JPS62266000A - 微生物の急速dna試験 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、生物学的核酸含有試料を7フセイして特定の
微生物の存在を検出する方法に関する。
微生物の存在を検出する方法に関する。
さらに詳しくは、生物学的試料から集めることのできる
バクテリアまたは他の有機体を同定しかつ定量するため
の、非常に急速かつ感受性の核酸交雑試験(hybri
dization tesE)に関する。
バクテリアまたは他の有機体を同定しかつ定量するため
の、非常に急速かつ感受性の核酸交雑試験(hybri
dization tesE)に関する。
現在の技術状ぶである試験は、クローニングされ断片化
されたゲノム(genomes)またはエピソーム(e
pisomes)から、それらがある遺伝子または性質
の所望の組を有する他の配列を表わことを基準にして、
選択される特定のRNAまたは組換え体DNAであるプ
ローブを包含する0例えば、ファルコウ(Falkow
)らへの米国特許第4,358,535号は、m RN
Aから、あるいは遺伝子または遺伝子断片のクローニ
ングによって、特別に得られたプローブ、cDNA逆転
写体を記載した。また、次の文献を参照:1985年の
概観文献1組換え体DNAおよび他の直接検体の同定技
術(Recombinant DNA and
0ther DirectSpecimen Id
entification Techniques
)J、L、S、 ト ンプキンス(Tompkins
)著、これはバクテリア同定系についてのシンポジウム
のときに提出され、そして実験室の医学における臨床(
9土ユn1cs in Laboratory
Medicine)、Vo1、5.99−107ページ
に発表された。また、ある種の寄生生物の特殊化した細
胞器官中に見出される非常に高度に反復した短い環状D
NA配列、すなわち、レイシュマニヱ(Leishma
nia)および関連する原生動物の動原核(変性したミ
トコンドリア)DNAを使用して、対応する動原核含有
原生動物によって感染した動物組織の調製物中の相同配
列を検出することは可能である(PCT/US8310
1029)。
されたゲノム(genomes)またはエピソーム(e
pisomes)から、それらがある遺伝子または性質
の所望の組を有する他の配列を表わことを基準にして、
選択される特定のRNAまたは組換え体DNAであるプ
ローブを包含する0例えば、ファルコウ(Falkow
)らへの米国特許第4,358,535号は、m RN
Aから、あるいは遺伝子または遺伝子断片のクローニ
ングによって、特別に得られたプローブ、cDNA逆転
写体を記載した。また、次の文献を参照:1985年の
概観文献1組換え体DNAおよび他の直接検体の同定技
術(Recombinant DNA and
0ther DirectSpecimen Id
entification Techniques
)J、L、S、 ト ンプキンス(Tompkins
)著、これはバクテリア同定系についてのシンポジウム
のときに提出され、そして実験室の医学における臨床(
9土ユn1cs in Laboratory
Medicine)、Vo1、5.99−107ページ
に発表された。また、ある種の寄生生物の特殊化した細
胞器官中に見出される非常に高度に反復した短い環状D
NA配列、すなわち、レイシュマニヱ(Leishma
nia)および関連する原生動物の動原核(変性したミ
トコンドリア)DNAを使用して、対応する動原核含有
原生動物によって感染した動物組織の調製物中の相同配
列を検出することは可能である(PCT/US8310
1029)。
種特異的DNAの交雑のたねのプローブ調製物は、特定
の遺伝子生産物の同定および分離を必要とし、あるいは
問題の種に対して独特であるか事実状独特である塩基配
列を有するゲノムの短い部分の同定および分離を必要と
するという仮定は広く支持されている。同様に、関連す
るバクテリアのある郡のDNAのプローブを作ろうとす
るとき、遺伝子生産物の同定、あるいは交叉交雑の所望
の性質を有する関連ゲノムの1つのクローニングしたセ
グメントの同定が必要でることが期待される。DNAを
クローニングしかつ交雑としてプラスミドまたは他の組
換え体DNAを使用しなくてはならいと仮定された。な
ぜなら1分別しないゲノムDNAを含む交雑の研究が、
種の間の盟店性を検査しあるいは立証するためになされ
てきたからである。[ジョンソン(J o h n s
o n)、J、L、(1984)、バクテリアの分類
におけn)、8−11ページ、N、R,クリーブ(Kr
ieg)(編)、分類学的細菌学のバーゲイのマHy)
、Vo1、1、ウィリアムス・アンド・ウィルキンソン
ス、7へルチモアコ。このような研究において、関連が
ないバクテリアの種の間でさえ非常に多過ぎるDNA配
列の相同性が存在して、クローニングしないDNAは有
用なプローブとなることができないと思われてきたので
、2つの異なるゲノムDNAを、いかに悪くよりはむし
ろ、いかによく交雑させるかが強調されてきた。
の遺伝子生産物の同定および分離を必要とし、あるいは
問題の種に対して独特であるか事実状独特である塩基配
列を有するゲノムの短い部分の同定および分離を必要と
するという仮定は広く支持されている。同様に、関連す
るバクテリアのある郡のDNAのプローブを作ろうとす
るとき、遺伝子生産物の同定、あるいは交叉交雑の所望
の性質を有する関連ゲノムの1つのクローニングしたセ
グメントの同定が必要でることが期待される。DNAを
クローニングしかつ交雑としてプラスミドまたは他の組
換え体DNAを使用しなくてはならいと仮定された。な
ぜなら1分別しないゲノムDNAを含む交雑の研究が、
種の間の盟店性を検査しあるいは立証するためになされ
てきたからである。[ジョンソン(J o h n s
o n)、J、L、(1984)、バクテリアの分類
におけn)、8−11ページ、N、R,クリーブ(Kr
ieg)(編)、分類学的細菌学のバーゲイのマHy)
、Vo1、1、ウィリアムス・アンド・ウィルキンソン
ス、7へルチモアコ。このような研究において、関連が
ないバクテリアの種の間でさえ非常に多過ぎるDNA配
列の相同性が存在して、クローニングしないDNAは有
用なプローブとなることができないと思われてきたので
、2つの異なるゲノムDNAを、いかに悪くよりはむし
ろ、いかによく交雑させるかが強調されてきた。
本発明以前においては、微生物の種の検出および同定の
ためのプローブは長さが数百ないし数千のヌクレオチド
のクローニングしたDNA配列であった。このDNA配
列は大量のゲノムから、ある性質、例えば、種または遺
伝子の一部に対する立証可能な独特性を基準にして、組
換えDNA手順によって精製された。この方法は欠点を
有し、そしてこれらの欠点は本発明によって克服される
。
ためのプローブは長さが数百ないし数千のヌクレオチド
のクローニングしたDNA配列であった。このDNA配
列は大量のゲノムから、ある性質、例えば、種または遺
伝子の一部に対する立証可能な独特性を基準にして、組
換えDNA手順によって精製された。この方法は欠点を
有し、そしてこれらの欠点は本発明によって克服される
。
第1に、従来、微生物の種の検出および同定のためのプ
ローブの役割をはたしてきた、クローニングしたDNA
セグメントの発生、特性づけおよび伸張は、高度に熟練
した分子生物学者のかなりの努力を必要とした。時間が
かかる組換え体DNA手順によるプローブ発生および調
製は不必要であり、そして望ましくないことさえあるこ
とを。
ローブの役割をはたしてきた、クローニングしたDNA
セグメントの発生、特性づけおよび伸張は、高度に熟練
した分子生物学者のかなりの努力を必要とした。時間が
かかる組換え体DNA手順によるプローブ発生および調
製は不必要であり、そして望ましくないことさえあるこ
とを。
未発明者らはここで明らかにする。:32に、標識した
分別しないゲノムDNAプローブが試料の分別しない核
酸中の相補的配夕噌に交雑できる程度は、クローニング
したゲノムの小さい部分が交雑できる程度の2〜3桁大
きく、その結果、交雑信号および感度は多数倍となり、
そして検出はいっそう急速となる。第3に、細胞の多数
のrRNAを利用して急速な交雑および検出を達成する
クローニングしたDNA一対一細胞のリポソーム−RN
A (rRNA)交雑手順[例えば、ゲンブローブ(G
enProbe)、米国カリ72ル:ア州すンジエゴ、
よって商業化された組織培養物のマイコプラズマ汚染試
験]が存在するが、本発明の全ゲノム交雑系は細胞当り
検出可能な配列の数において優れ、そして(i)標識さ
れたゲノムDNAプローブは交雑の間に組換え体DNA
