JP2002502614A - ミスマッチ検出技術 - Google Patents

ミスマッチ検出技術

Info

Publication number
JP2002502614A
JP2002502614A JP2000530632A JP2000530632A JP2002502614A JP 2002502614 A JP2002502614 A JP 2002502614A JP 2000530632 A JP2000530632 A JP 2000530632A JP 2000530632 A JP2000530632 A JP 2000530632A JP 2002502614 A JP2002502614 A JP 2002502614A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
double
stranded nucleic
mismatch
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000530632A
Other languages
English (en)
Inventor
ボーリーズ ケンパー
カリン バーケンカンプ−デントロダー
ステファン ゴルツ
Original Assignee
バリアジェニックス インク．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バリアジェニックス インク． filed Critical バリアジェニックス インク．
Publication of JP2002502614A publication Critical patent/JP2002502614A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)
  • Air Bags (AREA)
  • Geophysics And Detection Of Objects (AREA)

Abstract

(57)【要約】 以下の段階を含む二本鎖核酸におけるミスマッチを検出する方法を本明細書において開示する；a) 物質が二本鎖核酸におけるミスマッチに結合するがこれを切断しないような条件下で、二本鎖核酸を反応性物質と接触させる段階；b) 二本鎖核酸におけるミスマッチの存在の指標として、物質と二本鎖核酸との結合を検出する段階；c) 物質が二本鎖核酸におけるミスマッチを切断するような条件下で、二本鎖核酸を反応性物質と接触させる段階；およびd) 二本鎖核酸におけるミスマッチの存在の指標として、切断産物を検出する段階。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 全般的に、本発明はミスマッチ検出技術に関する。
【０００２】 コードおよび非コードDNAと共にRNAにおけるミスマッチを検出することができ
ることは、多くの診断的状況のみならず、治療的状況において重要である。その
ようなミスマッチは、単一のヌクレオチドにまたは多数のヌクレオチドにわたっ
て起こることがあり、コードされた蛋白質をそれぞれが独立して不活性にしうる
、遺伝子のフレームシフト、停止コドン、または置換が原因で起こる可能性があ
る。または、ミスマッチは無害な遺伝子変異体を示すことがあり、この場合、検
出可能な機能変化を示さない蛋白質産物が得られる（例えば、無害な遺伝子多型
）。８個の単塩基ミスマッチが起こる可能性があり、これらにはG：A、C：T、C ：C、G：G、A：A、T：T、C：A、およびG：Tが含まれ、核酸鎖がRNAの場合にはT の代わりにUが用いられる。ミスマッチ含有配列またはヘテロ二本鎖の少なくと も１つの鎖が、DNAもしくはRNAの欠失、置換、挿入、転位、または逆位を含む場
合には、核酸ループを形成しうる。
【０００３】 一つの特定の応用において、ミスマッチ検出技術は核酸配列における変異を同
定または評価するために用いてもよい。変異は、遺伝性の疾患または癌のような
致命的な欠損を引き起こしうる、生物の遺伝子材料の配列における遺伝性の変化
である（モドリッチ（Modrich）の最近の総説、Science 266；1959〜1960（1994
）を参照のこと）。その結果として、変異検出法は特に医学的診断においてます
ます重要となっている。変異はDNAシークエンシングによって非常に正確に場所 を特定することができるが（サンガー（Sanger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 74：5463〜5467（1977））、この方法は比較的時間がかかり、しかも費用が 高く、毒性化学物質を必要とする。または野生型と変異配列とをインビトロでア
ニーリングした後に得られるヘテロ二本鎖DNAにおける誤った対形成によって変 異を測定する方法も開発されている（コットン（Cotton）、Mutations Research
285：125〜144（1993）に論評されている）。
【０００４】 物理化学法のほかに、DNA修復に関係する蛋白質を用いた酵素アッセイ系も確 立されている。これらの酵素の一つは、バクテリオファージT4のエンドヌクレア
ーゼVII（T4 Endo VII）である（ゴルツ（Golz）ら、DNA Res.2：277〜284（199
5）；ケンパー（Kemper）ら、Eur. J. Biochem. 115：123〜131（1981））。T4
Endo VIIアッセイは、C/Cミスマッチ、ヘテロ二本鎖ループ、単ヌクレオチドバ ルジ、一本鎖オーバーハング、分岐DNA、かさの高い付加物、ソラレンクロスリ ンク、アプリン酸部位を含む、起こりうる全てのミスマッチを検出する（ケンパ
ー（Kemper）、ニコロフ＆ホークストラ（Nickoloff, J. A. and Hoekstra, M. ）編、「DNA損傷と修復、生化学、遺伝子学と細胞生物学（DNA Damage and Repa
ir, Biochemistry, Genetics and Cell Biology）」、ヒューマナプレス、トト ワ、第１巻（1997））。広い基質特異性によってこの酵素はミスマッチ検出にと
って極めて用途の広いツールとなる（コットン（Cotton）、「変異の検出（Muta
tion detection）」、オックスフォード大学出版、オクスフォード（1997））。
T4 Endo VIIの核酸分解活性を用いて、ヘテロ二本鎖DNAにおける変異は切断アッ
セイによって首尾よく検出されている（ヨウイル（Youil）ら、Genomics 32：43
1〜435（1996））。
【０００５】 T4 Endo VIIは、リゾルベースと呼ばれる酵素のクラスに属し、これは分岐DNA
中間体（例えば、十字型DNA）の分解を触媒する能力を特徴とし、その構造は数 百ヌクレオチドを含みうる。T4 Endo VIIのほかに、リゾルベースには、バクテ リオファージT7エンドヌクレアーゼ（ウェスト（West）、Ann. Rev. Biochem. 6
1、603（1992））および真核生物、特に、十字型DNAを認識して切断することが 示されている酵母のサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）
からのリゾルベース（ウェスト（West）、上記；イェンシュ（Jensch）ら、EMBO
J. 8、4325（1989））が含まれるが、これらに限定されない。
【０００６】 発明の概要 一般に、本発明は、以下の段階を含む二本鎖核酸におけるミスマッチを検出す
る方法を特徴とする：a) 二本鎖核酸を、二本鎖核酸におけるミスマッチを切断 することができるリゾルベースと、リゾルベースが二本鎖核酸におけるミスマッ
チに結合するがこれを切断しないような条件下で接触させる段階；b) 二本鎖核 酸におけるミスマッチの存在の指標として、リゾルベースの二本鎖核酸への結合
を検出する段階。
【０００７】 好ましい態様において、リゾルベースはバクテリオファージまたは真核生物リ
ゾルベース（例えば、T4エンドヌクレアーゼVII）である；接触条件はマグネシ ウムを含まないことを含む；二本鎖核酸は、リゾルベースと接触させる前に、ま
たはリゾルベースと接触させる段階と検出段階との間、のいずれかに少なくとも
１つの検出部分で標識する；検出部分はいかなる放射性標識、蛍光標識、ビオチ
ン、ジゴキシゲニン、発光物質、色素、または酵素でもよい；二本鎖の少なくと
も１本はビオチンで標識し、検出段階は二本鎖とストレプトアビジン結合検出部
分との反応を含む（例えば、発色色素との反応により検出可能な色を生じる酵素
）；二本鎖核酸の少なくとも１の鎖は増幅によって得られる；リゾルベースまた
は二本鎖核酸は固相支持体に結合する；リゾルベースは固相支持体に結合する；
固相支持体はマイクロタイタープレートまたは磁気ビーズである；接触段階は溶
液中で実施する；リゾルベース結合部位を決定する；本方法はさらに以下の段階
を含む：c) リゾルベースが二本鎖核酸におけるミスマッチを切断するような条 件下で、二本鎖核酸をリゾルベースと接触させる段階；およびd) 二本鎖核酸に おけるミスマッチの存在の指標として、切断産物を検出する段階；リゾルベース
はミスマッチの10ヌクレオチドまたはそれ以内（および、好ましくは６ヌクレオ
チド以内）で切断する；リゾルベース切断反応の部位を決定する；二本鎖核酸を
ヘテロ接合体から得る；二本鎖核酸の少なくとも１つの鎖は真核細胞、真性細菌
細胞、細菌細胞、マイコバクテリア細胞、バクテリオファージ、DNAウイルス、 またはRNAウイルスに由来する；二本鎖核酸の少なくとも１本はヒト細胞に由来 する；ミスマッチにより変異の存在が示される；変異により疾患または病態が診
断される；ミスマッチにより多型の存在が示される；およびミスマッチは必須遺
伝子に起こる。
【０００８】 関連する局面において、本発明は以下の段階を含む、二本鎖核酸におけるミス
