JPS60110299A - ｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝子プロ−ブを用いる核酸ハイブリダイゼ−シヨンによる細菌の検出方法 - Google Patents
ｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝子プロ−ブを用いる核酸ハイブリダイゼ−シヨンによる細菌の検出方法Info
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- JPS60110299A JPS60110299A JP59164735A JP16473584A JPS60110299A JP S60110299 A JPS60110299 A JP S60110299A JP 59164735 A JP59164735 A JP 59164735A JP 16473584 A JP16473584 A JP 16473584A JP S60110299 A JPS60110299 A JP S60110299A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１、発明の分野
本発明は、試験試料に含まれる一細菌の存在を検出する
分析方法及び試験手段に関するものであり、さらに詳し
くは、診断を助ける目的で、例えば、尿や血液等ヒト体
液の分析を行ったり、あるいは、汚染を検出するために
食品の試験を行うような健康上の問題に関する領域にお
ける、試験試料中の細菌の存在を検出するための分析方
法及び試験手段に関するものである。
分析方法及び試験手段に関するものであり、さらに詳し
くは、診断を助ける目的で、例えば、尿や血液等ヒト体
液の分析を行ったり、あるいは、汚染を検出するために
食品の試験を行うような健康上の問題に関する領域にお
ける、試験試料中の細菌の存在を検出するための分析方
法及び試験手段に関するものである。
２、 先行、技術の説明
試験試料中の細菌を検出する古典的方法においては、存
在する細菌の細胞数を拡大して、計数できる観察可能な
コロニーに成長させるために試料を培養する。この培養
物は、必要なら、抗菌活性に対する感受性を測定し、特
定の種であることを同定するために、他の試験に付すこ
とも可能である。細菌の培養法には特に手間がかかり、
熟練した技能者を必要とする。陽性もしくは陰性の結果
が確実に判定できるまでには、通常、２４〜４８時間の
インキュベーションが必要である。培養法の他の制約は
、試料を実験室へ輸送し、そこでの処理の間、に、該供
試試料中の細菌を生かしておく必要があるということで
ある。従来の培養法の多くの欠点を克服する方法を案出
するために、広範な各種の技術が、絶ゆまぬ努力で検討
され開発されて来ている。臨床試料中の細菌を検出する
ために光学顕微鏡が多用されている。検出限界を改良し
、存在する微生物の同定を助けるために、通常、試料は
染色される。しかしながら、この方法は、労力を要し、
良好な検出限界を与えない。免疫学的方法が開発され、
特異抗体との結合により識別出来る表面抗体を有する特
定種、属の検出に成功している。しかし、このような方
法は、血液あるいは尿などの体液などのソースからの共
通の表面抗原を与えないような広範な種屈からの細菌を
含有する試験試料中の細菌の定量には実用的ではない。
在する細菌の細胞数を拡大して、計数できる観察可能な
コロニーに成長させるために試料を培養する。この培養
物は、必要なら、抗菌活性に対する感受性を測定し、特
定の種であることを同定するために、他の試験に付すこ
とも可能である。細菌の培養法には特に手間がかかり、
熟練した技能者を必要とする。陽性もしくは陰性の結果
が確実に判定できるまでには、通常、２４〜４８時間の
インキュベーションが必要である。培養法の他の制約は
、試料を実験室へ輸送し、そこでの処理の間、に、該供
試試料中の細菌を生かしておく必要があるということで
ある。従来の培養法の多くの欠点を克服する方法を案出
するために、広範な各種の技術が、絶ゆまぬ努力で検討
され開発されて来ている。臨床試料中の細菌を検出する
ために光学顕微鏡が多用されている。検出限界を改良し
、存在する微生物の同定を助けるために、通常、試料は
染色される。しかしながら、この方法は、労力を要し、
良好な検出限界を与えない。免疫学的方法が開発され、
特異抗体との結合により識別出来る表面抗体を有する特
定種、属の検出に成功している。しかし、このような方
法は、血液あるいは尿などの体液などのソースからの共
