JPH1042879A - 染色体特異性標識プローブ／その調製方法／その用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 染色体ＤＮＡを効率よく増幅し、遺伝子スク
リーニングに適した染色体特異性標識プローブを短時間
で多量に得る。 【構成】 染色体由来のＤＮＡを制限酵素等で切断した
小断片の両端に、塩基配列が既知で、かつ一方の5'末端
のリン酸基が水酸基で置換された２本鎖ＤＮＡを連結し
たのち、前記２本鎖ＤＮＡに相補的な１本鎖ＤＮＡをプ
ライマーとして用いたポリメラーゼ反応、好ましくはＰ
ＣＲにより所望の量が得られるまで増幅し、増幅したＤ
ＮＡを直接あるいは間接的に標識する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、主としてポリメラーゼ
連鎖反応により調製される、遺伝子特異性標識プローブ
及びその調製方法、並びに前記プローブを用いた遺伝子
のスクリーニング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】染色体は多数の遺伝子を担っているゲノ
ムの独立した単位である。染色体は、極めて長いＤＮＡ
の線状分子でできており、細胞周期の大部分の期間中蛋
白質との複合体を形成している。

【０００３】体細胞周期は、細胞が通常の代謝活動を営
んでいる長い中間期と、細胞が２つの娘細胞に分裂する
有糸分裂期からなる。正常な体細胞は２倍体、すなわ
ち、各染色体の対をなしたコピー（相同な）を含んだ状
態で存在している。有糸分裂期には、染色体の対は分離
し各々が複製し、姉妹染色分体と呼ばれることもあるコ
ピーを形成する。各娘細胞は、それぞれの元の染色体の
対のうちの一方と各姉妹染色分体の対のうちの一方を受
け取る。

【０００４】生殖細胞（卵子または精子）は減数分裂に
よって産生される。減数分裂では生殖細胞が２回分裂を
起こし４個の娘細胞を産生する。その各々は染色体の半
数体セットを受け取る。

【０００５】ある生物、例えばドロソフィラ（Drosophi
la、ショウジョウバエ）の中間期の核は多糸性染色体と
呼ばれる巨大染色体を含んでいる。多糸性染色体は、接
合部を形成した倍数体対の連続的複製（約９回に及ぶ）
によって作られる。複製体は細胞分裂のようには分離せ
ず、会合したままでいる。多糸性の度合いは巨大染色体
中に含まれる半数体染色体の数である。

【０００６】多糸性染色体には顕微鏡下で観察できる一
連の縞模様がある。この縞模様は染色体の細胞学的地図
を形成している。連鎖地図で見られるように遺伝子転位
を、細胞学的地図の構造的転位と関連づけることができ
る。問題の遺伝子のプロープが手に入るならば、遺伝子
は、その遺伝子を特定のバンドに位置づけることが可能
である。

【０００７】特定の遺伝子を単離することが多くの生物
学的現象をの分子レベルで理解する第１歩である。興味
の対象となる遺伝子を単離する時の主な障害は遺伝子産
物についての知識がまったくないことである。すなわ
ち、遺伝子は遺伝され得る突然変異欠損（例えば、ヒト
におけるハンティングトン舞踏病）の遺伝的解析からの
み知られる。これらの場合においては、遺伝子単離のた
めの唯一の手だては、今までにクローニングされたＤＮ
Ａに近い連鎖を見いだすことを願って遺伝子地図を作成
することによって先ず突然変異体対立遺伝子の染色体上
の位置を明確に決定することであった。次にこのＤＮＡ
は興味の対象の突然変異体遺伝子座への染色体歩行を開
始するために使用されるであろう。

【０００８】染色体歩行においては、興味の対象の遺伝
子の近くに存在すると考えられるＤＮＡで始められ、こ
のＤＮＡを使用して標的遺伝子の方向に広がっている相
同性のクローンを単離する。染色体歩行を百キロベース
を遙かに越えて続行しなければならないならば、標的遺
伝子に向かって続けることを妨げる反復ＤＮＡ配列に殆
ど常に遭遇する。

【０００９】塩基対の規模が１００万を越えるような場
合には、開始クローンと標的遺伝子座の間にはかなりの
数の反復ＤＮＡ配列があるものと予想されるので、染色
体歩行は行なうべきではないと大方の分子生物学者は考
えている。不幸なことに、臨床的興味があるいくつかの
ヒト遺伝子のうちのいずれについても、１００万塩基以
内のマーカークローンなら十分近い方であろうと考えら
れるであろう。例えば、多くの研究室による数年の集中
的研究の後、ハンティングトン舞踏病の原因遺伝子は最
も近いＤＮＡマーカーから未だ少なくとも0.75メガ塩基
対隔たっており、もっと近いＤＮＡクローンが手あたり
次第に求められている。（F.S.Collins、シンポジウム
講演、第１６回国際遺伝学会議、トロント ８月２１
日、1988）。染色体歩行の問題点の多くを多少とも解消
すると考えられる特定の染色体領域からＤＮＡクローン
を単離する方法の開発が、本発明の目的の１つである。

【００１０】顕微解剖は、顕微鏡観察下でマイクロマニ
ピュレータを用いて染色体を断片に切断する技術をい
い、マイクロクローニングは、その結果生ずる断片を適
当なベクターにクローニングすることをいう。通常にお
いては、ベクターを使用して宿主細胞を形質転換し、染
色体ＤＮＡのライブラリーを作製する。この技術は染色
体の一部を単離してクローン化する上で優れている（Pi
rotta, Jackle and Edstrom, GeneticEng, Principles
& Methods, 5:1-17 (1983)）。