が形成できない、信号増幅ネットワークを形成すること
ができ、そして(i i)細胞中のゲノムDNAの量は
不変であるが、rRNAの量は細胞の生理学的状態に従
ってかなり変動することがる、という利点を有する。
分別しないゲノムDNAプローブが試料の分別しない核
酸中の相補的配夕噌に交雑できる程度は、クローニング
したゲノムの小さい部分が交雑できる程度の2〜3桁大
きく、その結果、交雑信号および感度は多数倍となり、
そして検出はいっそう急速となる。第3に、細胞の多数
のrRNAを利用して急速な交雑および検出を達成する
クローニングしたDNA一対一細胞のリポソーム−RN
A (rRNA)交雑手順[例えば、ゲンブローブ(G
enProbe)、米国カリ72ル:ア州すンジエゴ、
よって商業化された組織培養物のマイコプラズマ汚染試
験]が存在するが、本発明の全ゲノム交雑系は細胞当り
検出可能な配列の数において優れ、そして(i)標識さ
れたゲノムDNAプローブは交雑の間に組換え体DNA
が形成できない、信号増幅ネットワークを形成すること
ができ、そして(i i)細胞中のゲノムDNAの量は
不変であるが、rRNAの量は細胞の生理学的状態に従
ってかなり変動することがる、という利点を有する。
本発明は、工程:
(a)生物学的核酸含有試料を固定化し、(b)核酸を
変性し、 (c)前記試料を、アッセイすべき微生物の分別(f
rack i onat e)Lない、標識し、変性し
た全ゲノム(genome)DNAのプローブと、交雑
条件下に接触させ、そして(d)前記標識を検出するこ
とによって、交雑した核酸をアッセイする、 を含んでなることを特徴とする生物学的核酸含有試料を
特定の微生物、例えば、バクテリア、菌・カビ(fun
gi)、ウィルスまたは原生動物の存在についてアッセ
イする方法、に関する。
変性し、 (c)前記試料を、アッセイすべき微生物の分別(f
rack i onat e)Lない、標識し、変性し
た全ゲノム(genome)DNAのプローブと、交雑
条件下に接触させ、そして(d)前記標識を検出するこ
とによって、交雑した核酸をアッセイする、 を含んでなることを特徴とする生物学的核酸含有試料を
特定の微生物、例えば、バクテリア、菌・カビ(fun
gi)、ウィルスまたは原生動物の存在についてアッセ
イする方法、に関する。
本発明は、また、
(a)[知の微生物からの標識された全ゲノムDNA、
(b)固体の支持体上に固定化された参照核酸試料、前
記支持体は試料の固定化に利用できる、 (c)交雑試薬、および (d)化学ルミネッセンス検出のための試薬、 からなる生物学的核酸含有試料を特定の微生物の存在に
ついてアッセイするためのキット、に関する。
記支持体は試料の固定化に利用できる、 (c)交雑試薬、および (d)化学ルミネッセンス検出のための試薬、 からなる生物学的核酸含有試料を特定の微生物の存在に
ついてアッセイするためのキット、に関する。
前述のキットにおいて、交雑試薬は既知の微生物からの
標識した全ゲノムDNAを含有することができる。
標識した全ゲノムDNAを含有することができる。
前述の交雑試薬は、塩化ナトリウム、ドデシル硫酸ナト
リウム、ウシ血清アルブミンまたは脱脂乳および必要に
応じてホルムアミドの混合物を含むごとができる。
リウム、ウシ血清アルブミンまたは脱脂乳および必要に
応じてホルムアミドの混合物を含むごとができる。
本発明の新規な特長は、分別しないバクテリアまたは他
の全ゲノムDNAを、試料物質中の核酸の急速な検出お
よび同定のための交雑プローブとして使用できるという
ことである0本発明は種々の交雑フォーマツ) (f
o rmat)によって限定されない、なぜなら、本発
明は種々の試料調製手段、プローブ標識プロトコール(
protocOIS)、およびアニーリングおよび洗浄
の条件を含むことができるからである。プローブとして
、ある方法1例えば、クローニングにより分別されたD
NAよりはむしろ、ゲノム中の配列のすべて、あるいは
木質的にすべてを使用すると、交雑信号を急速に検出す
ることができる。その理由の一部は、特定の配列を欠失
(depelet)されなかった細胞からのDNA (
ゲノムDNAと定義する)の調製物は、同じDNAの一
部分がなすよりも、相同(homologous))細
胞DNAの試料へ完全に交雑する能力を有することにあ
る。
の全ゲノムDNAを、試料物質中の核酸の急速な検出お
よび同定のための交雑プローブとして使用できるという
ことである0本発明は種々の交雑フォーマツ) (f
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明は種々の試料調製手段、プローブ標識プロトコール(
protocOIS)、およびアニーリングおよび洗浄
の条件を含むことができるからである。プローブとして
、ある方法1例えば、クローニングにより分別されたD
NAよりはむしろ、ゲノム中の配列のすべて、あるいは
木質的にすべてを使用すると、交雑信号を急速に検出す
ることができる。その理由の一部は、特定の配列を欠失
(depelet)されなかった細胞からのDNA (
ゲノムDNAと定義する)の調製物は、同じDNAの一
部分がなすよりも、相同(homologous))細
胞DNAの試料へ完全に交雑する能力を有することにあ
る。
本発明による急速な信号の検出は、また、相補的配列の
含量と重複する、不規則な末端を有する断片の7二−リ
ングから生ずる標識プローブのネットワーク(netw
ork)の形成によって促進される。プローブDNAの
精製および標識付けは、二本鎖分子の本質的に不規則な
剪断および個々のポリヌクレオチド鎖のニラキング(n
icking)を含む、これらの剪断およびニラキング
の結果、プローブDNAが試料DNAとの交雑のために
変性される(−末鎖とされる)とき、この調製物は重複
する相補的配列の集団から構成される。交雑の過程の間
、プローブDNAの一本鎖のあるものは試料DNAとア
ニーリングし、そしであるものは他のプローブ配列とア
ニーリングする。操作可能生の特定の理論の拘束された
くないが、このような不規則の末端を有するプローブ配
列の交雑は、試料DNAまたはさらにプローブDNAへ
の交雑のために利用できる状態にとどまる一木鎖末端を
有する二重らせんを生ずると信じられる。このことが意
味するように、試料DNAとアニーリングするプローブ
DNAの分子は、また、プローブDNAなどの他の分子
と7ニーリングし、こうしてネットワークを形成し、そ
して交雑信号を増幅する。
含量と重複する、不規則な末端を有する断片の7二−リ
ングから生ずる標識プローブのネットワーク(netw
ork)の形成によって促進される。プローブDNAの
精製および標識付けは、二本鎖分子の本質的に不規則な
剪断および個々のポリヌクレオチド鎖のニラキング(n
icking)を含む、これらの剪断およびニラキング
の結果、プローブDNAが試料DNAとの交雑のために
変性される(−末鎖とされる)とき、この調製物は重複
する相補的配列の集団から構成される。交雑の過程の間
、プローブDNAの一本鎖のあるものは試料DNAとア
ニーリングし、そしであるものは他のプローブ配列とア
ニーリングする。操作可能生の特定の理論の拘束された
くないが、このような不規則の末端を有するプローブ配
列の交雑は、試料DNAまたはさらにプローブDNAへ
の交雑のために利用できる状態にとどまる一木鎖末端を
有する二重らせんを生ずると信じられる。このことが意
味するように、試料DNAとアニーリングするプローブ
DNAの分子は、また、プローブDNAなどの他の分子
と7ニーリングし、こうしてネットワークを形成し、そ
して交雑信号を増幅する。
驚くべきことには1本発明によれば、交雑法のパラメー
ター、温度、塩濃度および有機溶媒の存在を調節して、
交雑および厳格な洗浄の条件を規定することによって、
ある数のバクテリアの属からの精製されたDNA試料を
1組として同一の分別しないDNAの標識した調製物の
1系列でプロービングするとき、前記DNA試料を明確
に識別することができた。次いで、この手順は、わずか
に変更して、すなわち、前述の交雑の溶液の粗製、交雑
の時間などのをわずかに変更して、粗製の細胞リゼイト
(Llysate)中(7)DNAの同定および定量に
適用できることが発見された。
ター、温度、塩濃度および有機溶媒の存在を調節して、
交雑および厳格な洗浄の条件を規定することによって、
ある数のバクテリアの属からの精製されたDNA試料を
1組として同一の分別しないDNAの標識した調製物の
1系列でプロービングするとき、前記DNA試料を明確
に識別することができた。次いで、この手順は、わずか
に変更して、すなわち、前述の交雑の溶液の粗製、交雑