マッチの検出法を特徴とする：a) 物質が二本鎖核酸におけるミスマッチに結合 するがこれを切断しないような条件下で、二本鎖核酸を反応性物質と接触させる
段階；b) 二本鎖核酸におけるミスマッチの存在の指標として、物質と二本鎖核 酸との結合を検出する段階；c) 物質が二本鎖核酸におけるミスマッチを切断す るような条件下で、二本鎖核酸を反応性物質と接触させる段階；およびd) 二本 鎖核酸におけるミスマッチの存在の指標として、切断産物を検出する段階。
【０００９】 好ましい態様において、同じ試料について結合反応と切断反応とを実施する；
同じ二本鎖核酸の異なる試料について、結合反応と切断反応とを実施する（如何
なる順序でも、または同時に）；反応性物質はT4エンドヌクレアーゼVIIである ；結合反応条件にはマグネシウムが存在しないことを含み、切断反応条件にはマ
グネシウムの存在を含む；二本鎖核酸は、反応性物質と接触させる前または反応
性物質と接触させる段階と検出段階（b）もしくは（d）との間のいずれかに、少
なくとも１つの検出部分によって標識する；検出部分は、放射性標識、蛍光標識
、ビオチン、ジゴキシゲニン、発光物質、色素、または酵素のいずれかである；
二本鎖の少なくとも１つの鎖はビオチンで標識し、検出段階は二本鎖とストレプ
トアビジン結合検出部分（例えば、発色色素との反応により検出可能な色を生じ
る酵素）との反応を含む；二本鎖核酸の少なくとも１つの鎖は増幅によって得ら
れる；反応性物質は検出段階（b）の間、固相支持体に結合する；固相支持体は マイクロタイタープレートまたは磁気ビーズである；結合反応、接触反応、また
はその双方は溶液中で実施する；ミスマッチ部位は段階（b）、段階（d）、また
はその双方において決定する；反応性物質はミスマッチの10ヌクレオチドで、ま
たは10ヌクレオチド以内で切断する（および、好ましくは６ヌクレオチド以内）
；リゾルベース結合部位を決定する；本方法はさらに以下の段階を含む：c) 物 質が二本鎖核酸におけるミスマッチを切断するような条件下で、二本鎖核酸を反
応性物質と接触させる段階；およびd) 二本鎖各酸におけるミスマッチの存在の 指標として、切断産物を検出する段階；リゾルベースはミスマッチの10ヌクレオ
チドまたはそれ以内（および、好ましくは６ヌクレオチド以内）で切断する；二
本鎖核酸はヘテロ接合体から得られる；二本鎖核酸の少なくとも１つの鎖は、真
核細胞、真性細菌細胞、細菌細胞、ミコバクテリア細胞、バクテリオファージ、
DNAウイルス、またはRNAウイルスに由来する；二本鎖核酸の少なくとも１つの鎖
はヒト細胞に由来する；二本鎖核酸は野生型配列を有する鎖を少なくとも１つ含
む；ミスマッチにより変異の存在が示される；変異により疾患または病態が診断
される；ミスマッチにより多型の存在が示される；およびミスマッチは必須遺伝
子に起こる。
【００１０】 本明細書において用いるように、「ミスマッチ」という用語は、DNAまたはRNA
の一方の鎖におけるヌクレオチドが、ワトソン・クリックの塩基対形成および相
対するDNAまたはRNA鎖におけるヌクレオチドとのπスタッキング相互作用によっ
て対を形成しない、または形成できないことを意味する。このように、DNAまた はRNAの一方の鎖にアデニンがあれば、相対するDNAまたはRNA鎖におけるアデニ ンとミスマッチを形成するであろう。ミスマッチはまた、第二のヌクレオチドが
存在しない（すなわち１つまたはそれ以上のヌクレオチドが挿入または欠失して
いる）ために、第一のヌクレオチドが相対するDNAまたはRNA鎖における第二のヌ
クレオチドと対を形成することができない場合にも起こる。本発明の方法は、１
〜50ヌクレオチド（好ましくは、１〜10、およびより好ましくは１〜７）の配列
変化（これを含めて）を含む試験核酸におけるミスマッチを検出するために特に
有用である。
【００１１】 本明細書で用いるように、「リゾルベース」という用語は、ヘテロ二本鎖鋳型
における何らかのミスマッチ（例えば、ミスマッチループ）と共に十字型DNAを 認識して切断することができる蛋白質である。リゾルベースの例にはT4エンドヌ
クレアーゼVII、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）End
o XI、Endo X2、Endo X3、およびCCE1（イェンシュ（Jensch）ら、EMBO. J. 8：
4325、1989；クッファー＆ケンパー（Kupfer and Kemper）、Eur. J. Biochem.
238：77、1995）、T7エンドヌクレアーゼI、大腸菌MutY（ウ（Wu）ら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 89：8779〜8783、1992）、哺乳類チミングリコシラーゼ（ ワイバウアー（Wiebauer）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5842〜5845、1
990）、ヒト胸腺のトポイソメラーゼI（イェ（Yeh）ら、J. Biol. Chem. 266：6
480〜6484、1991；イェ（Yeh）ら、J. Biol. Chem. 269：15498〜15504、1994）
およびデオキシイノシン3'エンドヌクレアーゼ（ヤオ＆コウ（Yao and Kow）、J
. Biol. Chem. 269：31390〜31396、1994）が含まれるが、これらに限定されな い。所定のミスマッチ検出アッセイにおいて、１つまたは幾つかのリゾルベース
を利用してもよい。
【００１２】 本明細書において用いられる「変異」とは、表現型結果を生じる核酸配列にお
けるヌクレオチド配列変化（すなわち単一または複数のヌクレオチド置換、欠失
、または挿入）を指す。検出可能な表現型結果を生じないヌクレオチド配列の変
化は本明細書において「多型」と呼ぶ。
【００１３】 「必須遺伝子」とは、その産物が細胞の生存にとって必要である遺伝子を意味
する。
【００１４】 「反応性物質」とは、結合および切断反応の双方を、異なる反応条件で行う如
何なる分子（蛋白質、ペプチド、または他の有機分子）も意味する。
【００１５】 「ヘテロ二本鎖」とは、１つまたはそれ以上のミスマッチのために、第一の鎖
における１つまたはそれ以上のヌクレオチドが、第二の相対する相補鎖における
ヌクレオチドと適当な塩基対を形成することができない、アニーリングした２つ
の相補的核酸鎖の間に形成された構造を意味する。異なるタイプのヘテロ二本鎖
の例には、そのそれぞれがバッタカリヤ＆リレイ（Bhattacharyya and Lilley）
、Nucl. Acids. Res. 17：6821（1989）に開示されている、１つまたは幾つかの
ヌクレオチドの交換、および挿入または欠失変異を示す二本鎖が含まれる。本明
細書において用いられる「相補的」という用語は２つの核酸、例えばDNAまたはR
NAが、マッチしたワトソン・クリックの塩基対を形成して二本鎖領域を形成する
ことができる一連の連続したヌクレオチドを含むことを意味する。このように、
DNAまたはRNAの一つの鎖におけるアデニンは、相対する相補的DNA鎖のチミン、 または相対する相補的RNA鎖のウラシルと対を形成する。対形成領域を「二本鎖 」と呼ぶ。二本鎖は、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖のいずれであってもよい。
【００１６】 本明細書において用いられるように、「選択的にハイブリダイズ」という句は
、通常のハイブリダイゼーション条件下で第二の相補的核酸鎖とアニーリングし
て、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖のいずれかである安定な二本鎖を形成し、同
じ通常のハイブリダイゼーション条件下で無関係な核酸分子とは安定な二本鎖を
形成しない核酸鎖を指す。二本鎖の形成は、ハイブリダイゼーション反応におい
て２つの相補的核酸鎖をアニーリングすることによって得られる。ハイブリダイ
ゼーション反応は、２つの核酸鎖が、実質的または完全に相補的である特異的配
列において特定数のヌクレオチドを含まなければ、２つの核酸鎖の間のハイブリ
ダイゼーションが安定な二本鎖、例えば通常のストリンジェンシー条件で二本鎖
の領域を保持する二本鎖、を形成しないように、その下でハイブリダイゼーショ
ン反応が起こるハイブリダイゼーション条件（しばしばハイブリダイゼーション
ストリンジェンシーと呼ばれる）を調節することによって非常に特異的にするこ
とができる。「通常のハイブリダイゼーションまたは通常のストリンジェンシー
条件」は、如何なる所定のハイブリダイゼーション反応についても容易に決定さ
れる（例えば、アウスユベール（Ausubel）らの「分子生物学の現行プロトコー ル（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ウィリー＆サンズ
インク、ニューヨーク、またはサムブルック（Sambrook）らの「分子クローニン
グ、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、コールド
スプリングハーバー研究所出版を参照のこと）。
【００１７】 「特異的結合対」とは、互いに特異的な、共有結合または非共有結合親和性を
有する第一および第二のメンバーを含む分子の如何なる対も意味する。特異的結
合対の例には、抗原／抗体対、DNA結合蛋白質／DNA結合部位対、酵素／基質対、
レクチン／炭水化物対、および核酸二本鎖またはライゲーションしたDNA鎖が含 まれる。本発明の好ましい特異的結合対はアビジン（例えば、ストレプトアビジ
ン）およびビオチンである。
【００１８】 本明細書において用いられる「基準核酸」とは、長さが少なくとも20ヌクレオ
チドであって、好ましくは長さが100〜40,000ヌクレオチド、より好ましくは長 さが150〜5000ヌクレオチドであるDNAまたはRNAの配列である。しばしば基準核 酸は、対応する野生型集団から得られるDNAと識別できない配列を有する。
