DE68923979T2

DE68923979T2 - Verfahren und Satz zur Identifizierung von Bakterien unter Verwendung von chromosomaler DNS.

Info

Publication number: DE68923979T2
Application number: DE1989623979
Authority: DE
Inventors: Takayuki Ezaki; Katsuyuki Fujimura; Yasuhiro Hashimoto; Eiko Yabuuchi
Original assignee: Kobayashi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kobayashi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-01-30
Filing date: 1989-01-30
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2009-01-31
Also published as: EP0326989B1; JP2589729B2; JPH01196300A; EP0326989A3; EP0326989A2; DE68923979D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von Bakterien unter Verwendung von chromosomaler DNA, und ein Kit zum Einsatz bei der Anwendung dieses Verfahrens.
Bakterien werden im allgemeinen durch Untersuchung einiger ihrer phenotypischen Eigenschaften oder durch Nachweis von Antigenen, die spezifisch für die fraglichen Bakterien sind, identifiziert. Im Hinblick auf den in jüngster Zeit anwachsenden Umfang und Komplexität der Bereiche, in denen eine Identifikation von Bakterien erforderlich ist, wurde es oft schwierig, eine rasche und präzise Identifikation mit konventionellen Techniken durchzuführen. Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde ist als eine Technik bekannt, die zur Bakterienidentifikation und -detektion eingesetzt werden kann, und die jüngsten Verbesserungen, die in der Gentechnologie stattgefunden haben, machen es möglich, DNA- Sonden mit einer Spezifität für bestimmte Bakterien herzustellen (siehe japanische offengelegte Patentanmeldungen Nr. 61-44000 und 60-110299). Diese Sonden sind nützlich zum Nachweis von fraglichen Bakterien direkt aus einer Probe, sind aber nicht geeignet zum Einsatz für die Routinearbeit bei der Identifikation unbekannter Bakterienstämme, da die Notwendigkeit zur Bereitstellung vieler spezifischer Sonden und zur Durchführung einer Hybridisierung mit jeder Sonde in hohem Maße zur benötigten Zeit und zu den beteiligten Kosten beiträgt. Es wurde ein Verfahren berichtet, in dem eine Bakterienidentifikation und -detektion durchgeführt werden kann, unter Verwendung einer chromosomalen DNA-Sonde anstelle einer spezifischen Sonde (J. Clin. Microbiol., Juli 1987, S. 1239-1243). Jedoch führt dieses Verfahren zu Schwierigkeiten bei der Differenzierung zwischen hoch homologen Bakterienstämmen und findet nur beschränkte Anwendung in medizinischen und anderen Bereichen, wo eine Differenzierung zwischen Spezies desselben Bakterienstammes erforderlich ist.
Markierung der DNA in der Probe führt auch zu Problemen. Da die Probe im Stand der Technik selbst markiert ist, ist ein außerordentlich hohes Ausmaß an Fähigkeit beim klinischen Techniker erforderlich, eine Probe einer Nukleinsäure im Labor zu markieren. Ferner ist kein übliches und verläßliches Verfahren zur Überwachung der Markierungsausbeute zugänglich (siehe japanische offengelegte Patentanmeldungen Nr. 60- 201256 und 60-201257)
EP-A-0 235 726 betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Mikroorganismus in einer Probe, wobei zunächst hieraus extrahierte, markierte DNA hergestellt wird. Die Sonden werden hergestellt durch Immobilisieren einzelsträngiger DNA aus bekannten Mikroorganismen, und diese Sonden werden unter Hybridisierungsbedingungen mit der aus der Probe extrahierten, markierten DNA unter Bildung hybridisierter markierter DNA in Kontakt gebracht. Diese hybridisierte DNA wird dann getestet, um die Markierung unter Identifikation des Mikroorganismus nachzuweisen.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Bakterienidentifikation zur Verfügung zu stellen, das weniger zeit- und kostenaufwendig ist, und das zur Differenzierung zwischen hoch homologen Bakterienspezies in der Lage ist.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, ein Kit zur Verfügung zu stellen, das bei der Anwendung dieses Verfahrens einsetzbar ist, und das eine einfachere Durchführung der Bakterienidentifikation erlaubt.
Erfindungsgemäß wird die chromosomale DNA in einem zu testenden Bakterium als eine Sonde zur Hybridisierung mit der chromosomalen DNA in mehr als einer Bakterienspezies, die im Verdacht steht, mit dem fraglichen Bakterium identisch zu sein, verwendet, und das fragliche Bakterium wird durch Überprüfen seiner Homologie (dem Ausmaß der Kreuzhybridisierung) mit der einzelnen verdächtigten Spezies identifiziert. Insbesondere umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis der Spezies einer Bakteriengruppe die folgenden Schritte:
Identifizieren einer Bakteriengruppe, zu der die zu identifizierende Bakterienspezies gehört, nach üblichen Techniken, wie ihren physiologischen Eigenschaften, biochemischen Eigenschaften, gram-Färbung oder morphologischen Eigenschaften;
Bereitstellen einer Vielzahl von Behältern, von denen ein jeder einzelsträngige chromosomale, aus auf einer festen Phase immobilisierten Bakterienspezies extrahierte DNA enthält, wobei jeder Behälter einzelsträngige chromosomale, aus verschiedenen Bakterienspezies, die zur Bakteriumgruppenspezies gehört, extrahierte DNA enthält;
Extrahieren der chromosomalen DNA aus den zu identifizieren Bakterien, und entweder Denaturieren der extrahierten DNA unter Bildung einzelsträngiger DNA, die dann mit einem nicht- radioaktiven Marker markiert wird oder Markieren der extrahierten DNA mit einem nicht-radioaktiven Marker und anschließende Denaturierung unter Bildung einzelsträngiger DNA;
Zugabe der nicht-radiomarkierten einzelsträngigen DNA zur einzelstängigen DNA in den Behältern, Durchführung der Hybridisierung und Waschen der Behälter unter Entfernen der überschüssigen markierten DNA; und
Testen der nicht-radioaktiven Marker zur Bestimmung des Ausmaßes der Hybridisierung und Identifizierung der Bakterienspezies, die das höchste Ausmaß an Hybridisierung zeigt;
dadurch gekennzeichnet, daß die Behälter einzelne Wells in einer Mikrotiterplatte sind, auf deren inneren Oberflächen die einzelsträngigen chromosomalen DNAs immobilisiert sind.
Fig. 1 ist ein Flußdiagramm zur Beschreibung des Verfahrens zur Bestimmung der Gruppe, zu der ein zu testendes Bakterium gehört, und das auch das zur Identifizierung einzelner Bakteriengruppen verwendete Kit; und
