilíbrio da articulação com um polimorfismo noreferido gene, em que o referido gene é selecionado do grupo consistindo deCOL1A2, SSFA2, ITGA4, TSTA, TSTA3, RPS13, RDHl0, ELTD1,RNASE1, SEMA3C, FLJ12572, NELL1, RIPK2, GPR39, LAMP2 e ARL6,em que a identificação da referida ocorrência de nucleotídeo é associada coma resistência aumentada ao carrapato, caracterizado pelo fato de quecompreende uma sonda de oligonucleotídeo, iniciador ou par de iniciadores,ou combinações destes, para determinar a referida ocorrência de nucleotídeos.