【００１９】 「試験核酸」は、長さが少なくとも20ヌクレオチド、好ましくは長さが100〜4
0,000ヌクレオチド、およびより好ましくは長さが150〜5000ヌクレオチドである
DNAまたはRNAの配列である。特に大きい試験核酸断片を分析する場合（すなわち
２ kbより大きい）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（＜２ kb）に適した大き
さの断片を得るために、核酸を第二の制限酵素によって切断してもよい。第二の
制限酵素の選択は、DNA断片の制限酵素マップを作製することによって誘導され る。
【００２０】 必要に応じて、試験または基準核酸は検出アッセイを行う前に単離してもよい
。「単離核酸」とは、核酸が由来する生物の天然のゲノムおいて直接隣接してい
る核酸のいずれにも直接隣接していない（すなわち共有結合していない）核酸セ
グメントまたは断片を意味する。したがって、この用語には例えば、ベクター、
例えばバクテリオファージ、ウイルス、または自律複製できるプラスミドベクタ
ーに組み入れられる核酸が含まれる。「単離核酸」という用語はまた、化学的手
段、選択的増幅または制限エンドヌクレアーゼ処置によって生じた核酸断片のよ
うに、他の核酸から実質的に精製された核酸を含んでもよい。本発明の検出アッ
セイは、１つ以上のDNA配列を同時に分析するために用いられるため、単離およ び精製は必要でないが、望ましければ行ってもよい。
【００２１】 下記により詳細に開示するように、本発明は、核酸試料におけるDNAミスマッ チを検出する単純かつ安価な手段を提供する。本請求の方法は迅速且つ感度の良
い特性を有し、容易に自動化できることから、多数の試料の大規模スクリーニン
グ、または多数の基準核酸に対して特定の試料をスクリーニングする場合に実際
に役立つ。例えば、結合アッセイは、特定の反応性物質（T4 Endo VII）でコー ティングした既製のマイクロタイタープレートを使用することによって容易とな
る可能性があり、これは長期間にわたって冷蔵保存することができ、その結果を
ロボティクスによって処理してもよい。さらに、単に反応条件を変化させること
によって、非常に迅速な結合アッセイおよび第二の切断に基づくアッセイの双方
において用いることができる反応性物質を使用することによって、特に費用およ
び感度の点から従来の技術に対してより多くの利点が得られる。重要なことは、
この後者のアプローチによって、ミスマッチ検出段階について二重のチェックが
可能となり、同様に、単純かつ安価な結合アッセイによるマススクリーニングを
行い、その後に正確な切断アッセイによってミスマッチ部位を決定することがで
きる。
【００２２】 本明細書に記述の技術は、哺乳類の疾患（癌および様々な遺伝性の疾患）に関
連したDNA変異および多型のみならず、それらを治療するための治療物質の開発 を促進する変異を検出するために極めて有用である。または、方法は法医学的応
用または商業的な（例えば、農業）種における有用な形質の特定にも有用である
。
【００２３】 当業者は本発明が他の目的にも有用であることを認識すると思われる。例えば
、請求される方法は、クローニングしたDNAにおける単塩基対ミスマッチ、例え ば実験操作の際に導入された変異（例えば形質転換、変異誘発、PCR増幅、また は長期間の保存もしくは凍結融解サイクル後）の検出を容易にする。したがって
、本方法は、治療蛋白質を発現する遺伝子構築物、または遺伝子治療の目的のた
めに患者に導入される遺伝子構築物を試験するために有用である。
【００２４】 本方法はまた、細菌およびウイルス株の迅速なタイピングにも用いられる。「
タイプ」とは、特定の株と、同じまたは関連する細菌またはウイルスの他の株と
を区別する１つまたはそれ以上の核酸変異を検出することによって、同質遺伝子
の細菌またはウイルス株を特徴付けすることを意味する。例として、ヒト免疫不
全ウイルスの遺伝子変異体により、それぞれが異なる遺伝子変異を有する明確な
HIVタイプが単離された（ロペス・ガリンデス（Lopez-Galindez）ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 88：4280（1991））。タイピングに関して特に重要な試験DN
Aの他の例には、レトロウイルス科のウイルス、例えばヒトTリンパ球ウイルスま
たはヒト免疫不全ウイルス（特に、HTLV-I、HTLV-II、HIV-1またはHIV-2のいず れか一つ）から単離された試験DNA、アデノウイルス、パポバウイルス、または ヘルペスウイルス科のDNAウイルス、細菌、または他の生物、例えばスピロヘー タ（Spirochaetales）目の生物、トレポネーマ（Treponema）またはボレリア（B
orrelia）属、キネトプラスト（Kinetoplastida）目、トリパノソーマ・クルー ジ（Trypanosoma cruizi）種、放線菌（Actinomycetales）目、マイコバクテリ ウム（Mycobacteriaceae）科、結核菌（Mycobacterium tubercurosis）種、連鎖
球菌（Streptococcus）属のDNAウイルスが含まれる。
【００２５】 特に定義していなければ、本明細書において用いられる技術用語および科学用
語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と
同じ意味を有する。本明細書において言及した全ての刊行物は参照として本明細
書に組み入れられる。
【００２６】 本発明のその他の特徴および利点は以下の詳細な説明および添付の特許請求の
範囲から明らかとなると思われる。
【００２７】 詳細な説明 下記に、Mg2+の非存在下での固定化T4 Endo VIIによるへテロ二本鎖DNAにおけ
るミスマッチおよびバルジの結合に基づく改善された方法を示す。マイクロタイ
タープレートを使用することにより、大量の試料のスクリーニングが可能となり
、これによって技法は迅速、容易となり、そして用途が広くなる。ヘテロ二本鎖
における変異は、結合段階で決定してもよく、またはT4 Endo VII切断の後にMg2 + の存在下で陽性結合試料のアリコットをインキュベートすることによって解析 してもよい（ソラロ（Solaro）ら、J. Mol. Biol. 230：868〜877（1993）；ヨ ウイル（Youil）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：87〜91（1995））。単一
のリゾルベース試薬を用いて結合段階と切断段階とを組合せると、マイクロタイ
ターフォーマットにおいて多数の未知試料をスクリーニングして、試料の大多数
（すなわち陰性試料）を消去しながら陽性試料のみをさらに加工することができ
る。
【００２８】 リゾルベース結合によるミスマッチの検出 ゲル精製、PCR増幅鎖からアニーリングした84 bpおよび164 bpのヘテロ二本鎖
DNAに中心に存在する可能性がある全てのミスマッチについて、T4 Endo VII結合
アッセイを試験した。中心に位置するC/Cミスマッチまたは同じ技法によって作 製した8nt-挿入を有する263 bpのヘテロ二本鎖も調べた。
【００２９】 マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするため、高度に精製した
T4 Endo VII（ゴルツ（Golz）ら、1995、上記）を、75 mM燐酸カリウム緩衝液（
pH 6.5）および５ mM EDTAを含む燐酸緩衝液によって最終濃度20 μg/mlとなる ように希釈した。クローニングした酵素は、特定の実験条件下ではこの緩衝液中
でかなり高い特異的活性を示したことから、燐酸緩衝液はpH 6.5で使用した。標
準的な反応技法において96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、T4 E
ndo VII１μgの50 μlを加えて室温で少なくとも30分または１時間インキュベー
トした。インキュベーション時間はこれより長くても結果に影響を及ぼさなかっ
た。プレートは直ちに用いるか、または活性を喪失することなく７日まで４℃の
湿潤大気中で保存することができる。蛋白質含有コーティング溶液をウェルから
除去せずに、試料DNAを直接加えた。
【００３０】 結合アッセイに関して、放射性標識したヘテロ二本鎖DNA約３ fmoleを蛋白質 溶液を含む各ウェルに加え、マイクロタイタープレートを静かに混合した後、室
温で湿潤大気中で２時間インキュベートした。液体を捨て、ウェルあたりインキ
ュベーション緩衝液200 μlを毎回加えてプレートを５回洗浄することによって 、結合していないDNAと蛋白質とを除去した。結合DNAをウェルから放出させるた
めに、１％SDS溶液50 μlを加えた。ピペッティングを繰り返して完全に確実に 放出されるようにした。可視化して記録するために、試料の容積を少量に維持し
、必要であれば蒸発によって減少させた。液体５〜10 μlを小さいホワットマン
3MM濾紙上にしみ込ませ、風乾させて、燐造影装置（フジバス1000）によって定 量した。はいまたはいいえの答えによって変異の有無を報告し、ヘテロ二本鎖試
料の大規模スクリーニングは、数時間以内に処理することができる。
【００３１】 図1A〜1Cに示すように、全てのミスマッチを明らかに検出した。個々のミスマ
ッチにおける差も認識した。C/CおよびG/Cミスマッチの混合物に対するT4 Endo
VIIの親和性は最高であり、A/AおよびT/Tミスマッチの混合物に対する親和性は 最低であった。異なるヘテロ二本鎖に関するシグナル対ノイズ比を決定するため
に、考えられる全てのミスマッチおよび８ntインサートを有する、ヘテロ二本鎖
PCRを用いて合成した84 bp、164 bp、および263 bpのDNAを用いた繰り返し結合 実験からのデータは、比較した。表１に示すように、ミスマッチと対照間のシグ