【００１１】例えば、過去数年において、２、３のグル
ープ（Johnson ら、1987；Dreesenら、1988）は、マイ
クロクローニングの戦略（Scalenghe ら、1977；Pirrot
taら、1983）を用いて、多糸染色体中の遺伝子の物理的
位置の知識に基づいて興味あるドロソフィラの遺伝子を
単離した。このプロトコルにおいては、顕微解剖された
染色体ＤＮＡからの制限エンドヌクレアーゼによる切断
断片（通常、６塩基対認識のエンドヌクレアーゼである
EccRI により生じさせる）がλ−バクテリオファージベ
クター中にクローニングされる。続いて、興味のある染
色体領域を網羅する重複クローンの系列を回収するため
に、マイクロクローニングを行なったバクテリオファー
ジライブラリ中のユニークなＤＮＡ断片をプロープとし
て用いて、遙かに大きな染色体のＤＮＡ断片を含むドロ
ソフィラゲノムの２００キロベース領域からのＤＮＡの
９０％を回収することが可能であった（Johnson ら、19
87）。

【００１２】このマイクロクローニング戦略はマウス
（Rhome ら、1984）やヒトのような多糸染色体を欠いて
いる生物において試みられたが結果ははかばかしくなか
った。この場合の主要な問題は、僅かな数のクローンを
回収するために多数の染色体を解剖する必要があること
であった。ヒトＸ染色体の脆弱な位置からのＤＮＡをこ
の手順でクローニングするための多大な努力はこの技術
的理由から失敗した。

【００１３】多糸染色体についてさえ、望む制限断片の
収率は低く、このため、マイクロクローニングの段階の
効率が下がり、クローニングベクターの選択が制限され
る。効率を最大にするため、ファージベクターが通常用
いられる。しかし、ファージの充填のシステムの都合に
より、通常、挿入断片については１〜２０ＫＢという制
限が課せられる。

【００１４】一方、ヘテロＤＮＡ集団における特異的Ｄ
ＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略
す）によって増幅することが可能である（Mullis, U.S.
4,683,195; Mullis, U.S. 4,683,202）。従来のＰＣＲ
においては、増幅されるべき標的ＤＮＡ配列の両側に隣
接するＤＮＡ配列を予め調べておき、標的配列の各３’
末端側の隣接部位にアニーリング可能なプライマーを、
それぞれ１つずつデザインしてアニーリングさせ、この
アニーリングされたプライマーから、ＤＮＡポリメラー
ゼを用いて標的配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成する。こ
うして得られた２本鎖ＤＮＡを変性すると、変性により
得られる１本鎖ＤＮＡはプライマーに対して相補的であ
るため、再度プライマーと結合することができ、この１
本鎖ＤＮＡを鋳型として再びＤＮＡ合成が行なわれる。
このサイクルを繰り返すごとに、標的ＤＮＡ量が２倍ず
つ増加していくことになり、短時間で、大幅な増幅を行
なうことが可能である。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ＰＣＲにおいては、増幅すべき標的塩基配列の両側に隣
接する塩基配列に対して相補的な塩基配列を持つオリゴ
ヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いる
ため、両側の隣接領域がわからない限り、プライマーを
調製することができない。

【００１６】Frohman ら（PNAS, 85:8998-9002(1988)）
は、相補的ＤＮＡ（以下、ｃＤＮＡと略す）を増幅する
方法として、改変ＰＣＲ（アンカードＰＣＲ）について
記載している。ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡか
ら逆転写されたＤＮＡは一連のチミジンを含んでいる。
このため、ｃＤＮＡを増幅する場合、標的部位の両隣接
領域のうち一方は既知のホモポリマー配列であり、もう
一方についてのみ隣接領域を調べればよい。

【００１７】しかしながら、この方法においても、隣接
領域の一方については、やはり塩基配列を調べなければ
ならない。また、一般にゲノムＤＮＡは、ｃＤＮＡと異
なり既知のホモポリマー配列を含まないので、ゲノムＤ
ＮＡの増幅にこの方法を用いることは適当でない。

【００１８】したがって、本発明の目的は、ゲノムＤＮ
Ａを効率よく増幅して、遺伝子スクリーニングに用いる
ことのできる染色体特異性標識プローブを多量に得るこ
とにある。

【００１９】

【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するた
め、本発明の染色体特異性標識プローブは、染色体ＤＮ
Ａ由来のＤＮＡ断片の両端に、塩基配列が既知のＤＮＡ
断片が連結されてなるハイブリッド２本鎖ＤＮＡであ
り、かつ直接または間接的に標識されていることを特徴
とする。

【００２０】また、本発明の染色体特異性標識プローブ
の調製方法は、染色体またはそのコピー、及び／または
染色体断片またはそのコピーに由来する１つ以上の２本
鎖ＤＮＡを原料として、以下の工程、すなわち、（ａ）
前記２本鎖ＤＮＡを切断して、両側に断端を持つ２本鎖
ＤＮＡ断片を調製する工程と、（ｂ）前記２本鎖ＤＮＡ
断片の両断端に、5'末端の一方がリン酸基、他方が水酸
基であるプライマー２本鎖ＤＮＡを連結して、ハイブリ
ッド２本鎖ＤＮＡとする工程と、（ｃ）前記ハイブリッ
ド２本鎖ＤＮＡを変性して、ハイブリッド１本鎖ＤＮＡ
鎖とする工程と、（ｄ）前記ハイブリッド１本鎖ＤＮＡ
の3'末端に、前記（ｂ）で連結したプライマー２本鎖Ｄ
ＮＡの塩基配列部位に相補的なプライマー１本鎖ＤＮＡ
をアニーリングする工程と、（ｅ）前記アニーリングし
たプライマー１本鎖ＤＮＡを伸長することにより、ハイ
ブリッド２本鎖ＤＮＡを生成する工程と、（ｆ）前記
（ｃ）〜（ｅ）を所望の増幅度を得るまで反復する工程
と、（ｇ）増幅されたハイブリッド２本鎖ＤＮＡ断片
を、直接または間接的に標識する工程、を含むことを特
徴とする。

