JPH01196300A - 染色体ｄｎａを用いた細菌の同定方法および該同定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は染色体ＤＮＡを用いた細菌の同定方法およびこ
の同定に使用するキットに関する。

（従来の技術） −ｍに、細菌の同定は、いくつかの表現性状を調べたり
、特異的な抗原を検出することによって行なわれている
。近年、細菌の同定を必要とする分野も広がり、複雑化
し、従来の方法では迅速且つ正確に同定できない場合も
多い、一方で、細菌の同定検出において、特異プローブ
を用いてハイブリダイゼーションする方法が知られてい
る。近年組換えＤＮＡ技術を駆使しである特定の菌に対
して特異性を有するＤＮＡプローブの生産が可能になっ
た（特開昭６１−４４０００号公報および特開昭６０−
１１０２９９号公報）、これらのプローブは、検体から
直接特定菌を検出するには有用だが未知菌株を同定する
場合数多くの特異プローブを準備しまたそれぞれとハイ
ブリダイゼーションする必要があり、膨大な時間と費用
がかかるため、日常の同定検査に適用することは難しい
、一方、特異プローブではなく、染色体ＤＮＡをプロー
ブに用いて同定、検出を行う方法（Ｊ　、ＣＩｉｎ、Ｍ
　１ｃｒｏ、Ｊ　ｕｌｙ　１９８７゜ｐ１２３９−１２
４３）が報告されている。しかしこの方法では相同性の
高い菌種の鑑別が困難であるため、同属内の種別の鑑別
を要求される医療分野などでの検定には限界がある。

次に、検体ＤＮＡの標識については、検体自体を標識す
る欠点として、核酸サンプルにその場で標識するには臨
床技術者に普通とは認められない高度の技術的熟練を必
要とし、標識の歩留りをモニターする簡便な信頼性ある
方法がないことなどが挙げられ問題が多かった。く特開
昭６０−２０１２５６上述の如き従来方法の欠点を克服
すべく、本発明においては、時間がかからず低コストで
、相同性の高い菌種間の鑑別も可能な細菌同定方法を提
供することを目的とする。

さらに、本発明においては、該同定方法に使用するキッ
トも提供して、より一層検定を簡便にす本発明において
は、被検菌自体の染色体ＤＮＡをプローブとして、可能
性のある全菌種の染色体ＤＮＡとハイブリダイゼーショ
ンを行い、相同性（クロスハイブリダイゼーションの度
合）を比較して同定する。より詳しくは、本発明の方法
は、臨床上あるいは産業上有用であるｍ菌をグループ分
けし、１つのグループに含まれる全菌種から抽出し一本
鎖とした染色体ＤＮＡを各々固相化した容器を準備して
おき； 該グループに属するが菌種がいまだわからない被検菌株
から染色体ＤＮＡを抽出し変性させ、−重鎖ＤＮＡとし
てから非放射性標識しあるいは非放射性標識してから一
本鎖ＤＮＡとじ：この非放射性標識された一本鎖ＤＮＡ
を上記容器中の一本鎖としたＤＮＡに加え、ハイブリダ
イゼーションを行い、洗浄を行い；そして該標識体を測
定することによりハイブリッド、形成の度合を定量し、
被検菌ともっとも相同性の高い菌種を被検菌種と同定す
ることからなる、細菌の同定方法である。

本発明の同定方法をたとえば臨床分野で実施するために
は、まず検体を患者などから採取しなければならない、
以下、実際の検査の流れを尿採取を例にとって述べる。

採取した尿を血液寒天、ＢＴＢ培地、血液添加フェニル
エチルアルコール培地などに塗抹し分離培養する。分離
された集落を観察し、起因面と疑われた集落を調べ、た
とえば好気性グラム陽性球菌ならばカタラーゼテストを
実施して陽性ならばスタフィロコッカス属を中心とした
グループに、また陰性ならばストレプトコツカス属を中
心としたグループに分けることができる。このグループ
分けは第１図に概略図として示したとおりであるが、主
としてとこでも簡便に実施できる生理学的特性、生化学
的特性、グラム染色性、形態によってグループ分けされ
るが、これだけに限定されるものではない、グループ分
けされた細菌は各々適当な同定用キットを使用して検定
することができる。