ナル対ノイズ比は全ての場合について２より大きかった（表１）。
【００３２】
【表１】
【００３３】 図1Cに示したデータから技法の感度が高いこと、ヘテロ二本鎖DNAはホモ二本 鎖「野生型」DNAのバックグラウンドが87.5％までのであっても信頼可能に検出 されたことがさらに証明された。これは合成オリゴヌクレオチド、１つはC/Cミ スマッチ（「MMCC」）を有する44 bp、もう一つは８ヌクレオチドのインサート （「８ntインサート」）を有するオリゴヌクレオチド（図1C）（ソラロ（Solaro
）ら、上記）を用いて調べた。この感度はほとんどの応用にとって十分である。
例えば、PCR産物がヘテロ接合細胞から得られた場合、DNAの50％が融解および再
アニーリング後にヘテロ二本鎖となり、50％がホモ二本鎖となるであろう。ヘテ
ロ二本鎖DNAは２つの相補的ミスマッチを含み、それぞれが総DNAの25％を占めた
。酵素とミスマッチヌクレオチドの一つとの反応が不良であっても、もう一つを
利用できるために感度はそれでも高いと考えられる。双方のミスマッチの検出が
不良である場合は極めてまれであろう。
【００３４】 また、感度の実験における本発明者らによる結果から、燐酸緩衝液の濃度が個
々のヘテロ二本鎖に関してシグナル対ノイズ比に著しく影響を及ぼしうることが
示された。20 mM〜150 mMまでの濃度は幾つかの基質を用いた試行実験において 用いて成功した。
【００３５】 結論すると、上記実験から、T4 Endo VIIがミスマッチの部位で切断すること ができることに加えて、ミスマッチに結合することができることからも、T4 End
o VIIをミスマッチ検出に用いてもよいことが証明された。大腸菌の固定化修復 蛋白質MutSを用いた類似の技法が最近報告されている。しかしMutSは、C/Cミス マッチを報告する上で信頼できず、挿入または欠失変異も認識しない（ワグナー
（Wagner）ら、Nucleic Acids Res. 23：3944〜3948（1995））。さらに、MutS は、Endo VIIについて証明されているように、単純な第二ラウンドの切断反応に
用いることができない。
【００３６】 T4 Endo VII結合によるミスマッチ検出の実験プロトコールの比較 固定化T4 Endo VIIによるヘテロ二本鎖DNAの結合を、異なる３つの基質および
対照DNAに関して調べた。これらのDNAには、８ヌクレオチドのインサートが中央
に存在する46 bpの直鎖状ヘテロ二本鎖（図2A〜2Eにおける「８nt」）、十字型D
NA（図2A〜2Eにおける「CFM13」）、C/Cミスマッチを有するヘテロ二本鎖ヘアピ
ン（図2A〜2Eにおける「MMCC」）、および対照基質として同じ配列を有するがミ
スマッチを有しない直鎖状ホモ二本鎖（図2A〜2Eにおける「対照」）が含まれた
。
【００３７】 さらに、異なる２つのプロトコールを利用した。プロトコールIでは、T4 Endo
VIIとDNAとの間の結合反応が、マイクロタイタープレートのウェルの内表面に 総蛋白質が捕獲される前に進行する。プロトコールIIでは、蛋白質をコーティン
グしたプレートから開始して、その後第二の反応においてDNAを結合させる。い ずれのプロトコールにおいても、おなじ技法を用いて、イオン強度を増加させた
燐酸緩衝液によって一連の洗浄を行うことによって結合DNAとT4 Endo VIIとの間
の相対的結合強度を決定し、溶出した材料の定量を行った。
【００３８】 双方のプロトコールの平行した試験から得られた結果を図2Aおよび2Bに示し、
全ての基質に関して図2Cに要約する。結合DNA量は、予めコーティングしたマイ クロタイタープレートを用いた場合（プロトコールII）では、かなり高かったこ
とが判明している。予め形成された複合体の結合効率の減少はおそらく、ウェル
の内表面の結合が立体的に妨害された結果であった。これは、塩濃度が20 mM、5
0 mM、100 mMおよび150 mMの場合でも当てはまった。対照と試料DNAとの間の最 も大きい差は、結合反応を150 mM燐酸緩衝液で実施した場合に認められた。
【００３９】 T4 Endo VII切断段階の利用 結合アッセイを用いてミスマッチ含有試料を同定した後（すなわち上記結合技
術のいずれにおいても陽性試料）、試料の結果をリゾルベース切断アッセイを用
いてチェックしてもよい。この第二段階は、結合段階の後に直ちに行うことがで
き、または平行して実施することができる。T4 Endo VIIに関して、この段階はM
g2+を結合アッセイ試料のアリコット、または二本ずつの試料に加えることを含 む。Mg2+をこのように添加することによって、T4 Endo VIIはミスマッチヌクレ オチドのヌクレオチド数個分3'内側で切断するよう誘導される（図2D）。一つの
特定の例において、アリコットは図2Bでは「P100」において「MMCC」と示された
試料から採取した。この試料を15 mM Mg2+で処理して、37℃で15分インキュベー
トし、次に10％ポリアクリルアミドゲル（PAA）の中を電気泳動させた。図2Eに 示す結果は、Mg2+添加時のT4 Endo VIIによる試料の切断を示している。これら の実験では、適当な大きさのマーカーによって断片の大きさの概算が可能となり
、図2Dに示されるように変異の位置のマッピングが可能となった。
【００４０】 関連するアッセイ法 上記技術はT4 Endo VIIについて実施したが、本明細書において記述した一般 的なアプローチは、異なる反応条件下で基質を結合および切断することができる
他のリゾルベースおよび他の反応性物質を利用してもよい。したがって、本発明
のさらなる態様を下記に述べる。
【００４１】 i) その他の反応性物質：バクテリオファージT4エンドヌクレアーゼVIIは異 なる反応条件下で十字型DNAに結合して切断することが知られているリゾルベー スの一例であり、この酵素を精製する好ましい方法は、例えば参照として本明細
書に組み入れられる、バボン（Babon）ら、米国特許出願第08/545,404号に紹介 されている。類似の切断活性を有するさらなるリゾルベースには、バクテリオフ
ァージT7エンドヌクレアーゼI、およびS. セレビジエ（S. cerevisiae）十字型
切断酵素Endo X1、Endo X2、Endo X3、およびCCE1（ウェスト（West, S. C.）（
上記）において論評）が含まれる。バクテリオファージT7エンドヌクレアーゼI を精製する方法（デマシー（deMassy, B.）ら、J. Mol. Biol. 193：359（1987 ））、Endo X1（ウェスト＆コーナー（West, S.C. and Korner, A.）、PNAS 82 ：6445（1985）；ウェスト（West, S.C.）ら、J. Biol. Chem. 262：12752（198
7））、Endo X2（シミントン＆コロドナー（Symington. L. S. and Kolodner, R
.）、PNAS 82：7247（1985））、Endo X3（イェンシュ（Jensch, F.）ら、EMBO
J. 8、4325（1989））、およびCCE1（クッファー＆ケンパー（Kupfer and Kempe
r）、Eur. J. Biochem. 238：77（1995））が開示されている。これらのリゾル ベースのそれぞれがミスマッチ部位に結合するか否かは本明細書に記載のアッセ
イを用いて調べてもよい。
【００４２】 ii) さらなる核酸配列：本発明の技術は、広く多様な異なるタイプの核酸試 料におけるミスマッチ核酸についてアッセイするために用いてもよい。例えば、
少なくとも一つのDNA変異または多型を有することが疑われる既知または未知のD
NA配列のDNA制限断片を、ヘテロ二本鎖の形成において試験DNAとして用いてもよ
い。好ましくは、DNA制限断片は長さが少なくとも20塩基対である。より好まし くは、DNA制限断片は長さが50〜40,000塩基対までであり、より好ましくは長さ が100〜5000塩基対までである。特に大きいDNA断片（例えば、２ kbより大きい 断片）を分析する実験では、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に適した大き
さの断片を得るために（＜２ kb）、第二の制限酵素によって断片を切断するこ とが望ましいかも知れない。第二の制限酵素の選択は、断片の制限酵素マップを
作製することによって誘導されるであろう。
【００４３】 もう一つの例において、少なくとも部分的DNA配列が既知であるDNA鋳型を、増
幅した試験DNA源として用いることができる。そのような増幅は、PCR、NASBA、 およびSDAを含む如何なる既知の調製技法によって行ってもよい。そのような増 幅は、疑われるミスマッチまたは関係する配列のいずれかの側にプライマーを配
置することによって実施する。必要に応じて、これらのプライマーは例えば、放
射性標識または蛍光標識、またはビオチンによって標識してもよい。一般的に、
増幅された配列は長さが少なくとも50塩基対までである。最近のPCR技術の進歩 により、DNAの40 kbまでの増幅が可能になった。好ましくは増幅される領域は長
さが100〜40,000塩基対までであり、より好ましくは長さが150〜5000塩基対まで
である。当業者は隣接するDNA配列がごく部分的にわかっている場合、縮重DNAオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCR増幅によって試験DNAを調製してもよ
いことを認識していると思われる。
【００４４】 もう一つの例において、二本鎖核酸を適したクローニングベクターにサブクロ
ーニングして、クローニングベクターとハイブリダイズして鋳型の挿入部位に隣
接する既知のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅してもよい。この場合
