JP2589729B2 - 染色体ｄｎａを用いた細菌の同定方法および該同定用キット - Google Patents
染色体ｄｎａを用いた細菌の同定方法および該同定用キットInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は染色体DNAを用いた細菌の同定方法およびこ
の同定に使用するキットに関する。
の同定に使用するキットに関する。
（従来の技術） 一般に、細菌の同定は、いくつかの表現性状を調べた
り、特異的な抗原を検出することによって行なわれてい
る。近年、細菌の同定を必要とする分野も広がり、複雑
化し、従来の方法では迅速且つ正確に同定できない場合
も多い。一方で、細菌の同定検出において、特異プロー
ブを用いてハイブリダイゼーションする方法が知られて
いる。近年組換えDNA技術を駆使してある特定の菌に対
して特異性を有するDANプローブの生産が可能になった
（特開昭61−44000号公報および特開昭60−110299号公
報）。これらのプローブは、検体から直接特定菌を検出
するには有用だが未知菌株を同定する場合数多くの特異
プローブを準備しまたそれぞれとハイブリダイゼーショ
ンする必要があり、膨大な時間と費用がかかるため、日
常の同定検査に適用することは難しい。一方、特異プロ
ーブではなく、染色体DNAをプローブに用いて同定、検
出を行う方法（J.Clin.Microbiol.July 1987,p1239−12
43）が報告されている。しかしこの方法では相同性の高
い菌種の鑑別が困難であるため、同属内の種別の鑑別を
要求される医療分野などでの検定には限界がある。
り、特異的な抗原を検出することによって行なわれてい
る。近年、細菌の同定を必要とする分野も広がり、複雑
化し、従来の方法では迅速且つ正確に同定できない場合
も多い。一方で、細菌の同定検出において、特異プロー
ブを用いてハイブリダイゼーションする方法が知られて
いる。近年組換えDNA技術を駆使してある特定の菌に対
して特異性を有するDANプローブの生産が可能になった
（特開昭61−44000号公報および特開昭60−110299号公
報）。これらのプローブは、検体から直接特定菌を検出
するには有用だが未知菌株を同定する場合数多くの特異
プローブを準備しまたそれぞれとハイブリダイゼーショ
ンする必要があり、膨大な時間と費用がかかるため、日
常の同定検査に適用することは難しい。一方、特異プロ
ーブではなく、染色体DNAをプローブに用いて同定、検
出を行う方法（J.Clin.Microbiol.July 1987,p1239−12
43）が報告されている。しかしこの方法では相同性の高
い菌種の鑑別が困難であるため、同属内の種別の鑑別を
要求される医療分野などでの検定には限界がある。
次に、検体DNAの標識については、検体自体を標識す
る欠点として、核酸サンプルにその場で標識するには臨
床技術者に普通とは認められない高度の技術的熟練を必
要とし、標識の歩留りをモニターする簡便な信頼性ある
方法がないことなどが挙げられ問題が多かった。（特開
昭60−201256号公報及び特開昭60−201257号公報） （発明が解決しようとする課題） 上述の如き従来方法の欠点を克服すべく、本発明にお
いては、時間がかからず低コストで、相同性の高い菌種
間の鑑別も可能な細菌同定方法を提供することを目的と
する。
る欠点として、核酸サンプルにその場で標識するには臨
床技術者に普通とは認められない高度の技術的熟練を必
要とし、標識の歩留りをモニターする簡便な信頼性ある
方法がないことなどが挙げられ問題が多かった。（特開
昭60−201256号公報及び特開昭60−201257号公報） （発明が解決しようとする課題） 上述の如き従来方法の欠点を克服すべく、本発明にお
いては、時間がかからず低コストで、相同性の高い菌種
間の鑑別も可能な細菌同定方法を提供することを目的と
する。
さらに、本発明においては、該同定方法に使用するキ
ットも提供して、より一層検定を簡便にする。
ットも提供して、より一層検定を簡便にする。
（課題を解決するための手段） 本発明においては、被検菌自体を染色体DNAをプロー
ブとして、可能性のある全菌種の染色体DNAとハイブリ
ダイゼーションを行い、相同性（クロスハイブリダイゼ
ーションの度合）を比較して同定する。より詳しくは、
本発明の方法は、 臨床上あるいは産業上有用である細菌をグループ分け
し、１つのグループに含まれる全菌種から抽出し一本鎖
とした染色体DNAを各々固相化した容器を準備してお
き； 該グループに属するが菌種がいまだわからない被検菌
株から染色体DNAを抽出し変性させ、一本鎖DNAとしてか
ら非放射性標識しあるいは非放射性標識してから一本鎖
DNAとし； この非放射性標識された一本鎖DNAを上記容器中の一
本鎖としたDNAに加え、ハイブリダイゼーションを行
い、洗浄を行い；そして該標識体を測定することにより
ハイブリッド形成の度合を定量し、被検菌ともっとも相
同性の高い菌種を被検菌種と同定することからなる、細
菌の同定方法である。
ブとして、可能性のある全菌種の染色体DNAとハイブリ
ダイゼーションを行い、相同性（クロスハイブリダイゼ
ーションの度合）を比較して同定する。より詳しくは、
本発明の方法は、 臨床上あるいは産業上有用である細菌をグループ分け
し、１つのグループに含まれる全菌種から抽出し一本鎖
とした染色体DNAを各々固相化した容器を準備してお
き； 該グループに属するが菌種がいまだわからない被検菌
株から染色体DNAを抽出し変性させ、一本鎖DNAとしてか
ら非放射性標識しあるいは非放射性標識してから一本鎖
DNAとし； この非放射性標識された一本鎖DNAを上記容器中の一
本鎖としたDNAに加え、ハイブリダイゼーションを行
い、洗浄を行い；そして該標識体を測定することにより
ハイブリッド形成の度合を定量し、被検菌ともっとも相
同性の高い菌種を被検菌種と同定することからなる、細
菌の同定方法である。
本発明の同定方法をたとえば臨床分野で実施するため
には、まず検体を患者などから採取しなければならな