Fig. 2 ist ein Flußschema, das die Verfahren zur Handhabung der individuellen Bestandteile des erfindungsgemäßen Kits zur Identifizierung eines gram-negativen Bacillus oder gram-positiven Coccus in einer zu testenden Probe beschreibt.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bakterienidentifizierung im klinischen Bereich muß man zunächst eine Probe aus einem Patienten oder einer anderen geeigneten Quelle entnehmen. Die Abfolge der Schritte dieses Verfahrens, die in der Praxis durchzuführen sind, wird im folgenden beschrieben, wobei Urin als zu sammelnde Probe genommen wird.
Der gesammelte Urin wird auf ein Kulturmedium, wie Blutagar, BTB-Medium oder Phenylethylalkohol-Blutagar geimpft und einer Isolationskultivierung unterzogen. Die isolierten Kolonien werden überprüft, um zu bestimmen, welche Kolonie von den verursachenden Bakterienzellen gebildet wird. Falls die verdächtigen Bakterien aerobe gram-positive Coccen sind, werden sie einem Katalasetest unterworfen. Falls man findet, daß sie im Test positiv sind, können sie in eine Gruppe eingeordnet werden, die im allgemeinen aus dem Stamm der Staphylococcus besteht. Falls das Testergebnis negativ ist, können sie im allgemeinen in eine Gruppe eingeordnet werden, die aus dem Stamm Streptococcus besteht. Eine Übersicht über diese Gruppeneinteilung der Bakterien ist in Fig. 1 gezeigt. Kriterien zur Einteilung sind solche, die üblicherweise in jedem Labor angewandt werden, wie physiologische Eigenschaften, biochemische Eigenschaften, gram-Färbung und morphologische Eigenschaften. In Gruppen eingeordnete Bakterien können mit geeigneten Identifikationskits getestet werden.
Daher stellt die Erfindung auch ein Kit zur Bakterienidentifikation zur Verfügung, das Reagenzien zur Extraktion von DNA aus zu testenden Bakterienzellen und Behälter, in denen einzelsträngige chromosomale DNAs auf einer festen Phase für jede Bakteriengruppe immobilisiert werden, enthält. Die Menge der Mittel zur DNA-Extraktion im erfindungsgemäßen Kit entspricht ein paar Hundertstel von solchen üblichen Reagenzien, so daß das zu testende Bakterium in einer sehr kleinen Menge (oder Zellzahl) eingesetzt werden kann. Üblicherweise waren Naßzellgewichte von 1 bis 2 g notwendig zum Erhalt der zu markierenden DNA, jedoch ermöglicht das erfindungsgemäße Kit einen ausreichenden Test, auch wenn das Naßzellgewicht nur ca. 5 mg ist (z. B. 1,5 ml einer Zellösung mit einer McFarland-Turbidität von Nr. 3). Auch kleinere Mengen an Bakterien genügen, je nach der Gruppe zu der sie gehören. Das andere konstituierende Element des erfindungsgemäßen Kits sind die Behälter, mit denen die einzelsträngigen chromosomalen DNAs in einer festen Phase immobilisiert werden sollen. Mikrotiterplatten sind als solche Behälter geeignet. Falls als Ergebnis von Vortests die Zahl der verdächtigen Bakterien auf eine Anzahl unterhalb der Wellzahl vermindert ist, können die Wells, die für die Hybridisierung nicht notwendig ist, weggelassen werden. Daher ist die Verwendung einer Mikroplatte mit Abnehmbaren Wells bequem und sollte vom Umfang des erfindungsgemäßen Kits mit umfaßt sein. Die Verfahren zur Verwendung des erfindungsgemäßen Kits sind in Fig. 2 unter Bezugnahme auf einen Fall, wo DNAs, die mit einer oder zwei Sets an DNA- extrahierenden Reagenzien extrahiert wurden, eines zur Extraktion von DNA aus gram-negativen Bacillen und das andere zur Extraktion von DNA aus gram-positiven Coccen, mit POD oder Biotin unter Herstellung markierter DNAs zur Verwendung im Test markiert wurden, erläutert.
Detailliertere Information über das Kit einschließlich Einzelheiten über die entsprechenden Reagenzien und nicht- radioaktiven Marker finden sich in den folgenden Beispielen 4 bis 7.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß nur eine Substanz markiert werden muß, nämlich die chromosomale DNA auf dem zu testenden Bakterium. Folglich kann das Verfahren durch einen einzelnen Schritt einer Kreuzhybridisierung auf einem Multiwellbehälter, wie einer Mikroplatte, abgeschlossen werden.
Bakterienidentifikation nach dem erfindungsgemäßen Verfahren beruht auf einem Vergleich des Ausmaßes der Kreuzhybridisierung, so genügt eine einzelsträngige chromosomale DNA als in einer festen Phase zu immobilisierender DNA, und es besteht kein besonders Bedürfnis zur Herstellung von Fragmenten der DNA, die für die fraglichen Bakterien spezifisch ist, aus der chromosomalen DNA. Folglich kann das erfindungsgemäße Verfahren in sehr effizienter und billiger Weise angewandt werden.
Der Marker zur Markierung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu testenden DNA wird ausgewählt aus nicht- radioaktiven Markern ohne das Erfordernis von komplizierter Handhabung, Training und Vorrichtungen gehandhabt werden, und dies verringert den Aufwand für das Fachpersonal hinsichtlich Zeit und Kosten.
Aufgrund der drei oben beschriebenen Merkmale glaubt man, daß das erfindungsgemäße Verfahren die Durchführung einer Bakterienidentifikation auf genaue und rasche Art und Weise ermöglicht.
Das erfindungsgemäße Kit verwendet keine Membranfilter derart, die üblicherweise in der Bakterientaxonomie zur Bestimmung der Homologie von zwei Bakterien verwendet werden, wie z. B. Mikrozellulosefilter. Dafür verwendet das Kit einen Festphasenbehälter und ermöglicht die Bestimmung der bakteriellen Homologie durch eine nicht-isotope Technik. Der Festphasenbehälter kann aus jedem geeigneten Material, wie Polystyrol oder Polyvinylchlorid hergestellt werden, aber zur Durchführung der beabsichtigten Bestimmung der bakteriellen Homologie durch eine Nicht-Isotopentechnik ist es ratsam, ein Material zu verwenden, das frei von Problemen ist, denen man bei der Verwendung von Hydrozellulosefilter begegnet, wie der Lösung von Pigmenten oder Farbstoffen in die Spots während der Bestimmung, der Enzymaktivität, erhöhten Hintergrund aufgrund nicht-spezifischer Adsorption von Farbstoffen oder Pigmenten auf dem Filter und Schwierigkeiten bei der Reinigung.
Da das erfindungsgemäße Kit aus einer sehr kleinen Menge an Komponenten, einschließlich der Reagenzien für die Extraktion der DNA aus dem fraglichen Bakterium, aufgebaut ist, bietet die Erfindung den zusätzlichen Vorteil, daß der beabsichtigte Test zufriedenstellend durchgeführt werden kann, auch wenn die Menge an zu testenden Bakterienzellen nur mehrere Hundertstel der Größenordnung der zuvor erforderlichen Spiegel erreicht.
Der Bakterientest kann auf eine bequemere und verläßlichere Weise durch Einsetzen dieses Kits in dem bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Bakterienidentifikation eingesetzt werden. Die folgenden Beispiele dienen dem Zweck der weiteren Erläuterung der Erfindung, sind jedoch in keiner Weise als einschränkend auszulegen.