、PCR増幅に用いられるDNAオリゴヌクレオチドプライマーは、既知のDNA配列を 有するベクターにはハイブリダイズするが、挿入された鋳型DNAにはハイブリダ イズしないため、鋳型DNA配列情報は必要ではない。例えば、Bluescript（登録 商標）ベクターを用いて製造元の説明書に従って、アクセプター部位にDNA鋳型 をサブクローニングすることができる（ストラタジーン・クローニングシステム
ズ、ラホヤ、カリフォルニア州、製品カタログ、（1992））。Bluescriptベクタ
ーのT7およびT3 DNAプライマーは、挿入されたDNA鋳型をPCR増幅するために（ま
たは挿入されたDNA鋳型を同時にシークエンシングするために）用いることがで きる。他の市販のサブクローニングベクターもまた用いてもよい。これらには、
ファージラムダに基づく挿入ベクターならびに他の原核細胞および真核細胞ベク
ター（例えば、上記のストラタジーン社、およびサムブルック（Sambrook）らに
よって記載される、バクテリオファージ、昆虫ウイルス（バキュロウイルス）、
または動物ウイルス（SV-40またはアデノウイルス）に基づくベクター）が含ま れるがこれらに限定しない。上記のように、PCR増幅したDNA鋳型は試験DNA源と して用いることができ、またはもう一つの方法において、DNAミスマッチを少な くとも１つ有するDNAインサートを含むベクターを、PCR増幅の前にまず細菌、フ
ァージ、昆虫または動物細胞中で増殖させることによって増幅してもよい（サム
ブルック（Sambrook）ら、上記）。十分なDNAが得られれば（すなわち少なくと も１ナノグラム）、PCR増幅段階を省略することができる。
【００４５】 さらにもう一つの例において、本明細書に記述の技術を用いてRNAを試験して もよい。RNAは当技術分野で周知の技術によって細胞または組織から精製しても よい。例えば、RNAはmRNAを調製するためにオリゴ-dTクロマトグラフィーによっ
て精製してもよい（例えば、サムブルック（Sambrook）ら、上記、およびアウス
ユベール（Ausubel）ら、上記、を参照のこと）。リボゾームRNAを分析する場合
、または特定のmRNAが豊富に存在する場合、オリゴ-dTクロマトグラフィーは必 要でない。精製RNAまたはmRNAを熱変性させて完全な一本鎖にし、対照鎖（例え ば対照DNA鎖）とハイブリダイズさせてRNA：DNAヘテロ二本鎖を形成する。RNA：
DNA二本鎖を形成する方法は当技術分野において周知であり、詳細に記載されて いる（サムブルック（Sambrook）ら、上記を参照）。RNA：DNAヘテロ二本鎖を形
成した後、本明細書に記述の方法を用いてDNAとRNAとの間の誤った対形成によっ
て生じたミスマッチを検出してもよい。好ましい態様において、対照DNAは5'末 端標識する。またはRNAは放射性標識ウラシルを生存細胞または組織に加えるこ とによって均一に標識することができる。
【００４６】 二本鎖核酸の鎖の片方または両方は、真核細胞（例えば、ヒト細胞）、真性細
菌細胞、バクテリオファージ、DNAウイルスまたはRNAウイルスに由来してもよい
。好ましいRNAウイルスには、ヒトT細胞白血病ウイルスおよびヒト免疫不全ウイ
ルス（例えば、HTLV-I、HTLV-II、HIV-1、およびHIV-2）が含まれるがこれらに 限定しない。好ましいDNAウイルスには、アデノウイルス、パポバウイルス、ま たはヘルペスウイルス科のいずれかが含まれるがこれらに限定しない。好ましい
真性細菌細胞には、スピロヘータ目（Spirochaetales）、キネトプラスト目（Ki
netoplastida）、または放線菌目（Actinomycetales）、トレポネーマ科（Trepo
nemataceae）、トリパノソーマ科（Trypoanosomatidae）、またはマイコバクテ リア科（Mycobacteriaceae）、および結核菌種（Mycobacterium tuberculosis）
、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、トレポネーマ・ペルテニュ（Trep
onema pertenue）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ま
たはトリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）のメンバーが含まれるが これらに限定されない。
【００４７】 核酸鎖はまた、治療蛋白質の標的として作用しうるヒト遺伝子（例えば疾患の
発病、維持もしくは進行に必要である必須のヒト遺伝子）、または疾患もしくは
病態の診断に関係するヒト遺伝子、例えば、主要遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子
を含んでもよい；好ましい哺乳類腫瘍遺伝子には、abl、akt、crk、erb-A、erb-
B、ets、fes/fps、fgr、fms、fos、jun、kit、mil/raf、mos、myb、myc、H-ras 、K-ras、rel、ros、sea、sis、ski、src、およびyesが含まれるがこれらに限定
しない；好ましい腫瘍抑制遺伝子には、p53、網膜芽細胞腫（好ましくはRB1）、
腺腫様多発結腸ポリープ、NF-1、NF-2、MLH-1、MTS-1、MSH-2、BRCA-1、BRCA-2 、ATM、およびヒト非ポリポーシス遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。
【００４８】 または、二本鎖核酸鎖の一方または両方がβ-グロビン、α1-アンチトリプシ ン、21-ヒドロキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット、ジ ヒドロプテリジンレダクターゼ、ロドプシン、β-アミロイド、神経生長因子、 スーパーオキシドジスムターゼ、ハンチントン病、嚢胞性繊維症、アデノシンデ
アミナーゼ、β-地中海貧血、オルニチントランスカルバミラーゼ、コラーゲン 、bcl-2、β-ヘキソサミニダーゼ、トポイソメラーゼII、ヒポキサンチンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ、フェニルアラニン4-モノオキシゲナーゼ、第VIII
因子、第IX因子、ヌクレオシドホスホリラーゼ、グルコース-6-燐酸デヒドロゲ ナーゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー
、フォンヒッペル・リンダウ病、またはマウス斑紋状メンケス遺伝子のいずれか
一つから単離してもよい。核酸はまた、如何なる細胞周期調節遺伝子、好ましく
はp21、p27、またはp16に由来してもよい。
【００４９】 iii) さらなる標識技法：上記方法は、如何なる検出可能な標識および検出技
法を用いて実施してもよい。例えば、二本鎖核酸は5'末端標識してもよく、また
はヘテロ二本鎖形成の前後いずれかに放射活性燐によって均一に標識してもよい
。一つの特定の例において、標識は、α位で放射活性燐または硫黄（例えば、32 P、33P、または35S）によって放射性標識した１つまたはそれ以上のデオキシリ ボヌクレオチド（すなわちdNTPs：dA、dG、dC、またはT）を用いてPCR増幅の際 に実施してもよい。一般的に、１つまたはそれ以上の放射性標識したdNTP 0.1〜
50 μCiをPCR反応に加えることができ、過剰量の標識はセファデックスG-50カラ
ムクロマトグラフィーによって除去した（例えばスピンカラムを用いて）。もう
一つの特殊な例において、二本鎖核酸はローダミン標識ウラシルおよび標準的な
技術（モレキュラープローブズ、ユージーン、オレゴン州）を用いてPCR反応の 際に均一に標識してもよい。または試験二本鎖はヘテロ二本鎖形成の前後にビオ
チンによってタグをつけることができる（チザード（Tizard）ら、PNAS 87, 451
4（1990））。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後にビオチン化DNAを検出する
方法は開示されている（アウスユベール（Ausubel）ら、上記、第７章）。一つ の好ましい態様において、ビオチン化二本鎖核酸の検出は、核酸をストレプトア
ビジン結合酵素および発色基質（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダー
ゼ）と接触させることによって行う。さらにもう一つの代わりの方法において、
二本鎖核酸は蛍光dNTPsによってタグをつけてもよい（例えば、フルオレセイン ；例えば、アンソルゲ（Ansorge, W.）ら、Nucl. Acids. Res. 15、4593（1987 ）；ジョンストン-ダウ（Johnston-Dow, E.）ら、BioTechniques 5、754（1987 ）；プローバー（Prober, J.）ら、Science 238、336（1987））。もう一つの例
において、特定のDNAポリメラーゼ、特にT4 DNAポリメラーゼの3'--＞5'エキソ ヌクレアーゼ活性を用いてヘテロ二本鎖DNAを放射性標識してもよい。他の標識 アプローチは、参照として本明細書に組み入れられる、コットン（Cotton）ら、
米国特許第5,698,400号およびバボン（Babon）ら、米国特許出願第08/545,404号
に記述されている。
【００５０】 iv) さらなる結合アッセイ：反応性物質と二本鎖核酸との結合は既知の技術 によって解析してもよい。例えば、上記のアプローチは、マイクロタイターウェ
ルに固定した反応性物質によって捕捉された標識二本鎖核酸の検出を含むが、他
のタイプの固相支持体を利用してもよい。そのような固相支持体には、ビーズ（
例えば磁気ビーズ）と共に試験管、プレート、カラム、またはチップが含まれる
がこれらに限定されない。固定化はまた、直接結合と共に間接結合を含む、如何