い。以下、実際の検査の流れを尿採取を例にとって述べ
る。
には、まず検体を患者などから採取しなければならな
い。以下、実際の検査の流れを尿採取を例にとって述べ
る。
採取した尿を血液寒天、BTB培地、血液添加フェニル
エチルアルコール培地などに塗株し分離培養する。分離
された集落を観察し、起因菌と疑われた集落を調べ、た
とえば好気性グラム陽性球菌ならばカタラーゼテストを
実施して陽性ならばスタフィロコッカス属を中心とした
グループに、また陰性ならばストレプトコッカス属を中
心としたグループに分けることができる。このグループ
分けは第１図に概略図として示したとおりであるが、主
としてどこでも簡便に実施できる生理学的特性、生化学
的特性、グラム染色性、形態によってグループ分けされ
るが、これだけに限定されるものではない。グループ分
けされた細菌は各々適当な同定用キットを使用して検定
することができる。
エチルアルコール培地などに塗株し分離培養する。分離
された集落を観察し、起因菌と疑われた集落を調べ、た
とえば好気性グラム陽性球菌ならばカタラーゼテストを
実施して陽性ならばスタフィロコッカス属を中心とした
グループに、また陰性ならばストレプトコッカス属を中
心としたグループに分けることができる。このグループ
分けは第１図に概略図として示したとおりであるが、主
としてどこでも簡便に実施できる生理学的特性、生化学
的特性、グラム染色性、形態によってグループ分けされ
るが、これだけに限定されるものではない。グループ分
けされた細菌は各々適当な同定用キットを使用して検定
することができる。
すなわち、本発明はさらに、被検菌体からDNAを抽出
する試薬および細菌グループ毎の一本鎖とした染色体DN
Aを固相化した容器を含む、細菌の同定用キットをも提
供する。本発明のキットに使用されるDNA抽出試薬は、
キットにおける量が従来の試薬の量の数百分の１の量で
あるため、検定に使用する被検菌の量（菌数）も極く少
量で検定可能である。従来標識用のDNAを得るためには
菌湿重量１〜2g必要であったのに対して、本発明のキッ
トでは、菌湿重量5mg程度（たとえばマックファーラン
ドNo.3の菌液1.5ml）、あるいは菌のグループによって
はそれ以下でも充分検定できた。本発明のキットのもう
一方の構成要素である固相化する容器は、マイクロプレ
ートのウェルが適当である。使用者が独自に検査してグ
ループ以下の種類の菌に焦点をしぼった場合、それら数
種の菌のみ組合せればよいので不要なウェルはとりはず
せるマイクロプレートが便利である。本発明のキットは
そのようなとりはずし可能なウェルを有するマイクロプ
レートも包含する。キットを使用する場合、その使用手
順は第２図に例示してあるとおりである。第２図におい
てはグラム陰性桿菌用DNA抽出試薬およびグラム陽性球
菌用DNA抽出試薬で抽出したDNAをPOD、ビオチンなどで
標識したものを検体DNAとして使用する場合を示してい
る。
する試薬および細菌グループ毎の一本鎖とした染色体DN
Aを固相化した容器を含む、細菌の同定用キットをも提
供する。本発明のキットに使用されるDNA抽出試薬は、
キットにおける量が従来の試薬の量の数百分の１の量で
あるため、検定に使用する被検菌の量（菌数）も極く少
量で検定可能である。従来標識用のDNAを得るためには
菌湿重量１〜2g必要であったのに対して、本発明のキッ
トでは、菌湿重量5mg程度（たとえばマックファーラン
ドNo.3の菌液1.5ml）、あるいは菌のグループによって
はそれ以下でも充分検定できた。本発明のキットのもう
一方の構成要素である固相化する容器は、マイクロプレ
ートのウェルが適当である。使用者が独自に検査してグ
ループ以下の種類の菌に焦点をしぼった場合、それら数
種の菌のみ組合せればよいので不要なウェルはとりはず
せるマイクロプレートが便利である。本発明のキットは
そのようなとりはずし可能なウェルを有するマイクロプ
レートも包含する。キットを使用する場合、その使用手
順は第２図に例示してあるとおりである。第２図におい
てはグラム陰性桿菌用DNA抽出試薬およびグラム陽性球
菌用DNA抽出試薬で抽出したDNAをPOD、ビオチンなどで
標識したものを検体DNAとして使用する場合を示してい
る。
各試薬、標識体の組成の詳細を含め、キットの内容に
ついては実施例４ないし７にあるとおりである。
ついては実施例４ないし７にあるとおりである。
（作用） 本発明の方法においては、被検菌体からの染色体DNA
自体を標識するため、被標識体が一種類で済む。これに
より、マイクロプレートのような多孔容器を用いれば一
回の交雑操作で実施できる。
自体を標識するため、被標識体が一種類で済む。これに
より、マイクロプレートのような多孔容器を用いれば一
回の交雑操作で実施できる。
さらに、本発明の方法の同定はクロスハイブリダイゼ
ーションの度合の比較にもとづいているので、固相化す
るDNAは一本鎖にした染色体DNAを用いさえすればよく、
染色体DNAの中からわざわざそれぞれの菌に特異的なDNA
フラグメントを開発する必要がない。その結果、該方法
は非常に効率的且つ安く実施できる。
ーションの度合の比較にもとづいているので、固相化す
るDNAは一本鎖にした染色体DNAを用いさえすればよく、
染色体DNAの中からわざわざそれぞれの菌に特異的なDNA
フラグメントを開発する必要がない。その結果、該方法
は非常に効率的且つ安く実施できる。
また、本発明の方法における被検DNAを標識するのに
用いる標識体は非放射性のものから選択されるので、高
度な技術、訓練、設備等を必要とせず、時間的にも経済
的にも負担が少ない。
用いる標識体は非放射性のものから選択されるので、高
度な技術、訓練、設備等を必要とせず、時間的にも経済
的にも負担が少ない。
上記３点の組合せにより、本発明の方法は相乗的に正
確且迅速に菌種を同定し得る安価な方法であると確信す
る。
確且迅速に菌種を同定し得る安価な方法であると確信す
る。
本発明のキットにおいては、従来細菌分類学で相同性
測定に用いられていたニトロセルロース・フィルターな
どの膜フィルターを使用せず、固相容器を用いることで