すなわち、本発明はさらに、被検菌体からＤＮＡを抽出
する試薬および細菌グループ毎の一本鎖とした染色体Ｄ
ＮＡを固相化した容器を含む、細菌の同定用キットをも
提供する０本発明のキットに使用されるＤＮＡ抽出試薬
は、キットにおける量が従来の試薬の量の数百分の１の
量であるため、検定に使用する被検菌のｉ（菌数）も掻
く少量で検定可能である。従来標識用のＤＮＡを得るた
めには菌湿重量１〜２ｇ必要であったのに対して、本発
明のキットでは、菌湿重量５ｍｇ程度（たとえばマツク
ファーランドＮｏ、３の菌液１．５ｍｌ＞、あるいは菌
のグループによってはそれ以下でも充分検定できた。本
発明のキットのもう一方の構成要素である固相化する容
器は、マイクロプレートのウェルが適当である。使用者
が独自に検査してグループ以下の数種の菌に焦点をしぼ
った場合、それら数種の菌のみ組合せればよいので不要
なウェルはとりはずせるマイクロプレートが便利である
。本発明のキットはそのようなとりはずし可能なウェル
を有するマイクロプレートも包含する。キットを使用す
る場合、その使用手順は第２図に例示しであるとおりで
ある。第２図においてはグラム陰性桿菌用ＤＮＡ抽出試
薬およびグラム陽性球菌用ＤＮＡ抽出試薬で抽出したＤ
ＮＡをＰＯＤ、ビオチンなどで標識したものを検体ＤＮ
Ａとして使用する場合を示している。

各試薬、標識体の組成の詳細を含め、キットの内容につ
いては実施例４ないし７にあるとおりである。

（作　　用） 本発明の方法においては、被検菌体からの染色体ＤＮＡ
自体を標識するため、被標識体が一種類で済む。これに
より、マイクロプレートのような多孔容器を用いれば一
回の交雑操作で実施できる。

さらに、本発明の方法の同定はクロスハイブリダイゼー
ションの度合の比較にもとづいているので、固相化する
ＤＮＡは一本鎖にした染色体ＤＮＡを用いさえすればよ
く、染色体ＤＮＡの中かられざわざそれぞれの菌に特異
的なりＮＡフラグメントを開発する必要がない。その結
果、該方法は非常に効率的且つ安〈実施できる。

また、本発明の方法における被検ＤＮＡを標識するのに
用いる標識体は非放射性のものから選択されるので、高
度な技術、訓練、設備等を必要とせず、時間的にも経済
的にも負担が少ない。

上記３点の組合せにより、本発明の方法は相乗的に正確
且迅速に菌種を同定し得る安価な方法であると確信する
。

本発明のキットにおいては、従来細菌分類学で相同性測
定に用いられていたニトロセルロース・フィルターなど
の膜フィルターを使用せず、固相容器を用いることで非
アイソトープ法による相同性測定を可能にした。該固相
容器の材質はポリスチレン、ポリ塩化ビニールなど、特
に限定はないが、ニトロセルロースフィルターに見られ
るような、酵素活性測定の際のスポット中の色素の溶出
、色素のフィルターへの非特異的吸着によるパックグラ
ウトの上昇、洗浄の困難さ等を回避できるものを使用す
ることによって非アイソトープ法による相同性の測定が
達成できた。

さらに、被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬をはじめと
するキット構成成分が各々非常に少量なので、従来の数
百分の１の被検菌体量で充分検定が可能になった。

本発明のキットを本発明の同定方法に使用することによ
って、より一層簡便旦確実な検定が可能になる。

（実施例） 下記実施例は本発明の詳細な説明するためのものであっ
て、何ら限定するものではない。

夫１鮭Ｌ ■固相化容器の調製 レジオネラ属１３菌種よりマーマー（Ｍａｒｍｕｒ）法
〔生化学実験講座２．核酸の化学Ｉ１日本生化学会俵 一東京化学同人出版〕に従ってＤＮＡを抽出し、１００
℃５分間加熱後、水中で急冷することにより一本鎖ＤＮ
Ａを調製した。各−重鎖ＤＮＡを０．１Ｍ　Ｍ　ｙ　Ｃ
ｅ　２を含ｔｒＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，０）テ１ｏｕｙ
／ｚｌノ濃度に調製し、マイクロプレート（イムノプレ
ート■：ヌンク社製もしくはマイクロフローブラックプ
レート：ダイナチック社製）に１００μｌ／ウエル（ｗ
ｅ　ｌ　Ｉ　）ずつ上記１３菌種のＤＮＡ溶液を加えた
。３５℃１時間放置後上清を除き、下記プレ÷ハイブリ
ダイゼーション溶液３００Ａ１１／ウェルを加え、３５
℃１時間放置後上清を除き、乾燥下で５°Ｃに保存した
。