BEISPIEL 1

(1) HERSTELLUNG VON BEHÄLTERN, IN DENEN CHROMOSOMALE DNAs IN EINER FESTEN PHASE IMMOBILISIERT WERDEN

DNA wurde aus 13 Arten des Stammes Legionella nach dem Marmur-Verfahren, beschrieben im "Chemistry of Nucleic Acids: Part I", in A Course in Experimental Biochemistry, Bd. 2, zusammengestellt von The Japanese Biochemical Society und veröffentlicht von der Tokyo Kogaku Dojin, extrahiert. Die extrahierten DNAs wurden 5 Minuten auf 100ºC erhitzt und in Eiswasser unter Herstellung einzelsträngiger DNAs abgeschreckt. Alle einzelsträngigen DNAs wurden auf eine Konzentration von 10 ug/ml mit PBS (pH 7,0), enthaltend 0,1 M MgCl&sub2;, eingestellt. Die so hergestellten DNA-Lösungen aus den 13 Bakterienspezies wurden zu einer Mikroplatte gegeben (Immunoplate II von Nunc Inc. oder MicroFluor Black Plate von Dynatech Laboratories, Inc.) in Mengen von 100 ul/Well.
Nach Stehenlassen für 1 Stunde bei 35ºC wurde der Überstand entfernt und eine Prä-Hybridisierungslösung [siehe Rezeptur im folgenden unter (2)] wurde in einer Menge von 300 ul/Well zugegeben. Nach 1-stündigem Stehenlassen bei 35ºC wurde der Überstand entfernt und der Rückstand bei 5ºC unter Trocknungsbedingungen gelagert.