非アイソトープ法による相同性測定を可能にした。該固
相容器の材質はポリスチレン、ポリ塩化ビニールなど、
特に限定はないが、ニトロセルロースフィルターに見ら
れるような、酵素活性測定の際のスポット中の色素の溶
出、色素のフィルターへの非特異的吸着によるバックグ
ラウンドの上昇、洗浄の困難さ等を回避できるものを使
用することによって非アイソトープ法による相同性の測
定が達成できた。
測定に用いられていたニトロセルロース・フィルターな
どの膜フィルターを使用せず、固相容器を用いることで
非アイソトープ法による相同性測定を可能にした。該固
相容器の材質はポリスチレン、ポリ塩化ビニールなど、
特に限定はないが、ニトロセルロースフィルターに見ら
れるような、酵素活性測定の際のスポット中の色素の溶
出、色素のフィルターへの非特異的吸着によるバックグ
ラウンドの上昇、洗浄の困難さ等を回避できるものを使
用することによって非アイソトープ法による相同性の測
定が達成できた。
さらに、被検菌体からDNAを抽出する試薬をはじめと
するキット構成成分が各々非常に少量なので、従来の数
百分の１の被検菌体量で充分検定が可能になった。
するキット構成成分が各々非常に少量なので、従来の数
百分の１の被検菌体量で充分検定が可能になった。
本発明のキットを本発明の同定方法に使用することに
よって、より一層簡便且確実な検定が可能になる。
よって、より一層簡便且確実な検定が可能になる。
（実施例） 下記実施例は本発明を詳細に説明するためのものであ
って、何ら限定するものではない。
って、何ら限定するものではない。
実施例１ 固相化容器の調製 レジオネラ属13菌種よりマーマー（Marmur）法〔生化
学実験講座2,核酸の化学I,日本生化学会編東京化学同人
出版〕に従ってDNAを抽出し、100℃５分間加熱後、氷中
で急冷することにより一本鎖DNAを調製した。各一本鎖D
NAを0.1M MgCl2を含むPBS（pH7.0）で10μg/mlの濃度に
調製し、マイクロプレート（ノムノプレートII:ヌンク
社製もしくはマイクロフローブラックプレート：ダイナ
テック社製）に100μ／ウェル（well）ずつ上記13菌
種のDNA溶液を加えた。35℃１時間放置後上清を除き、
下記プレハイブリダイゼーション溶液300μ／ウェル
を加え、35℃１時間放置後上清を除き、乾燥下で５℃に
保持した。
学実験講座2,核酸の化学I,日本生化学会編東京化学同人
出版〕に従ってDNAを抽出し、100℃５分間加熱後、氷中
で急冷することにより一本鎖DNAを調製した。各一本鎖D
NAを0.1M MgCl2を含むPBS（pH7.0）で10μg/mlの濃度に
調製し、マイクロプレート（ノムノプレートII:ヌンク
社製もしくはマイクロフローブラックプレート：ダイナ
テック社製）に100μ／ウェル（well）ずつ上記13菌
種のDNA溶液を加えた。35℃１時間放置後上清を除き、
下記プレハイブリダイゼーション溶液300μ／ウェル
を加え、35℃１時間放置後上清を除き、乾燥下で５℃に
保持した。
検体からの非放射性標識一本鎖DNA調製 ＜方法１＞ ヒトの胸水から分離されたレジオネラ菌よりマーマー
法に従ってDNAを抽出し、100℃５分間加熱後、氷中で急
冷することにより一本鎖DNAを調製した。0.1×SSC、す
なわち、0.15M NaCl−0.015Mクエン酸三ナトリウム溶液
の10倍希釈液で500μg/mlの一本鎖DNA濃度を有する溶液
をつくり、そのうちの20μとラベザイムPOD（和光純
薬工業（株）製造・販売のペルオキシダーゼ標識体）20
μとを混合し、これに５％グルタルアルデヒド６μ
を加え混合し、37℃で10分インキュベートしてPOD標識D
NAを得た。これにプレーハイブリダイゼーション溶液
〔０〜50％ホルムアミド、１×デンハート溶液（0.02％
ウシ血清アルブミン、0.02％ポリビニルピロリドン（分
子量3.6×103〜４×104）および0.02％フィコール（分
子量４×105）、２×SSC（上記SSCの1/2濃縮液）もしく
は0.15M NaCl−0.03Mトリスー塩酸緩衝液、０〜６％ポ
リエチレングリコール6000および50〜200μg/ml変性サ
ケ精子DNA〕10mlを加え、ハイブリダイゼーション溶液
として使用した。
法に従ってDNAを抽出し、100℃５分間加熱後、氷中で急
冷することにより一本鎖DNAを調製した。0.1×SSC、す
なわち、0.15M NaCl−0.015Mクエン酸三ナトリウム溶液
の10倍希釈液で500μg/mlの一本鎖DNA濃度を有する溶液
をつくり、そのうちの20μとラベザイムPOD（和光純
薬工業（株）製造・販売のペルオキシダーゼ標識体）20
μとを混合し、これに５％グルタルアルデヒド６μ
を加え混合し、37℃で10分インキュベートしてPOD標識D
NAを得た。これにプレーハイブリダイゼーション溶液
〔０〜50％ホルムアミド、１×デンハート溶液（0.02％
ウシ血清アルブミン、0.02％ポリビニルピロリドン（分
子量3.6×103〜４×104）および0.02％フィコール（分
子量４×105）、２×SSC（上記SSCの1/2濃縮液）もしく
は0.15M NaCl−0.03Mトリスー塩酸緩衝液、０〜６％ポ
リエチレングリコール6000および50〜200μg/ml変性サ
ケ精子DNA〕10mlを加え、ハイブリダイゼーション溶液
として使用した。
＜方法２＞ 方法１と同様にして調製した一本鎖DNA液10μにフ
ォトプローブビオチン（ベクター社製）５μを加えて
混合し、氷中で太陽灯下10cmの位置で15分照射した。照
射後0.1MトリスーHCl（pH9.0）緩衝液で100μにし、
それに２−ブタノール100μ加えて抽出した。上清の
２−ブタノール層を除き、再び２−ブタノール100μ
加え、抽出して上清を除き、水層とプレハイブリダイゼ
ーション溶液10mlと混合して、ハイブリダイゼーション
溶液とした。
ォトプローブビオチン（ベクター社製）５μを加えて
混合し、氷中で太陽灯下10cmの位置で15分照射した。照
射後0.1MトリスーHCl（pH9.0）緩衝液で100μにし、