通の表面抗原を与えないような広範な種屈からの細菌を
含有する試験試料中の細菌の定量には実用的ではない。
亜硝酸塩などの細菌の代謝産物やアデノシン三リン酸な
どのヌクレオチド、Ｃ標識化グルコースからのＺ４ｃｏ
、、及び特異酵素の検出に基づく、他の試験法も開発さ
れている。これ等の方法には、欠点が多く、例えば、試
験試料中の酵素によりＡＴＰが分解されうろこと、ホス
トの組織などの非細菌源からＡＴＰが由来しうろこと、
放射性物質がバイオハザード（生物学的危険）を与える
こと、又類似活性を有する酵素がホストから生じうるな
どの問題が淫げられる。
どのヌクレオチド、Ｃ標識化グルコースからのＺ４ｃｏ
、、及び特異酵素の検出に基づく、他の試験法も開発さ
れている。これ等の方法には、欠点が多く、例えば、試
験試料中の酵素によりＡＴＰが分解されうろこと、ホス
トの組織などの非細菌源からＡＴＰが由来しうろこと、
放射性物質がバイオハザード（生物学的危険）を与える
こと、又類似活性を有する酵素がホストから生じうるな
どの問題が淫げられる。
粒子計舷装置も細菌の検出に用いられている。
このような装置は、小さなオリアイスを流れる液体中に
粒子が存在することによって惹起されるオリフィスを横
切る電流の乱れを測定するものである。この方法は、複
雑で高価な装置を必要とするうえに、非特異的であり、
取シ扱いに十分な注意と粒子のない条件を必要とする。
粒子が存在することによって惹起されるオリフィスを横
切る電流の乱れを測定するものである。この方法は、複
雑で高価な装置を必要とするうえに、非特異的であり、
取シ扱いに十分な注意と粒子のない条件を必要とする。
他の形式の測定法によっても、特殊な液状培地中での細
菌の増殖が測定される。この場合の装置は定期的に濁度
の測定を行うが、濁度の増加は成長する細菌の存在を示
す。
菌の増殖が測定される。この場合の装置は定期的に濁度
の測定を行うが、濁度の増加は成長する細菌の存在を示
す。
従って、Ｐ０菌の存在をｉｔするだめの迅速で正踊、経
済的な方法と手段が多年にわたって、絶えず要望されて
来た。
済的な方法と手段が多年にわたって、絶えず要望されて
来た。
ラジオイムノアセイ、分光分析法、螢光分析法、微少側
熱法、及び電気化学的方法の発展によって代表されるよ
うな、近接分野における分析技術の急速な進歩にもかか
わらず、細菌学的試験に主として使用される方法は、依
然として平板培養法でを）シ、これは今日でもなお、パ
スツールや１９世世紀側の微生物学者により用いられた
ものと殆んど同じである。現代医学の要求は、微生物を
検出するための、培養法に代る他の方法の１発によって
満たされることが微生物学における従来技術に関する最
近の解析から結論されている（ Ｎａｔｕｒｅ３０２
（１９８３） ｐ、 ＸＸＶＩ ）。
熱法、及び電気化学的方法の発展によって代表されるよ
うな、近接分野における分析技術の急速な進歩にもかか
わらず、細菌学的試験に主として使用される方法は、依
然として平板培養法でを）シ、これは今日でもなお、パ
スツールや１９世世紀側の微生物学者により用いられた
ものと殆んど同じである。現代医学の要求は、微生物を
検出するための、培養法に代る他の方法の１発によって
満たされることが微生物学における従来技術に関する最
近の解析から結論されている（ Ｎａｔｕｒｅ３０２
（１９８３） ｐ、 ＸＸＶＩ ）。
１９６４年にニガード（Ｎｙｇａａｒｄ ）とホール（
）（ａｌｌ）は、Ｊ、ＭＯｌ、Ｂｉｏｌ、 ９ ： １
２５−１４２（１９６４）において、試料をニトロセル
ロース薄膜により濾過してＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド
を定量的に検出する方法を報告している。彼等は、１本
鎖ＤＮＡは 。
）（ａｌｌ）は、Ｊ、ＭＯｌ、Ｂｉｏｌ、 ９ ： １
２５−１４２（１９６４）において、試料をニトロセル
ロース薄膜により濾過してＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド
を定量的に検出する方法を報告している。彼等は、１本
鎖ＤＮＡは 。
膜に吸着するが、二本鎖（相補的な）ＤＮＡ 、及び一
本鎖又は二本鎖ＲＮＡは膜を通過することを見出してい
る。一本鎖の試料ＤＮＡと放射性標識ＲＮＡ を溶液中
でインキュベートすると、放射性標識ＲＮＡと試料中の
相補的なりＮＡ鎖間でノ・イブリダイゼーション結合が
起った。次に、この反応混合物はニトロセルロースフィ
ルタを通過せしめられた。雑種分子形成を行わない（）
・イブリダイスされない）標識ＲＮＡは通過したが、Ｄ