(2) HERSTELLUNG NICHT-RADIOAKTIV MARKIERTER EINZELSTRÄNGIGER DNA AUS DER PROBE

VERFAHREN 1

DNA wurde nach dem Marmur-Verfahren aus einem Bakterium des Stammes Legionella, isoliert aus menschlichem Lungenauswurf, extrahiert. Die extrahierte DNA wurde bei 100ºC 5 Minuten erhitzt und in Eiswasser unter Herstellung einzelsträngiger DNA abgeschreckt. Diese einzelsträngige DNA wurde in einer Konzentration von 500 ug/ml mit 0,1 x SSC, oder einer 10- fachen Verdünnung einer 0,15 M NaCl-0,015 M Trinatriumcitratlösung gelöst. Ein Teil (20 ul) dieser Lösung wurde mit 20 ul Labezyme-POD (einer Markerperoxidase, hergestellt und verkauft von Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) vermischt. Nach Zugabe von 5 % Glutaraldehyd (6 ul) wurde die Mischung bei 37ºC 10 Minuten unter Herstellung einer POD-markierten DNA inkubiert. Diese wurde mit 10 ml einer Prä-Hybridisierungslösung [0 bis 50 % Formamid; 1 x Denhardt's Lösung {0,02 % BSA, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht 3,6 x 10³ bis 4 x 10&sup4;) und 0,02 % Ficoll (Molekulargewicht 4 x 10&sup5;)}; 2 x SSC oder 0,15 M NaCl-0,03 M Tris-HCl-Pufferlösung; 0 bis 6 % Polyethylenglycol 6000; und 50 bis 200 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA unter Herstellung einer Hybridisierungslösung, vermischt.

VERFAHREN 2

10 Mikroliter der einzelsträngigen DNA-Lösung, hergestellt wie in Verfahren 1, wurden mit 5 ul PHOTOPROBE TM Biotin (Vector Laboratories, Ins.) vermischt, und die Mischung wurde 15 Minuten in Eiswasser unter einem Sonnenstrahler, der 10 cm darüber angeordnet war, bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurde das Volumen der Mischung auf 100 ul mit einer 0,1 M Tris-HCl (pH 9,0) Pufferlösung eingestellt. Nach Extraktion mit 100 ul 2-Butanol wurde die 2-Butanolschicht im Überstand entfernt, worauf sich ein weiterer Extraktionszyklus mit 100 ul 2- Butanol und Entfernung des Überstands anschloß. Die wäßrige Schicht wurde mit 100 ul einer Prä-Hybridisierungslösung unter Herstellung einer Hybridisierungslösung vermischt.

(3) HYBRIDISIERUNG UND BESTIMMUNG DES AUSMASSES DER HYBRIDBILDUNG

IN VERFAHREN 1

Die in (2) hergestellte Hybridisierungslösung wurde zu 100 ul/Well zu der Mikroplatte (Immunoplate II) präkonditioniert in (1), gegeben, und man ließ die Reaktion bei 35ºC 2 Stunden fortschreiten. Der Überstand wurde entfernt, und die Wells wurden dreimal mit 2 x SSC-Lösung gewaschen. Nach Zugabe von 100 ul einer 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin- H&sub2;O&sub2;-Lösung, wurde die Mischung 5 Minuten zur Farbentwicklung inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe 100 ul 2 N HCl abgebrochen, und die Absorptionsmessung erfolgte bei λ = 450 nm mit einem Mikroplattenableser.

IN VERFAHREN 2

Die in (2) hergestellte Hybridisierungslösung wurde in 100 ul/Well zu der Mikroplatte (MikroFluor Black Plate), präkonditioniert in (1), gegeben, und man ließ die Reaktion bei 42ºC 12 Stunden fortschreiten. Der Überstand wurde entfernt, und die Wells wurden dreimal mit 2 x SSC gewaschen. Anschließend wurden 300 ul PBS, enthaltend 2 % BAS und 0,1 % Triton X-100 zugegeben, und man ließ die Mischung bei 35ºC 10 Minuten stehen. Der Überstand wurde entfernt und β- Galaktosidasestreptavidin (Zymed Laboratories) verdünnt zu 1:1000 mit dem oben beschriebenen PBS, wurde in 100-ul- Anteilen zugegeben. Nach 30-minütiger Reaktion bei 35ºC wurden die Wells dreimal mit PBS, enthaltend 0,1 % Triton X- 100, gewaschen, worauf sich die Zugabe von 4- Methylumbelliferyl-β-D-galaktosidlösung in 100-ul-Anteilen anschloß. 30 Minuten später wurde die Intensität der Fluoreszenz bei 450 nm mit Anregung bei 360 nm gemessen.

EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE

Die Ergebnisse des nach den Prozeduren (1) bis (3) durchgeführten Experiments sind in Tabelle 2 beschreiben. TABELLE 2 Bakterienquelle der in der festen Phase in Mikrowells fixierten DNA Verfahren (Abs. λ=450nm) Intensität der Fluoreszenz Legionella pneumophila Legionella feeleii Legionella jordanis Legionella micdadei Legionella longbeachae Legionella wadsworthii Legionella sainthelensi Legionella hackeliae Legionella rubrilucens Legionella cherrii Legionella dumoffii Legionella gormanii Legionella bozemanii
Die Intensität der Fluoreszenz, angegeben in relativen Werten, mit einem Maximum von 100, das als Referenzwert angenommen wird, ist in Tabelle 2 gezeigt.
Auf Basis der Daten in Tabelle 2 wurde das Bakterium des aus dem menschlichen Lungenauswurf isolierten Stammes Legionella als L. pneumophila identifiziert.