それに２−ブタノール100μ加えて抽出した。上清の
２−ブタノール層を除き、再び２−ブタノール100μ
加え、抽出して上清を除き、水層とプレハイブリダイゼ
ーション溶液10mlと混合して、ハイブリダイゼーション
溶液とした。
ハイブリダイゼーション及びハイブリッド形成の度合
の定量 ＜方法１の場合＞ であらかじめ調製したマイクロプレート（イムノプレ
ートII）にのハイブリダイゼーション溶液を100μ
／ウェルずつ加え、35℃で２時間反応させた。上清を除
去し、２×SSC溶液で３回ウェルを洗浄し、3,3′,5,5′
−テトラメチルベンジジン−H2O2溶液100μ加え、５
分間インキュベーーションして発色させた後、2NHCl100
μ加えて反応停止後マイクロプレートリーダーを用い
てλ＝450nmで吸光度を測定した。
の定量 ＜方法１の場合＞ であらかじめ調製したマイクロプレート（イムノプレ
ートII）にのハイブリダイゼーション溶液を100μ
／ウェルずつ加え、35℃で２時間反応させた。上清を除
去し、２×SSC溶液で３回ウェルを洗浄し、3,3′,5,5′
−テトラメチルベンジジン−H2O2溶液100μ加え、５
分間インキュベーーションして発色させた後、2NHCl100
μ加えて反応停止後マイクロプレートリーダーを用い
てλ＝450nmで吸光度を測定した。
＜方法２の場合＞ であらかじめ調製したマイクロプレート（マイクロ
フローブラックプレート）にのハイブリダイゼーショ
ン溶液100μ／ウェルを加え、42℃で12時間反応させ
た。上清を除去し、２×SSCで３回洗浄後、２％牛血清
アルブミンと0.1％トライトンＸ−100とを含むPBS300μ
を加えて35℃で10分放置後、上清を除き、上記PBSで
1:1000に希釈したβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトア
ビジン（ザイメッド（Zymed）社製）を100μずつ加え
35℃30分反応後、0.1％トライトンＸ−100を含むPBSで
３回洗浄後、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド溶液100μずつ加え、30分後に励起波長360
nm、測定波長450nmで蛍光強度を測定した。
フローブラックプレート）にのハイブリダイゼーショ
ン溶液100μ／ウェルを加え、42℃で12時間反応させ
た。上清を除去し、２×SSCで３回洗浄後、２％牛血清
アルブミンと0.1％トライトンＸ−100とを含むPBS300μ
を加えて35℃で10分放置後、上清を除き、上記PBSで
1:1000に希釈したβ−ガラクトシダーゼ−ストレプトア
ビジン（ザイメッド（Zymed）社製）を100μずつ加え
35℃30分反応後、0.1％トライトンＸ−100を含むPBSで
３回洗浄後、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド溶液100μずつ加え、30分後に励起波長360
nm、測定波長450nmで蛍光強度を測定した。
実験結果 上記ないしの手順を経て得られた結果を表２に示
す。
す。
表中の蛍光強度はその最大値を100とし、他はそれに
対する相対値とした。
対する相対値とした。
上記の結果よりヒトの胸水から分離されたレジオネラ
菌はレジオネラ・ニューモフィラ（L.pneumophila）と
同定された。
菌はレジオネラ・ニューモフィラ（L.pneumophila）と
同定された。
実施例２ 下痢便をスキロー（Skirrow）培地で42℃、48時間
微好気培養すると紅色を帯びたＳ型集落が観察された。
その集落はオキシダーゼ陽性、糖非発酵の性状でグラム
染色の結果、カンピロバクター属に特徴的ならせん状に
湾曲した陰性菌であった。
微好気培養すると紅色を帯びたＳ型集落が観察された。
その集落はオキシダーゼ陽性、糖非発酵の性状でグラム
染色の結果、カンピロバクター属に特徴的ならせん状に
湾曲した陰性菌であった。
この集落から生理塩水−EDTA溶液でマックファーラン
ドNo.2の菌液1.5ml作製し、被験菌液とした。この液を
エッペンドルフ製サンプリングチューブに移し15000回
転,30秒遠心し上清を除いた後、菌体を生理塩水−EDTA
溶液200μに懸濁した。リゾチーム粉末を溶解液でと
かし5mg/ml濃度にし50μ加え室温で５分放置した。さ
らに20％SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液30μ加
え60℃５分加温すると粘度をおびた半透明の状態になっ
た。
ドNo.2の菌液1.5ml作製し、被験菌液とした。この液を
エッペンドルフ製サンプリングチューブに移し15000回
転,30秒遠心し上清を除いた後、菌体を生理塩水−EDTA
溶液200μに懸濁した。リゾチーム粉末を溶解液でと
かし5mg/ml濃度にし50μ加え室温で５分放置した。さ
らに20％SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液30μ加
え60℃５分加温すると粘度をおびた半透明の状態になっ
た。
フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール
（25:24:1）200μ加え激しく振とう後、15000回転５
分遠心して上清を新しいサンプリングチューブに移し
た。冷エタノール400μ加えよく混合し1500回転３分
遠心して上清をデカントした。沈澱のDNAに0.1×SSC20
μ加え溶解し（原液）10μをとり0.1×SSCを加え20
0μにした。分光光度計を用いてλ＝260nmで吸光度を
測定しDNA濃度を求めた。結果、原液のDNA濃度15μg/10
μであった。残った原液を100℃、５分間加熱、氷中
で急冷して一本鎖DNAとした。この液10μにフォトプ
ローブビオチン（ベクター社製）５μを加えて混合
し、氷中で太陽灯下10cmの位置で15分照射した。照射後
0.1MトリスーHCl（pH9.0）緩衝液で100μにし、それ
に２−ブタノール100μ加えて抽出した。上清の２−