の時間などのをわずかに変更して、粗製の細胞リゼイト
(Llysate)中(7)DNAの同定および定量に
適用できることが発見された。
有機体を識別するための交雑試験の能力は、かなりな程
度に、核酸の交雑および交雑後の洗浄のために選択する
条件、すなわち、基準に依存する。交雑の品質に影響を
及ぼすように操作することができる条件は、(1)交雑
溶液および洗浄溶液中に塩濃度、そして(2)これらの
溶液の温度である。核酸二重らせんにおいて許容される
塩基の不一致の比率は、塩濃度が減少するにつれておよ
び/または温度が少々するにつれて、減少する。交雑の
歓檻遺はこれらのパラメーターによって定められ、これ
のパラメーターは完全な塩基対の形成を要求するように
、あるいはある範囲の値にわたって完全より低い塩基対
の一致を許すように操作することができる。このことが
意味するように、条件または厳格さを調節することによ
って、密接に関連する種およびかけはなれた種の間の識
別を程度を達成することができる。例えば、本発明の1
つのモードにおいて、グラム陽性バクテリアおよびグラ
ム陰性バクテリアのみを識別し、そして他のモードにお
いて、腸内細菌科(Enterobacteriace
ae)の構成員を他の微生物の族と識別することができ
、そして最も感度の高いモードにおいて、この族におけ
るバクテリアを1例えば、クレブシェラ・ニユーモニエ
x(Klebsiel la pneumon上工至
)よりわむしろ、大腸菌(Escherichia
coli)を同定することができる。
度に、核酸の交雑および交雑後の洗浄のために選択する
条件、すなわち、基準に依存する。交雑の品質に影響を
及ぼすように操作することができる条件は、(1)交雑
溶液および洗浄溶液中に塩濃度、そして(2)これらの
溶液の温度である。核酸二重らせんにおいて許容される
塩基の不一致の比率は、塩濃度が減少するにつれておよ
び/または温度が少々するにつれて、減少する。交雑の
歓檻遺はこれらのパラメーターによって定められ、これ
のパラメーターは完全な塩基対の形成を要求するように
、あるいはある範囲の値にわたって完全より低い塩基対
の一致を許すように操作することができる。このことが
意味するように、条件または厳格さを調節することによ
って、密接に関連する種およびかけはなれた種の間の識
別を程度を達成することができる。例えば、本発明の1
つのモードにおいて、グラム陽性バクテリアおよびグラ
ム陰性バクテリアのみを識別し、そして他のモードにお
いて、腸内細菌科(Enterobacteriace
ae)の構成員を他の微生物の族と識別することができ
、そして最も感度の高いモードにおいて、この族におけ
るバクテリアを1例えば、クレブシェラ・ニユーモニエ
x(Klebsiel la pneumon上工至
)よりわむしろ、大腸菌(Escherichia
coli)を同定することができる。
クローニングしたプローブまたは分別した核酸を含む交
雑系では、混合試料中の相同配列への標識ゲノムDNA
の交雑の特異性は、プローブに関連するが、プローブに
対して真に相補的ではない、試料中の核酸とプローブと
の相互作用を減少することによって増大することが′t
′きる。これは標識しない既知の核酸の予備交雑および
/または交雑の工程を含めることによって達成され、こ
のような交雑は、混合試料において、標識したプローブ
のあるものと結合することによって所望の測定を妨害す
るであろうDNAまたはRNAの配列を飽和するであろ
う。
雑系では、混合試料中の相同配列への標識ゲノムDNA
の交雑の特異性は、プローブに関連するが、プローブに
対して真に相補的ではない、試料中の核酸とプローブと
の相互作用を減少することによって増大することが′t
′きる。これは標識しない既知の核酸の予備交雑および
/または交雑の工程を含めることによって達成され、こ
のような交雑は、混合試料において、標識したプローブ
のあるものと結合することによって所望の測定を妨害す
るであろうDNAまたはRNAの配列を飽和するであろ
う。
下に記載する実施例において、プローブの標識付けは、
雑種の検出が試料の膜のオートラジオグラフによる場合
、放射能によって実施するか、あるいは雑種の検出がプ
ローブの蓄積部位における酵素的色の生成による場合、
ニック翻訳によるビオチンの組込みによって実施する。
雑種の検出が試料の膜のオートラジオグラフによる場合
、放射能によって実施するか、あるいは雑種の検出がプ
ローブの蓄積部位における酵素的色の生成による場合、
ニック翻訳によるビオチンの組込みによって実施する。
しかしながら、限定的な読取り要件は存在しないので、
他のプローブの標識付けは本発明に等しく適用される。
他のプローブの標識付けは本発明に等しく適用される。
本発明は、有機体を集め、濃縮し、そして、マトリック
ス、例えば、ニトロセルロース紙上にその場で、あるい
は溶液中で溶菌する、いかなる場合においても適用する
ことができる。こうして、本発明はバクテリアに適用で
きるばかりでなく、かつまた他の微生物の検出および同
定に適用することができる。それらの例は1次の通りで
あるが、これらの限定されない:ウイルス、例えば。
ス、例えば、ニトロセルロース紙上にその場で、あるい
は溶液中で溶菌する、いかなる場合においても適用する
ことができる。こうして、本発明はバクテリアに適用で
きるばかりでなく、かつまた他の微生物の検出および同
定に適用することができる。それらの例は1次の通りで
あるが、これらの限定されない:ウイルス、例えば。
サイトメガロウィルス、単純ヘルペスウィルスおよびヒ
トT−リンパそう行性(T−1ymph。
トT−リンパそう行性(T−1ymph。
tropic)ウィルス、菌・カビ類、例えば、膣炎お
よび他の真菌症の感染の主な病因学的因子の原因である
プラスモジウム(Plasmodi且」)種およびトリ
コモナスΦバギナリス(エエichomonas v
aginalis)、医学的微生物学の包括的考察は1
次の文献に記載されている:レンネッテ(Lennet
te)、E、H,l1、 物学のマニュアル(鼠
エユnual of C11nical
Micr。
よび他の真菌症の感染の主な病因学的因子の原因である
プラスモジウム(Plasmodi且」)種およびトリ
コモナスΦバギナリス(エエichomonas v
aginalis)、医学的微生物学の包括的考察は1
次の文献に記載されている:レンネッテ(Lennet
te)、E、H,l1、 物学のマニュアル(鼠
エユnual of C11nical
Micr。
biolo )、第3版、アメリカンφソサイアテ
ィー・フォー−マイクロバイオロジー、米国ワシントン
州、1980.本発明は尿道の感染の診断においてとく
に有用である。
ィー・フォー−マイクロバイオロジー、米国ワシントン
州、1980.本発明は尿道の感染の診断においてとく
に有用である。
次のバクテリアは尿道の感染(UTI)に導く太服遁(
E s c h 60〜90%の発生率、vJ胱er
ichia 炎(低いUTI)および腎孟coli
) 腎炎(腎を包含する)の両者における最も
普通のUTI病 原体、UTIの大部分は約1 60 0−血清型;はんの限 定された数によって引き起こ される;これらは01.0 2.04.06,07.0 8.09.011、O18゜ 025.039.075であ る; o−Il;!性分離物にも頻繁 に直面する。
E s c h 60〜90%の発生率、vJ胱er
ichia 炎(低いUTI)および腎孟coli
) 腎炎(腎を包含する)の両者における最も
普通のUTI病 原体、UTIの大部分は約1 60 0−血清型;はんの限 定された数によって引き起こ される;これらは01.0 2.04.06,07.0 8.09.011、O18゜ 025.039.075であ る; o−Il;!性分離物にも頻繁 に直面する。
プロテウス種 第2の最も頻繁に直面する尿(pr□t
eus 動の病原体;5〜20%、きspp、)
わめて過酷な腎の感染を引き起こすことがある。3
つの種 :P、 m1rabilis (最も普通)、ヱユ 匹ユニ ganiiおよび旦ユ L! t ge r i、血清学は複雑で あるが、特に関連性ない。
eus 動の病原体;5〜20%、きspp、)
わめて過酷な腎の感染を引き起こすことがある。3
つの種 :P、 m1rabilis (最も普通)、ヱユ 匹ユニ ganiiおよび旦ユ L! t ge r i、血清学は複雑で あるが、特に関連性ない。
クレブシェラ種(発生率3〜10%、多少任意スタフィ
ロコツカ UTIに関連する2つの種:s spp、
) ermidis、発生率4〜20%、いったん
見過ごされ たが、これらの有機体は細菌 頻繁な病原因子であることが 発見された。