【００２１】また、本発明の遺伝子スクリーニング方法
は、上記染色体特異性標識プローブを１つ以上用いてin
situ ハイブリダイゼーションを行なうことを特徴とす
る。

【００２２】以下、本発明について好ましい態様を挙げ
て詳細に説明する。本発明における染色体特異性標識プ
ローブの調製方法においては、まず、染色体及び／また
は、フローソーティング法（Grayら、Cold Spring Harb
or Symposia on Quantitative Biology 51: 141-157 (1
986)）や、顕微解剖法などの方法で得た染色体断片を、
そのまま、あるいは１つ以上のコピーを生成した後、制
限酵素などにより切断して、両端に断端を持つ２本鎖Ｄ
ＮＡ断片を調製する。

【００２３】本発明において、２本鎖ＤＮＡとは、２本
のＤＮＡ鎖が相補的塩基間（アデノシン（Ａ）とチミン
（Ｔ）；グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ））の水素結合
により二重螺旋構造を形成しているものである。ＤＮＡ
分子は、通常、5'リン酸基末端及び3'水酸基末端を有
し、これらの末端はin vitroにおける化学的または酵素
的手法により修飾することができる。

【００２４】本発明においては、制限酵素を１種類以上
用いて、上記２本鎖ＤＮＡを多数の小断片に切断するこ
とが好ましい。一般に、ＤＮＡ断片が短いほうがＰＣＲ
の基質として有効であり（Saiki ら、1988）、例えば、
１００〜５００塩基対程度の長さが好ましい。また、断
片数が多いほうが、以下に述べる２本鎖プライマーが断
片の両断端に連結しやすい。

【００２５】本発明において、制限酵素とは、制限エン
ドヌクレアーゼとも呼ばれ、２本鎖ＤＮＡを特定の位置
で切断する酵素群である。制限酵素により切断された各
々の２本鎖ＤＮＡ断片は制限酵素断片と呼ばれ、断片の
集合は消化物と呼ばれる。制限酵素として知られる酵素
の種類は多く、切断部位の認識様式や切断パターンも多
種多様である。例えば、両鎖を同じ部位で切断し、平滑
断端を残す酵素もあれば、両鎖を異なる部位で切断し、
オーバーハングス、プロトルーディング末端、付着末
端、粘着末端などと呼ばれる断端を残す酵素もある。

【００２６】本発明に用いる制限酵素の種類に特に制限
はないが、平均して７５から数千塩基対に１カ所の割合
で染色体を切断するものが好ましく、平均して２５６塩
基対に１カ所の割合で染色体を切断する、４塩基対認識
の酵素を用いることがより好ましい。このような酵素と
しては、例えば、MboI、AluI、HpaII 、FnuDII、DpnI、
SciNI 、HhaI、HaeII 、RasI、およびTaqIなどがある。
また、例えばMboIのように、付着末端を残すような制限
酵素を用いることが、更に好ましい。なお、既知の制限
酵素の認識部位に関する情報は、R. J. Roberts によっ
てNuclei AcidsResearchの毎年最初の号に発表され、ま
た、制限酵素の供給元としては、Bethesda Research La
bs、Boehringer Mannheim Biochemicals、及びNew Engl
and Biolabs などがある。

【００２７】なお、本発明においては、制限酵素による
以外の方法、例えば、凍結と解凍を繰り返すなど、他の
酵素的、化学的または物理的手段を用いることもでき
る。しかしながら、この場合においては、後の工程で２
本鎖プライマーＤＮＡを連結できるように、切断された
ＤＮＡの断端を修復する必要が生じる場合がある。

【００２８】次に、上記の様にして得られた染色体ＤＮ
Ａ断片、好ましくは制限酵素断片に、２本鎖プライマー
を連結する。プライマーとは、鋳型ＤＮＡ鎖の一部に相
補的な塩基配列を持ち、鋳型ＤＮＡにアニーリングする
１本鎖ＤＮＡの小断片である。すなわち、ＤＮＡポリメ
ラーゼにより触媒されるＤＮＡ合成は、プライマーの3'
末端から開始され、鋳型ＤＮＡ鎖に沿って、重合が停止
するまで末端を伸長する。あるＤＮＡポリメラーゼが、
相補性ＤＮＡ鎖の合成を連続して行ない得る能力のこと
を、前進性（processivity）という。また、本発明にお
いては、プライマーと、これに相補的な塩基配列を持つ
１本鎖ＤＮＡが結合して成る２本鎖ＤＮＡを、２本鎖プ
ライマーと呼ぶことにする。

【００２９】また、連結とは、ＤＮＡリガーゼにより行
なわれ、制限酵素切断とは反対に、ＤＮＡ鎖の切れ目を
つなぎ合わせることをいう。ＤＮＡリガーゼは、あるＤ
ＮＡ分子の5'リン酸基末端と、別のＤＮＡ分子の3'水酸
基末端を、リン酸ジエステル結合により連結する反応を
触媒し、水酸基末端どうしを連結することはない。ま
た、末端が付着末端、平滑末端のどちらも連結すること
ができる。