BEISPIEL 2

(1) Bei Kultivierung von diarrhetischem Stuhl im Skirrow- Medium bei 42ºC über 48 Stunden unter mikroaerophilen Bedingungen wuchsen Kolonien vom S-Typ mit einem scharlachroten Schimmer. Diese Kolonien waren Oxidase- positiv und fermentierten keine Zucker. Diese Eigenschaften, in Kombination mit den Ergebnissen der gram-Färbung zeigte, daß diese Kolonien aus gram- negativen Bakterien gebildet wurden, die in spiralgebogenen Stäbchen vorlagen, was typisch ist für Bakterien des Stammes Campylobacter.
Unter Einsatz einer physiologischen Kochsalz-EDTA-Lösung, wurden 1,5 ml einer Zellsuspension mit einer McFarland- Turbidität von Nr. 2 aus den Kolonien hergestellt, und als Lösung des zu testenden Bakteriums verwendet. Dies Testlösung wurde in ein Eppendorf-Probenröhrchen überführt und bei 15000 Upm 30 Sekunden unter Entfernung des Überstands zentrifugiert. Die Zellen wurden in 100 ul physiologischer Kochsalz-EDTA-Lösung suspendiert. Ein Lysozympulver wurde in einer Auflöselösung gelöst und auf eine Konzentration von 5 mg/ml eingestellt. Ein Anteil (50 ul) der Lösung wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten stehengelassen. Nach Zugabe von 30 ul einer 20%igen SDS (Natriumlaurylsulfat)-Lösung, wurde die Mischung bei 60ºC für 5 Minuten erhitzt, worauf sie viskos und durchscheinend wurde.
Zu dieser Mischung wurden 200 ul Phenolchloroformisoamylalkohol (25:24:1) zugegeben, worauf sich heftiges Schütteln und Zentrifugation bei 15000 Upm für 5 Minuten anschloß.. Der Überstand wurde in ein neues Probenröhrchen überführt und gut mit 400 ul kaltem Ethanol vermischt. Nach Zentrifugation bei 15000 Upm für 3 Minuten wurde der Überstand dekantiert. Die DNA im Präzipitat wurde in 20 ul 0,1 x SSC gelöst, und 10 ul der Stammlösung wurden auf 200 ul durch Zugabe von 0,1 x SSC erhöht. Die Konzentration der DNA wurde durch Absorptionsmessung bei λ = 260 nm mit einem Spektralphotometer bestimmt. Man fand, daß die Konzentration in der DNA in der Stammlösung 15 ug/10 ul war. Die restliche Stammlösung wurde auf 100ºC für 5 Minuten erhitzt und in Eiswasser unter Herstellung einzelsträngiger DNAs abgeschreckt. Ein Anteil (10 ul) der Lösung wurde mit 5 ul PHOTOPROBE TM Biotin (Laboratories, Inc.) vermischt, und die Mischung wurde 15 Minuten in Eiswasser unter einem Sonnenstrahler, der 10 cm darüber angeordnet war, bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurde das Volumen der Lösung auf 100 ul 2- Butanol erhöht und der Überstand entfernt. Die wäßrige Schicht wurde mit 10 ml einer Prä-Hybridisierungslösung unter Herstellung einer Hybridisierungslösung vermischt.
(2) Die in (1) hergestellte Hybridisierungslösung wurde in Mengen von 100 ul/Well zu der Campylobacter-Mikroplatte, die auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben vorkonditioniert war, zugegeben, und man ließ die Reaktion bei 42ºC 12 Stunden fortschreiten. Der Überstand wurde entfernt, und die Wells dreimal mit 2 x SSC gewaschen. Nach Zugabe von 300 ul eines Blockierungsreagenses ließ man die Mischung bei 35ºC 10 Minuten stehen. Nach Entfernen des Überstands wurde β- Galaktosidase-Streptavidin, verdünnt auf 1:1000, mit einem Blockierungsreagens in 100-ul-Anteilen zugegeben, und man ließ die Reaktion bei 35ºC 30 Minuten fortschreiten. Nach dreimaligem Waschen mit einer Phosphat-gepufferten Lösung, wurden 4-Methylumbelliferyl- β-D-galaktosidlösung in 100-ul-Anteilen zugegeben. 30 Minuten später wurde die Intensität der Fluoreszenz bei 450 nm unter Anregung bei 360 nm gemessen.
Das Ergebnis des oben beschriebenen Experiments ist in Tabelle 3 zusammengefaßt, in der die Intensität der Fluoreszenz, bezogen auf relative Werte, angegeben ist, mit einem Maximum bei 100 als Referenzwert. TABELLE 3 Bakterienquelle der DNA, fixiert in der festen Phase in Mikrowells Intensität der Fluoreszenz Campylobacter fetus Campylobacter jejuni Campylobacter coli Campylobacter pyloridis Campylobacter sputorum
Auf Basis der in Tabelle 3 gezeigten Daten wurde das fragliche Bakterium als C. jejuni identifiziert.