ブタノール層を除き、再び２−ブタノール100μ加え
抽出し上清を除き、水層とプレハイブリダイゼーション
溶液10mlと混合してハイブリダイゼーション溶液とし
た。
（25:24:1）200μ加え激しく振とう後、15000回転５
分遠心して上清を新しいサンプリングチューブに移し
た。冷エタノール400μ加えよく混合し1500回転３分
遠心して上清をデカントした。沈澱のDNAに0.1×SSC20
μ加え溶解し（原液）10μをとり0.1×SSCを加え20
0μにした。分光光度計を用いてλ＝260nmで吸光度を
測定しDNA濃度を求めた。結果、原液のDNA濃度15μg/10
μであった。残った原液を100℃、５分間加熱、氷中
で急冷して一本鎖DNAとした。この液10μにフォトプ
ローブビオチン（ベクター社製）５μを加えて混合
し、氷中で太陽灯下10cmの位置で15分照射した。照射後
0.1MトリスーHCl（pH9.0）緩衝液で100μにし、それ
に２−ブタノール100μ加えて抽出した。上清の２−
ブタノール層を除き、再び２−ブタノール100μ加え
抽出し上清を除き、水層とプレハイブリダイゼーション
溶液10mlと混合してハイブリダイゼーション溶液とし
た。
実施例１と同様の方法で作製したカンピロバクター
用マイクロプレートにで作製したハイブリダイゼーシ
ョン溶液100μ／ウェル加え42℃で12時間反応させ
た。上清を除去し、２×SSCで３回洗浄後ブロッキング
試薬300μを加えて35℃で10分放置後上清を除きブロ
ッキング試薬で1:1000に希釈したβ−ガラクトシダーゼ
−ストレプトアビジンを100μずつ加え35℃30分反応
後リン酸緩衝液で３回洗浄し、４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−ガラクトシド溶液100μずつ加え30分
後に励起波長360nm、測定波長450nmで蛍光強度を測定し
た。
用マイクロプレートにで作製したハイブリダイゼーシ
ョン溶液100μ／ウェル加え42℃で12時間反応させ
た。上清を除去し、２×SSCで３回洗浄後ブロッキング
試薬300μを加えて35℃で10分放置後上清を除きブロ
ッキング試薬で1:1000に希釈したβ−ガラクトシダーゼ
−ストレプトアビジンを100μずつ加え35℃30分反応
後リン酸緩衝液で３回洗浄し、４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−ガラクトシド溶液100μずつ加え30分
後に励起波長360nm、測定波長450nmで蛍光強度を測定し
た。
実験結果は表３のとおりである。表中の蛍光強度はそ
の最高値を100とし、他はそれに対する相対値とした。
の最高値を100とし、他はそれに対する相対値とした。
上記の結果より、被験菌株は、カンピロバクター・ジ
ェジュニ（C.jejuni）と同定された。
ェジュニ（C.jejuni）と同定された。
実施例３ ヒトの咽頭スワブより得られた検出を血液平板で好
気培養後、グラム染色、カタラーゼテストを実施した。
グラム陽性の連鎖状の球菌でカタラーゼ陰性であったの
で、ストレプトコッカスグループに分類した。この集落
からEDTA溶液でマックファーランドNo.3の菌液1.5mlを
調製し、被験菌液とした。この液をサンプリングチュー
ブに移し、15000回転30秒遠心し、上清を除いた後、菌
体をEDTA溶液200μに懸濁した。アクロモペプチダー
ゼ粉末を溶解液で溶かして5mg/mlの濃度にし50μ加え
て室温で５分放置した。さらに、20％SDS溶液30μ加
え、60℃、５分加温すると、半透明の状態となった。フ
ェノール、クロロホルム・イソアミルアルコール200μ
加え激しく振とう後、15000回転５分遠心して上清を
新しいサンプリングチューブに移した。エタノール400
μ加えよく混合し15000回転３分遠心して上清をデカ
ントした。沈澱のDNAに0.1×SSC20μ加え溶解し（原
液）10μをとり0.1×SSCを加え200μにした。分光
光度計を用いてλ＝260nmで吸光度を測定しDNA濃度を求
めた。結果、原液のDNA濃度10μg/μであった。残っ
た原液を100℃、５分間加熱、氷中で急冷して一本鎖DNA
とした。この液10μにフォトプローブビオチン（ベク
ター社製）５μを加えて混合し、氷中で太陽灯下10cm
の位置で15分照射した。照射後0.1MトリスーHCl（pH9.
0）緩衝液で100μにし、それに２−ブタノール100μ
加えて抽出した。上清の２−ブタノール層を除き、再
び２−ブタノール100μ加え抽出し上清を除き、水層
とプレハイブリダイゼーション溶液100mlと混合してハ
イブリダイゼーション溶液とした。
気培養後、グラム染色、カタラーゼテストを実施した。
グラム陽性の連鎖状の球菌でカタラーゼ陰性であったの
で、ストレプトコッカスグループに分類した。この集落
からEDTA溶液でマックファーランドNo.3の菌液1.5mlを
調製し、被験菌液とした。この液をサンプリングチュー
ブに移し、15000回転30秒遠心し、上清を除いた後、菌
体をEDTA溶液200μに懸濁した。アクロモペプチダー
ゼ粉末を溶解液で溶かして5mg/mlの濃度にし50μ加え
て室温で５分放置した。さらに、20％SDS溶液30μ加
え、60℃、５分加温すると、半透明の状態となった。フ
ェノール、クロロホルム・イソアミルアルコール200μ
加え激しく振とう後、15000回転５分遠心して上清を
新しいサンプリングチューブに移した。エタノール400
μ加えよく混合し15000回転３分遠心して上清をデカ
ントした。沈澱のDNAに0.1×SSC20μ加え溶解し（原
液）10μをとり0.1×SSCを加え200μにした。分光
光度計を用いてλ＝260nmで吸光度を測定しDNA濃度を求
めた。結果、原液のDNA濃度10μg/μであった。残っ
た原液を100℃、５分間加熱、氷中で急冷して一本鎖DNA
とした。この液10μにフォトプローブビオチン（ベク
ター社製）５μを加えて混合し、氷中で太陽灯下10cm
の位置で15分照射した。照射後0.1MトリスーHCl（pH9.