■検体からの非放射性標識−重鎖ＤＮＡ調製く方法１〉 ヒトの胸水から分離されたレジオネラ菌よりマーマー法
に従ってＤＮＡを抽出し、１００℃５分間加熱後、水中
で急冷することにより一本鎖ＤＮＡを調製した。０．ｌ
Ｘ５ＳＣ１すなわち、０．１５ＭＮａＣ１−０，０１５
Ｍクエン酸三ナトリウム溶液の１０倍希釈液で５００μ
ｇ／ｚｌの一本鎖ＤＮＡ濃度を有する溶液をつくり、そ
のちの２０μｌとラベザイムＰＯＤヒドロμｌを加え混
合し、３７℃で１０分インキユベートシてＰＯＤ標識Ｄ
ＮＡを得た。これにプレーハイブリダイゼーション溶液
〔０〜５０％ホルムアミド、１×デンハート？８液（０
，０２％ウシ血清アイレブミン、０．０２％ポリビニル
ピロリドン（分子量３．６×１０３〜４Ｘ１０’）およ
び０．０２％フィコール（分子量４ｘｌＯ’）、２ＸＳ
ＳＣ（上記ＳＳＣの１７２濃縮液）もしくは０．１５Ｍ
ＮａＣ＆−０，０３Ｍ　トリス−塩酸緩衝液、０〜６％
ポリエチレングリコール６０００および５０〜２００μ
ｇ／ｘｉ変性サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　）１０ｙｌを加え、
ハイブリダイゼーション溶液として使用した。

く方法２〉 方法１と同様にして調製した一本箱ＤＮＡ液１０μｌに
フォトプローブビオチン（ベクター社製）５μｒを加え
て混合し、水中で太陽灯下１ｏｃＩＩ＋の位置で１５分
照射した。照射後０．１Ｍ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ９，
０）［ｆｆｆ液で１００μ！にし、それに２−ブタノー
ル１００Ａｔ１加えて抽出した。上清の２−ブタノール
層を除き、再び２−ブタノール１００ＪｉＺ加え、抽出
して上清を除き、水層とプレハイブリダイゼーション溶
液１０Ｒ１と混合して、ハイブリダイゼーション溶液と
した。

■ハイブリダイゼーション及びハイブリッド形成の度合
の定量 く方法１の場合〉 ■であらかじめ調製したマイクロプレート（イムノプレ
ート■）に■のハイブリダイゼーション溶液を１００μ
ｌ／ウエルずっ加え、３５℃で２時間反応させた。上清
を除去し、２　Ｘ　Ｓ、Ｓ　Ｃ溶液で３回ウェルを洗浄
し、３．３′、５．５′−テトラメチルベンチジン−Ｈ
２０２溶液１００μ！加え、５分間インキュベ−ション
して発色させた後、２ＮＨＣ１１００μ！加えて反応停
止後マイクロリーダーを用いてλ＝４５０　ｎ　ｍで吸
光度と測定した く方法２の場合〉 ■であらかじめ調製したマイクロプレート（マイクロフ
ローブラックプレート）に■のハイブリダイゼーション
溶液１００μｌ／ウエルを加え、４２℃で１２時間反応
させた。上清を除去し、２ＸＳＳＣで３回洗浄後、２％
牛血清アルブミンと０，１％トライトンＸ　−１００と
を含むＰ　Ｂ　Ｓ　３００μ！を加えて３５℃で１０分
放置後、上清を除き、上記ＰＢＳで１　：１０００に希
釈したβ〜ガラクトシダーゼーストレプトアビジン（ザ
イメッド（Ｚ　ｙｍｅｄ）社製）を１００μｌずつ加え
３５℃３０分反応後、０．１％トライトンＸ−１００を
含むＰＢＳで３回洗浄後、４−メチルウｎｍで蛍光強度
を測定した。

及ｌ直ｌ 上記■ないし■の手順を経て得られた結果を表２に示す
。

表−ｍ−λ 表中の蛍光強度はその最大値を１００とし、他はそれに
対する相対値とした。

上記の結果よりヒトの膨水から分離されたレジオネラ菌
はレジオネラ・ニューモフィラ（し、ｐｎｅｕｍ＊ｐｈ
ｉｌａ）と同定された。

天１脛３工 ■　下痢便をスキロー（Ｓｋｉｒｒｏｗ）培地で４２℃
、４８時間微好気培養すると紅色を帯びたＳ型集落が観
察された。その集落はオキシダーゼ陽性、糖非発酵の性
状でグラム染色の結果、カンピロバクタ−属に特徴的な
らせん状に湾曲した陰性菌であった。

この集落から生理塩７８ＤＴＡ溶液でマツクファーラン
ドＮｏ、２の菌液１．５ｍｌ作製し、被験菌液とした。

この液をエッペンドルフ製サンプリングチューブに移し
１５０００回転、３回転速心し上清を除いた後、菌体を
生理塩水−ＥＤＴＡ溶液２００μｌに懸濁した。

リゾチーム粉末を溶解液でとかし５ｗｇ／ｍｌ濃度にび
な半透明の状態になった。

フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２
５：２４：１）２００μ！加え激しく振どう後、１５０
００回転５分遠心して上清を新しいサンプリングチュー
ブに移した。冷エタノール４００μ！加えよく混合し１
５０００回転３分遠心して上清をデカントした。