BEISPIEL 3

(1) Eine Probe aus einem menschlichen Schlundabstrich wurde aeorb auf einem Blutagar-Plattenmedium kultiviert und sowohl einer gram-Färbung als auch einem Catalasetest unterzogen. Da die Kolonien gram-positiv, Catalase- negativ und cocoidale Bakterien, die in Ketten wuchsen, waren, wurden sie als zur Spretococcusgruppe zugehörig klassifiziert. Unter Verwendung einer EDTA-Lösung wurden 1,5 ml einer Zellösung mit einer McFarland-Turbidität von Nr. 3 aus diesen Kolonien hergestellt, und als eine Lösung für das zu testende Bakterium verwendet. Diese Testlösung wurde in ein Probenröhrchen überführt und bei 15000 Upm 30 Sekunden unter Entfernung des Überstands zentrifugiert. Die Zellen wurden in 200 ul EDTA-Lösung suspendiert. Ein Achrompeptidasepulver wurde in einer Auflösungslösung gelöst, auf eine Konzentration von 5 mg/ml eingestellt und bei Raumtemperatur 5 Minuten stehengelassen. Nach Zugabe von 30 ul einer 20%igen SDS- Lösung wurde die Mischung auf 60ºC für 5 Minuten erhitzt, worauf sie durchscheinend wurde.
Zu dieser Mischung wurden 200 ul Phenolchloroformisoamylalkohol zugegeben, worauf heftiges Schütteln und Zentrifugation bei 15000 Upm für 5 Minuten folgte. Der Überstand wurde in ein neues Probenröhrchen überführt und gut mit 400 ul kaltem Ethanol vermischt. Nach Zentrifugation bei 15000 Upm für 3 Minuten wurde der Überstand dekantiert. Die DNA im Präzipitat wurde in 20 ul 0,1 x SSC gelöst, und 10 ul der Stammlösung wurden auf 200 ul durch Zugabe von 0,1 x SSC erhöht. Die Konzentration der DNA wurde durch Absorptionsmessung bei λ = 260 nm mit einem Spektralphotometer bestimmt. Die DNA-Konzentration in der Stammlösung wurde zu 10 ug/ul gefunden. Die übrige Stammlösung wurde auf 100ºC für 5 Minuten erhitzt und in Eiswasser unter Herstellung einzelsträngiger DNAs gelöscht. Ein Anteil (10 ul) der Lösung wurde mit 5 ul PHOTOPROBE TM Biotin (Laboratories, Inc.) vermischt, und die Mischung wurde 15 Minuten in Eiswasser unter einem Sonnenstrahler, der 10 cm darüber angeordnet war, bestrahlt. Nach Bestrahlung wurde das Volumen der Lösung auf 100 ul mit einer 0,1 M Tris-HCl (pH 9,0) Pufferlösung erhöht. Nach Extraktion mit 100 ul 2-Butanol, wurde 2-Butanol im Überstand entfernt, worauf ein weiterer Extraktionszyklus mit 100 ul 2-Butanol zum Entfernen des Überstands folgte. Die wäßrige Schicht wurde mit 10 ml einer Prä-Hybridisierungslösung unter Herstellung einer Hybridisierungslösung vermischt.
(2) Die in (1) hergestellte Hybridisierungslösung wurde in Mengen von 100 ul/Well zu der Campylobacter-Mikroplatte, die auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben vorkonditioniert war, zugegeben, und man ließ die Reaktion bei 42ºC 12 Stunden fortschreiten. Der Überstand wurde entfernt, und die Wells wurden dreimal mit 2 x SSC gewaschen. Nach Zugabe von 300 ul eines Blockierungsmittels ließ man die Mischung bei 35ºC 10 Minuten stehen. Nach Entfernen des Überstands wurde β- Galaktosidase-Streptavidin, verdünnt auf 1:1000, mit einem Blockierungsreagens, in 100-ul-Anteilen zugegeben, und man ließ die Reaktion bei 35ºC 30 Minuten fortschreiten. Nach dreimaligem Waschen mit einer Phosphatpufferlösung, wurde 4-MethylumbellifEryl-β-D- galaktosidlösung in 100-ul-Anteilen zugegeben. 30 Minuten später wurde die Intensität der Fluoreszenz bei 450 nm unter Anregung bei 360 nm gemessen.
Das Ergebnis des oben beschriebenen Experiments ist in Tabelle 4 zusammengefaßt, in der die Intensität der Fluoreszenz, bezogen auf relative Werte mit einem Maximum bei 100 als Referenzwert angegeben ist. TABELLE 4 Bakterienquelle der in fester Phase in Mikrowells fixierten DNA Intensität der Fluoreszenz Streptococcus mitis Streptococcus sanguis Streptococcus oralis Streptococcus pneumoniae Streptococcus mutans Streptococcus anginosus Streptococcus intermedius Streptococcus consetellatus Streptococcus salivarius Streptococcus morbillorum Streptococcus bovis Streptococcus acidominimus Streptococcus uberis Streptococcus parvulus Streptococcus pleomorphus Streptococcus hansenii Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus equisimilis Streptococcus canis Streptococcus equi Streptococcus porcinus Streptococcus iniae Streptococcus suis

BEISPIEL 4

Ein Kit zur Identifikation von gram-negativen Bazillen wurde aufgebaut aus den folgenden Komponenten (1) bis (5) in einer Menge, die zum Test von 10 Proben (in den Beispielen 5 bis 7, alle Kitkomponenten einschließlich Reagenzien und Lösungen sind unter der Annahme, daß sie zum Test von 10 Proben zu verwenden sind, beschrieben) aufgebaut. (1) REGENZIEN ZUR EXTRAKTION VON DNA AUS ZELLEN (Zum Test auf gram-negativen Bacillus) Menge Physiologische Kochsalz-EDTA-Lösung SDS-Lösung Lysozympulver und Auflöselösung Phenolchloroformisoamylalkohol Ethanol

(2) NICHT-RADIOAKTIVER MARKER

(Marker-Biotin)

Hergestellt von Biotechnology Research Enterprises S.A. Pty. Ltd. und Vector Laboratories, Inc. und verkauft unter den Handelsmarken PHOTO BIOTIN und PHOTOPROBE BIOTIN.