【００３０】本発明の特に重要な特徴として、２本鎖プ
ライマーにおける２つの5'末端の内、一方だけがリン酸
基を有し、もう一方の5'末端は、3'末端と同様に水酸基
を有する。これによって、図２に示すように、２本鎖プ
ライマーどうしが３個以上直列に連結して２本鎖オリゴ
マーが生成され、このオリゴマーが、ＰＣＲ時に加えら
れるプライマーとアニーリングを起こすことにより、Ｐ
ＣＲを阻害することを防止することができる。図３に示
されるように、２本鎖プライマーが２個連結して生成さ
れる２本鎖ダイマー分子は自己相補性であるため、ＰＣ
Ｒ時にはヘアピン分子を形成する。このため、２本鎖プ
ライマーが２個連結しても、増幅反応が阻害される心配
はない。

【００３１】また、上記のような２本鎖オリゴマー生成
をより効果的に防止するため、本発明の２本鎖プライマ
ーは、制限酵素によって形成された付着末端に相補的な
付着末端を有することが好ましが、アダプターＤＮＡを
用いて、制限断片の付着末端とは相補的でない付着末端
を持つ２本鎖プライマーを連結したり、制限酵素断片と
２本鎖プライマーの平滑末端どうしを連結することもで
きる。このように、２本鎖プライマーとＤＮＡ断片の平
滑末端どうしを連結しようとするときは、２本鎖オリゴ
マーの生成を防ぐために、２本鎖プライマーには、5'水
酸基末端が付着末端であるものを用い、かつ、ＤＮＡリ
ガーゼには、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼのように１本鎖
ＤＮＡの連結を起こさないリガーゼを用いることが好ま
しい。２本鎖プライマーは、異なる制限酵素についての
内部認識部位も提供することがある。これにより、増幅
されたＤＮＡの後の操作が容易になる可能性がある。

【００３２】本発明で用いる２本鎖プライマーの長さ
は、２０〜３０塩基対であることが好ましい。長さが２
０塩基対より短いと、２本鎖プライマー連結部位のハイ
ブリダイゼーションにおける特異性が小さくなり、増幅
時に用いる１本鎖プライマーとのアニーリング速度が低
下する。一方、長さが３０塩基対を超えると、連結反応
時におけるプライマーのモル濃度が不足して、プライマ
ーが制限断片の両端に連結しにくくなる。但し、実験時
においては、１５０塩基対の長さに及ぶ２本鎖を使用で
きた例もある。また、２本鎖プライマーのＧＣ含量は５
０％程度が好ましく、ＧＣ塩基対が２本鎖プライマー全
体に均一に分布することが好ましい。

【００３３】上記の様に調製されたハイブリッド２本鎖
ＤＮＡは、変性され、各々5'末端と3'末端を持つ２本の
ハイブリッド１本鎖ＤＮＡに分離される。ここで、変性
とは、ＤＮＡ複製の過程において、二重螺旋鎖ＤＮＡが
分離して１本鎖となる現象をいう。分離した各ＤＮＡ鎖
は鋳型として、鋳型に相補的な新しいＤＮＡ鎖の合成に
供される。この反応は、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒
される。

【００３４】変性により１本鎖となった各ハイブリッド
ＤＮＡ鎖の3'末端には、先に２本鎖プライマーを連結し
た部位の塩基配列に相補的な塩基配列を持つ１本鎖プラ
イマー分子がアニーリングされる。ここで、アニーリン
グとは、再生、またはハイブリダイゼーションとも呼ば
れ、変性の逆の過程、すなわち、相補的な２本の１本鎖
ＤＮＡを水素結合して、２本鎖ＤＮＡを生成することを
いう。

【００３５】アニーリングされたプライマーがＤＮＡポ
リメラーゼ反応で伸長されることにより、新たなハイブ
リッド２本鎖ＤＮＡが生成して、増幅が遂行される。本
発明においては、上記の変性、アニーリング、及びポリ
メラーゼ反応の過程を、所望の増幅度を得るまで反復す
るが、この増幅の方法としては、ＰＣＲを用いることが
好ましい。本発明におけるＰＣＲは、制限断片の両端に
２本鎖プライマーが連結され、サンドウィッチ状になっ
たものを基質として行なわれる。すなわち、塩基配列が
既知の２本鎖プライマーが、あらかじめ染色体ＤＮＡの
制限断片に連結されており、この部位がＰＣＲ時におけ
るプライマーのアニーリング部位となる。本発明では、
制限断片と２本鎖プライマーを、たとえ平滑末端どうし
で連結した場合においても、２本鎖プライマーの有する
5'末端のうち一方だけにしかリン酸基が存在しないので
２本鎖プライマーが断片に連結される方向は常に同一で
ある。このため、従来のＰＣＲと対照的に、ＰＣＲ反応
混合物には、１種類の１本鎖プライマーだけを、すなわ
ち、２本鎖プライマーを形成する１本鎖ＤＮＡの内、5'
水酸基末端を持つ鎖と同一の塩基配列を持つ１本鎖ＤＮ
Ａだけを加えればよい。また、増幅時に所望の２本鎖を
得るため、各ＤＮＡ鎖は別々に合成されることが好まし
い。この時、一方のＤＮＡ鎖を適当なポリヌクレオチド
キナーゼで処理し、他方は処理しないで、アニーリング
を行なう（Maniatis、前述の文献396を参照）。なお、
ＤＮＡ濃度と大きさが連結に及ぼす効果の理論的解析に
ついては、Dugaiczyk らJ. Mol. Biol. (1975) 96,1 に
詳しい。このようにしてＰＣＲ増幅された２本鎖ＤＮＡ
断片はすべて、あらかじめ選択した細胞学的遺伝子座由
来のものである。

【００３６】なお、ＰＣＲ反応に続いて、増幅後の断片
をベクター中にマイクロクローニングし、このベクター
により宿主細胞を形質変換し、増殖させることにより、
更に増幅を行なうこともできる。通常、この工程は必要
ないが、例えば、増幅したＤＮＡをクローニングして、
比較的ユニークで、プローブとして有効な個々のＤＮＡ
をスクリーニングする場合などに有効である。また、増
幅ＤＮＡの一部をクローニングし、残りはそのままプロ
ーブとして使用してもよい。