なる適当な手段によって行ってもよい。間接結合は、如何なるタイプの共有結合
または非共有結合特異的結合対を含んでもよい。そのような結合対は当技術分野
において周知であり、解析において用いられる条件下で変性または分離しない核
酸または蛋白質成分を含む如何なる対も含む；そのような対には、抗原／抗体対
、DNA結合蛋白質／DNA結合部位対（例えばGCN4蛋白質とそのDNA結合部位）、酵 素／基質対、レクチン／炭水化物対、および塩基対を形成した核酸またはライゲ
ーションした核酸が含まれるがこれらに限定されない。本発明の好ましい特異的
結合対は、アビジン／ビオチンである。
【００５１】 または結合反応は溶液中で実施してもよく、複合体は如何なる標準的な技法に
よって検出してもよい。一つの特定の例において、複合体は二本鎖核酸を捕捉し
て（例えばニトロセルロースフィルター上で）、結合した標識反応性物質が濾紙
上に存在するか否かを解析することによって単離してもよい。または反応性物質
は捕捉してもよく（例えば、免疫沈降または特異的抗体カラムのような免疫学的
技術によって）、標識二本鎖核酸の有無を解析してもよい。さらにもう一つのア
プローチにおいて、反応性物質二本鎖核酸複合体はDNAフットプリント、ゲル固 定アッセイ法、またはその他のゲル電気泳動アプローチのような標準的な技術に
よって検出してもよい。
【００５２】 v) さらなる切断アッセイ法：上記のように、ミスマッチ切断反応産物は、好
ましくは二本鎖分子におけるミスマッチの位置を決定するためにサイズマーカー
の存在下でゲル電気泳動によって解析してもよい。しかし、本アプローチはこの
技術に限定されず、如何なるタイプの切断反応および検出技術を用いて行っても
よい（例えば、固相支持体上）。本発明において有用な切断技術の例は、参照と
して本明細書に組み入れられる、コットン（Cotton）ら、米国特許第5,698,400 号、およびバボン（Babon）ら、米国特許出願第08/545,404号に記載されている 。
【００５３】 vi) さらなる核酸分離技術：上記の周知の基本的な変性ポリアクリルアミド ゲル電気泳動技術のほかに（サムブルック（Sambrook）ら、上記も参照のこと）
、反応性物質結合または切断産物の分離を増加させるために、そして特に大きい
切断産物（例えば、＞２ kb）を分析するために、多様な電気泳動法が利用でき る。分離度が増加した変性ポリアクリルアミドゲルは、二本鎖核酸におけるミス
マッチの特異的部位をより正確に決定するという利点を有する。さらに、そのよ
うなゲルによって切断産物の分析は改善される。例えば、楔形のスペーサーを用
いて、場の勾配を形成する、または緩衝液勾配、電解質勾配もしくはアクリルア
ミド段階的勾配を組み入れてもよい。ホルムアミドは標準的な変性ポリアクリル
アミドゲルに含めてもよく、またはより長いゲル（80〜100 cm）を用いてもよい
。これらの電気泳動技術は詳細に記述されている（アウスユベール（Ausubel） ら、上記）。または、２ kbより大きい切断産物は、制限酵素によって特異的に 切断して、断片の大きさを減少させることができるが、特定の制限酵素の選択は
、分析すべき特定のDNAの制限酵素マップによって支配される。または大きい切 断産物は変性（例えばアルカリ）アガロースゲル上で電気泳動して、DNAと相互 作用する試薬（例えば染色または色素）、例えば銀、エチジウムブロマイド、ア
クリジンオレンジ、4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール（すなわちDAPI）、ヘ キスト色素等によって直接可視化することができる（サムブルック（Sambrook）
ら、上記；およびバッサム（Bassam）ら、Anal. Biochem. 196、80（1991））。
さらに、電気泳動したDNAはメンブレンにトランスファーして（例えばDEAE-セル
ロース、ナイロン、または他の適したメンブレン）、放射活性または非放射活性
（例えばビオチン、ジゴキシゲニン、またはフルオレセイン）タグをつけたプロ
ーブとのフィルター上でのハイブリダイゼーションによって可視化してもよい。
【００５４】 または、核酸（例えば、二本鎖核酸切断産物）は、HPLCカラムに基づく、また
は毛細管電気泳動アプローチを含むがこれらに限定されない非ゲル技術によって
分離してもよい。
【００５５】 その他の態様は特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
簡単に図面について説明する。
【図１】 図1A〜1Cは、固定化T4 Endo VIIによるヘテロ二本鎖DNAの選択的
結合を説明する写真である。ヘテロ二本鎖DNAの固定化T4 Endo VIIに対する結合
は、本明細書に記述のように、マイクロタイタープレートのT4 Endo VIIコーテ ィングウェルにおいて75 mM燐酸緩衝液（pH 6.5）中に、5'末端標識ヘテロ二本 鎖DNAを加えることによって試験した。十分に洗浄することによって過剰量のDNA
を除去した後、結合したDNA量はウェルから回収した試料のアリコットを濾紙に しみ込ませることによって決定した。放射活性の量は燐造影によって決定した。
試料の像を示す。図1Aは、断片配列の中心に存在するそれぞれ起こりうるミスマ
ッチを有する84ヌクレオチドおよび164ヌクレオチドのPCR断片を用いた結果を示
す。ハイブリダイゼーションのために、変異型と野生型PCR断片の等量をTE-緩衝
液（10 mMトリス塩酸、pH 8.0、１ mM EDTA）100 μl中で混合した。ハイブリダ
イゼーションは、バイオメトラ・サーモサイクラーにおいて最初95℃で５分の変
性段階から始めて10℃ずつ（15分／段階）試料を段階的に冷却することによって
実施した。ハイブリダイゼーション後、DNAを標準的な方法によって5'末端標識 した。図1Bは、長さが263ヌクレオチドで、C/CおよびG/Gミスマッチが中心に存 在する、または８ヌクレオチド挿入が中心に存在するPCR断片から形成されたヘ テロ二本鎖を用いた結果を示す。固定化T4 Endo VIIに対する結合および結合材 料の量の解析は上記の図1Aの記述と同様に実施した。図1Cは、C/Cミスマッチ（ 「MMCC」）を有する合成ヘテロ二本鎖基質、または８ヌクレオチドのインサート
（「８ヌクレオチドのループ」）の等量を、燐酸緩衝液の個々の最適な濃度で異
なる量のホモ二本鎖DNAと混合することによって調べた結合アッセイ法の感度を 示す結果を示す。アッセイ法は図1Aにおいて説明したプロトコールに従って実施
した。図1A〜1Cについて、「ctr」とは、誤った対形成のないハイブリッドホモ 二本鎖を含む対照を示し、「std」とはスポットあたり15,000 psiで標識した基 質を含む標準物質を含む。
【図２】 図2A〜2EはマイクロタイタープレートのウェルにおけるT4 Endo
VIIによるへテロ二本鎖DNAの選択的結合を示す。異なる２つのプロトコールを用
いて固定化T4 Endo VIIによるヘテロ二本鎖DNAの結合を調べた。図2Aは、マイク
ロタイタープレートのウェルにT4 Endo VIIとヘテロ二本鎖DNAとを同時に加えた
場合の結果を示す。図2BはマイクロタイタープレートのウェルにT4 Endo VIIと ヘテロ二本鎖DNAとを連続的に加えた結果を示す。いずれの実験においても、同 じシリーズの燐酸緩衝液（「P」）濃度（mM）を用い、これはブロットの上に示 すようにP20、P50、P100、およびP150であった。十分に洗浄した後にウェルに保
持された材料から採取したアリコットを濾紙にしみ込ませて燐造影によって定量
した。試料の像を示す。図2Aおよび2Bでは、「std」は、加えたDNAの総量を含む
標準物質を示し；「8nt」は８ヌクレオチドの挿入ループを有するヘテロ二本鎖D
NAを示す；「CFM13」は合成分岐十字型DNAを示す；「MMCC」はC/Cミスマッチが 中心に存在するヘテロ二本鎖ヘアピンDNAを示す（図2Eに完全な配列を示す）； および「対照」は、ホモ二本鎖ヘアピンDNAを示す。図2CはプロトコールIIによ って測定した異なる基質に関する相対的結合効率の比較を示す（図2Bに示すよう
に）。図2Cでは、明るい灰色のバーは「8nt」試料に対応し、黒いバーは「CFM13
」試料に対応し、白いバーは「MMCC」試料に対応し、そして暗い灰色のバーは「
対照」試料に対応する。図2Dはヘアピン基質MMCCのヌクレオチド配列を示す。矢
印は、図2Eに示す実験においてマッピングされたT4 Endo VII切断部位を印す。 図2Eは、ウェル「MMCC/P100」から採取したアリコットにおいて、T4 Endo VIIの
ヌクレアーゼ活性が15 mM Mg2+の添加によって活性化されたことを示している（
図2Bから）。反応産物は10％変性PAAゲル上で分離した。5'末端標識基質「MMCC 」におけるミスマッチC/Cに隣接する切断（図2Dに示す）により、長さが36ヌク レオチドおよび15ヌクレオチドの断片を生じた。図2Eでは、レーン１は対照DNA を示し、レーン２はMMCC DNAを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ゴルツ ステファン ドイツ連邦共和国 エッセン イム オス ターブルシュ 14 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA08 AA11 CA01 CA11 DA03 DA05 HA08 HA09 HA11 HA14 4B063 QA01 QA17 QA18 QA19 QQ06 QQ07 QQ08 QQ10 QQ41 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR48 QR50 QR66 QR79 QR83 QR84 QS16 QS28 QS34 QX01 4B064 AF27 CA21 CC24 DA01 DA11 DA13