ロコツカ UTIに関連する2つの種:s spp、
) ermidis、発生率4〜20%、いったん
見過ごされ たが、これらの有機体は細菌 頻繁な病原因子であることが 発見された。
ストレプトコツ力 、ミュ faecalis最も3種
(Store 普通;発生率2〜5%。
(Store 普通;発生率2〜5%。
他のグラム陰性か これらは−緒になってUTIん軟菌
(rod) の低い率を占める;Pseues、E、
hafnia、 泳動の感染の試験の目的は三重である=(1)試料が無
菌であるか否かを決定する(環境に依存して、試料が1
04または105細胞/mlを含有する場合); (2)感染が存在する場合、それがグラム陽性またはグ
ラム陰性のバクテリアかどうかを決定する; (3)感染の原因であるバクテリアの特定の種を決定す
る。
(rod) の低い率を占める;Pseues、E、
hafnia、 泳動の感染の試験の目的は三重である=(1)試料が無
菌であるか否かを決定する(環境に依存して、試料が1
04または105細胞/mlを含有する場合); (2)感染が存在する場合、それがグラム陽性またはグ
ラム陰性のバクテリアかどうかを決定する; (3)感染の原因であるバクテリアの特定の種を決定す
る。
好ましい実施態様において、試験すべき物質をニトロセ
ルロース膜上の小さいスポットとして集め、そしてNa
OH溶液上にこの膜を浮かべることによってバクテリア
または他の有機体をその場で溶菌する;これは、また、
DNAへ変性しかつその膜上のスポットにおいてそれを
固定化する効果を有する。同一の膜または付属する膜の
上に標準が存在し、前記標準は有機体の既知量の変性さ
れたDNAのスポットであり、それらに対して流体を試
験する。DNAの変性後、膜を処理して交雑のために準
備する。
ルロース膜上の小さいスポットとして集め、そしてNa
OH溶液上にこの膜を浮かべることによってバクテリア
または他の有機体をその場で溶菌する;これは、また、
DNAへ変性しかつその膜上のスポットにおいてそれを
固定化する効果を有する。同一の膜または付属する膜の
上に標準が存在し、前記標準は有機体の既知量の変性さ
れたDNAのスポットであり、それらに対して流体を試
験する。DNAの変性後、膜を処理して交雑のために準
備する。
プローブは、試験すべき試料の予測される複雑さおよび
同時の決定を実施する必要性に依存して、1または複数
の種からのDNAであることができる。プローブはラジ
オアイソトープで、あるいはラジオアイソトープ以外で
標識することができ、そして標識付けは生体内または生
体外で実施することができる。単一の混合物中の異なる
プローブを異なる方法で標識することができるので、D
NAの複雑な試料への1より多い交雑を個々に検出しか
つ同定することができ、同様にプローブの混合物の単一
の構成員を交雑することができる。
同時の決定を実施する必要性に依存して、1または複数
の種からのDNAであることができる。プローブはラジ
オアイソトープで、あるいはラジオアイソトープ以外で
標識することができ、そして標識付けは生体内または生
体外で実施することができる。単一の混合物中の異なる
プローブを異なる方法で標識することができるので、D
NAの複雑な試料への1より多い交雑を個々に検出しか
つ同定することができ、同様にプローブの混合物の単一
の構成員を交雑することができる。
プローブDNAは、例えば、バクテリアの培養物から標
準法によって調製することができる。標準法は、洗浄剤
の溶菌、有機溶媒による抽出、エタノール沈殿および緩
衝水性媒質中のDNAの解離を包含する。この取扱いの
結果、各細胞からのDNAは、もはや、無傷の細胞中に
あるような染包体の大ささの1つの二本鎖の分子ではな
く、むしろ、この精製法はDNAを多分100,000
塩基対(100kb)の平均長さの小さい分子に剪断す
る。こうして、バクテリアの染色体は精製の間に断片化
し、そして、破壊する間、一般にl/2,1/4.1/
8などの大きさの分子を生成し、破壊の部位はDNA配
列に関して不規則である。
準法によって調製することができる。標準法は、洗浄剤
の溶菌、有機溶媒による抽出、エタノール沈殿および緩
衝水性媒質中のDNAの解離を包含する。この取扱いの
結果、各細胞からのDNAは、もはや、無傷の細胞中に
あるような染包体の大ささの1つの二本鎖の分子ではな
く、むしろ、この精製法はDNAを多分100,000
塩基対(100kb)の平均長さの小さい分子に剪断す
る。こうして、バクテリアの染色体は精製の間に断片化
し、そして、破壊する間、一般にl/2,1/4.1/
8などの大きさの分子を生成し、破壊の部位はDNA配
列に関して不規則である。
プローブDNAの標識付けは、ある数の方法で実施する
ことができ、ある方法はラジオアイソトープを包含し、
そしである方法はそれを含まない。プローブのはたらき
をするDNAの試料は。
ことができ、ある方法はラジオアイソトープを包含し、
そしである方法はそれを含まない。プローブのはたらき
をするDNAの試料は。
ゲノムの断片の非常に高度に重複した組から構成されて
いる。バクテリア、(およびウィルス)の場合において
、ゲノムは表現「染色体の大きさのDNA分子」と同義
語である。なぜなら、バクテリアにおける遺伝情報の事
実上すべては、バクテリアの染色体と考えられるものか
ら構成する単一のDNA分子中に含有されるからである
。交雑系において有効であることが立証された1つのP
!識付は手順は、ニック翻訳である。この手順は、DN
A試料を2つの酵素、すなわち、Dナーゼ(DNase
)IおよびDNAポリメラーゼで処理することを含む、
Dナーゼエはエンドヌクレアーゼであり、−末鎖のニッ
クを二本鎖DNA分子中に本質的に不規則に導入する0
次いで、DNAポリメラーゼはニックをDNA合成の開
始点として使用し、そして存在するポリヌクしオチド鎖
の一部分を置換することにより、デオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートをポリマーのDNA中に組込む、
Dナーゼエによるニラキング(nicking)は、ま
た、−木調のレベルでDNA非常に減少した長さを生ず
る。
いる。バクテリア、(およびウィルス)の場合において
、ゲノムは表現「染色体の大きさのDNA分子」と同義
語である。なぜなら、バクテリアにおける遺伝情報の事
実上すべては、バクテリアの染色体と考えられるものか
ら構成する単一のDNA分子中に含有されるからである
。交雑系において有効であることが立証された1つのP
!識付は手順は、ニック翻訳である。この手順は、DN
A試料を2つの酵素、すなわち、Dナーゼ(DNase
)IおよびDNAポリメラーゼで処理することを含む、
Dナーゼエはエンドヌクレアーゼであり、−末鎖のニッ
クを二本鎖DNA分子中に本質的に不規則に導入する0
次いで、DNAポリメラーゼはニックをDNA合成の開
始点として使用し、そして存在するポリヌクしオチド鎖
の一部分を置換することにより、デオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートをポリマーのDNA中に組込む、
Dナーゼエによるニラキング(nicking)は、ま
た、−木調のレベルでDNA非常に減少した長さを生ず
る。
交雑の速度および高い感度(数時間内に1つのスポット
において104のバクテリアの不明瞭ではない検出)は
、標識プローブとして、ゲノムのクローニングした小さ
い部分よりはむしろ、分別しないバクテリアのDNAの
試料を使用することによって達成される。交雑の特異性
(バクテリアの種の不明瞭ではない識別)は、交雑およ
びフィルターの洗浄のために条件の特定の組を選択する
ことによって達成される。
において104のバクテリアの不明瞭ではない検出)は
、標識プローブとして、ゲノムのクローニングした小さ
い部分よりはむしろ、分別しないバクテリアのDNAの
試料を使用することによって達成される。交雑の特異性
(バクテリアの種の不明瞭ではない識別)は、交雑およ
びフィルターの洗浄のために条件の特定の組を選択する
ことによって達成される。
種々の方法を使用してポリヌクレオチドの標識付けを標
識付けすることができる。標識は、1つの位置に集まる
ようにするよりはむしろ、ポリヌクレオチドの長さに沿
って分布させることが好ましい、標識付けのいくつかの
手段を下に概説する。
識付けすることができる。標識は、1つの位置に集まる
ようにするよりはむしろ、ポリヌクレオチドの長さに沿
って分布させることが好ましい、標識付けのいくつかの
手段を下に概説する。
5−(3−アミン)アリルデオキシウリジントリホスフ
ェート(AA−duTP)またはそのビオチニル化誘導
体を、ランガー(Langer)at1、 Acad
