JPS62266000A - 微生物の急速ｄｎａ試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的核酸含有試料を７フセイして特定の
微生物の存在を検出する方法に関する。

さらに詳しくは、生物学的試料から集めることのできる
バクテリアまたは他の有機体を同定しかつ定量するため
の、非常に急速かつ感受性の核酸交雑試験（ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ　　ｔｅｓＥ）に関する。

現在の技術状ぶである試験は、クローニングされ断片化
されたゲノム（ｇｅｎｏｍｅｓ）またはエピソーム（ｅ
ｐｉｓｏｍｅｓ）から、それらがある遺伝子または性質
の所望の組を有する他の配列を表わことを基準にして、
選択される特定のＲＮＡまたは組換え体ＤＮＡであるプ
ローブを包含する０例えば、ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ
）らへの米国特許第４，３５８，５３５号は、ｍ　ＲＮ
　Ａから、あるいは遺伝子または遺伝子断片のクローニ
ングによって、特別に得られたプローブ、ｃＤＮＡ逆転
写体を記載した。また、次の文献を参照：１９８５年の
概観文献１組換え体ＤＮＡおよび他の直接検体の同定技
術（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ＤＮＡ　　ａｎｄ　　
０ｔｈｅｒ　　ＤｉｒｅｃｔＳｐｅｃｉｍｅｎ　　Ｉｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
）Ｊ、Ｌ、Ｓ、　　ト　ンプキンス（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ
）著、これはバクテリア同定系についてのシンポジウム
のときに提出され、そして実験室の医学における臨床（
９土ユｎ１ｃｓ　　ｉｎ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｖｏ１、５．９９−１０７ページ
に発表された。また、ある種の寄生生物の特殊化した細
胞器官中に見出される非常に高度に反復した短い環状Ｄ
ＮＡ配列、すなわち、レイシュマニヱ（Ｌｅｉｓｈｍａ
ｎｉａ）および関連する原生動物の動原核（変性したミ
トコンドリア）ＤＮＡを使用して、対応する動原核含有
原生動物によって感染した動物組織の調製物中の相同配
列を検出することは可能である（ＰＣＴ／ＵＳ８３１０
１０２９）。

種特異的ＤＮＡの交雑のたねのプローブ調製物は、特定
の遺伝子生産物の同定および分離を必要とし、あるいは
問題の種に対して独特であるか事実状独特である塩基配
列を有するゲノムの短い部分の同定および分離を必要と
するという仮定は広く支持されている。同様に、関連す
るバクテリアのある郡のＤＮＡのプローブを作ろうとす
るとき、遺伝子生産物の同定、あるいは交叉交雑の所望
の性質を有する関連ゲノムの１つのクローニングしたセ
グメントの同定が必要でることが期待される。ＤＮＡを
クローニングしかつ交雑としてプラスミドまたは他の組
換え体ＤＮＡを使用しなくてはならいと仮定された。な
ぜなら１分別しないゲノムＤＮＡを含む交雑の研究が、
種の間の盟店性を検査しあるいは立証するためになされ
てきたからである。［ジョンソン（Ｊ　ｏ　ｈ　ｎ　ｓ
　ｏ　ｎ）、Ｊ、Ｌ、（１９８４）、バクテリアの分類
におけｎ）、８−１１ページ、Ｎ、Ｒ，クリーブ（Ｋｒ
ｉｅｇ）（編）、分類学的細菌学のバーゲイのマＨｙ）
、Ｖｏ１、１、ウィリアムス・アンド・ウィルキンソン
ス、７へルチモアコ。このような研究において、関連が
ないバクテリアの種の間でさえ非常に多過ぎるＤＮＡ配
列の相同性が存在して、クローニングしないＤＮＡは有
用なプローブとなることができないと思われてきたので
、２つの異なるゲノムＤＮＡを、いかに悪くよりはむし
ろ、いかによく交雑させるかが強調されてきた。

本発明以前においては、微生物の種の検出および同定の
ためのプローブは長さが数百ないし数千のヌクレオチド
のクローニングしたＤＮＡ配列であった。このＤＮＡ配
列は大量のゲノムから、ある性質、例えば、種または遺
伝子の一部に対する立証可能な独特性を基準にして、組
換えＤＮＡ手順によって精製された。この方法は欠点を
有し、そしてこれらの欠点は本発明によって克服される
。

第１に、従来、微生物の種の検出および同定のためのプ
ローブの役割をはたしてきた、クローニングしたＤＮＡ
セグメントの発生、特性づけおよび伸張は、高度に熟練
した分子生物学者のかなりの努力を必要とした。時間が
かかる組換え体ＤＮＡ手順によるプローブ発生および調
製は不必要であり、そして望ましくないことさえあるこ
とを。