沈澱のＤＮＡに０．１ｘＳＳＣ２０μ！加え溶解しく原
液）１０μＮをとり０．１ｘＳＳＣを加え２００μｍに
した。

分光光度計を用いてλ＝２６０ｎｍで吸光度を測定しＤ
ＮＡ濃度を求めた。結果、原液のＤＮＡ濃度１５μ！？
／　１０μ！であった。残った原液を１００℃、５分間
加熱、水中で急冷して一本鎖ＤＮＡとした。この液ｌＯ
μ！にフォトプローブビオチン（ベクター社製）５μｌ
を加えて混合し、水中で太陽灯下１０ｃｚの位置で１５
分照射した。照射後０．１Ｍ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ９
，０）緩衝液で１００μ！にし、それに２−ブタノール
１００μ！加えて抽出した。上清の２−ブタノール層を
除き、再び２−ブタノール１００μ！加え抽出し上清を
除き、水層とプレハイブリダイゼーション溶液１０１１
１と混合してハイブリダイゼーション溶液とした。

■　実施例１と同様の方法で作製したカンピロバクタ−
用マイクロプレートに■で作製したハイブリダイゼーシ
ョン溶液１００μｌ／ウェル加え４２℃で１２時間反応
させた。上清を除去し、２ｘｓｓｃで３回洗浄後ブロッ
キング試薬３００μｌを加えて３５℃で１０分放置後上
清を除きブロッキング試薬で１：１０００に希釈したβ
−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジンを１００μｌ
ずつ加え３５℃３０分反応後リン酸緩衝液で３回洗浄し
、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド
溶液１００μｌずつ加え；雫すル ３０分後に励起波長３６０ｎ転壬洸波長４５０ｎｍで蛍
光強度を測定した。

実験結果は表３のとおりである０表中の蛍光強度はその
最高値を１００とし、他はそれに対する相対値とした。

表　　３ 上記の結果より、メ験菌株は、カンピロバクタ−・ジェ
ジュニ（Ｃ、ｊｅｊｕｎｉ）と同定された。

及１λ１ ■　ヒトの咽頭スワブより得られた検体を血液平板で好
気培養後、グラム染色、カタラーゼテストを実施した。

グラム陽性の連鎖球菌でカタラーゼ陰性であったので、
ストレプトコッカスグループに分類した。この集落から
ＥＤＴＡ溶液でマツクファーランドＮｏ、３の閉液１．
５ｘ１を調製し、被験１液とした。この液をサンプリン
グチューブに移し、１５０００回転３０秒遠心し、上清
を除いた後、菌体をＥＤＴＡ溶液２００μｌに懸濁した
。アクロモペプチダーゼ粉末を溶解液で溶かして５ｚｇ
／ｚｆの濃度にし５０μｌ加えて室温で５分放置した。

さらに、ＺＯ％ＳＤＳ＋；　　　　　　　　　　　−溶
液３０μ！加え、６０℃、５分加温すると、半透明の状
態となった。フェノール、クロロホルム・イソアミルア
ルコール２００μ！加え激しく振どうｆ＆、１５０００
回転５分遠心して上清を新しいサンプリングチューブに
移した。冷エタノール４００μｌ加えよく混合し１５０
００回転３分遠心して上清をデカントした。

沈澱のＤ　ｒ（Ａに０．ＩＸ　Ｓ　Ｓ　Ｃ２０μ！加え
溶解しく原液）ＩＯＪｕ　ｌをト１）０．ＩＸ　Ｓ　Ｓ
　Ｃを加え２００ｕｆｆｉニした。

分光光度計を用いてλ＝　２６０ｎｍで吸光度を測定し
ＤＮＡ濃度を求めた。結果、原液のＤＮＡ濃度１０μ９
／μｌであった。残った原液を１００℃、５分間加熱、
水中で急冷して一本鎖ＤＮＡとした。この液１０μｌに
フォトプローブビオチン（ベクター社製）５μｒを加え
て混合し、水中で太陽灯下１０ｃｍの位置で１５分照射
した。照射後０．１Ｍ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ９，０）
［漬液で１００μｌにし、それに２−ブタノール１００
μ！加えて抽出した。上清の２−ブタノール層を除き、
再び２−ブタノール１００μ！加え抽出し上清を除き、
水層とプレハイブリダイゼーション溶液１０ｔｌと混合
してハイブリダイゼーション溶液とした。