(Reagenzien des Marker-Biotins)

PHOTOBIOTIN oder PHOTOPROBE Biotin 0,05 ml x 1
0,1 M Tris-HCl (pH 9,0) 1 ml x 1
2-Butanlol 2 ml x 1
Prä-Hybridisierungslösung 100 ml x 1

(3) MIKROPLATTE MIT IN FESTER PHASE IMMOBILISIERTER DNA HERGESTELLT AUS PLASTIKMATERIALIEN WIE POLYSTYROL

(4) WASCHLÖSUNG

20 x SSC 150 ml x 1
(verwendet als eine 10-fache Verdünnung in destilliertem Wasser)

(5) REAGENZIEN ZUM NACHWEIS VON NICHT-RADIOAKTIVEM MARKER

Blockierungsreagens: Phosphatpufferlösung enthaltend 2 % BSA 400 ml x 1
β-Galaktosidase-Streptovidin 0,1 ml x 1
Waschlösung: Phosphatpufferlösung 150 ml x 1
(verwendet als 10-fache Verdünnung in destilliertem Wasser)
Substratlösung: 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid 10 ml x 1
Verdünnungslösung: Pufferlösung enthaltend 1 mM MgCl&sub2; 100 ml x 1
(Substratlösung wurde als 10-fache Verdünnung in Verdünnungslösung verwendet)
Das aus den obigen Komponenten (1) bis (5) zusammengesetzte Kit wurde in Beispiel 2 verwendet und die Bakterienspezies des Stammes Campylobacter in der Probe wurden mit hoher Effizienz identifiziert.
Neben dem β-Galaktosidase-Streptavidin im Kit kann auch Streptavidin oder Avidin, markiert mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, verwendet werden.

BEISPIEL 5

Ein Kit zur Identifikation von gram-positivem Coccus war aufgebaut aus den folgenden Komponenten (1) bis (5). (1) REAGENZIEN ZUR EXTRAKTION VON DNA AUS ZELLEN (Zum Test auf gram-positiven Coccus) Menge EDTA-Lösung SDS-Lösung Achromopeptidasepulver * und Auflöse-Lösung Phenolchloroformisoamylalkohol Ethano * Hergestellt aus Achromobacter lyticus; hergestellt und verkauft von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

(2) NICHT-RADIOAKTIVER MARKER

(Marker-Biotin)

(Reagenzien des Marker-Biotins)

PHOTOBIOTIN oder PHOTOPROBE Biotin 0,05 ml x 1
0,1 M Tris-HCl (pH 9,0) 1 ml x 1
2-Butanol 2 ml x 1
Hybridisierungslösung 100 ml x 1

(4) WASCHLÖSUNG

(5) REAGENZIEN ZUM NACHWEIS VON NICHT-RADIOAKTIVEM MARKER

Blockierungsreagens: Phosphatpufferlösung enthaltend 2 % BSA 400 ml x 1
β-Galaktosidase-Streptovidin 0,1 ml x 1
Waschlösung: Phosphatpufferlösung 150 ml x 1
(verwendet als 10-fache Verdünnung in destilliertem Wasser)
Substratlösung: 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid 10 ml x 1 Verdünnungslösung: Pufferlösung, enthaltend 1 mM MgCl&sub2; 100 ml x 1
(Substratlösung wurde als 10-fache Verdünnung in Verdünnungslösung verwendet)
Das aus den obigen Komponenten (1) bis (5) zusammengesetzte Kit wurde in Beispiel 2 verwendet und die Bakterienspezies des Stammes Streptococcus in der Probe wurden mit hoher Effizienz identifiziert.
Neben dem β-Galaktosidase-Streptavidin im Kit kann auch Streptavidin oder Avidin, markiert mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, verwendet werden.

BEISPIEL 6

Ein Kit wurde aufgebaut wie in Beispiel 4, mit Ausnahme, daß der Marker Biotin durch Labezyme-Peroxidase (POD) ersetzt wurde. Im einzelnen war das Kit dasselbe wie in Beispiel 4, mit Ausnahme, der Verwendung der folgenden Markierungsreagenzien und nicht-radioaktiven Marker- Nachweisagenzien.

MARKIERUNGSREAGENZIEN

Labezyme-POD-Reagenzien* (Labezyme-POD) 200 ul x 1
25 % Glutaraldehydlösung 25 ul x 1
* Labezyme-POD-Set: Hergestellt und verkauft von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., enthält farbbildende Reagenzien zusätzlich zur Markerperoxidase (hergestellt durch das Verfahren beschrieben in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 60-501488).

NICHT-RADIOAKTIVE MARKER-NACHWEISMITTEL

Substratlösung 10 ml x 1
Verdünnungslösung (H&sub2;O&sub2;-haltige Pufferlösung) 100 ml x 1
(Substratlösung wurde als 10-fache Verdünnung in der Verdünnungslösung verwendet).
Substratlösung, enthaltend der folgenden Substrate als Reagans, das zum Nachweis und zur Bestimmung der Enzymaktivität der Peroxidase in der Lage ist:
Tyraminhydrochlorid F)
p-Cresol(F)
4-Hydroxyphenylessigsäure(F)
3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure(F)
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)
3,3',5,5'-Etramethylbenzidin
5-Aminsalicylsäure
(F: Fluoreszenz-emittierendes Substrat)
Unter Verwendung des oben beschriebenen Kits wurde eine Bakterienspezies des Stammes Campylobacter erfolgreich identifiziert.