【００３７】本発明の好ましい態様の１つとしては、ニ
ックトランスレーションにより、ゲノム全体を放射線標
識ヌクレオチドで標識した後、制限酵素で消化して染色
体断片化を調製し、この断片をプローブとして用いるこ
とにより、上記増幅されたＤＮＡをスクリーニングす
る。反復配列はより強いシグナルを生ずる（Crampton
ら、1981）。この場合において、ゲノム全体を消化する
必要はなく、フローソーティングや顕微解剖などの手段
で特定の染色体部位を選択した後、適切な大きさの断片
に消化すればよい。

【００３８】本発明の調製方法においては、最後に、上
記のように増幅されたＤＮＡを、ハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いるために標識する。プローブの標
識方法に特に限定はなく、例えば、放射線同位体、発蛍
光団、クエンチャー、酵素または酵素基質などにより標
識することができる。標識のＤＮＡに対する結合は、直
接または間接どちらでもよく、また、共有結合または非
共有結合どちらでもよい。例えば、アビジン結合酵素を
ビオジン化ＤＮＡに結合させる方法や、蛋白質と結合し
た配列特異性ＤＮＡを目的のＤＮＡに連結させた後、そ
の蛋白質に特異性の、標識された抗体を結合させる方法
などがある。好ましくは、ハイブリダイゼーションプロ
ーブはランダムプライマーを用いて調製される（Feinbe
rgとVogelstein (1983), Anal., Biochem., 132, 6; I
d., 137, 266 ）。この方法では、プローブは32Ｐで標
識される。

【００３９】次に、本発明の遺伝子スクリーニング方法
について述べる。本発明においては、上記のように調製
された１種類以上の染色体特異性標識プローブをハイブ
リダイゼーションプローブとして用いて、in situ ハイ
ブリダイゼーションを行ない、ゲノムＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングする。ｃＤＮＡ転写
体は発現遺伝子に関連しているので、ｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングすることがより好ましい。すなわ
ち、遺伝子が発現されるときには、遺伝情報が先ずｍＲ
ＮＡに転写され、このｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳さ
れる。このｍＲＮＡを細胞から単離して、１本鎖ｃＤＮ
Ａを調製する鋳型として使用することができる。この１
本鎖ｃＤＮＡを、今度は鋳型として使用して、２本鎖ｃ
ＤＮＡを調製し、ベクターにクローニングする。すなわ
ち、ｃＤＮＡライブラリーとは、それぞれが興味ある細
胞によって産生されたｍＲＮＡから転写された、このよ
うなｃＤＮＡ挿入部を持っているベクターで形質転換さ
れた細胞の培養物である。それらの調製に使用された逆
転写酵素の前進性の限度のためにｃＤＮＡは完全な遺伝
子に対応しないかも知れないが、一度同定されれば、興
味ある遺伝子に関連したｃＤＮＡがゲノムＤＮＡライブ
ラリーにおける全遺伝子を同定するためのプローブとし
て使用される。なお、ハイブリッドダイゼーションプロ
ーブを用いて所望のクローンを同定する方法は、後述す
るManiatisらの文献309 ページに記載されている。

【００４０】

【作用】本発明では、塩基配列が既知の２本鎖プライマ
ーを、あらかじめ染色体ＤＮＡ断片の両断端に連結し、
増幅時にはこの部位にプライマーをアニーリングするの
で、標的部位に隣接する部位の塩基配列に制限されるこ
となくポリメラーゼ反応を行なうことができる。

【００４１】本発明で用いる２本鎖プライマーは、両5'
末端のうち一方だけがリン酸基であり、もう一方の5'末
端は、3'末端と同様に水酸基である。このため、染色体
断片と常に同一方向に連結される。従って、ＰＣＲを行
なう際に、従来と異なり、ＰＣＲ反応混合物には、１種
類の１本鎖プライマー、すなわち、２本鎖プライマーを
形成する１本鎖ＤＮＡの内、5'水酸基末端を有する方の
鎖と同一の塩基配列を持つ１本鎖ＤＮＡを加えるだけで
よく、プライマー調製の手間が少なくて済む。また、上
記の構造により、染色体断片と２本鎖プライマーの付着
末端どうしを連結する際に、２本鎖プライマーが３個以
上連結して、ＰＣＲを妨害するオリゴマーが生成するの
を防止でき、ＰＣＲを効率よく行なうことができる。

【００４２】本発明によれば、理論上、脊椎動物の１０
個の中期染色体を顕微解剖して得られた１０フェムトグ
ラムのＤＮＡ断片を、１０ナノグラムまで増幅すること
ができる。すなわち、試料ＤＮＡ中に１００キロベース
の塩基配列が存在するとすると、増幅産物中には、塩基
配列１キロベース当たり１ナノグラムのＤＮＡが含まれ
る計算になる。このため、クローニングを行なわなくて
も多量のＤＮＡを得ることができ、クローニングを行な
う場合でも、比較的増幅率の低いベクターを使用できる
ため、広範囲のベクターを選択できる。

【００４３】

【実施例】

実施例１ 図１には、本発明の一実施例が示されている。ドロソフ
ィラ・メラノガスタ（Drosophila melanogaster ）の第
３染色体の右腕の基部の83D-F 領域を本発明の方法の標
的として選んだ。この領域は、Tpl の重複か、異型接合
性欠失が致死的である（Lindsleyら、1972）という点で
ドロソフィラゲノムに特有のTpl 遺伝子座を含んでい
る。染色体断片を、唾液腺染色体から83D-F 領域は１つ
の単位として、そして83E-84E に渡って広がる３つの断
片の一続きとして切断した。染色体の断片を、各々、プ
ロティナーゼＫ−ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）緩
衝液の１ｎＬの小滴中に加えて処理し、フェノール抽出
によって除タンパクして（Pirrottaら、1983）。ＤＮＡ
の部分量を高濃度（４０単位／μＬ）のMboIで消化し
た。