、 Sci、)、78:6633(1981)の方法
によって合成し、そしてDNAポリメラーゼを使用する
ニック翻訳よって二本fiDNAプa−プ中に導入する
ことができる。アミノ側基をもつプローブをアミン反応
性標識と反応させることができる。
ェート(AA−duTP)またはそのビオチニル化誘導
体を、ランガー(Langer)at1、 Acad
、 Sci、)、78:6633(1981)の方法
によって合成し、そしてDNAポリメラーゼを使用する
ニック翻訳よって二本fiDNAプa−プ中に導入する
ことができる。アミノ側基をもつプローブをアミン反応
性標識と反応させることができる。
6−カルボキシフルオレセインおよび4°。
5′−ジメトキシ−6−カルボキシメチルフルオレセイ
ンのN−ヒドロキシスフィンイミドエステル、およびそ
れらのベーターガラクトシル銹導体を、ニック翻訳され
たプローブと直接反応させることができる。これらの活
性化された色素を過剰量で使用して標識の組込みを最大
にし、次いで結合しない色素をゲル濾過によって標識さ
れたDNAから分離する。
ンのN−ヒドロキシスフィンイミドエステル、およびそ
れらのベーターガラクトシル銹導体を、ニック翻訳され
たプローブと直接反応させることができる。これらの活
性化された色素を過剰量で使用して標識の組込みを最大
にし、次いで結合しない色素をゲル濾過によって標識さ
れたDNAから分離する。
架橋基上に末端アミンをもつ標識は、二官能性試薬、例
えば、ジメチルアジビミデート、ヘキサメチレンジイソ
シアネート、およびp、p’−ジフルオロ−m、m’−
ジニトロ−フェニルスルホンによって、ニック翻訳され
たDNAへ結合することができる。標識を過剰量の二官
能性試薬と反応させ、次いで反応しない試薬を除去する
ことができる。活性化された標識をニック翻訳されたプ
ローブと反応させることができる。
えば、ジメチルアジビミデート、ヘキサメチレンジイソ
シアネート、およびp、p’−ジフルオロ−m、m’−
ジニトロ−フェニルスルホンによって、ニック翻訳され
たDNAへ結合することができる。標識を過剰量の二官
能性試薬と反応させ、次いで反応しない試薬を除去する
ことができる。活性化された標識をニック翻訳されたプ
ローブと反応させることができる。
ある種の平らな芳香族化合物は、二本鎖核酸の血液の間
に入り(intercalate)可逆的複合体(co
mplex)を形成する。あるインターカレイティング
剤(intercalating agent)を、
インタカレーション(intercalation)複
合体の光分解によって、ポリヌクレオチドへ共有結合さ
せることができる。光活性化可能なインターカレイティ
ング剤の例は、8−7ジドエチジウム、8−7ジドメチ
ジウムおよびフロクマリン類1例えば、アンゲリシンで
ある。これらのインター力レイター(intercal
ator)は、官能基を含有する架橋アームで変性する
ことができる。8−7ジドメチジウム銹導体は、次の文
献に記載されているようにして調製できる:へルツバー
グ(Hertzberg)およびダーバン(Derva
n)、至に力土二土にヱヱ旦左ヱニ文ユ差亜・ソサイア
テ4 (J、 Amer、 Chem。
に入り(intercalate)可逆的複合体(co
mplex)を形成する。あるインターカレイティング
剤(intercalating agent)を、
インタカレーション(intercalation)複
合体の光分解によって、ポリヌクレオチドへ共有結合さ
せることができる。光活性化可能なインターカレイティ
ング剤の例は、8−7ジドエチジウム、8−7ジドメチ
ジウムおよびフロクマリン類1例えば、アンゲリシンで
ある。これらのインター力レイター(intercal
ator)は、官能基を含有する架橋アームで変性する
ことができる。8−7ジドメチジウム銹導体は、次の文
献に記載されているようにして調製できる:へルツバー
グ(Hertzberg)およびダーバン(Derva
n)、至に力土二土にヱヱ旦左ヱニ文ユ差亜・ソサイア
テ4 (J、 Amer、 Chem。
Soc、)、104:313 (1982)およびミッ
チェル(Mi t che l l)およびダーバン(
Dervan)、 盗−+jL”:r2エフ%’J5(
1972)、標識は変性されたインター力レイターへ直
接結合することができる0例えば、6−カルボキシフル
オレセインまたは4′、5°−ジメトキシ−6−カルボ
キシメチルフルオレセインのN−ヒドロキシスフィンイ
ミドエステルを、インター力レイター誘導体と反応させ
てアミン架橋を形成することができる0次いで、これら
のインター力レイターー標識接合体をポリヌクレオチド
のプローブに付加し、−七して光分解することができる
。あるいは、変性されたインター力レイターをポリヌク
レオチドのプローブで光分解し。
チェル(Mi t che l l)およびダーバン(
Dervan)、 盗−+jL”:r2エフ%’J5(
1972)、標識は変性されたインター力レイターへ直
接結合することができる0例えば、6−カルボキシフル
オレセインまたは4′、5°−ジメトキシ−6−カルボ
キシメチルフルオレセインのN−ヒドロキシスフィンイ
ミドエステルを、インター力レイター誘導体と反応させ
てアミン架橋を形成することができる0次いで、これら
のインター力レイターー標識接合体をポリヌクレオチド
のプローブに付加し、−七して光分解することができる
。あるいは、変性されたインター力レイターをポリヌク
レオチドのプローブで光分解し。
次いで標識化合物に結合させることができる。8−7ジ
ドメチジウムは、インター力レイターの以外の機構を介
して、−末鎖核酸へ光分解的に化合物することができる
[パルトン(Balton)およびカーy(Kern)
(1978)線艶Ω呈g(Nuc1、 Ac1ds
Res、)、5:48913、この手段を使用してこ
のインター力レイター誘導体を一本鎖のDNAおよびR
NAへ結合することができる。
ドメチジウムは、インター力レイターの以外の機構を介
して、−末鎖核酸へ光分解的に化合物することができる
[パルトン(Balton)およびカーy(Kern)
(1978)線艶Ω呈g(Nuc1、 Ac1ds
Res、)、5:48913、この手段を使用してこ
のインター力レイター誘導体を一本鎖のDNAおよびR
NAへ結合することができる。
RNA−RNA雑種の検出のために、抗体を使用するこ
とができる。DNA RNA雑種に対して特異的な抗
体を刺激する免疫原は、ホモポリマーまたはへチロポリ
マーのポリヌクレオチド二重らせんからなることができ
る[キタガワ(Kitagawa)およびストラー(S
tollar)(1982)i土又垂工(M o 1
、 I mmuno、)、19:4131]、選択し
たRNADNA二重らせんは、メチル化蛋白質へ吸着さ
せることができ、あるいはそうでなければ普通の免疫原
担体物質1例えば、ウシ血清アルブミンに結合させ、そ
して所望の31種動物に駐車することができる[ストラ
ー(St o 11ar)(1980) 外工免庶工(
Mo 1 、 I mmu n o 、)、70 :
70] 、抗体試薬は、全抗体、抗体断片、多官能性
抗体凝集体から成ることができ、あるいは一般に、抗体
からの1または2以上の特異的結合部位を含む任意の物
質から成ることができる。
とができる。DNA RNA雑種に対して特異的な抗
体を刺激する免疫原は、ホモポリマーまたはへチロポリ
マーのポリヌクレオチド二重らせんからなることができ
る[キタガワ(Kitagawa)およびストラー(S
tollar)(1982)i土又垂工(M o 1
、 I mmuno、)、19:4131]、選択し
たRNADNA二重らせんは、メチル化蛋白質へ吸着さ
せることができ、あるいはそうでなければ普通の免疫原
担体物質1例えば、ウシ血清アルブミンに結合させ、そ
して所望の31種動物に駐車することができる[ストラ
ー(St o 11ar)(1980) 外工免庶工(
Mo 1 、 I mmu n o 、)、70 :
70] 、抗体試薬は、全抗体、抗体断片、多官能性
抗体凝集体から成ることができ、あるいは一般に、抗体
からの1または2以上の特異的結合部位を含む任意の物
質から成ることができる。
抗体試薬のための免疫グロブリン源は、任意の利用可能
な方法、例えば、普通の抗血清およびモノクローナル技
術により得ることができる。
な方法、例えば、普通の抗血清およびモノクローナル技
術により得ることができる。
アッセイすべき試験試料は、問題の任意の媒質であるこ
とができ、そして通常、医学的、獣医学的、環境的、栄
養的、または工業的の意味を有する液状試料であろう、
とくに、ヒトおよび動物の検体および体液1例えば、尿