0）緩衝液で100μにし、それに２−ブタノール100μ
加えて抽出した。上清の２−ブタノール層を除き、再
び２−ブタノール100μ加え抽出し上清を除き、水層
とプレハイブリダイゼーション溶液100mlと混合してハ
イブリダイゼーション溶液とした。
実施例１と同様の方法で作製したストレプトコッカ
ス用マイクロプレートにで作製したハイブリダイゼー
ション溶液100μ／ウェル加え42℃で12時間反応させ
た。上清を除去し２×SSCで３回洗浄後ブロッキング試
薬300μを加えて35℃で10分放置後上清を除きブロッ
キング試薬で1:1000に希釈したβ−ガラクトシダーゼ−
ストレプトアビジンを100μずつ加え35℃30分反応後
リン酸緩衝液で３回洗浄し、４−メチルウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド溶液100μずつ加え30分後
に励起波長360nm、測定波長450nmで蛍光強度を測定し
た。
ス用マイクロプレートにで作製したハイブリダイゼー
ション溶液100μ／ウェル加え42℃で12時間反応させ
た。上清を除去し２×SSCで３回洗浄後ブロッキング試
薬300μを加えて35℃で10分放置後上清を除きブロッ
キング試薬で1:1000に希釈したβ−ガラクトシダーゼ−
ストレプトアビジンを100μずつ加え35℃30分反応後
リン酸緩衝液で３回洗浄し、４−メチルウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド溶液100μずつ加え30分後
に励起波長360nm、測定波長450nmで蛍光強度を測定し
た。
実験結果は表４のとおりである。表中蛍光強度は、そ
の最高値を100とし、他はそれに対する相対値とした。
の最高値を100とし、他はそれに対する相対値とした。
表 ４ マイクロウェルに固相化したDNAの菌種 蛍光強度 ストレプトコッカス・ミティス（S.mitis） ＜10 ストレプトコッカス・サンギウス（S.sanguis） 14 ストレプトコッカス・オラリス（S.oralis） ＜10 肺炎球菌（S.pneumoniae） ＜10 ストレプトコッカス・ミュータンス （S.mutans） 15 ストレプトコッカス・アンギノーサス （S.anginosus） 100 ストレプトコッカス・インターメディウス （S.intermedius） 55 ストレプトコッカス・コンステラータス （S.consetellatus） 52 ストレプトコッカス・サリバリウス （S.salivarius） 19 ストレプトコッカス・モルビローラム （S.morbillorum） ＜10 ストレプトコッカス・ボビス（S.bovis） 17 ストレプトコッカス・アシドミニーマス （S.acidominimus） ＜10 ストレプトコッカス・ウベリス（S.uberis） ＜10 ストレプトコッカス・パラブルス （S.parvulus） ＜10 ストレプトコッカス・プレオモーフス （S.pleomorphus） ＜10 ストレプトコッカス・ハンセニー （S.hansenii） ＜10 ストレプトコッカス・ピオジェネス （S.pyogenes） ＜10 ストレプトコッカス・アガラクティエ （S.sgalactiae） ＜10 ストレプトコッカス・イクイシミリス （S.equisimilis） ＜10 ストレプトコッカス・カニス（S.canis） ＜10 ストレプトコッカス・イクイ（S.equi） ＜10 ストレプトコッカス・ポーシナス（S.porcinus） ＜10 ストレプトコッカス・イニエ（S.iniae） ＜10 ストレプトコッカス・スイス（S.suis） ＜10 実施例４ グラム陰性桿菌同定用キットは下記ないしの成分
（10検体分）より構成された。（以下の実施例において
も、各試薬、溶液などはすべて10検体用の量で記載し
た。） 菌体からDNAを抽出する試薬 （グラム陰性桿菌用） 数量 生理塩水−EDTA溶液 20ml×１本 20％SDS溶液 0.3ml×１本 リゾチーム粉末及び溶解液 2.5mg×１本＋0.5ml×１本 フェノール・クロロホルム ・イソアミルアルコール 2ml×１本 エタノール 4ml×１本 0.1×SSC 5ml×１本 非放射性標識体 （ビオチン標識体） バイオテクノロジー・リサーチ・エンタープライシス
社（Biotechnology Research Enterprises S.A.Pty.Lt
d.）とベクター・ラボラトリー社（Vector Laboratorie
s,Inc.）が製造。各々フォト・ビオチン（Photo Biotin
TM）およびフォトプローブ・ビオチン（PHOTOPROBETM B
iotin）として販売。
（10検体分）より構成された。（以下の実施例において
も、各試薬、溶液などはすべて10検体用の量で記載し
た。） 菌体からDNAを抽出する試薬 （グラム陰性桿菌用） 数量 生理塩水−EDTA溶液 20ml×１本 20％SDS溶液 0.3ml×１本 リゾチーム粉末及び溶解液 2.5mg×１本＋0.5ml×１本 フェノール・クロロホルム ・イソアミルアルコール 2ml×１本 エタノール 4ml×１本 0.1×SSC 5ml×１本 非放射性標識体 （ビオチン標識体） バイオテクノロジー・リサーチ・エンタープライシス
社（Biotechnology Research Enterprises S.A.Pty.Lt
d.）とベクター・ラボラトリー社（Vector Laboratorie
s,Inc.）が製造。各々フォト・ビオチン（Photo Biotin
TM）およびフォトプローブ・ビオチン（PHOTOPROBETM B
iotin）として販売。
（ビオチン標識試薬） フォト・ビオチンもしくはフォトプローブ・ビオチン0.