【００４４】細いガラスの針を装着したミクロマニュピ
レーターを用いてガラスのカバースリップに固定した染
色体を切断した。切断したＤＮＡ断片を、蒸発を防ぐた
めにパラフィンオイルを満たしたチャンバー中のシラン
化処理したカバースリップから懸滴している１０ｍＭト
リス塩酸ｐＨ8.0 、１０ｍＭＮａＣｌ、0.1 ％ＳＤＳ、
５００ｇ／ｍＬプロテナーゼＫからなる１ｎＬの小滴中
に入れる。小滴をフェノールで３回抽出し、続いてクロ
ロフォルムで抽出して残存フェノールを除去する。２０
単位／ＬのMboI（特別注文でBethesda Research Lab.か
ら得た）を含む２５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ8.0 、５０ｍ
ＭＭｇＣｌ2 、２５０ｍＭＮａＣｌからなる溶液を１／
５容量加え、そしてオイルチャンバを３７℃でインキュ
ベートすることによりＤＮＡを消化する。この酵素は４
塩基対認識配列を持っており、その結果、ＤＮＡを４塩
基5'付着端を担っている多数の小片に切断する。この小
滴に、化１に示されるような、リン酸化されたMboI付着
端を持った２０量体の二本鎖オリゴヌクレオチドの等容
量を加える。

【００４５】

【化１】

【００４６】化１において、二本鎖オリゴヌクレオチド
の5'付着端だけがリン酸基であり、もう一方は水酸基で
あることが重要である。

【００４７】続いて２５０ｍＭトリス塩酸 pH8.0、５０
ｍＭＭｇＣｌ2 、５ｍＭＡＴＰ、５ｍＭジチオトレイト
ール、２５％ポリエチレングリコール４．５単位／Ｌの
Ｔ４リガーゼの混液を１／５容量を加え、オイルチャン
バを２０℃で１６時間インキュベートする。リンカー二
本鎖の濃度は、約５ｎＬ連結反応液中１００ｎｇ／Ｌで
あると見積もられる。

【００４８】それぞれの末端において構造が定まってい
る２０量体のオリゴヌクレオチドを持ったＤＮＡを含む
該小滴は、１０ｍＭトリス塩基ｐＨ8.0 、１ｍＭＥＤＴ
Ａの混液３Ｌで希釈することによってオイルチャンバか
ら回収される。その容積を５００ｍＭトリス塩基ｐＨ8.
3 、５００ｍＭＫＣｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ2 の混液を１
０Ｌ、各デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰとｄＴＴＰ、超高純度試薬ス
トック溶液、ファルマシア）の１０ｍＭ混液を２Ｌ、２
本鎖プライマーの２４量体のＤＮＡ鎖に対して相補的で
ある、適切な２０量体のオリゴヌクレオチド２００ｎｇ
／Ｌを１Ｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位、Perk
in Elmer Cetus, Norwalk, CT ）を１Ｌ、及びｄＨ2 Ｏ
８４Ｌを加えて容積を１００Ｌに調節する。ここでプ
ライマーとして用いられる、２０量体のオリゴヌクレオ
チドの組成を、化２に示す。

【００４９】

【化２】

【００５０】上記ポリメラーゼ連鎖反応液にパラフィン
オイルを重層し、９５℃で1.5 分間加熱し、ＤＮＡ二本
鎖を変性する。次に反応混合物を５２℃で２分間インキ
ュベートし、プライマーを、染色体ＤＮＡ分子の付着端
に対してアニーリングし、７２℃に温度を上げてＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ分子の半保存的複製が
行なわれるようにする。このサイクルを２５〜４０回繰
り返した結果、染色体ＤＮＡ断片の0.1 〜１ｐｇの出発
質量から１００ｎｇ以上が合成された。

【００５１】増幅した染色体ＤＮＡ（ＰＣＲプローブ）
は、アガロースゲル中で、数百から数千の塩基対の範囲
にある大きさのＤＮＡ断片のスミアーとして認められ
る。ドロソフィラ・メラノガスタの第３齢の幼虫の唾液
腺染色体の切断した83D-F 領域からのＤＮＡを増幅し
た。そして次にビオチン−１６−duTP（Enzo）とともに
ニックトランスレーションを行なうことによって標識し
た。ビオチン化したＤＮＡを染色体とハイブリッド形成
させ、ハイブリッドを形成した位置を３，３−ジアミノ
ベンチジンテトラハイドロクロライドを基質として使用
してストレプトアバアジン西洋ワサビ−ペルオキシダー
ゼ複合体で染色することによって現像した。

【００５２】ＰＣＲプローブの唾液腺染色体に対するin
situ ハイブリダイゼーションにより切断した区間にわ
たる主要シグナルを生じ、その他の部分でははるかにシ
グナルが弱かった。この結果からＰＣＲプローブは切断
したゲノム領域に相補的なユニークなＤＮＡ配列から主
として成り立っていることが示された。完全な83D-FＰ
ＣＲプローブに対する相補性によって単離されたいくつ
かのコスミドクローンもin situ ハイブリダイゼーショ
ンによって試験された。これらの実験は、83D-F 区間か
らのコスミドＤＮＡクローン中に反復配列の存在を明ら
かにしている。コスミドＤＮＡと対照的にＰＣＲプロー
ブがハイブリダイゼーションの強い二次的部位を明らか
にすることができなかったことは、おそらく増幅ＤＮＡ
に配列のより大きい複雑性が存在することの表れであろ
う。ＰＣＲプローブはたぶん２００ないし３００キロベ
ースのゲノムＤＮＡ配列を代表しているが（Bossy ら、
1984）コスミドクローンは約４００キロベースのゲノム
配列を含む。