未発明者らはここで明らかにする。：３２に、標識した
分別しないゲノムＤＮＡプローブが試料の分別しない核
酸中の相補的配夕噌に交雑できる程度は、クローニング
したゲノムの小さい部分が交雑できる程度の２〜３桁大
きく、その結果、交雑信号および感度は多数倍となり、
そして検出はいっそう急速となる。第３に、細胞の多数
のｒＲＮＡを利用して急速な交雑および検出を達成する
クローニングしたＤＮＡ一対一細胞のリポソーム−ＲＮ
Ａ　（ｒＲＮＡ）交雑手順［例えば、ゲンブローブ（Ｇ
ｅｎＰｒｏｂｅ）、米国カリ７２ル：ア州すンジエゴ、
よって商業化された組織培養物のマイコプラズマ汚染試
験］が存在するが、本発明の全ゲノム交雑系は細胞当り
検出可能な配列の数において優れ、そして（ｉ）標識さ
れたゲノムＤＮＡプローブは交雑の間に組換え体ＤＮＡ
が形成できない、信号増幅ネットワークを形成すること
ができ、そして（ｉ　ｉ）細胞中のゲノムＤＮＡの量は
不変であるが、ｒＲＮＡの量は細胞の生理学的状態に従
ってかなり変動することがる、という利点を有する。

本発明は、工程： （ａ）生物学的核酸含有試料を固定化し、（ｂ）核酸を
変性し、 （ｃ）前記試料を、アッセイすべき微生物の分別（ｆ　
ｒａｃｋ　ｉ　ｏｎａｔ　ｅ）Ｌない、標識し、変性し
た全ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）ＤＮＡのプローブと、交雑
条件下に接触させ、そして（ｄ）前記標識を検出するこ
とによって、交雑した核酸をアッセイする、 を含んでなることを特徴とする生物学的核酸含有試料を
特定の微生物、例えば、バクテリア、菌・カビ（ｆｕｎ
ｇｉ）、ウィルスまたは原生動物の存在についてアッセ
イする方法、に関する。

本発明は、また、 （ａ）［知の微生物からの標識された全ゲノムＤＮＡ、 （ｂ）固体の支持体上に固定化された参照核酸試料、前
記支持体は試料の固定化に利用できる、 （ｃ）交雑試薬、および （ｄ）化学ルミネッセンス検出のための試薬、 からなる生物学的核酸含有試料を特定の微生物の存在に
ついてアッセイするためのキット、に関する。

前述のキットにおいて、交雑試薬は既知の微生物からの
標識した全ゲノムＤＮＡを含有することができる。

前述の交雑試薬は、塩化ナトリウム、ドデシル硫酸ナト
リウム、ウシ血清アルブミンまたは脱脂乳および必要に
応じてホルムアミドの混合物を含むごとができる。

本発明の新規な特長は、分別しないバクテリアまたは他
の全ゲノムＤＮＡを、試料物質中の核酸の急速な検出お
よび同定のための交雑プローブとして使用できるという
ことである０本発明は種々の交雑フォーマツ）　（ｆ　
ｏ　ｒｍａｔ）によって限定されない、なぜなら、本発
明は種々の試料調製手段、プローブ標識プロトコール（
ｐｒｏｔｏｃＯＩＳ）、およびアニーリングおよび洗浄
の条件を含むことができるからである。プローブとして
、ある方法１例えば、クローニングにより分別されたＤ
ＮＡよりはむしろ、ゲノム中の配列のすべて、あるいは
木質的にすべてを使用すると、交雑信号を急速に検出す
ることができる。その理由の一部は、特定の配列を欠失
（ｄｅｐｅｌｅｔ）されなかった細胞からのＤＮＡ　（
ゲノムＤＮＡと定義する）の調製物は、同じＤＮＡの一
部分がなすよりも、相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ））細
胞ＤＮＡの試料へ完全に交雑する能力を有することにあ
る。

本発明による急速な信号の検出は、また、相補的配列の
含量と重複する、不規則な末端を有する断片の７二−リ
ングから生ずる標識プローブのネットワーク（ｎｅｔｗ
ｏｒｋ）の形成によって促進される。プローブＤＮＡの
精製および標識付けは、二本鎖分子の本質的に不規則な
剪断および個々のポリヌクレオチド鎖のニラキング（ｎ
ｉｃｋｉｎｇ）を含む、これらの剪断およびニラキング
の結果、プローブＤＮＡが試料ＤＮＡとの交雑のために
変性される（−末鎖とされる）とき、この調製物は重複
する相補的配列の集団から構成される。交雑の過程の間
、プローブＤＮＡの一本鎖のあるものは試料ＤＮＡとア
ニーリングし、そしであるものは他のプローブ配列とア
ニーリングする。操作可能生の特定の理論の拘束された
くないが、このような不規則の末端を有するプローブ配
列の交雑は、試料ＤＮＡまたはさらにプローブＤＮＡへ
の交雑のために利用できる状態にとどまる一木鎖末端を
有する二重らせんを生ずると信じられる。このことが意
味するように、試料ＤＮＡとアニーリングするプローブ
ＤＮＡの分子は、また、プローブＤＮＡなどの他の分子
と７ニーリングし、こうしてネットワークを形成し、そ
して交雑信号を増幅する。