■　実施例１と同様の方法で作製したストレプトコッカ
ス用マイクロプレートに■で作製したハイブリダイゼー
ション溶液１００μｍ／ウェル加え４２℃で１２時間反
応させた。上清を除去し２ｘｓｓｃで３回洗浄後ブロッ
キング試薬３００μｌを加えて３５℃で１０分放置後上
清を除きブロッキング試薬で１：１０００に希釈したβ
−ガラクトシダーゼ−ストレプトアビジンを１００μ！
ずつ加え３５℃３０分反応後リン酸緩衝液で３回洗浄し
、４−メチルウンベリフェ度を測定した。

実験結果は表４のとおりである０表中蛍光強度は、その
最高値を１００とし、他はそれに対する相対値とした。

表　　　４ マイ　ロウエルに　　　し？−Ｄ　Ｎ　Ａの　　　　　
　　筺光笈叉ストレブトコ・ンカス・ミティス（Ｓ、輸
１ｔｉｓ）　　　　　　　　　＜１０ストレプトコツカ
ス・サンギウス（Ｓ　、ｓａｎｇｕｉｓ）　　　　　　
　　１４ストレプトコツカス・オラリス（Ｓ　、ｏｒａ
ｌ　ｉｓ）　　　　　　　　　＜１０肺炎球菌（Ｓ　、
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　　　　　　　　　　　　　　
　　　＜１０ストレプトコツカス・ミュータンス（Ｓ、
鰺ｕｔａｎｓ）　　　　　　　　１５ストレプトコツカ
ス・アンギノーサス（Ｓ　、ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）　　
　　１００ストレアトコツカス・インターメディウス（
Ｓ　、　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）　　５５ストレプト
コツカス・コンステラータス（Ｓ　、ｃｏｎｓｅｔｅｌ
ｌａｔｕｓ）　　５２ストレプトコツカス・サリバリウ
ス（Ｓ　、５ａｌｉｖａｒｉｕｓ）　　　　　１９スト
レプトコツカス・モルビローラム（Ｓ　、ｍｏｒｂｉｌ
ｌｏｒｕｍ）　　　＜ＩＱストレプトコッカス・ボビス
（Ｓ　、ｂｏｖｉｓ）　　　　　　　　　　　　１７ス
トレブトコツカス・アシドミニ−マス（Ｓ　、ａｃｉｄ
ｏｍｉｎｉｍｕｓ）　＜１０ストレプトコツカス・ウベ
リス（Ｓ　、ｕｂｅｒｉｓ）　　　　　　　　　＜１０
ストレプトコツカス・バラブルス（Ｓ　、ｐａｒｖｕｌ
ｕｓ）　　　　　　　＜１０ストレプトコ・ンカス・プ
レオモーフス（Ｓ　、ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｕｓ）　　　
（１０ストレプトコツカス・ハンセニー（Ｓ　、ｈａｎ
ｓｅｎｉｉ）　　　　　　　＜１０ストレプトコツカス
・ビオジェネス（Ｓ　、ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　　　　　
　＜１０ストレプトコツカス・アガラクティエ（Ｓ　、
ａｇａｌａｃｔｉａｅ）　　　　＜１０ストレプトコツ
カス・イクイシミリス（Ｓ、ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ＞
　　　＜１０ストレプトコツカス・カニス（Ｓ　、ｃａ
ｎｉｓ）　　　　　　　　　　＜１０ストレプトコツカ
ス・イクイ（Ｓ　、ｅｑｕｉ）　　　　　　　　　　＜
１０ストレプトコツカス・ボーシナス（Ｓ　、ｐｏｒｃ
ｉｎｕｓ）　　　　　　＜１０ストレプトコツカス・イ
ニエ（Ｓ　、１ｎｉａｅ）　　　　　　　　　　＜１０
ストレプトコツカス・スイス（Ｓ　、５ｕｉｓ）　　　
　　　　　　　＜１０夾１ｊＬ（ グラム陽性桿菌同定用キットは下記■ないし■の成分（
１０検体分）より構成された。（以下の実施例において
も、各試薬、溶液などはすべて１０検体用の量で記載し
た。） ■　　　からＤＮＡを　′　る−薬 くグラム陰性桿菌用）　　　　　　　　数量生理塩采乍
ＤＴＡ溶液　　　　２０ｉ＋ＩＸ　１本２０％ＳＤＳ溶
液　　　　　　　０．３ｚｆＸ　１本リゾチーム粉末及
び溶解液　　２．５ｘｙＸ　１本＋０．５ｘｆＸ　１本 フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２訳ＺＸ１本エタ
ノール　　　　　　　　　　４ｚｆＸ１本０．１ｘＳＳ
Ｃ５ｚｌＸ１本 ■　非放射性標識体 （ビオチン標識体） バイオテクノロジー・リサーチ・エンタープライシス社
（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　Ｅ
ｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓＳ　、Ａ　、Ｐ　−ｆ−ｙ、Ｌ　
＋ｄ、）とベクター・ラボラトリ−各々フォト・ビオチ
ン（Ｐ　ｈｏｔｏ　Ｂ　１ｏｔｉｎ　”）およびフォト
プローブ・ビオチン（ＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥ”　Ｂｉｏ
ｔｉｎ）として販売。