【００５３】増幅したＤＮＡが切断した染色体領域を代
表している程度をさらに試験するために制限酵素分解し
たコスミドＤＮＡのサザンブロットをＰＣＲプローブと
ハイブリダイゼーションさせた。ドロソフィラ・メラノ
ガスタのゲノムＤＮＡの約１０5 のcospneo クローンを
３０００Ｃｉ／ｍＭ［32Ｐ］ｄＡＴＰでニックトランス
レーションによって認識した83D-F ＰＣＲプローブでス
クリーニングした。約１００の陽性クローンから、８個
を拾いあげた。１つのプレートからのコスミドのうち４
つは同一であった。コスミドからのＤＮＡをEcoRl とXb
a-I で消化し、１％アガロース上で分画しエチジウムブ
ロミドで染色した。ＤＮＡはニトロセルローズにブロッ
ト転移させ、83D-F プローブでハイブリッドを形成させ
た。その結果から、これらの制限酵素分解を受けたコス
ミドクローンにおけるより大きなゲノムＤＮＡ断片の大
部分がＰＣＲプローブによって検出されることが示され
た。それゆえ、このプローブは、in situ ハイブリダイ
ゼーションの結果によって示唆されるように切断された
染色体断片中に存在するＤＮＡ配列の多くを含んでいる
ように思われる。

【００５４】染色体の領域が豊富な反復ＤＮＡ配列を含
んでいる場合には、プローブとして使用するためにユニ
ークな増幅ＤＮＡ断片の相当する収集を同定することが
望ましいであろう。83D-F 区間から得られたＰＣＲプロ
ーブをMboIで消化し、ホスファターゼで処理したBam-HI
で開いたプラスミド中にショットガン方式でクローニン
グした。これらの組換え体プラスミドを持っている数百
個のバクテリアのコロニーをニトロセルローズフィルタ
ーに固定し、そして反復ＤＮＡ配列（Cramptonら、198
1）を含むクローンを同定するために全ゲノムＤＮＡと
ハイブリダイゼーションを行なった。これらのコロニー
をプレート上から取り除いた。残ったコロニーをとって
おき、多量に生育させ、ゲノムの挿入部を多量に単離
し、コスミドクローンのライブラリーのプローブとして
使用した。完全ＰＣＲプローブと同様に、このプローブ
も、83D-F 領域から由来するＤＮＡクローンを同定する
ことができた。この手順を用いての遺伝子同定のための
別の戦略は、個別のクローン、または増幅したＤＮＡラ
イブラリーからのいくつかのクローンのプールを適当な
変異体中の制限断片の長さの多型性を同定するためのプ
ローブとして使用することであろう。

【００５５】特異的な染色体領域からの増幅されたＤＮ
Ａプローブも全ゲノムの物理的地図作成とこれらプロジ
ェクトについてのクローンの収集におけるギャップを満
たすために使用することができる。

【００５６】実施例２ 実施例１では、本発明の方法により、ドロソフィラ・メ
ラノガスタの多糸性染色体からＤＮＡを得たが、本発明
は、他の生物の非多糸性染色体の特異的領域からＤＮＡ
を単離するためにも有効なはずである。以下はヒト（非
多糸性）染色体からＤＮＡを増幅するためのプロトコル
である。

【００５７】１．フローソーティングによって単離され
た特異的な型（染色体２２）の中期のヒト染色体約４
０，０００を１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ7.5 、１ｍＭＮａ
−ＥＤＴＡ，１０ｍＭＮＡＣｌ、0.1 ％ＳＤＳ、0.25ｍ
ｇ／ｍＬプロティナーゼＫの混液１００μＬ中に懸濁さ
せ、５５℃で１時間インキュベートした。 ２．ＤＮＡ溶液を等量のフェノール／クロロフォルムで
１回抽出した。 ３．ＤＮＡ溶液を等量のクロロフォルムで１回抽出し
た。 ４．１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを2.5 容量のエ
タノールとともに加え、この混液を２０℃で１６時間イ
ンキュベートした。 ５．ＤＮＡの沈殿をミクロ遠心分離機中で１４，０００
ｘｇで３０分間遠心分離することによって集め、精製染
色体ＤＮＡのペレットを回収した。 ６．ＤＮＡのペレットを、１μＬのReact ２緩衝液(Bet
hesda Research Labs)、１μＬのMboI酵素（２０単位／
μＬ）を加えた８μＬの蒸留水に溶解した。そして混合
物を３７℃で１時間インキュベートした。 ７．（６）における１０μＬのＤＮＡ消化物に、２μＬ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＢＲＬ）、１μＬのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（９単位／μＬ，Bohringer/Mannhei
m）、１μＬのオリゴヌクレオチドリンカー／アダプタ
ー（0.5 μｇの前述のリン酸化MboIの４量体付着端を持
った２０量体オリゴヌクレオチド二本鎖）と６μＬの蒸
留水を加え、混合物を１９℃で１６時間インキュベート
した。 ８．２μＬの連結産物（７）を実施例１で示したように
１００μＬのポリメラーゼ連鎖反応カクテルの中にいれ
て薄め、２０サイクルの増幅を行なった。