驚くべきことには１本発明によれば、交雑法のパラメー
ター、温度、塩濃度および有機溶媒の存在を調節して、
交雑および厳格な洗浄の条件を規定することによって、
ある数のバクテリアの属からの精製されたＤＮＡ試料を
１組として同一の分別しないＤＮＡの標識した調製物の
１系列でプロービングするとき、前記ＤＮＡ試料を明確
に識別することができた。次いで、この手順は、わずか
に変更して、すなわち、前述の交雑の溶液の粗製、交雑
の時間などのをわずかに変更して、粗製の細胞リゼイト
（Ｌｌｙｓａｔｅ）中（７）ＤＮＡの同定および定量に
適用できることが発見された。

有機体を識別するための交雑試験の能力は、かなりな程
度に、核酸の交雑および交雑後の洗浄のために選択する
条件、すなわち、基準に依存する。交雑の品質に影響を
及ぼすように操作することができる条件は、（１）交雑
溶液および洗浄溶液中に塩濃度、そして（２）これらの
溶液の温度である。核酸二重らせんにおいて許容される
塩基の不一致の比率は、塩濃度が減少するにつれておよ
び／または温度が少々するにつれて、減少する。交雑の
歓檻遺はこれらのパラメーターによって定められ、これ
のパラメーターは完全な塩基対の形成を要求するように
、あるいはある範囲の値にわたって完全より低い塩基対
の一致を許すように操作することができる。このことが
意味するように、条件または厳格さを調節することによ
って、密接に関連する種およびかけはなれた種の間の識
別を程度を達成することができる。例えば、本発明の１
つのモードにおいて、グラム陽性バクテリアおよびグラ
ム陰性バクテリアのみを識別し、そして他のモードにお
いて、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅ
ａｅ）の構成員を他の微生物の族と識別することができ
、そして最も感度の高いモードにおいて、この族におけ
るバクテリアを１例えば、クレブシェラ・ニユーモニエ
ｘ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎ上工至
）よりわむしろ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌｉ）を同定することができる。

クローニングしたプローブまたは分別した核酸を含む交
雑系では、混合試料中の相同配列への標識ゲノムＤＮＡ
の交雑の特異性は、プローブに関連するが、プローブに
対して真に相補的ではない、試料中の核酸とプローブと
の相互作用を減少することによって増大することが′ｔ
′きる。これは標識しない既知の核酸の予備交雑および
／または交雑の工程を含めることによって達成され、こ
のような交雑は、混合試料において、標識したプローブ
のあるものと結合することによって所望の測定を妨害す
るであろうＤＮＡまたはＲＮＡの配列を飽和するであろ
う。

下に記載する実施例において、プローブの標識付けは、
雑種の検出が試料の膜のオートラジオグラフによる場合
、放射能によって実施するか、あるいは雑種の検出がプ
ローブの蓄積部位における酵素的色の生成による場合、
ニック翻訳によるビオチンの組込みによって実施する。

しかしながら、限定的な読取り要件は存在しないので、
他のプローブの標識付けは本発明に等しく適用される。

本発明は、有機体を集め、濃縮し、そして、マトリック
ス、例えば、ニトロセルロース紙上にその場で、あるい
は溶液中で溶菌する、いかなる場合においても適用する
ことができる。こうして、本発明はバクテリアに適用で
きるばかりでなく、かつまた他の微生物の検出および同
定に適用することができる。それらの例は１次の通りで
あるが、これらの限定されない：ウイルス、例えば。

サイトメガロウィルス、単純ヘルペスウィルスおよびヒ
トＴ−リンパそう行性（Ｔ−１ｙｍｐｈ。

ｔｒｏｐｉｃ）ウィルス、菌・カビ類、例えば、膣炎お
よび他の真菌症の感染の主な病因学的因子の原因である
プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉ且」）種およびトリ
コモナスΦバギナリス（エエｉｃｈｏｍｏｎａｓ　　ｖ
ａｇｉｎａｌｉｓ）、医学的微生物学の包括的考察は１
次の文献に記載されている：レンネッテ（Ｌｅｎｎｅｔ
ｔｅ）、Ｅ、Ｈ，ｌ１、　　　　物学のマニュアル（鼠
エユｎｕａｌ　　　ｏｆ　　　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　　
Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏ　　　）、第３版、アメリカンφソサイアテ
ィー・フォー−マイクロバイオロジー、米国ワシントン
州、１９８０．本発明は尿道の感染の診断においてとく
に有用である。