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の段階を含む、二本鎖核酸におけるミスマッチを検出す
    る方法： a) 二本鎖核酸を、二本鎖核酸におけるミスマッチを切断することができるリ
    ゾルベースと、リゾルベースがミスマッチに結合するが切断しない条件下で、接
    触させる段階；および b) 該二本鎖核酸におけるミスマッチの存在の指標として、該リゾルベースと
    該二本鎖核酸との結合を検出する段階。
  2. 【請求項２】 リゾルベースがバクテリオファージまたは真核生物リゾルベ
    ースである、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 接触条件がマグネシウムが存在しないことを含む、請求項１
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 接触段階が溶液中で行われる、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 以下の段階をさらに含む、請求項１記載の方法： c) リゾルベースが二本鎖核酸におけるミスマッチを切断する条件下で、該二
    本鎖核酸を該リゾルベースと接触させる段階；および d) 該二本鎖核酸におけるミスマッチの存在の指標として、切断産物を検出す
    る段階。
  6. 【請求項６】 リゾルベースが上記ミスマッチの10ヌクレオチドで、または
    10ヌクレオチド以内で切断する、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 上記リゾルベースの結合または上記リゾルベース切断反応の
    部位が決定される、請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】 以下の段階を含む、二本鎖核酸におけるミスマッチを検出す
    る方法： a) 反応性物質が該二本鎖核酸におけるミスマッチに結合するが切断しないよ
    うな条件下で、該二本鎖核酸を該反応性物質と接触させる段階； b) 該二本鎖核酸におけるミスマッチの存在の指標として、該反応性物質と該
    二本鎖核酸との結合を検出する段階； c) 上記物質が該二本鎖核酸におけるミスマッチを切断する条件下で、該二本
    鎖核酸を該反応性物質と接触させる段階； d) 該核酸におけるミスマッチの存在の指標として切断産物を検出する段階。
  9. 【請求項９】 結合反応条件がマグネシウムが存在しないことを含み、切断
    反応条件がマグネシウムが存在することを含む、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項10】 反応性物質またはリゾルベースがT4エンドヌクレアーゼVII である、請求項１または８記載の方法。
  11. 【請求項11】 反応性物質またはリゾルベースと接触させる前に、上記二本
    鎖核酸が少なくとも一つの検出部分によって標識される、請求項１または８記載
    の方法。
  12. 【請求項12】 上記反応性物質または上記リゾルベースとの接触段階と上記
    検出段階との間に、上記二本鎖核酸が少なくとも一つの検出部分によって消化後
    標識される、請求項１または８記載の方法。
  13. 【請求項13】 上記検出部分が放射性標識、蛍光標識、ビオチン、ジゴキシ
    ゲニン、発光物質、色素または酵素のいずれかである、請求項11または12記載の
    方法。
  14. 【請求項14】 上記二本鎖の少なくとも１つの鎖がビオチンで標識され、上
    記検出段階が上記二本鎖とストレプトアビジン結合検出部分との反応を含む、請
    求項１または８記載の方法。
  15. 【請求項15】 上記二本鎖核酸の少なくとも１つの鎖が増幅によって提供さ
    れる、請求項１または８記載の方法。
  16. 【請求項16】 上記反応性物質、上記リゾルベース、または上記二本鎖核酸
    が固相支持体に結合している、請求項１または８に記載の方法。
  17. 【請求項17】 上記固相支持体がマイクロタイタープレートまたは磁気ビー
    ズである、請求項16記載の方法。
  18. 【請求項18】 上記二本鎖核酸がヘテロ接合体から得られる、請求項１また
    は８記載の方法。
  19. 【請求項19】 上記二本鎖核酸の少なくとも１つの鎖が真核細胞、真性細菌
    細胞、細菌細胞、ミコバクテリア細胞、バクテリオファージ、DNAウイルス、ま たはRNAウイルスに由来する、請求項１または８記載の方法。
  20. 【請求項20】 上記二本鎖核酸の少なくとも１つの鎖がヒト細胞に由来する
    、請求項19記載の方法。
  21. 【請求項21】 上記二本鎖核酸が、野生型配列を有する少なくとも一つの鎖
    を含む、請求項１または８記載の方法。
  22. 【請求項22】 上記ミスマッチにより変異の存在が示される、請求項１また
    は８記載の方法。
  23. 【請求項23】 上記変異により疾患または病態が診断される、請求項22記載
    の方法。
  24. 【請求項24】 上記ミスマッチにより多型の存在を示す、請求項１または８
    記載の方法。
  25. 【請求項25】 上記ミスマッチが必須遺伝子において起こる、請求項１また
    は８記載の方法。
JP2000530632A 1998-02-04 1999-01-29 ミスマッチ検出技術 Withdrawn JP2002502614A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7371698P 1998-02-04 1998-02-04
US60/073,716 1998-02-04
PCT/US1999/001936 WO1999040222A1 (en) 1998-02-04 1999-01-29 Mismatch detection techniques