ＮＡ−ＲＮＡ ノ・イブリッドは、フィルターに固着す
るに充分な一本鎖ＤＮＡ領域を有するものであった。
本鎖又は二本鎖ＲＮＡは膜を通過することを見出してい
る。一本鎖の試料ＤＮＡと放射性標識ＲＮＡ を溶液中
でインキュベートすると、放射性標識ＲＮＡと試料中の
相補的なりＮＡ鎖間でノ・イブリダイゼーション結合が
起った。次に、この反応混合物はニトロセルロースフィ
ルタを通過せしめられた。雑種分子形成を行わない（）
・イブリダイスされない）標識ＲＮＡは通過したが、Ｄ
ＮＡ−ＲＮＡ ノ・イブリッドは、フィルターに固着す
るに充分な一本鎖ＤＮＡ領域を有するものであった。
フィルターに結合した放射能の測定により形成されたハ
イブリッド量が評価された。
イブリッド量が評価された。
この核酸ハイブリダイゼーション法に端を発して他の改
良法が開発され、特定の種々の分析への応用がなされた
。ギレスピー（Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ ）とシュビーゲ／
ｌ／ ７７ （Ｓｐｉａｇｅｌｍａｎ） （Ｊ９Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ。
良法が開発され、特定の種々の分析への応用がなされた
。ギレスピー（Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ ）とシュビーゲ／
ｌ／ ７７ （Ｓｐｉａｇｅｌｍａｎ） （Ｊ９Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ。
１２： ８２９−８４３（１９６５））はニトロセルロ
ースフィルター上に一本鎖ＤＮＡ試料を固定し、このフ
ィルターを放射性標識化ＲＮＡの溶液に浸漬しノ・イプ
リダイゼーションを起こさせた。過剰の標識化ＲＮＡは
、ＲＮａｓｅ処理と洗浄によシ除去された。
ースフィルター上に一本鎖ＤＮＡ試料を固定し、このフ
ィルターを放射性標識化ＲＮＡの溶液に浸漬しノ・イプ
リダイゼーションを起こさせた。過剰の標識化ＲＮＡは
、ＲＮａｓｅ処理と洗浄によシ除去された。
薄膜フィルタを用いたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼー
ション法は、ｆンハル） （Ｄｅｎｈａｒｄｔ ） Ｊ
／Ｃヨって発展せしめられた［ Ｂｉｏｏｈｉｍ、 Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、 Ｒ（１Ｂ。
ション法は、ｆンハル） （Ｄｅｎｈａｒｄｔ ） Ｊ
／Ｃヨって発展せしめられた［ Ｂｉｏｏｈｉｍ、 Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、 Ｒ（１Ｂ。
Ｃｏｍｔｎｕｎ、 ２３：６４１−６４６（１９６６）
）。１重鎖試料Ｄ−ＮＡ をニトロセル口、−スに結合
させ、予備（前）ハイブリダイゼーション溶液で処理し
、ノ・イブリダイゼーション反応中のラベルされたプロ
ーブＤＮＡ の非特異的結合を最小にした。グルンシュ
タイン（ＱｒｕｎｓＬｅｉｎ ）とホグネス（Ｈｏｇｎ
ｅｓｓ ） （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃ１ｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７２：３９６１−３９６５（１９７
５））はＥ、 ａｏｌｉ （大腸菌）コロニーを迅速に
スクリーニングする固相コロニーハイブリダイゼーショ
ン法を開発し、どれが挿入したＤＮＡ配列を含むかを決
定した。固体支持体に核酸を固定する方法も、ＲＮＡと
短鎖ＤＮＡフラグメントを含むように改良された。開発
されたこの方法紘化学的に反Ｉ応”性の基を含有する紙
を使用するもので（Ａｌｗｉｎｅ等、ｐｒｏｅ、 Ｎａ
ｔｆ、 Ａｃａｄ、３ｏｉ、 ＵＳＡ７４：４３５０（
１９７７）、５ｅｅｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡａｉｄａＲ
ｏｓ、 １０：１９７９（１９８２）、及びｌ（ｕｎｇ
ｏｒ、 ｇｉｏｃｈ。
）。１重鎖試料Ｄ−ＮＡ をニトロセル口、−スに結合
させ、予備（前）ハイブリダイゼーション溶液で処理し
、ノ・イブリダイゼーション反応中のラベルされたプロ
ーブＤＮＡ の非特異的結合を最小にした。グルンシュ
タイン（ＱｒｕｎｓＬｅｉｎ ）とホグネス（Ｈｏｇｎ
ｅｓｓ ） （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｔ、 Ａｃ１ｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７２：３９６１−３９６５（１９７