次のバクテリアは尿道の感染（ＵＴＩ）に導く太服遁（
Ｅ　ｓ　ｃ　ｈ　　６０〜９０％の発生率、ｖＪ胱ｅｒ
ｉｃｈｉａ　　　炎（低いＵＴＩ）および腎孟ｃｏｌｉ
）　　　　　腎炎（腎を包含する）の両者における最も
普通のＵＴＩ病 原体、ＵＴＩの大部分は約１ ６０　０−血清型；はんの限 定された数によって引き起こ される；これらは０１．０ ２．０４．０６，０７．０ ８．０９．０１１、Ｏ１８゜ ０２５．０３９．０７５であ る；　ｏ−Ｉｌ；！性分離物にも頻繁 に直面する。

プロテウス種　第２の最も頻繁に直面する尿（ｐｒ□ｔ
ｅｕｓ　　動の病原体；５〜２０％、きｓｐｐ、）　　
　　わめて過酷な腎の感染を引き起こすことがある。３
つの種 ：Ｐ、　　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ （最も普通）、ヱユ　匹ユニ ｇａｎｉｉおよび旦ユ　Ｌ！ ｔ　ｇｅ　ｒ　ｉ、血清学は複雑で あるが、特に関連性ない。

クレブシェラ種（発生率３〜１０％、多少任意スタフィ
ロコツカ　ＵＴＩに関連する２つの種：ｓ　　ｓｐｐ、
）　　　ｅｒｍｉｄｉｓ、発生率４〜２０％、いったん
見過ごされ たが、これらの有機体は細菌 頻繁な病原因子であることが 発見された。

ストレプトコツ力　、ミュ　ｆａｅｃａｌｉｓ最も３種
（Ｓｔｏｒｅ　　普通；発生率２〜５％。

他のグラム陰性か　これらは−緒になってＵＴＩん軟菌
（ｒｏｄ）　　の低い率を占める；Ｐｓｅｕｅｓ、Ｅ、
　　ｈａｆｎｉａ、 泳動の感染の試験の目的は三重である＝（１）試料が無
菌であるか否かを決定する（環境に依存して、試料が１
０４または１０５細胞／ｍｌを含有する場合）； （２）感染が存在する場合、それがグラム陽性またはグ
ラム陰性のバクテリアかどうかを決定する； （３）感染の原因であるバクテリアの特定の種を決定す
る。

好ましい実施態様において、試験すべき物質をニトロセ
ルロース膜上の小さいスポットとして集め、そしてＮａ
ＯＨ溶液上にこの膜を浮かべることによってバクテリア
または他の有機体をその場で溶菌する；これは、また、
ＤＮＡへ変性しかつその膜上のスポットにおいてそれを
固定化する効果を有する。同一の膜または付属する膜の
上に標準が存在し、前記標準は有機体の既知量の変性さ
れたＤＮＡのスポットであり、それらに対して流体を試
験する。ＤＮＡの変性後、膜を処理して交雑のために準
備する。

プローブは、試験すべき試料の予測される複雑さおよび
同時の決定を実施する必要性に依存して、１または複数
の種からのＤＮＡであることができる。プローブはラジ
オアイソトープで、あるいはラジオアイソトープ以外で
標識することができ、そして標識付けは生体内または生
体外で実施することができる。単一の混合物中の異なる
プローブを異なる方法で標識することができるので、Ｄ
ＮＡの複雑な試料への１より多い交雑を個々に検出しか
つ同定することができ、同様にプローブの混合物の単一
の構成員を交雑することができる。

プローブＤＮＡは、例えば、バクテリアの培養物から標
準法によって調製することができる。標準法は、洗浄剤
の溶菌、有機溶媒による抽出、エタノール沈殿および緩
衝水性媒質中のＤＮＡの解離を包含する。この取扱いの
結果、各細胞からのＤＮＡは、もはや、無傷の細胞中に
あるような染包体の大ささの１つの二本鎖の分子ではな
く、むしろ、この精製法はＤＮＡを多分１００，０００
塩基対（１００ｋｂ）の平均長さの小さい分子に剪断す
る。こうして、バクテリアの染色体は精製の間に断片化
し、そして、破壊する間、一般にｌ／２，１／４．１／
８などの大きさの分子を生成し、破壊の部位はＤＮＡ配
列に関して不規則である。

プローブＤＮＡの標識付けは、ある数の方法で実施する
ことができ、ある方法はラジオアイソトープを包含し、
そしである方法はそれを含まない。プローブのはたらき
をするＤＮＡの試料は。