BEISPIEL 7

Es wurde ein Kit wie in Beispiel 5 zusammengestellt, mit Ausnahme, daß der Marker Biotin durch Labezyme-Peroxidase (POD) ersetzt wurde. Insbesondere war das Kit dasselbe, was in Beispiel 5 beschrieben ist, mit Ausnahme der Verwendung der folgenden Markierungsreagenzien und nicht-radioaktiven Marker-Nachweismittel.

MARKIERUNGSREAGENZIEN

NICHT-RADIOAKTIVE MARKER-NACHWEISMITTEL

Substratlösung 10 ml x 1
Verdünnungslösung (H&sub2;O&sub2;-haltige Pufferlösung) 100 ml x 1
(Substratlösung wurde als 10-fache Verdünnung in der Verdünnungslösung verwendet).
Substratlösung, enthaltend der folgenden Substrate als Reagans, das zum Nachweis und zur Bestimmung der Enzymaktivität der Peroxidase in der Lage ist:
Tyraminhydrochlorid (F)
p-Cresol(F)
4-Hydroxyphenylessigsäure(F)
3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure(F)
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)
3,3',5,5'-Etramethylbenzidin
5-Aminsalicylsäure
(F: Fluoreszenz-emittierendes Substrat)
Unter Verwendung des oben beschriebenen Kits wurde eine Bakterienspezies des Stammes Streptococcus erfolgreich identifiziert.

Claims

1. Verfahren zum Identifizieren einer Bakterienspezies, umfassend die Schritte:

Identifizieren einer Bakteriengruppe, zu der die zu identifizierende Bakterienspezies gehört, nach üblichen Techniken, wie ihren physiologischen Eigenschaften, biochemischen Eigenschaften, gram-Färbung oder morphologischen Eigenschaften;

Bereitstellen einer Vielzahl von Behältern, von denen ein jeder einzelsträngige chromosomale DNA, extrahiert aus einer, in einer festen Phase immobilisierten Bakterienspezies, enthält, wobei jeder Behälter einzelsträngige chromosomale DNA enthält, die aus verschiedenen Bakterienspezies, zugehörig zu der Bakteriumgruppenspezies, extrahierte wurde;

Extrahieren der chromosomalen DNA aus dem zu identifizieren Bakterium, und entweder Denaturieren der extrahierten DNA unter Bildung einzelsträngiger DNA, die anschließend mit einem nicht-radioaktiven Marker markiert wird, oder Markieren der extrahierten DNA mit einem nicht-radioaktiven Marker und anschließende Denaturierung unter Bildung einzelsträngiger DNA;

Zugabe nicht-radioaktiv markierter einzelsträngiger DNA zu der einzelstängigen DNA in den Behältern, Durchführung der Hybridisierung und Waschen der Behälter unter Entfernen des Überschusses markierter DNA; und

Testen der nicht-radioaktiven Marker unter Bestimmung des Ausmaßes der Hybridisierung und Identifikation der Bakterienspezies, welches das höchste Ausmaß an Hybridisierung zeigt;

dadurch gekennzeichnet , daß die Behälter einzelne Wells in einer Mikrotiterplatte sind, auf deren inneren Oberflächen die einzelsträngigen chromosomalen DNAs immobilisiert sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der nicht-radioaktive Marker Biotin oder ein Enzym ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die in einer festen Phase zu immobilisierende chromosomale DNA eine ist, die aus einem Bakterium extrahiert wurde, in einem Fragment oder auf eine geeignete Größe geschnitten wurde, und einzelsträngig gemacht wurde.

4. Kit zur Identifizierung einer Bakterienspezies nach Anspruch 1, welches Reagenzien zur Extraktion von DNA aus zu testenden Bakterienzellen, ein nicht-radioaktives Markierungsreagens für DNA und Behälter enthält, von denen ein jeder einzelsträngige chromosomale DNA enthält, die aus der in einer festen Phase immobilisierten Bakterienspezies extrahiert wurde, wobei jeder Behälter einzelstränginge DNA, extrahiert aus verschiedenen Bakterienspezies, zugehörig zur bakteriellen Gruppe, enthält;

dadurch gekennzeichnet, daß die Behälter einzelne Wells einer Mikrotiterplatte sind, auf deren inneren Oberflächen die einzelsträngigen chromosomalen DNAs immobilisiert sind.

5. Kit nach Anspruch 4, worin die Reagenzien zur Extraktion von DNA aus gram-negativen Bakterien dienen.

6. Kit nach Anspruch 4, worin die Reagenzien zur Extraktion von DNA aus gram-positiven Bakterien dienen.

7. Kit nach Anspruch 4, worin die Wells abnehmbar sind.

8. Kit nach Anspruch 4, worin die Reagenzien in solch kleinen Mengen verwendet werden, daß die DNA aus den Zellen extrahiert werden kann, deren Menge äquivalent zu 1,5 ml einer Zellsuspension mit einer McFarland- Turbidität von Nr. 0,5 bis 6 ist.