05ml×１本 0.1Mトリス−塩酸pH9.0 1ml×１本 ２−ブタノール 2ml×１本 プレハイブリダイゼーション溶液 100ml×１本 DNAを固相化したマイクロプレート マイクロプレートの材質としてポリスチレンのような
プラスチック基材 洗浄液 20×SSC 150ml×１本 使用時 蒸留水で10倍希釈 非放射性標識体を検出する試薬 ブロッキング試薬:2％ウシ血清アルブミンを含むリン酸
緩衝液 400ml×１本 β−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン 0.1ml×１
本 洗浄液：リン酸緩衝液 150ml×１本 使用時蒸留水で10倍希釈 基質液:4−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
シド 10ml×１本 希釈液:1mM MgCl2を含む緩衝液 100ml×１本 使用時 基質液を希釈液で10倍希釈 上記キットを実施例２において使用して、液体中のカ
ンピロバクター属菌種を効率よく同定できた。
05ml×１本 0.1Mトリス−塩酸pH9.0 1ml×１本 ２−ブタノール 2ml×１本 プレハイブリダイゼーション溶液 100ml×１本 DNAを固相化したマイクロプレート マイクロプレートの材質としてポリスチレンのような
プラスチック基材 洗浄液 20×SSC 150ml×１本 使用時 蒸留水で10倍希釈 非放射性標識体を検出する試薬 ブロッキング試薬:2％ウシ血清アルブミンを含むリン酸
緩衝液 400ml×１本 β−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン 0.1ml×１
本 洗浄液：リン酸緩衝液 150ml×１本 使用時蒸留水で10倍希釈 基質液:4−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
シド 10ml×１本 希釈液:1mM MgCl2を含む緩衝液 100ml×１本 使用時 基質液を希釈液で10倍希釈 上記キットを実施例２において使用して、液体中のカ
ンピロバクター属菌種を効率よく同定できた。
なお、上記β−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジ
ンの外に、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼで標識したストレプトアビジン、あるいはこれらの
酵素のいずれかで標識したアビジンも使用できる。
ンの外に、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼで標識したストレプトアビジン、あるいはこれらの
酵素のいずれかで標識したアビジンも使用できる。
実施例５ グラム陽性球菌同定用キットは下記成分ないしよ
り構成された。
り構成された。
菌体からDNAを抽出する試薬 （グラム陽性球菌用） EDTA溶液 20ml×１本 20％SDS溶液 0.3ml×１本 アクロモペプチダーゼ＊粉末及び溶解液 2.5mg×１本＋
0.5ml×１本 フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール 2ml
×１本 エタノール 4ml×１本 0.1×SSC 5ml×１本 ＊アクロモペプチダーゼ:Achromopeptidase（アクロモ
バクター・リチクス（Achromobucter lyticus）から得
られる：和光純薬工業（株）製造・販売） 非放射性標識体 （ビオチン標識体） バイオテクノロジー・リサーチ・エンタープライシス
社（Biotechnology Research Enterprises S.A.Pty.Lt
d.）とベクター・ラボラトリー社（Vector Laboratorie
s,Inc.）が製造。各々フォト・ビオチン（Photo Biotin
TM）およびフォトプローブ・ビオチン（PHOTOPROBETM B
iotin）として販売。
0.5ml×１本 フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール 2ml
×１本 エタノール 4ml×１本 0.1×SSC 5ml×１本 ＊アクロモペプチダーゼ:Achromopeptidase（アクロモ
バクター・リチクス（Achromobucter lyticus）から得
られる：和光純薬工業（株）製造・販売） 非放射性標識体 （ビオチン標識体） バイオテクノロジー・リサーチ・エンタープライシス
社（Biotechnology Research Enterprises S.A.Pty.Lt
d.）とベクター・ラボラトリー社（Vector Laboratorie
s,Inc.）が製造。各々フォト・ビオチン（Photo Biotin
TM）およびフォトプローブ・ビオチン（PHOTOPROBETM B
iotin）として販売。
（ビオチン標識試薬） フォト・ビオチンもしくはフォトプローブ・ビオチン
0.05ml×１本 0.1mトリス−塩酸pH9.0 1ml×１本 ２−ブタノール 2ml×１本 ハイブリダイゼーション溶液 100ml×１本 DNAを固相化したマイクロプレート マイクロプレートの材質としてポリスチレンのような
プラスチック基材 洗浄液 20×SSC 150ml×１本 使用時 蒸留水で10倍希釈 非放射性標識体を検出する試薬 ブロッキング試薬:2％ウシ血清アルブミンを含むリン
酸緩衝液 400ml×１本 β−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン 0.1ml×１
本 洗浄液：リン酸緩衝液 150ml×１本 使用時蒸留水で10倍希釈 基質液:4−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
シド 10ml×１本 希釈液:1mM MgCl2を含む緩衝液 100ml×１本 使用時 基質液を希釈液で10倍希釈 上記キットを実施例３において使用して、検体中のス
トレプトコッカス属菌種を効率よく同定できた。
0.05ml×１本 0.1mトリス−塩酸pH9.0 1ml×１本 ２−ブタノール 2ml×１本 ハイブリダイゼーション溶液 100ml×１本 DNAを固相化したマイクロプレート マイクロプレートの材質としてポリスチレンのような
プラスチック基材 洗浄液 20×SSC 150ml×１本 使用時 蒸留水で10倍希釈 非放射性標識体を検出する試薬 ブロッキング試薬:2％ウシ血清アルブミンを含むリン
酸緩衝液 400ml×１本 β−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジン 0.1ml×１
本 洗浄液：リン酸緩衝液 150ml×１本 使用時蒸留水で10倍希釈 基質液:4−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
シド 10ml×１本 希釈液:1mM MgCl2を含む緩衝液 100ml×１本 使用時 基質液を希釈液で10倍希釈 上記キットを実施例３において使用して、検体中のス
トレプトコッカス属菌種を効率よく同定できた。
このキットにおいて、β−ガラクトシダーゼ−ストレ
プトアビジンの外にペルオキシダーゼまたはアルカリホ
スファターゼで標識したストレプトアビジン、あるいは
これらの酵素のいずれかで標識したアビジンも使用でき
る。
プトアビジンの外にペルオキシダーゼまたはアルカリホ
スファターゼで標識したストレプトアビジン、あるいは
これらの酵素のいずれかで標識したアビジンも使用でき
る。
実施例６ 実施例４におけるキットのビオチン標識体の代りに、
ラベザイムーペルオキシダーゼ（Labezyme−POD）を使
用したキットをつくった。
ラベザイムーペルオキシダーゼ（Labezyme−POD）を使
用したキットをつくった。
下記標識試薬及び非放射性標識を検出する試薬を使用
した以外は実施例４のキットと同じ内容である。
した以外は実施例４のキットと同じ内容である。
標識試薬 ラベザイムーPOD試薬＊ ラベザイムーPOD 200μ×１本 25％グルタルアルデヒド溶液 25μ×１本 ＊Labezyme−PODset:和光純薬工業（株）製造・販売。P
OD（ペルオキシダーゼ）標識体だけでなく発色試薬など
も含む。（特許公開昭60−501488の方法により製造） 非放射性標識体を検出する試薬 基質液 10ml×１本 希釈液（H2O2を含む緩衝液） 100ml×１本 使用時基質液を希釈液で10倍希釈 基質液中の基質として （F:蛍光を発する基質） チラミンハイドロクロライド(F) ｐ−クレゾール(F) ４−ヒドロキシフェニル酢酸(F) ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸(F) 2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−