ゲノムの断片の非常に高度に重複した組から構成されて
いる。バクテリア、（およびウィルス）の場合において
、ゲノムは表現「染色体の大きさのＤＮＡ分子」と同義
語である。なぜなら、バクテリアにおける遺伝情報の事
実上すべては、バクテリアの染色体と考えられるものか
ら構成する単一のＤＮＡ分子中に含有されるからである
。交雑系において有効であることが立証された１つのＰ
！識付は手順は、ニック翻訳である。この手順は、ＤＮ
Ａ試料を２つの酵素、すなわち、Ｄナーゼ（ＤＮａｓｅ
）ＩおよびＤＮＡポリメラーゼで処理することを含む、
Ｄナーゼエはエンドヌクレアーゼであり、−末鎖のニッ
クを二本鎖ＤＮＡ分子中に本質的に不規則に導入する０
次いで、ＤＮＡポリメラーゼはニックをＤＮＡ合成の開
始点として使用し、そして存在するポリヌクしオチド鎖
の一部分を置換することにより、デオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートをポリマーのＤＮＡ中に組込む、
Ｄナーゼエによるニラキング（ｎｉｃｋｉｎｇ）は、ま
た、−木調のレベルでＤＮＡ非常に減少した長さを生ず
る。

交雑の速度および高い感度（数時間内に１つのスポット
において１０４のバクテリアの不明瞭ではない検出）は
、標識プローブとして、ゲノムのクローニングした小さ
い部分よりはむしろ、分別しないバクテリアのＤＮＡの
試料を使用することによって達成される。交雑の特異性
（バクテリアの種の不明瞭ではない識別）は、交雑およ
びフィルターの洗浄のために条件の特定の組を選択する
ことによって達成される。

種々の方法を使用してポリヌクレオチドの標識付けを標
識付けすることができる。標識は、１つの位置に集まる
ようにするよりはむしろ、ポリヌクレオチドの長さに沿
って分布させることが好ましい、標識付けのいくつかの
手段を下に概説する。

５−（３−アミン）アリルデオキシウリジントリホスフ
ェート（ＡＡ−ｄｕＴＰ）またはそのビオチニル化誘導
体を、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ａｔ１、　　Ａｃａｄ
、　　Ｓｃｉ、）、７８：６６３３（１９８１）の方法
によって合成し、そしてＤＮＡポリメラーゼを使用する
ニック翻訳よって二本ｆｉＤＮＡプａ−プ中に導入する
ことができる。アミノ側基をもつプローブをアミン反応
性標識と反応させることができる。

６−カルボキシフルオレセインおよび４°。

５′−ジメトキシ−６−カルボキシメチルフルオレセイ
ンのＮ−ヒドロキシスフィンイミドエステル、およびそ
れらのベーターガラクトシル銹導体を、ニック翻訳され
たプローブと直接反応させることができる。これらの活
性化された色素を過剰量で使用して標識の組込みを最大
にし、次いで結合しない色素をゲル濾過によって標識さ
れたＤＮＡから分離する。

架橋基上に末端アミンをもつ標識は、二官能性試薬、例
えば、ジメチルアジビミデート、ヘキサメチレンジイソ
シアネート、およびｐ、ｐ’−ジフルオロ−ｍ、ｍ’−
ジニトロ−フェニルスルホンによって、ニック翻訳され
たＤＮＡへ結合することができる。標識を過剰量の二官
能性試薬と反応させ、次いで反応しない試薬を除去する
ことができる。活性化された標識をニック翻訳されたプ
ローブと反応させることができる。

ある種の平らな芳香族化合物は、二本鎖核酸の血液の間
に入り（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅ）可逆的複合体（ｃｏ
ｍｐｌｅｘ）を形成する。あるインターカレイティング
剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　　ａｇｅｎｔ）を、
インタカレーション（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）複
合体の光分解によって、ポリヌクレオチドへ共有結合さ
せることができる。光活性化可能なインターカレイティ
ング剤の例は、８−７ジドエチジウム、８−７ジドメチ
ジウムおよびフロクマリン類１例えば、アンゲリシンで
ある。これらのインター力レイター（ｉｎｔｅｒｃａｌ
ａｔｏｒ）は、官能基を含有する架橋アームで変性する
ことができる。８−７ジドメチジウム銹導体は、次の文
献に記載されているようにして調製できる：へルツバー
グ（Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ）およびダーバン（Ｄｅｒｖａ
ｎ）、至に力土二土にヱヱ旦左ヱニ文ユ差亜・ソサイア
テ４　（Ｊ、　　Ａｍｅｒ、　　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、）、１０４：３１３　（１９８２）およびミッ
チェル（Ｍｉ　ｔ　ｃｈｅ　ｌ　ｌ）およびダーバン（
Ｄｅｒｖａｎ）、　盗−＋ｊＬ”：ｒ２エフ％’Ｊ５（
１９７２）、標識は変性されたインター力レイターへ直
接結合することができる０例えば、６−カルボキシフル
オレセインまたは４′、５°−ジメトキシ−６−カルボ
キシメチルフルオレセインのＮ−ヒドロキシスフィンイ
ミドエステルを、インター力レイター誘導体と反応させ
てアミン架橋を形成することができる０次いで、これら
のインター力レイターー標識接合体をポリヌクレオチド
のプローブに付加し、−七して光分解することができる
。あるいは、変性されたインター力レイターをポリヌク
レオチドのプローブで光分解し。