、血液(血清または血漿)、乳、脳を髄液、唾液、糞便
物質、肺の吸出された物質、喉のスワブ、性器のスワブ
および滲出物、Iliのスワブ、および鼻咽頭の吸出さ
れた物質を本発明の方法によってアッセイすることがで
きる。患者または試験すべき他の源から得られた試験試
料は種として二本鎖核酸1例えば、細胞中に含有されて
いた前記核酸、を含有する場合。
とができ、そして通常、医学的、獣医学的、環境的、栄
養的、または工業的の意味を有する液状試料であろう、
とくに、ヒトおよび動物の検体および体液1例えば、尿
、血液(血清または血漿)、乳、脳を髄液、唾液、糞便
物質、肺の吸出された物質、喉のスワブ、性器のスワブ
および滲出物、Iliのスワブ、および鼻咽頭の吸出さ
れた物質を本発明の方法によってアッセイすることがで
きる。患者または試験すべき他の源から得られた試験試
料は種として二本鎖核酸1例えば、細胞中に含有されて
いた前記核酸、を含有する場合。
この試料を処理して核酸を変性し、そして必要に応じて
、まず、細胞から酸を開放する。核酸の変性は、好まし
くは、沸騰水中の加熱により、あるいはアルカリ処理(
例えば、0.INの水酸化ナトリウム)処理によって達
成され、このアルカリ処理は、必要に応じて、細胞を溶
解するために同時に使用することができる。また、核酸
の開放は、例えば、Ia械的崩壊(凍結/融解、摩耗、
超音波処理)、物理的/化学的崩壊[洗浄剤、例えば、
「トリトン(TRITON)J、 「ツイーン(TW
EEN)J、ドデシル硫酸ナトリウム、アルカリ処理、
浸透圧ショック、または熱)、または酵素的溶解(リゾ
チーム、プロテイナーゼK、ペプシン)によって実現す
ることができる。得られる試験媒体は核酸を一本鎖の形
態で含有し、次いでこれを本発明の交雑法に従ってアッ
セイすることができる。
、まず、細胞から酸を開放する。核酸の変性は、好まし
くは、沸騰水中の加熱により、あるいはアルカリ処理(
例えば、0.INの水酸化ナトリウム)処理によって達
成され、このアルカリ処理は、必要に応じて、細胞を溶
解するために同時に使用することができる。また、核酸
の開放は、例えば、Ia械的崩壊(凍結/融解、摩耗、
超音波処理)、物理的/化学的崩壊[洗浄剤、例えば、
「トリトン(TRITON)J、 「ツイーン(TW
EEN)J、ドデシル硫酸ナトリウム、アルカリ処理、
浸透圧ショック、または熱)、または酵素的溶解(リゾ
チーム、プロテイナーゼK、ペプシン)によって実現す
ることができる。得られる試験媒体は核酸を一本鎖の形
態で含有し、次いでこれを本発明の交雑法に従ってアッ
セイすることができる。
本発明は、さらに、試薬系、す門わち、所望のアッセイ
法を実施するために要求される必須の要素のすべてを含
む、試薬の組み合わせまたは手段を提供する。試薬系は
商業的に包装された形態で、試薬の適合性が許す場合、
組成物または混合物として、試験装置の形態で、または
より通常キットとして、すなわち、必要な試薬を保持し
、かつ通常アッセイを実施するための書かれた説明を含
む、1または2以上の容器の包装された組み合わせなど
として提供される0本発明の試薬系は、ここに記載する
種々の交雑フォーマットを実施するための、すべての立
体的配置および組成物を包含する。
法を実施するために要求される必須の要素のすべてを含
む、試薬の組み合わせまたは手段を提供する。試薬系は
商業的に包装された形態で、試薬の適合性が許す場合、
組成物または混合物として、試験装置の形態で、または
より通常キットとして、すなわち、必要な試薬を保持し
、かつ通常アッセイを実施するための書かれた説明を含
む、1または2以上の容器の包装された組み合わせなど
として提供される0本発明の試薬系は、ここに記載する
種々の交雑フォーマットを実施するための、すべての立
体的配置および組成物を包含する。
試薬系は、次の構成成分を含む:
(1)前述のように標識された核酸プローブ、および
(2)前もって装填された参照および対照のDNAスポ
ットを含むことができる、試料DNA固定化膜、この系
の試験キットの形態は、さらに、補助化学物質、′交雑
溶液の成分、および試験試料中の二本鎖核酸を一本鎖の
形態に転化することのできる変性剤を含むことができる
。好ましくは、化学的溶菌剤および、試料を処理して一
本鎖核酸をそれから解放するための変性剤1例えば、ア
ルカリが含められる。
ットを含むことができる、試料DNA固定化膜、この系
の試験キットの形態は、さらに、補助化学物質、′交雑
溶液の成分、および試験試料中の二本鎖核酸を一本鎖の
形態に転化することのできる変性剤を含むことができる
。好ましくは、化学的溶菌剤および、試料を処理して一
本鎖核酸をそれから解放するための変性剤1例えば、ア
ルカリが含められる。
本発明の主要な利点は、次の通りである:(1)バクテ
リア種のゲノム全体を、例えば、プローブとして使用す
ることは、同じゲノムのクローニングしたセグメントの
使用を越えた、決定的な利点を有する。
リア種のゲノム全体を、例えば、プローブとして使用す
ることは、同じゲノムのクローニングしたセグメントの
使用を越えた、決定的な利点を有する。
(a)!’#在的にすべての配列が交雑できる場合、プ
ローブと相同ゲノムとの間の配列の相同性が程度がより
大きいと、ゲノムの一部のみとプローブとしてクローニ
ンされたセグメントとの間の相同性を含む交雑の場合よ
りも、非常に大きい信号が発生する。
ローブと相同ゲノムとの間の配列の相同性が程度がより
大きいと、ゲノムの一部のみとプローブとしてクローニ
ンされたセグメントとの間の相同性を含む交雑の場合よ
りも、非常に大きい信号が発生する。
(b)プローブDNAの供給は、細胞の生長および細胞
リゼイトからのDNAの簡単な精製のみに依存する;組
換えDNA手順を必要としない。
リゼイトからのDNAの簡単な精製のみに依存する;組
換えDNA手順を必要としない。
(c)プローブの品質の調節は、バクテリアの標準の微
生物学的同定およびDNAの簡単な物理学的特性づけの
みを含む。
生物学的同定およびDNAの簡単な物理学的特性づけの
みを含む。
(2)固定化された試料物質として、精製されたDNA
よりもむしろ、粗製の細胞リゼイト中の変性されたDN
Aの使用は、交雑信号の他の従来予期されなかった増幅
を与える。なぜなら、本発明において、精製されたDN
Aを使用する研究から期待されるよりも約5倍少ない細
胞を検出できることが観察されたからである。さらに、
プロービングすべき試料は、フィルターで濾過するかあ
るいはフィルター上にスポツティングすることによって
調製できるアルカリ性細胞すゼイト中で、単に変性され
たDNAであるので、試料の調製は複雑でなく、また臨
界的ではない。
よりもむしろ、粗製の細胞リゼイト中の変性されたDN
Aの使用は、交雑信号の他の従来予期されなかった増幅
を与える。なぜなら、本発明において、精製されたDN
Aを使用する研究から期待されるよりも約5倍少ない細
胞を検出できることが観察されたからである。さらに、
プロービングすべき試料は、フィルターで濾過するかあ
るいはフィルター上にスポツティングすることによって
調製できるアルカリ性細胞すゼイト中で、単に変性され
たDNAであるので、試料の調製は複雑でなく、また臨
界的ではない。
この分野においてよ〈知られているように、バクテリア
の細胞はリポソームのRNAの数千のコピーを有する。
の細胞はリポソームのRNAの数千のコピーを有する。
全廁胞すゼイトはRNAおよびDNAの両者が保存され
る条件下に調製されるとき、核酸含有物質のすべてを交
雑のために固定化することができる;同様に、RNAを
単独で精製しかつ固定化することができる[トマス(T
h。
る条件下に調製されるとき、核酸含有物質のすべてを交
雑のために固定化することができる;同様に、RNAを
単独で精製しかつ固定化することができる[トマス(T
h。
mas)、P、−3,rニトロセルロース紙へ移された
変性されたRNAおよび小さいDNA断片の交雑(Hy
bridization of Denature
d RNA and SmallDNA Fr
agments Transfered to
N1trocellulose PUSA、ヱ7,5
201−5205 (1980)]、全ゲノムDNAを
プローブとして使用するとき、RNA分子はプローブD
NAのリポソームRNA遺伝子部分への交雑によて検出
可能であろう、この全ゲノムプローブを使用することに
よって得られる利点は、次の通りであえる:(i)組換
えDNA手順によってクローニングしたリポソームRN
A遺伝子を前もって発生させないで、多量のリポソーム
RNAを標識プローブへの交雑によって急速に検出する
ことができ、そして (i i)細胞中の多量のrRNAによって提供される