（ビオチン標識試薬） フォト・ビオチンもしくはフォトプローブ・ビオチン　
　　　　　　　　　　０．０５ｄ’Ｘ　１本０．１Ｍ　
）リス−塩酸ｐＨ９，０１ｍｌ×１本２−ブタノール　
　　　　　　　　２ｊＩＸ１本プレハイブリダイゼーシ
ョン溶液　１ｏｏ４　Ｎ×１本■　ＤＮＡを固相化した
マイクロプレートマイクロプレートの材質としてポリス
チレンのようなプラスチック基材 ■　洗浄液 ２０ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１５０ｄＸ　１本 使用時　蒸留水で１０倍希釈 ■　非放射性標識体を検出する試薬 ブロッキング試薬：２％ウシ血清アルブミンを含むリン
酸榎漬液　　　　　　　４００ｍｆＸ　１本β−ガラク
トシダーセトトレブトアビジン０．１ｄＸ　１本 使用時蒸留水で１０倍希釈 基質液＝４−メチルウムベリフェリルーβ−Ｄ−ガラク
トシド　　　　　　　　　１０ｉｊ！Ｘ　１本希釈液：
１１１ＭＭｇＣ１２を含む緩衝液　１００ｚＩＸ　１本
使用時　基質液を希釈液で１０倍希釈 上記キットを実施例２において使用して、検体中のカン
ピロバクタ−属菌種を効率よく同定できた。

なお、上記β−ガラクトシダーーンクトレブトアビジン
の外に、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファター
ゼでＢＷａしたストレプトアビジン、あるいはこれらの
酵素のいずれかで標識したアビジンも使用できる。

尺１１Σ グラム陽性球菌同定用キットは下記成分■ないし■より
構成された。

■　菌体からＤＮＡを抽出する試薬 （グラム陽性球菌用） ＥＤＴＡ溶液　　　　　　　　　２０ｚＩＸ　１本２０
％ＳＤＳ溶液　　　　　　　　０．３ｉ＋ｆＸ　１本ア
クロモペプチダーゼ　粉末及び溶解液２．５ｚｙＸ　１
本＋０．５ｚｌＸ　１本フェノール・クロロホルム・イ
ソアミルアルコール　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２ｘｆＸ１本エタノール　　　　　　　　　
　　　４ｚｌＸ１本０．１ｘＳＳＣ５ｚｆｆｉＸ１本 ＊アクロモペプチダーゼ：　Ａ　ｅｈｒｏｍｏｐｅｐｔ
ｉｄａｓｅ＜アクロモバクタ−・リチクス（Ａｃｈｒｏ
ｓ＋ｏｂｕｃｔｅｒＩｙｔｉｃｕｓ）から得られる：和
光純薬工業（株ン製造・販売） ■　非放射性標識体 （ビオチン標識体） バイオテクノロジー・リサーチ・エンタープライシス社
（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｅ
ｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ各々フォト・ビオチン（Ｐ　ｈｏ
ｔｏ　Ｂ　ｉｏｔｉｎＴＭ）およびフォトプローブ・ビ
オチン（ＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥ”　Ｂｉｏｔｉｎ）とし
て販売。

（ビオチン標識試薬） フォト・ビオチンもしくはフォトプローブ・ビオチン　
　　　　　　　　　　０．０５ｚｆＸ　１本０．１Ｍ　
）　！Ｊ　ス−塩１１ＱｐＨ９，ｏ　　　　　１　ｚｌ
×１　本２−ブタノール　　　　　　　　　２Ｒ１×１
本ハイブリダイゼーション溶液　　１００ｚｔ’Ｘ　１
本■　ＤＮＡを固相化したマイクロプレートマイクロプ
レートの材質としてポリスチレンのようなプラスチック
基材 ■　洗浄液 ｚｏｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１５０ｉ＋ｌＸ　ｌ　本使用時　蒸
留水で１０倍希釈 ■　非放射性標識体を検出する試薬 ブロッキング試薬＝２％ウシ血清アルブミンを含むリン
酸榎街液　　　　　　　４００ｘｌＸ　１本β−ガラク
トシダー−ｔ＝’Ｙ５　トレプトアビジン０、ｂ＋ｌＸ
　１本 洗浄液ニリン酸緩衝液　　　　　　１５０ｘｆＸ　１本
使用時蒸留水で１０倍希釈 基質液：４−メチルウムベリフェリルーβ−Ｄ〜ガラク
トシド　　　　　　　　　１０置ＮＸ１本希釈液：１箇
Ｍ　ＨｇＣ１ｔを含むＩｌ！衝液漬液００ｚｌＸ　１本
使用時　基質液を希釈液で１０倍希釈 上記キットを実施例３において使用して、検体中のスト
レプトコツカス属菌種を効率よく同定できた。