次いで標識化合物に結合させることができる。８−７ジ
ドメチジウムは、インター力レイターの以外の機構を介
して、−末鎖核酸へ光分解的に化合物することができる
［パルトン（Ｂａｌｔｏｎ）およびカーｙ（Ｋｅｒｎ）
（１９７８）線艶Ω呈ｇ（Ｎｕｃ１、　　Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒｅｓ、）、５：４８９１３、この手段を使用してこ
のインター力レイター誘導体を一本鎖のＤＮＡおよびＲ
ＮＡへ結合することができる。

ＲＮＡ−ＲＮＡ雑種の検出のために、抗体を使用するこ
とができる。ＤＮＡ　　ＲＮＡ雑種に対して特異的な抗
体を刺激する免疫原は、ホモポリマーまたはへチロポリ
マーのポリヌクレオチド二重らせんからなることができ
る［キタガワ（Ｋｉｔａｇａｗａ）およびストラー（Ｓ
ｔｏｌｌａｒ）（１９８２）ｉ土又垂工（Ｍ　ｏ　１　
、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏ、）、１９：４１３１］、選択し
たＲＮＡＤＮＡ二重らせんは、メチル化蛋白質へ吸着さ
せることができ、あるいはそうでなければ普通の免疫原
担体物質１例えば、ウシ血清アルブミンに結合させ、そ
して所望の３１種動物に駐車することができる［ストラ
ー（Ｓｔ　ｏ　１１ａｒ）（１９８０）　外工免庶工（
Ｍｏ　１　、　　Ｉ　ｍｍｕ　ｎ　ｏ　、）、７０　：
　７０］　、抗体試薬は、全抗体、抗体断片、多官能性
抗体凝集体から成ることができ、あるいは一般に、抗体
からの１または２以上の特異的結合部位を含む任意の物
質から成ることができる。

抗体試薬のための免疫グロブリン源は、任意の利用可能
な方法、例えば、普通の抗血清およびモノクローナル技
術により得ることができる。

アッセイすべき試験試料は、問題の任意の媒質であるこ
とができ、そして通常、医学的、獣医学的、環境的、栄
養的、または工業的の意味を有する液状試料であろう、
とくに、ヒトおよび動物の検体および体液１例えば、尿
、血液（血清または血漿）、乳、脳を髄液、唾液、糞便
物質、肺の吸出された物質、喉のスワブ、性器のスワブ
および滲出物、Ｉｌｉのスワブ、および鼻咽頭の吸出さ
れた物質を本発明の方法によってアッセイすることがで
きる。患者または試験すべき他の源から得られた試験試
料は種として二本鎖核酸１例えば、細胞中に含有されて
いた前記核酸、を含有する場合。

この試料を処理して核酸を変性し、そして必要に応じて
、まず、細胞から酸を開放する。核酸の変性は、好まし
くは、沸騰水中の加熱により、あるいはアルカリ処理（
例えば、０．ＩＮの水酸化ナトリウム）処理によって達
成され、このアルカリ処理は、必要に応じて、細胞を溶
解するために同時に使用することができる。また、核酸
の開放は、例えば、Ｉａ械的崩壊（凍結／融解、摩耗、
超音波処理）、物理的／化学的崩壊［洗浄剤、例えば、
　「トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｊ、　「ツイーン（ＴＷ
ＥＥＮ）Ｊ、ドデシル硫酸ナトリウム、アルカリ処理、
浸透圧ショック、または熱）、または酵素的溶解（リゾ
チーム、プロテイナーゼＫ、ペプシン）によって実現す
ることができる。得られる試験媒体は核酸を一本鎖の形
態で含有し、次いでこれを本発明の交雑法に従ってアッ
セイすることができる。

本発明は、さらに、試薬系、す門わち、所望のアッセイ
法を実施するために要求される必須の要素のすべてを含
む、試薬の組み合わせまたは手段を提供する。試薬系は
商業的に包装された形態で、試薬の適合性が許す場合、
組成物または混合物として、試験装置の形態で、または
より通常キットとして、すなわち、必要な試薬を保持し
、かつ通常アッセイを実施するための書かれた説明を含
む、１または２以上の容器の包装された組み合わせなど
として提供される０本発明の試薬系は、ここに記載する
種々の交雑フォーマットを実施するための、すべての立
体的配置および組成物を包含する。