急速な交雑検出に加えて、時間の間のゲノムプローブD
NAのネットワーク形成は、前述のように、交雑の信号
をさらに増幅する。
変性されたRNAおよび小さいDNA断片の交雑(Hy
bridization of Denature
d RNA and SmallDNA Fr
agments Transfered to
N1trocellulose PUSA、ヱ7,5
201−5205 (1980)]、全ゲノムDNAを
プローブとして使用するとき、RNA分子はプローブD
NAのリポソームRNA遺伝子部分への交雑によて検出
可能であろう、この全ゲノムプローブを使用することに
よって得られる利点は、次の通りであえる:(i)組換
えDNA手順によってクローニングしたリポソームRN
A遺伝子を前もって発生させないで、多量のリポソーム
RNAを標識プローブへの交雑によって急速に検出する
ことができ、そして (i i)細胞中の多量のrRNAによって提供される
急速な交雑検出に加えて、時間の間のゲノムプローブD
NAのネットワーク形成は、前述のように、交雑の信号
をさらに増幅する。
次の実施例により、本発明を尿道感染の診断に適用でき
る1つの方法を説明する。
る1つの方法を説明する。
X施勇
(1)1〜100μlの懸濁液をニトロセルロースのシ
ート上にスポツティングまたは濾過することができるよ
うにするために、必要に応じて、細胞を遠心によって濃
縮する。
ート上にスポツティングまたは濾過することができるよ
うにするために、必要に応じて、細胞を遠心によって濃
縮する。
(2)ニトロセルロースのシートを0.5モルのNaO
H上で湿潤させて、バクテリアをその場で溶菌しかつ変
性する。1.0モルのトリス(Tris) −HC1、
pH7,5、中で中和し1次いテフィルターを1.5モ
ルのNac1、0.5モルのトリス、pH7,5、中で
すすぐ。
H上で湿潤させて、バクテリアをその場で溶菌しかつ変
性する。1.0モルのトリス(Tris) −HC1、
pH7,5、中で中和し1次いテフィルターを1.5モ
ルのNac1、0.5モルのトリス、pH7,5、中で
すすぐ。
(3)フィルターをプロッティング(blotting
)L、次いで80℃において0.5〜2時間真空ベーキ
ングする。
)L、次いで80℃において0.5〜2時間真空ベーキ
ングする。
(4)このフィルターを塩/蛋白質/SDS溶液中で0
.5時間〜数時間の間668複合体において予備交雑し
、次いでベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bet
hesda Re5earch Laboratr
ies)(“BRL”)、米国マリンランド州ガイサー
バーグ、20877、のビオチン−11−cUTPを前
駆体トリホスフェートの1つとして使用して、ニック翻
訳によりビオチニル化された変性プローブDNAを添加
する。68℃で少なくとも1時間交雑する。
.5時間〜数時間の間668複合体において予備交雑し
、次いでベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bet
hesda Re5earch Laboratr
ies)(“BRL”)、米国マリンランド州ガイサー
バーグ、20877、のビオチン−11−cUTPを前
駆体トリホスフェートの1つとして使用して、ニック翻
訳によりビオチニル化された変性プローブDNAを添加
する。68℃で少なくとも1時間交雑する。
(5)フィルターを1系列の塩/SDS溶液中で各回数
分間室温および高温において洗浄して、結合しないプロ
ーブを除去し、そして不安定な雑種を解離する。
分間室温および高温において洗浄して、結合しないプロ
ーブを除去し、そして不安定な雑種を解離する。
(6)フィルターをプローブ溶液で飽和させ、次いでB
RLのストレプトアビジ、ンを添加する。
RLのストレプトアビジ、ンを添加する。
結合しなストレプトアビジンを洗浄除去した後、URL
のビオチニル化ポリ(アルカリ性ホスファターゼ)を添
加する。さらに洗浄した後、ニトロ−ブルーテトラゾリ
ウムおよび5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホ
スフェート(両者ハBRLから入手可能である)を含有
する溶液中でフィルターをインキュベーションする。不
溶性の色はフィルター上で交雑部位において発生する。
のビオチニル化ポリ(アルカリ性ホスファターゼ)を添
加する。さらに洗浄した後、ニトロ−ブルーテトラゾリ
ウムおよび5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホ
スフェート(両者ハBRLから入手可能である)を含有
する溶液中でフィルターをインキュベーションする。不
溶性の色はフィルター上で交雑部位において発生する。
プローブとしてバクテリア種のゲノムDNAを使用する
と、ビオチニル化ヌクレオチドを使用するニック翻訳に
より標識付けしかつBRLストレプトアビジン/ポリア
ルカリ性ホスファターゼのキットを使用して雑種を検出
すると、 (1)ニトロセルロース上の1つのスポット中でlnH
の精製されたDNAを容易に検出することができ、 (2)ニトロセルロース上の1つのスポット中でその場
で溶菌された104のバクテリア細胞を検出することが
できる(104ゲノム=はぼ50pg)。
と、ビオチニル化ヌクレオチドを使用するニック翻訳に
より標識付けしかつBRLストレプトアビジン/ポリア
ルカリ性ホスファターゼのキットを使用して雑種を検出
すると、 (1)ニトロセルロース上の1つのスポット中でlnH
の精製されたDNAを容易に検出することができ、 (2)ニトロセルロース上の1つのスポット中でその場
で溶菌された104のバクテリア細胞を検出することが
できる(104ゲノム=はぼ50pg)。
(3)尿道の感染に含まれるバクテリアのいくつかの異
なる属のDNAを明瞭に区別することができ、そして (4)DNAの調製、交雑および検出を合計3時間に短
縮することができる(プローブについて、lng/10
の相同DNAへの交雑)。
なる属のDNAを明瞭に区別することができ、そして (4)DNAの調製、交雑および検出を合計3時間に短
縮することができる(プローブについて、lng/10
の相同DNAへの交雑)。
この明最初および特許請求の範囲は例示を目的としそし
て限定を意図するものではなく、そして変更および変化
は本発明の精神および範囲を逸脱しないで行うことがで
きる。
て限定を意図するものではなく、そして変更および変化
は本発明の精神および範囲を逸脱しないで行うことがで
きる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、工程: (a)生物学的核酸含有試料を固定化し、 (b)核酸を変性し、 (c)前記試料を、アッセイすべき微生物の分別しない
、標識し、変性した全ゲノムDNAのプローブと、交雑
条件下に接触させ、そして (d)前記標識を検出することによって、交雑した核酸
をアッセイする、 を含んでなることを特徴とする生物学的核酸含有試料を
特定の微生物の存在についてアッセイする方法。 2、微生物は、バクテリア、菌・カビ、ウィルスおよび
原生動物から成る群より選択される特許請求の範囲第1
項記載の方法。 3、微生物は尿道感染の原因となる特許請求の範囲第1
または2項記載の方法。 4、微生物は大腸菌(Escherichiacoli
)、プロテウス種(Proteusspp.)、クレブ
シエラ種(Klebsiella spp.)、スタフ
ィロコッカス種(Staphylococcus sp
p.)、ストレプトコッカス種(Storeptoco
ccusspp.)、シュードモナス種(Pseudo
monas spp.)およびラクトバシルス種(La
ctobacillus spp.)から成る群より選
択される特許請求の範囲第1〜3項のいずれかに記載の
方法。 5、標識付けは生きている全細胞中で、細胞リゼイト中
で、あるいは抽出した核酸を使用して実施する特許請求
の範囲第1〜4項のいずれかに記載の方法。 6、標識は、蛋白質結合性配位子、ハプテン、抗原、蛍
光化合物、色素、放射性部分および酵素から成る群より
選択される特許請求の範囲第1〜5項のいずれかに記載
の方法。 7、蛋白質結合性配位子はビオチン含有部分である特許
請求の範囲第6項記載の方法。 8、標識の検出は、化学ルミネッセンスにより、あるい
は酵素反応により実施する特許請求の範囲第1〜7項の
いずれかに記載の方法。 9、固定化は、化学的反応または物理的吸着により、フ
ィルター、固体のシートおよびビーズから成る群より選
択される支持体を使用して実施する特許請求の範囲第1
〜8項のいずれかに記載の方法。 10、前記標識付けはDNA結合性配位子を核酸とプロ