【００５８】本操作手順の結果、出発染色体ＤＮＡから
in vitroでＤＮＡを多量に合成し、収集できる。本実施
例は、単数の多糸性染色体を消化する代わりに非多糸性
染色体の複数を望ましい断片に切断するという点で、実
施例１と異なっている。好ましくは、所望の染色体の少
なくとも約１，０００のコピー（即ち多糸性染色体中の
多糸性の程と同じ位の数）が提供される。染色体のコピ
ーの数が多いほど、そして染色体上の増幅されるべき興
味ある遺伝子、または他の遺伝子的要素のコピーの数が
多い程、少ないＰＣＲサイクルで所望のレベルの増幅を
達成することができる。増幅した非多糸性染色体断片を
in situ ハイブリダイゼーション実験におけるプローブ
として使用した（Pinkelらによって記述された「染色体
ペインティング」、PNA(USA), 85:9138-42(1988)）。こ
れによって各断片がそれが由来した染色体とハイブリッ
ドダイゼーションしたことを確かめた。この増幅ＤＮＡ
分子の収集は、引き続き材料をプラスミドまたはバクテ
リオファージベクターの中にクローニングするか、もっ
と容易にはさらに複数ラウンドのin vitro増幅によって
続行することができる。

【００５９】適切に標識された、増幅染色体ＤＮＡを遺
伝子スクリーニングに使用することができる。例えば、
ダウン症候群と結びついたヒト染色体２１を、フローソ
ーティングを使用して単離することができ、そして本発
明を使用してこの染色体の断片を増幅することができ
る。ダウン症候群についての検定においては、胚のＤＮ
Ａがこのように得られた標識断片を使用してスクリーニ
ングされる。正常なヒトでは染色体２１が２つだけであ
る。３本のこのような染色体の存在は、ダウン症候群の
遺伝子マーカーである。

【００６０】慢性骨髄性白血病は異常なフィラデルフィ
ア染色体がマーカーとなっている。これは染色体９と２
２の転座を通じて起こる。染色体９と２２を別々に単離
子、そしてそれらの断片を増幅し、最初の染色体９とハ
イブリッド形成を形成するプローブと２番目の染色体２
２とハイブリッドを形成するプローブを作るのに使用す
る。これらのプローブは異なる方法で標識される（例え
ば、異なる放射波長の発蛍光団）。フィラデルフィア染
色体は両方のプローブによって検出される。正常な染色
体９と２２は一方のプローブまたは他方のプローブとだ
け強くハイブリッドを形成する。

【００６１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
ポリメラーゼ反応によりＤＮＡ増幅を行なう際に、標的
部位に隣接する部位の塩基配列が既知である必要がな
く、また、プライマーとして加える１本鎖ＤＮＡは１種
類だけでよい。このため、ポリメラーゼ反応を効果的に
利用して、目的のプローブを短時間で多量に合成するこ
とができる。

【００６２】本発明のプローブをもちいることにより、
染色体の数や構成などに関する遺伝学的分析が容易とな
る。例えば、ｃＤＮＡに対するショットガンプローブと
して用いて、ｃＤＮＡクローンを収集し、次にこれらの
クローンをプローブとしてゲノムのクローンの重複シリ
ーズを単離したり、また、これらのｃＤＮＡクローンを
用いて、ゲノムのサザンブロットにおいてはっきりと識
別できる制限酵素断片長多型(ＲＥＬＰｓ)を探索し、遺
伝子特異性の欠陥を確認することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における染色体特異性標識プローブの調
製方法の一実施例を示す連続図である。

【図２】両5'末端を処理しない２本鎖プライマーを用い
た場合における、ＰＣＲ反応の様子を示す連続図であ
る。

【図３】5'末端の一方を水酸基で置換した、本発明にお
ける２本鎖プライマーを用いた場合における、ＰＣＲ反
応の様子を示す連続図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 染色体またはそのコピー、及び／または
   染色体断片またはそのコピーに由来する１つ以上の２本
   鎖ＤＮＡを原料として、以下の工程、すなわち、 （ａ）前記２本鎖ＤＮＡを切断して、両側に断端を持つ
   ２本鎖ＤＮＡ断片を調製する工程と、 （ｂ）前記２本鎖ＤＮＡ断片の両断端に、5'末端の一方
   がリン酸基、他方が水酸基であるプライマー２本鎖ＤＮ
   Ａを連結して、ハイブリッド２本鎖ＤＮＡとする工程
   と、 （ｃ）前記ハイブリッド２本鎖ＤＮＡを変性して、ハイ
   ブリッド１本鎖ＤＮＡ鎖とする工程と、 （ｄ）前記ハイブリッド１本鎖ＤＮＡの3'末端に、前記
   （ｂ）で連結したプライマー２本鎖ＤＮＡの塩基配列部
   位に相補的なプライマー１本鎖ＤＮＡをアニーリングす
   る工程と、 （ｅ）前記アニーリングしたプライマー１本鎖ＤＮＡを
   伸長することにより、ハイブリッド２本鎖ＤＮＡを生成
   する工程と、 （ｆ）前記（ｃ）〜（ｅ）を所望の増幅度を得るまで反
   復する工程と、 （ｇ）増幅されたハイブリッド２本鎖ＤＮＡ断片を、直
   接または間接的に標識する工程、を含むことを特徴とす
   る染色体特異性標識プローブの調製方法。
2. 【請求項２】 染色体ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片の両端
   に、塩基配列が既知のＤＮＡ断片が連結されてなるハイ
   ブリッド２本鎖ＤＮＡであり、かつ直接または間接的に
   標識されていることを特徴とする染色体特異性標識プロ
   ーブ。
3. 【請求項３】 請求項２記載の染色体特異性標識プロー
   ブを１つ以上用いてin situ ハイブリダイゼーションを
   行なうことを特徴とする遺伝子スクリーニング方法。