試薬系は、次の構成成分を含む： （１）前述のように標識された核酸プローブ、および （２）前もって装填された参照および対照のＤＮＡスポ
ットを含むことができる、試料ＤＮＡ固定化膜、この系
の試験キットの形態は、さらに、補助化学物質、′交雑
溶液の成分、および試験試料中の二本鎖核酸を一本鎖の
形態に転化することのできる変性剤を含むことができる
。好ましくは、化学的溶菌剤および、試料を処理して一
本鎖核酸をそれから解放するための変性剤１例えば、ア
ルカリが含められる。

本発明の主要な利点は、次の通りである：（１）バクテ
リア種のゲノム全体を、例えば、プローブとして使用す
ることは、同じゲノムのクローニングしたセグメントの
使用を越えた、決定的な利点を有する。

（ａ）！’＃在的にすべての配列が交雑できる場合、プ
ローブと相同ゲノムとの間の配列の相同性が程度がより
大きいと、ゲノムの一部のみとプローブとしてクローニ
ンされたセグメントとの間の相同性を含む交雑の場合よ
りも、非常に大きい信号が発生する。

（ｂ）プローブＤＮＡの供給は、細胞の生長および細胞
リゼイトからのＤＮＡの簡単な精製のみに依存する；組
換えＤＮＡ手順を必要としない。

（ｃ）プローブの品質の調節は、バクテリアの標準の微
生物学的同定およびＤＮＡの簡単な物理学的特性づけの
みを含む。

（２）固定化された試料物質として、精製されたＤＮＡ
よりもむしろ、粗製の細胞リゼイト中の変性されたＤＮ
Ａの使用は、交雑信号の他の従来予期されなかった増幅
を与える。なぜなら、本発明において、精製されたＤＮ
Ａを使用する研究から期待されるよりも約５倍少ない細
胞を検出できることが観察されたからである。さらに、
プロービングすべき試料は、フィルターで濾過するかあ
るいはフィルター上にスポツティングすることによって
調製できるアルカリ性細胞すゼイト中で、単に変性され
たＤＮＡであるので、試料の調製は複雑でなく、また臨
界的ではない。

この分野においてよ〈知られているように、バクテリア
の細胞はリポソームのＲＮＡの数千のコピーを有する。

全廁胞すゼイトはＲＮＡおよびＤＮＡの両者が保存され
る条件下に調製されるとき、核酸含有物質のすべてを交
雑のために固定化することができる；同様に、ＲＮＡを
単独で精製しかつ固定化することができる［トマス（Ｔ
ｈ。

ｍａｓ）、Ｐ、−３，ｒニトロセルロース紙へ移された
変性されたＲＮＡおよび小さいＤＮＡ断片の交雑（Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｄｅｎａｔｕｒｅ
ｄ　　ＲＮＡ　　ａｎｄ　　ＳｍａｌｌＤＮＡ　　Ｆｒ
ａｇｍｅｎｔｓ　　Ｔｒａｎｓｆｅｒｅｄ　　ｔｏ　　
Ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　　ＰＵＳＡ、ヱ７，５
２０１−５２０５　（１９８０）］、全ゲノムＤＮＡを
プローブとして使用するとき、ＲＮＡ分子はプローブＤ
ＮＡのリポソームＲＮＡ遺伝子部分への交雑によて検出
可能であろう、この全ゲノムプローブを使用することに
よって得られる利点は、次の通りであえる：（ｉ）組換
えＤＮＡ手順によってクローニングしたリポソームＲＮ
Ａ遺伝子を前もって発生させないで、多量のリポソーム
ＲＮＡを標識プローブへの交雑によって急速に検出する
ことができ、そして （ｉ　ｉ）細胞中の多量のｒＲＮＡによって提供される
急速な交雑検出に加えて、時間の間のゲノムプローブＤ
ＮＡのネットワーク形成は、前述のように、交雑の信号
をさらに増幅する。

次の実施例により、本発明を尿道感染の診断に適用でき
る１つの方法を説明する。

Ｘ施勇 （１）１〜１００μｌの懸濁液をニトロセルロースのシ
ート上にスポツティングまたは濾過することができるよ
うにするために、必要に応じて、細胞を遠心によって濃
縮する。

（２）ニトロセルロースのシートを０．５モルのＮａＯ
Ｈ上で湿潤させて、バクテリアをその場で溶菌しかつ変
性する。１．０モルのトリス（Ｔｒｉｓ）　−ＨＣ１、
ｐＨ７，５、中で中和し１次いテフィルターを１．５モ
ルのＮａｃ１、０．５モルのトリス、ｐＨ７，５、中で
すすぐ。