ーブ中で光化学的に反応させることによって実施する特
許請求の範囲第1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US83678786A | 1986-03-06 | 1986-03-06 | |
US836787 | 1986-03-06 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62266000A true JPS62266000A (ja) | 1987-11-18 |
Family
ID=25272733
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62051844A Pending JPS62266000A (ja) | 1986-03-06 | 1987-03-06 | 微生物の急速dna試験 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0235727A3 (ja) |
JP (1) | JPS62266000A (ja) |
KR (1) | KR870009030A (ja) |
AU (1) | AU6972287A (ja) |
DK (1) | DK114387A (ja) |
FI (1) | FI870946A (ja) |
IL (1) | IL81741A0 (ja) |
NO (1) | NO870614L (ja) |
ZA (1) | ZA871581B (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4876186A (en) * | 1985-11-05 | 1989-10-24 | Battelle Development Corporation | Detection and differentiation of coxiella burnetii in biological fluids |
NO870613L (no) * | 1986-03-05 | 1987-09-07 | Molecular Diagnostics Inc | Deteksjon av mikroorganismer i en prve inneholdende nukleinsyre. |
AU601021B2 (en) * | 1987-03-11 | 1990-08-30 | Molecular Diagnostics, Inc. | Assay for necleic acid sequences in a sample |
JP2589729B2 (ja) * | 1988-01-30 | 1997-03-12 | 極東製薬工業株式会社 | 染色体dnaを用いた細菌の同定方法および該同定用キット |
IL87668A0 (en) * | 1988-09-04 | 1989-02-28 | Yeda Res & Dev | Assay for amoebas |
IE64040B1 (en) * | 1989-06-15 | 1995-06-28 | Akzo Nv | Method for determining nucleic acid |
FR2674632B1 (fr) * | 1991-03-29 | 1994-07-22 | Bertin & Cie | Procede et dispositif de detection rapide de micro-organismes indesirables dans un produit du domaine agro-alimentaire ou medico-veterinaire. |
ES2097701B1 (es) * | 1995-02-09 | 1997-11-16 | Consejo Superior Investigacion | Procedimiento para obtener sondas especificas de estirpe o de especie. |
KR100691806B1 (ko) * | 2005-08-04 | 2007-03-12 | 삼성전자주식회사 | 비드 및 나노포어를 이용한 핵산 검출방법 및 검출장치 |
JP2009034052A (ja) * | 2007-08-02 | 2009-02-19 | Canon Inc | ハイブリダイゼーション方法および装置 |
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---|---|---|---|---|
US4446237A (en) * | 1981-03-27 | 1984-05-01 | Life Technologies, Inc. | Method for detection of a suspect viral deoxyribonucleic acid in an acellular biological fluid |
EP0062286A1 (en) * | 1981-03-31 | 1982-10-13 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Diagnostic test for hepatitis B virus |
WO1984001174A1 (en) * | 1982-09-20 | 1984-03-29 | Harvard College | Identification of microorganisms |
US4737454A (en) * | 1983-07-14 | 1988-04-12 | Molecular Diagnostics, Inc. | Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays |
IL71715A0 (en) * | 1983-08-05 | 1984-09-30 | Miles Lab | Method,gene probes and test kit for detecting bacteria by nucleic acid hybridization |
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- 1987-02-17 NO NO870614A patent/NO870614L/no unknown
- 1987-02-24 EP EP87102580A patent/EP0235727A3/en not_active Withdrawn
- 1987-03-03 IL IL81741A patent/IL81741A0/xx unknown
- 1987-03-04 FI FI870946A patent/FI870946A/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-03-05 DK DK114387A patent/DK114387A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-03-05 ZA ZA871581A patent/ZA871581B/xx unknown
- 1987-03-05 AU AU69722/87A patent/AU6972287A/en not_active Abandoned
- 1987-03-06 KR KR870001997A patent/KR870009030A/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-03-06 JP JP62051844A patent/JPS62266000A/ja active Pending
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DK114387A (da) | 1987-09-07 |
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NO870614L (no) | 1987-09-07 |
FI870946A0 (fi) | 1987-03-04 |
AU6972287A (en) | 1987-09-10 |
EP0235727A3 (en) | 1990-02-14 |
ZA871581B (en) | 1987-12-30 |
FI870946A (fi) | 1987-09-07 |
IL81741A0 (en) | 1987-10-20 |
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