６−スルホン酸） 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン ５−アミノサリチル酸 などペルオキシダーゼの酵素活性検出・定量できる試薬 このキットを使用してカンピロバクター属の菌種を同
定できた。
OD（ペルオキシダーゼ）標識体だけでなく発色試薬など
も含む。（特許公開昭60−501488の方法により製造） 非放射性標識体を検出する試薬 基質液 10ml×１本 希釈液（H2O2を含む緩衝液） 100ml×１本 使用時基質液を希釈液で10倍希釈 基質液中の基質として （F:蛍光を発する基質） チラミンハイドロクロライド(F) ｐ−クレゾール(F) ４−ヒドロキシフェニル酢酸(F) ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸(F) 2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−
６−スルホン酸） 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン ５−アミノサリチル酸 などペルオキシダーゼの酵素活性検出・定量できる試薬 このキットを使用してカンピロバクター属の菌種を同
定できた。
実施例７ 実施例５におけるキットのビオチンの標識体の代り
に、ラベザイムーペルオキシダーゼ（Labezyme−POD）
を使用したキットをつくった。
に、ラベザイムーペルオキシダーゼ（Labezyme−POD）
を使用したキットをつくった。
下記標識試薬及び非放射性標識を検出する試薬を使用
した以外は実施例４のキットと同じ内容である。
した以外は実施例４のキットと同じ内容である。
標識試薬 ラベザイムーPOD試薬＊ ラベザイム−POD 200μ×１本 25％グルタルアルデヒド溶液 25μ×１本 ＊Labezyme−PODset:和光純薬工業（株）製造・販売。P
OD（ペルオキシダーゼ）標識体だけでなく発色試薬など
も含む。（特許公開昭60−501488の方法により製造） 非放射性標識体を検出する試薬 基質液 10ml×１本 希釈液（H2O2を含む緩衝液） 100ml×１本 使用時基質液を希釈液で10倍希釈 基質液中の基質として （F:蛍光を発する基質） チラミンハイドロクロライド(F) ｐ−クレゾール(F) ４−ヒドロキシフェニル酢酸(F) ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸(F) 2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン６
−スルホン酸） 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン ５−アミノサリチル酸 などペルオキシダーゼの酵素活性検出・定量できる試薬 このキットを使用してストレプトコッカス属の菌種を
同定できた。
OD（ペルオキシダーゼ）標識体だけでなく発色試薬など
も含む。（特許公開昭60−501488の方法により製造） 非放射性標識体を検出する試薬 基質液 10ml×１本 希釈液（H2O2を含む緩衝液） 100ml×１本 使用時基質液を希釈液で10倍希釈 基質液中の基質として （F:蛍光を発する基質） チラミンハイドロクロライド(F) ｐ−クレゾール(F) ４−ヒドロキシフェニル酢酸(F) ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸(F) 2,2′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン６
−スルホン酸） 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン ５−アミノサリチル酸 などペルオキシダーゼの酵素活性検出・定量できる試薬 このキットを使用してストレプトコッカス属の菌種を
同定できた。
第１図は被検菌をグループ分けする過程及びグループ分
けされた菌グループの同定に使用するキットを表示する
フローシートであり； 第２図は、本発明のキットを使用して検体中のグラム陰
性桿菌あるいはグラム陽性球菌を同定する場合のキット
内各構成成分の使用手順を示すフローシートである。
けされた菌グループの同定に使用するキットを表示する
フローシートであり； 第２図は、本発明のキットを使用して検体中のグラム陰
性桿菌あるいはグラム陽性球菌を同定する場合のキット
内各構成成分の使用手順を示すフローシートである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 日本細菌学会教育委員会編「細菌学技 術叢書８新しい分類学に伴走する細菌同 定法」、（昭62−９−１）、菜根出版、 Ｐ．98〜113 ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ，Ｖｏｌ. 183，Ｎｏ．２，（1985），Ｐ．378〜 382
Claims (12)
- 【請求項１】臨床上あるいは産業上有用である細菌をグ
ループ分けし、１つのグループに含まれる菌種から抽出
し１本鎖とした染色体DNAを各々固相化した容器を準備
しておき； 該グループに属するが菌種がいまだにわからない被検菌
株から染色体DNAを抽出し変性させ、一本鎖DNAとしてか
ら非放射性標識しあるいは非放射性標識してから一本鎖
DNAとし； この非放射性標識された一本鎖DNAを上記容器中の一本
鎖としたDNAに加え、ハイブリダイゼーションを行い、
洗浄を行い；そして該標識体を測定することによりハイ
ブリッド形成の度合を定量し、被検菌と最も相同性の高
い菌種を披検菌種と同定することからなる、細菌の種の
同定方法。 - 【請求項２】グループ分けが細菌の生理学的生化学的特
性および形態学的特徴を組み合わせることによって行わ
れる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】固相化する容器がマイクロプレートのウェ
ルである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】非放射性標識体がビオチンあるいは酵素で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】固相化する染色体DNAとして、細菌から抽
出され適切なサイズに断片化し一本鎖とした染色体DNA
を用いる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】被検菌体が、グラム陰性桿菌またはグラム
陽性球菌である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】被検菌体が、レジオネラ属、カンピロバク
ター属またはストレプトコッカス属からなるグループか
ら選択される属に含まれる、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】グラス陰性桿菌またはグラム陽性球菌であ
る被検菌体からDNAを抽出する試薬、並びに細菌グルー
プ毎の一本鎖とした染色体DNAを固相化した容器を含
む、細菌の種の同定用キット。 - 【請求項９】被検菌体が、レジオネラ属、カンピロバク
ター属またはストレプトコッカス属からなるグループか
ら選択される属に含まれる、請求項８記載のキット。 - 【請求項１０】容器がマイクロプレートのウェルであ
る、請求項８に記載のキット。 - 【請求項１１】マイクロプレートのウェルが取り外し可
能なものである、請求項10に記載のキット。 - 【請求項１２】被検菌体からDNAを抽出する試薬の量が
マックファーランドNo.0.5−６の菌液1.5ml相当の菌量
からDNAを抽出できる程少量である、請求項８に記載の
キット。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP63021098A JP2589729B2 (ja) | 1988-01-30 | 1988-01-30 | 染色体ｄｎａを用いた細菌の同定方法および該同定用キット |
| EP89101539A EP0326989B1 (en) | 1988-01-30 | 1989-01-30 | Method and kit for bacterial identification using chromosomal DNA |
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| JP63021098A JP2589729B2 (ja) | 1988-01-30 | 1988-01-30 | 染色体ｄｎａを用いた細菌の同定方法および該同定用キット |
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| 日本細菌学会教育委員会編「細菌学技術叢書８新しい分類学に伴走する細菌同定法」、（昭６２−９−１）、菜根出版、Ｐ．９８〜１１３ |
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