（３）フィルターをプロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ
）Ｌ、次いで８０℃において０．５〜２時間真空ベーキ
ングする。

（４）このフィルターを塩／蛋白質／ＳＤＳ溶液中で０
．５時間〜数時間の間６６８複合体において予備交雑し
、次いでベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｒ
ｉｅｓ）（“ＢＲＬ”）、米国マリンランド州ガイサー
バーグ、２０８７７、のビオチン−１１−ｃＵＴＰを前
駆体トリホスフェートの１つとして使用して、ニック翻
訳によりビオチニル化された変性プローブＤＮＡを添加
する。６８℃で少なくとも１時間交雑する。

（５）フィルターを１系列の塩／ＳＤＳ溶液中で各回数
分間室温および高温において洗浄して、結合しないプロ
ーブを除去し、そして不安定な雑種を解離する。

（６）フィルターをプローブ溶液で飽和させ、次いでＢ
ＲＬのストレプトアビジ、ンを添加する。

結合しなストレプトアビジンを洗浄除去した後、ＵＲＬ
のビオチニル化ポリ（アルカリ性ホスファターゼ）を添
加する。さらに洗浄した後、ニトロ−ブルーテトラゾリ
ウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スフェート（両者ハＢＲＬから入手可能である）を含有
する溶液中でフィルターをインキュベーションする。不
溶性の色はフィルター上で交雑部位において発生する。

プローブとしてバクテリア種のゲノムＤＮＡを使用する
と、ビオチニル化ヌクレオチドを使用するニック翻訳に
より標識付けしかつＢＲＬストレプトアビジン／ポリア
ルカリ性ホスファターゼのキットを使用して雑種を検出
すると、 （１）ニトロセルロース上の１つのスポット中でｌｎＨ
の精製されたＤＮＡを容易に検出することができ、 （２）ニトロセルロース上の１つのスポット中でその場
で溶菌された１０４のバクテリア細胞を検出することが
できる（１０４ゲノム＝はぼ５０ｐｇ）。

（３）尿道の感染に含まれるバクテリアのいくつかの異
なる属のＤＮＡを明瞭に区別することができ、そして （４）ＤＮＡの調製、交雑および検出を合計３時間に短
縮することができる（プローブについて、ｌｎｇ／１０
の相同ＤＮＡへの交雑）。

この明最初および特許請求の範囲は例示を目的としそし
て限定を意図するものではなく、そして変更および変化
は本発明の精神および範囲を逸脱しないで行うことがで
きる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： （ａ）生物学的核酸含有試料を固定化し、 （ｂ）核酸を変性し、 （ｃ）前記試料を、アッセイすべき微生物の分別しない
   、標識し、変性した全ゲノムＤＮＡのプローブと、交雑
   条件下に接触させ、そして （ｄ）前記標識を検出することによって、交雑した核酸
   をアッセイする、 を含んでなることを特徴とする生物学的核酸含有試料を
   特定の微生物の存在についてアッセイする方法。 ２、微生物は、バクテリア、菌・カビ、ウィルスおよび
   原生動物から成る群より選択される特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３、微生物は尿道感染の原因となる特許請求の範囲第１
   または２項記載の方法。 ４、微生物は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
   ）、プロテウス種（Ｐｒｏｔｅｕｓｓｐｐ．）、クレブ
   シエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐｐ．）、スタフ
   ィロコッカス種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ
   ｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｃｏ
   ｃｃｕｓｓｐｐ．）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏ
   ｍｏｎａｓ　ｓｐｐ．）およびラクトバシルス種（Ｌａ
   ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．）から成る群より選
   択される特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の
   方法。 ５、標識付けは生きている全細胞中で、細胞リゼイト中
   で、あるいは抽出した核酸を使用して実施する特許請求
   の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、標識は、蛋白質結合性配位子、ハプテン、抗原、蛍
   光化合物、色素、放射性部分および酵素から成る群より
   選択される特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載
   の方法。 ７、蛋白質結合性配位子はビオチン含有部分である特許
   請求の範囲第６項記載の方法。 ８、標識の検出は、化学ルミネッセンスにより、あるい
   は酵素反応により実施する特許請求の範囲第１〜７項の
   いずれかに記載の方法。 ９、固定化は、化学的反応または物理的吸着により、フ
   ィルター、固体のシートおよびビーズから成る群より選
   択される支持体を使用して実施する特許請求の範囲第１
   〜８項のいずれかに記載の方法。 １０、前記標識付けはＤＮＡ結合性配位子を核酸とプロ
   ーブ中で光化学的に反応させることによって実施する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。