このキ・・トにおいて、β−ガラクトシダーｉ−トレブ
トアビジンの外にペルオキシダーゼまたはアルカリホス
ファターゼで標識したストレプトアきる。

に、ラベザイムーペルオキシダーゼ（Ｌａｂｅｚｙｍｅ
　−ＰＯＤ＞を使用したキットをつくった。

下記標識試薬及び非放射性標識を検出する試薬を使用し
た以外は実施例４のキットと同じ内容である。

導１１ｖ劃 ラベザイムーＰＯＤ試薬＊ ラベザイム−Ｐ　ＯＤ　　　　　　　２００μＩＸ１本
２５％グルタルアルデヒド溶液　　２５μ２×１本発色
試薬なども含む、（特許公開昭６０−５０１４８８の方
法により製造） 一ト　　　　　　１．；　　　　を　　　１　　る含　
゛基質液　　　　　　　　　　　　　１０ｚＮＸ　１本
希釈液（Ｈ２Ｏ２を含む緩衝液）　　　１００ｘｌＸ　
１本使用時基質液を希釈液で１０倍希釈 基質液中の基質として　　（Ｆ：蛍光を発する基質）チ
ラミンハイドロクロライド（Ｆ） Ｐ−クレゾール（Ｆ） ４−ヒドロキシフェニル酢酸（Ｆ） ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（Ｆ）２
．２′−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン）−６
′−スルホン酸 ３．３′、５．５′−テトラメチルベンチジン５−アミ
ノサリチル酸 などペルオキシダーゼの酵素活性検出・定量できる試薬 このキットを使用してカンピロバクタ−属の菌種を同定
できた。

りに、ラベザイムーペルオキシダーゼ（Ｌａｂｅｚｙｍ
ｅ−ＰＯＤ）を使用したキットをつくった。

下記標識試薬及び非放射性標識を検出する試薬を使用し
た以外は実施例４のキットと同じ内容である。

ラベザイムーＰＯＤ試薬＊ ラベザイムーＰ　ＯＤ　　　　　　　２００μｆｆ１Ｘ
１本２５％グルタルアルデヒド溶液　　２５μ！×１本
発色試薬なども含む、（特許公開昭６０−５０１４８８
の方法により製造） 、・　身性；イを　　る　薬 基質液　　　　　　　　　　　　　１０ｚｉ’Ｘ　１本
希釈液（Ｈ２Ｏ２を含む緩衝液）　　　１００ｚｌＸ　
ｌ　本使用時基質液を希釈液で１０倍希釈 基質液中の基質として　　（Ｆ：蛍光を発する基質）チ
ラミンハイドロクロライド（Ｆ） Ｐ−クレゾール（Ｆ） ４−ヒドロキシフェニル酢酸（Ｆ） ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（Ｆ）２
．２′−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリン）−６
′−スルホン酸 ３．３′、５．５′−テトラメチルベンチジン５−アミ
ンサリチル酸 などペルオキシダーゼの酵素活性検出・定量できる試薬 このキットを使用してストレプトコツカス属の菌種を同
定できた。