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002502614A true JP2002502614A (ja) 2002-01-29

Family

ID=22115362

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000530632A Withdrawn JP2002502614A (ja) 1998-02-04 1999-01-29 ミスマッチ検出技術

Country Status (8)

Country Link
US (1) US6110684A (ja)
EP (1) EP1053352B1 (ja)
JP (1) JP2002502614A (ja)
AT (1) ATE224458T1 (ja)
AU (1) AU753273B2 (ja)
CA (1) CA2319712A1 (ja)
DE (1) DE69902996T2 (ja)
WO (1) WO1999040222A1 (ja)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7195871B2 (en) * 1996-01-24 2007-03-27 Third Wave Technologies, Inc Methods and compositions for detecting target sequences
US6214552B1 (en) * 1998-09-17 2001-04-10 Igen International, Inc. Assays for measuring nucleic acid damaging activities
US6403309B1 (en) * 1999-03-19 2002-06-11 Valigen (Us), Inc. Methods for detection of nucleic acid polymorphisms using peptide-labeled oligonucleotides and antibody arrays
WO2001051668A1 (en) * 2000-01-13 2001-07-19 Immunivest Corporation Ferrofluid based arrays
GB0000992D0 (en) * 2000-01-18 2000-03-08 Astrazeneca Uk Ltd Methods
GB0000995D0 (en) * 2000-01-18 2000-03-08 Zeneca Ltd Methods
GB0001005D0 (en) * 2000-01-18 2000-03-08 Zeneca Ltd Methods
US6365355B1 (en) * 2000-03-28 2002-04-02 The Regents Of The University Of California Chimeric proteins for detection and quantitation of DNA mutations, DNA sequence variations, DNA damage and DNA mismatches
US6340566B1 (en) * 2000-03-28 2002-01-22 The Regents Of The University Of California Detection and quantitation of single nucleotide polymorphisms, DNA sequence variations, DNA mutations, DNA damage and DNA mismatches
GB0021286D0 (en) * 2000-08-30 2000-10-18 Gemini Genomics Ab Identification of drug metabolic capacity
US6539102B1 (en) * 2000-09-01 2003-03-25 Large Scale Proteomics Reference database
ATE421989T1 (de) * 2000-12-01 2009-02-15 Cornell Res Foundation Inc Nachweis von nukleinsäureunterschieden mit einer kombination aus endonukleasespaltungs- und ligationsreaktionen
WO2002059381A2 (en) * 2001-01-06 2002-08-01 The General Hospital Corporation Gene for identifying individuals with familial dysautonomia
US20030092157A1 (en) * 2001-03-16 2003-05-15 Hayden Michael R. Compositions, screening systems and methods for modulating HDL cholesterol and triglyceride levels
CA2448484A1 (en) * 2001-05-25 2002-12-05 Xenon Genetics, Inc. Diagnostic methods for cardiovascular disease, low hdl-cholesterol levels, and high triglyceride levels
US20030220844A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Marnellos Georgios E. Method and system for purchasing genetic data
AU2003254298A1 (en) 2002-08-02 2004-02-23 Stratatech Corporation Species specific dna detection
US20050101640A1 (en) * 2002-10-16 2005-05-12 Recordati Ireland Limited Lisinopril/lercanidipine combination therapy
US20040147566A1 (en) * 2002-10-16 2004-07-29 Amedeo Leonardi Lisinopril/lercanidipine combination therapy
EP2112229A3 (en) 2002-11-25 2009-12-02 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
US8206904B2 (en) 2002-12-18 2012-06-26 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids
ATE525469T1 (de) 2002-12-18 2011-10-15 Third Wave Tech Inc Nachweis kleiner nukleinsäuren
US7297780B2 (en) 2003-01-06 2007-11-20 Third Wave Technologies, Inc. Reactive functional groups for preparation of modified nucleic acid
US7189512B2 (en) * 2003-02-20 2007-03-13 Noga Porat Methods for variation detection
EP1651779A4 (en) * 2003-08-08 2006-10-04 Univ Jefferson METHOD FOR FAST IDENTIFICATION OF ALTERNATIVE SPLEISSEN
US7462451B2 (en) * 2004-04-26 2008-12-09 Third Wave Technologies, Inc. Compositions for modifying nucleic acids
WO2006022628A1 (en) * 2004-07-22 2006-03-02 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of type ii diabetes and treatments thereof
JP2008520245A (ja) * 2004-11-23 2008-06-19 ワン，シャオ・ビン 切断−増幅法による核酸多様性の検出
WO2007059348A2 (en) * 2005-11-17 2007-05-24 Third Wave Technologies, Inc. Compositions and methods for detecting an hcv-1 subtype
EP3617321A3 (en) 2006-05-31 2020-04-29 Sequenom, Inc. Methods and compositions for the extraction and amplification of nucleic acid from a sample
CA2654016C (en) 2006-06-01 2016-01-05 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids
WO2007140599A1 (en) 2006-06-05 2007-12-13 Cancer Care Ontario Assessment of risk for colorectal cancer
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
WO2008084571A1 (ja) * 2007-01-12 2008-07-17 Japan Science And Technology Agency 核酸応答性ゲルおよびその製造方法ならびにその利用
WO2008098142A2 (en) 2007-02-08 2008-08-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification
US20110189663A1 (en) 2007-03-05 2011-08-04 Cancer Care Ontario Assessment of risk for colorectal cancer
CA2680588A1 (en) 2007-03-26 2008-10-02 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
KR101049349B1 (ko) * 2007-05-07 2011-07-13 어 스쿨 코포레이션 칸사이 유니버시티 분자 응답성 겔 미립자, 그의 제조 방법 및 그의 이용
US7947446B2 (en) * 2007-05-29 2011-05-24 Ming-Sheng Lee High throughput mutation screening methods and kits using a universalized approach—differential sequence fill-in (DSF)-enabled sequential adapter ligation and amplification
GB0713183D0 (en) * 2007-07-06 2007-08-15 King S College London Method
EP2195452B1 (en) 2007-08-29 2012-03-14 Sequenom, Inc. Methods and compositions for universal size-specific polymerase chain reaction
MX2010002613A (es) * 2007-09-07 2010-08-04 Third Wave Tech Inc Metodos y aplicaciones para la cuantificacion del blanco.
WO2009114543A2 (en) 2008-03-11 2009-09-17 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
EP2276858A4 (en) 2008-03-26 2011-10-05 Sequenom Inc RESTRICTED ENDONUCLEASE AMPLIFIED POLYMORPHIC SEQUENCE DETECTION
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
CN104878086A (zh) 2009-02-11 2015-09-02 卡里斯Mpi公司 肿瘤的分子谱分析
CN102428191A (zh) * 2009-03-18 2012-04-25 塞昆纳姆股份有限公司 热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用
EP2414545B1 (en) 2009-04-03 2017-01-11 Sequenom, Inc. Nucleic acid preparation compositions and methods
WO2010124257A2 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Colby Pharmaceutical Company Methods and kits for determining oxygen free radical (ofr) levels in animal and human tissues as a prognostic marker for cancer and other pathophysiologies
AU2010315400B2 (en) 2009-10-27 2016-07-21 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
US8394589B2 (en) 2009-12-21 2013-03-12 Northwestern University Methods for diagnosing scapuloperoneal spinal muscular atrophy or Charcot-Marie-Tooth disease type 2C by detecting mutations in TRPV4
CA2785020C (en) 2009-12-22 2020-08-25 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
US10093981B2 (en) 2010-10-19 2018-10-09 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US20150218639A1 (en) 2014-01-17 2015-08-06 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
US20150225792A1 (en) 2014-01-17 2015-08-13 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US10233501B2 (en) 2010-10-19 2019-03-19 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
EP3441479B1 (en) 2011-02-02 2020-09-02 Exact Sciences Development Company, LLC Digital sequence analysis of dna methylation
WO2012117588A1 (ja) 2011-02-28 2012-09-07 独立行政法人科学技術振興機構 複数物質応答性ゲルおよびその製造方法並びにその利用
EP3378954B1 (en) 2011-04-29 2021-02-17 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
US9000146B2 (en) 2011-05-12 2015-04-07 Exact Sciences Corporation Isolation of nucleic acids
US8808990B2 (en) 2011-05-12 2014-08-19 Exact Sciences Corporation Serial isolation of multiple DNA targets from stool
US8993341B2 (en) 2011-05-12 2015-03-31 Exact Sciences Corporation Removal of PCR inhibitors
CA2840528C (en) * 2011-06-27 2018-07-17 Flir Systems, Inc. Method, kit and composition for segregating target nucleic acid from mixed nucleic acid samples
EP3269820A1 (en) 2011-12-22 2018-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Kit for the amplification of a sequence from a ribonucleic acid
EP3757210B1 (en) 2012-03-02 2022-08-24 Sequenom, Inc. Methods for enriching cancer nucleic acid from a biological sample
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
US20140093873A1 (en) 2012-07-13 2014-04-03 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US9212392B2 (en) 2012-09-25 2015-12-15 Exact Sciences Corporation Normalization of polymerase activity
US9896728B2 (en) 2013-01-29 2018-02-20 Arcticrx Ltd. Method for determining a therapeutic approach for the treatment of age-related macular degeneration (AMD)
EP3597774A1 (en) 2013-03-13 2020-01-22 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
EP4234721A3 (en) 2013-03-14 2023-10-18 Mayo Foundation for Medical Education and Research Detecting neoplasm
AU2014321355B2 (en) 2013-09-20 2019-10-10 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for the analysis of radiosensitivity
US10253358B2 (en) 2013-11-04 2019-04-09 Exact Sciences Development Company, Llc Multiple-control calibrators for DNA quantitation
WO2015089438A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Northwestern University Biomarkers for post-traumatic stress states
WO2015095689A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Exact Sciences Corporation Synthetic nucleic acid control molecules
US11365447B2 (en) 2014-03-13 2022-06-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2016094813A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Exact Sciences Corporation Compositions and methods for performing methylation detection assays
CN113897432A (zh) 2014-12-12 2022-01-07 精密科学公司 用于进行甲基化检测测定的组合物和方法
US10435755B2 (en) 2015-03-27 2019-10-08 Exact Sciences Development Company, Llc Detecting esophageal disorders
CA3233310A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Exact Sciences Development Company, Llc Multiplex amplification detection assay and isolation and detection of dna from plasma
US20170321286A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Exact Sciences Corporation Detection of lung neoplasia by amplification of rna sequences
CN116064796A (zh) 2016-05-05 2023-05-05 精密科学公司 通过分析甲基化dna来检测肺肿瘤
ES2963227T3 (es) 2016-07-19 2024-03-26 Exact Sciences Corp Moléculas de control de ácido nucleico de organismos no humanos
CA3029842A1 (en) 2016-07-19 2018-01-25 Exact Sciences Development Company, Llc Methylated control dna
CA3034903A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting hepatocellular carcinoma
EP3519554A4 (en) 2016-09-30 2020-05-20 The Governing Council Of The University Of Toronto SYSTEM FOR IDENTIFYING AND TARGETING CELLS IN A HETEROGENIC POPULATION FOR SELECTIVE EXTRACTION OF CELL CONTENT
EP3574110A4 (en) 2017-01-27 2021-01-13 Exact Sciences Development Company, LLC DETECTION OF COLUMN NEOPLASIA BY ANALYSIS OF METHYLATED DNA
US10648025B2 (en) 2017-12-13 2020-05-12 Exact Sciences Development Company, Llc Multiplex amplification detection assay II
US11230731B2 (en) 2018-04-02 2022-01-25 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
US11408030B2 (en) 2018-09-10 2022-08-09 Andy Madrid Test for detecting Alzheimer's disease
KR20210111254A (ko) 2018-11-30 2021-09-10 캐리스 엠피아이, 아이엔씨. 차세대 분자 프로파일링
WO2020206170A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
WO2021087275A1 (en) 2019-10-31 2021-05-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting ovarian cancer
WO2021112918A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Caris Mpi, Inc. Pan-cancer platinum response predictor
US20230357852A1 (en) 2020-08-19 2023-11-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting non-hodgkin lymphoma
AU2021345359A1 (en) 2020-09-21 2023-05-11 Progenity, Inc. Compositions and methods for isolation of cell-free dna
EP4314286A1 (en) 2021-08-06 2024-02-07 Sansure Biotech Inc. Compositions for liquefying a viscous biological sample, combination products, liquefying agents, and kits thereof, and methods and application thereof

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5217863A (en) * 1988-02-04 1993-06-08 Medical Research Council Detection of mutations in nucleic acids
AU3539089A (en) * 1988-04-08 1989-11-03 Salk Institute For Biological Studies, The Ligase-based amplification method
US5459039A (en) * 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
EP0596028B1 (en) * 1991-07-19 1997-04-02 Upstate Biotechnology, Inc. Method for detection of mutations
WO1993020233A1 (en) * 1992-03-27 1993-10-14 University Of Maryland At Baltimore Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes
US5851770A (en) * 1994-04-25 1998-12-22 Variagenics, Inc. Detection of mismatches by resolvase cleavage using a magnetic bead support
EP0760002B1 (en) * 1994-04-25 2003-08-27 Avitech Diagnostics, Inc. Detection of mutation by resolvase cleavage
WO1996035809A1 (en) * 1995-05-11 1996-11-14 Avitech Diagnostics Inc Detection of mismatches by resolvase cleavage on a solid support
US5824471A (en) * 1995-06-05 1998-10-20 Brigham And Women's Hospital Detection of mismatches by cleavage of nucleic acid heteroduplexes
US5571676A (en) * 1995-06-07 1996-11-05 Ig Laboratories, Inc. Method for mismatch-directed in vitro DNA sequencing
AU6886296A (en) * 1995-09-08 1997-03-27 University Of Dundee, The Dna structure-specific nucleases
US6027898A (en) * 1997-08-18 2000-02-22 Transgenomic, Inc. Chromatographic method for mutation detection using mutation site specifically acting enzymes and chemicals
DE19757144A1 (de) * 1997-12-20 1999-06-24 Boerries Prof Dr Rer Na Kemper Dualer enzymatischer Test zum Nachweis von Mutationen in DNA beliebiger Herkunft durch Endonuklease VII

Also Published As

Publication number Publication date
EP1053352B1 (en) 2002-09-18
AU753273B2 (en) 2002-10-10
ATE224458T1 (de) 2002-10-15
AU2482899A (en) 1999-08-23
DE69902996T2 (de) 2003-04-30
US6110684A (en) 2000-08-29
EP1053352A1 (en) 2000-11-22
CA2319712A1 (en) 1999-08-12
WO1999040222A1 (en) 1999-08-12
DE69902996D1 (de) 2002-10-24
EP1053352A4 (en) 2001-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6110684A (en) Mismatch detection techniques
AU711836B2 (en) Detection of mismatches by resolvase cleavage using a magnetic bead support
EP0760002B1 (en) Detection of mutation by resolvase cleavage
JP3421036B2 (ja) Ｄｎａ配列の解析のための化学的方法
AU697642B2 (en) High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
US6027877A (en) Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, purification of amplified DNA samples and allele identification
AU656514B2 (en) Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
AU599083B2 (en) Detection of microorganisms in a nucleic acid containing sample
US5972618A (en) Detection of mutations in nucleic acids by chemical cleavage
WO1997009444A9 (en) Detection of mismatches by resolvase cleavage using a magnetic bead support
JP4481491B2 (ja) 核酸の検出方法
EP0843736B1 (en) Detection of mismatches by resolvase cleavage on a solid support
AU716070B2 (en) Detection of mutation by resolvase cleavage
Hernández-Neuta et al. Application of Padlock and Selector Probes in Molecular Medicine
Bayer et al. In Situ Hybridization

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20050418

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20051208

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20060210

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20060213