【図面の簡単な説明】

第１図は被検菌をグループ分けする過程及びグループ分
けされた菌グループの同定に使用するキットを表示する
フローシートであり； 第２図は、本発明のキットを使用して検体中のグラム陰
性桿菌あるいはグラム陽性球菌を同定する場合のキット
内容構成成分の使用手順を示すフローシートである。 特許出願人　　　小林製薬株式会社 （外４名） 手続補正書 平成耐相元年２月１３ａ ２、発明の名称 染色体ＤＮＡ’に用いた細菌の同定方法および該同定用
キット ６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名称　　小林製薬株式会社 ４、代理人 ５、補正の対象 明細書の〔特許請求の範囲〕と〔発明の詳細な説明〕の
欄 ６、補正の内容　　　　　　　　　　　　　＼゛　、・
ｔ・　・ 別紙の通り　　　　　　　　　　　　　　　＼。 ／、１〜 （１）特許請求の範囲を次のように訂正する。 「１．臨床上あるいは産業上有用である細菌をグループ
分けし、１つのグループに含まれる菌種から抽出し一本
鎖とした染色体ＤＮＡ’Ｙ各々固相化した容器を準備し
ておき； 該グループに属するが菌種がいまだわからない被検菌株
から染色体ＤＮＡを抽出し変性させ、−重鎖ＤＮＡとし
てから非放射性標識しあるいは非放射性標識してから一
本鎖ＤＮＡとし；この非放射性標識された一本箱ＤＮＡ
’Ｙ上記容器中の一本鎖としたＤＮＡｖｃ加え、ハイブ
リダイセーフ３フフ行い、洗浄を行い；そして該標識体
を測定することによりハイブリッド形成の度合を定量し
、被検菌ともつとも相同性の高い菌種を被検菌種と同定
することからなる、細菌の同定方法。 ２、グループ分けが細菌の生理学的生化学的特性および
形態学的特徴を組合せることによって行なわれる特許請
求の範囲第１項の方法。 ３、固相化する容器がマイクロプレートのウェルである
特許請求の範囲第１項の方法。 ４、非放射性標識体がビチオンあるいは酵素である特許
請求の範囲第１項の方法。 ５、固相化する染色体ＤＮＡとして、細菌から抽出され
適切なサイズに断片化し一本鎖とした染色体ＤＮＡ’に
用いる特許請求の範囲第１項の方法。 ６、被検菌体からＤＮＡ’に抽出する試薬および細菌グ
ループ毎の一本鎖とした染色体ＤＮＡ’に面相化した容
器を含む、細菌の同定用キット。 ７、容器がマイクロプレートのウェルである特許請求の
範囲第６項のキット。 ８、被検菌体からＤＮＡ−ｇ抽出する試薬がグラム陰性
桿菌用である特許請求の範囲第６項のキット。 ９、被検菌体からＤＮＡ−ｇ抽出する試薬がグラム陽性
球菌用である特許請求の範囲第６項のキット。 １０、　　マイクロプレートのウェルがとりはずし可能
なものである特許請求の範囲第７項のキット。 １１、　　被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬の量がマ
ツクファーランド屋０．５〜６の菌液１．５　ｍｌ相当
の菌景かもＤＮＡを抽出できる程少竜である特許請求の
範囲第６項のキット。」 （２）明細書を次のように訂正する、 頁　　行　　　　誤　　　　　　　　　　正４１０　Ｍ
ｉｃｒｏ　　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｌｏ　　　７　　　
グラウト　　　　　グラウンド１３１９　　マイクロリ
ーダー　　　マイクロプレートリーダー １８　下２　　ピロリ（Ｇ、ｐｙｌｏｒｉ）　　ピロリ
ディス（Ｃ，ｐｙｌｏｒｉｄｉｓ） １９　　６　　　　連鎖　　　　　　連鎖状の↓ ２．２′−アジノービス（３− エチルベンゾチアゾリノン−

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）臨床上あるいは産業上有用である細菌をグループ
   分けし、１つのグループに含まれる全菌種から抽出し一
   本鎖とした染色体ＤＮＡを各々固相化した容器を準備し
   ておき； 該グループに属するが菌種がいまだわからない被検菌株
   から染色体ＤＮＡを抽出し変性させ、一本鎖ＤＮＡとし
   てから非放射性標識しあるいは非放射性標識してから一
   本鎖ＤＮＡとし； この非放射性標識された一本鎖ＤＮＡを上記容器中の一
   本鎖としたＤＮＡに加え、ハイブリダイゼーションを行
   い、洗浄を行い；そして該標識体を測定することにより
   ハイブリッド形成の度合を定量し、被検菌ともっとも相
   同性の高い菌種を被検菌種と同定することからなる、細
   菌の同定方法。
2. （２）グループ分けが細菌の生理学的生化学的特性およ
   び形態学的特徴を組合せることによつて行なわれる特許
   請求の範囲第１項の方法。
3. （３）固相化する容器がマイクロプレートのウェルであ
   る特許請求の範囲第１項の方法。
4. （４）非放射性標識体がビオチンあるいは酵素である特
   許請求の範囲第１項の方法。
5. （５）固相化する染色体ＤＮＡとして、細菌から抽出さ
   れ適切なサイズに断片化し一本鎖とした染色体ＤＮＡを
   用いる特許請求の範囲第１項の方法。
6. （６）被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬および細菌グ
   ループ毎の一本鎖とした染色体ＤＮＡを固相化した容器
   を含む、細菌の同定用キット。
7. （７）容器がマイクロプレートのウェルである特許請求
   の範囲第６項のキット。
8. （８）被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬がグラム陰性
   桿菌用である特許請求の範囲第６項のキット。
9. （９）被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬がグラム陽性
   球菌用である特許請求の範囲第６項のキット。
10. （１０）マイクロプレートのウェルがとりはずし可能な
    ものである特許請求の範囲第７項のキット。
11. （１１）被検菌体からＤＮＡを抽出する試薬の量がマッ
    クファーランドＮｏ．０．５〜６の菌液１．５ｍｌ相当
    の菌量からＤＮＡを抽出できる程少量である特許請求の
    範囲第６項のキット。