５））はＥ、 ａｏｌｉ （大腸菌）コロニーを迅速に
スクリーニングする固相コロニーハイブリダイゼーショ
ン法を開発し、どれが挿入したＤＮＡ配列を含むかを決
定した。固体支持体に核酸を固定する方法も、ＲＮＡと
短鎖ＤＮＡフラグメントを含むように改良された。開発
されたこの方法紘化学的に反Ｉ応”性の基を含有する紙
を使用するもので（Ａｌｗｉｎｅ等、ｐｒｏｅ、 Ｎａ
ｔｆ、 Ａｃａｄ、３ｏｉ、 ＵＳＡ７４：４３５０（
１９７７）、５ｅｅｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡａｉｄａＲ
ｏｓ、 １０：１９７９（１９８２）、及びｌ（ｕｎｇ
ｏｒ、 ｇｉｏｃｈ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＡｃＬａ ６５３：３４４（１９８
１）） 、又、ニトロセルロースに固定する前に核酸を
誘導体にするものである（ Ｔｈｏｍａｓ、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ３ｃｉ。
１）） 、又、ニトロセルロースに固定する前に核酸を
誘導体にするものである（ Ｔｈｏｍａｓ、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ３ｃｉ。
ＵＳＡ ７７：５２０１（１９８０））。
多くの疾患のために核酸ハイブリダイゼーション法が開
発された。即ち、遺伝子病として知られるα−サラセミ
ア（Ｋａｎ等、Ｎｏｗ Ｅｎｇ、 Ｊ、 Ｍｏｄ。
発された。即ち、遺伝子病として知られるα−サラセミ
ア（Ｋａｎ等、Ｎｏｗ Ｅｎｇ、 Ｊ、 Ｍｏｄ。
２９５：１１６５（１９７６）〕、〕β−ザラセミア
０ｒｋｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：６２７（１９８
２）］及び鎌状状赤血球貧血症 ）（ａｎ及びｌ）ｏｇ
ｙ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、５ｃｉＵＳ
Ａ ７５：５６３１（１９７８）、Ｇｅａｖｅｒ等、１
ｂｉｄ７８：５０８１（１９８１”ｌ、Ｗ ｉ ｌ ｓ
ｏ ｎ等、１ｂｉｄ ７９ ：３６２８（１９８２）
及びＣｏｎｎａｒ等、１ｂｉｄ ８０：２７８（１９８
３）〕などが挙けられる。感染因子の有無の試験に核酸
ハイブリダイゼーションを用いる報告もなされている。
０ｒｋｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：６２７（１９８
２）］及び鎌状状赤血球貧血症 ）（ａｎ及びｌ）ｏｇ
ｙ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、５ｃｉＵＳ
Ａ ７５：５６３１（１９７８）、Ｇｅａｖｅｒ等、１
ｂｉｄ７８：５０８１（１９８１”ｌ、Ｗ ｉ ｌ ｓ
ｏ ｎ等、１ｂｉｄ ７９ ：３６２８（１９８２）
及びＣｏｎｎａｒ等、１ｂｉｄ ８０：２７８（１９８
３）〕などが挙けられる。感染因子の有無の試験に核酸
ハイブリダイゼーションを用いる報告もなされている。
これ等の報告には、糞便試料中のエンテロトキシン産生
細菌を試験する方法がある（Ｍｏａｅｌｅｙ等、Ｊ、
Ｉｎｆｅｏｔ、Ｄｉｓ、 ４２：８９２（（１９８０，
）、１ｂｉｄ １４５：５６３（１９８２）、及び米国
特許第４，３５８，５３５号〕。更に、パスツール研究
所（１ｎａｔｉｔｕＬ Ｐａ８もｅｕｒ）、英国特許第
２，０１９，４０８−Ｂも参照さ詐たい。血清中の肝炎
ウィルスもハイブリダイゼーション法によシ検出されて
いる〔５ｏｈｎｒｒｉＬｚ等、Ｐｒｏｏ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 ３ｃｉ、 ＵＳＡ７９：５６７５（１９
８２）及びＢｅｍｉｎｇｅｒ等、Ｊ、 Ｍａｄ。
細菌を試験する方法がある（Ｍｏａｅｌｅｙ等、Ｊ、
Ｉｎｆｅｏｔ、Ｄｉｓ、 ４２：８９２（（１９８０，
）、１ｂｉｄ １４５：５６３（１９８２）、及び米国
特許第４，３５８，５３５号〕。更に、パスツール研究
所（１ｎａｔｉｔｕＬ Ｐａ８もｅｕｒ）、英国特許第
２，０１９，４０８−Ｂも参照さ詐たい。血清中の肝炎
ウィルスもハイブリダイゼーション法によシ検出されて
いる〔５ｏｈｎｒｒｉＬｚ等、Ｐｒｏｏ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 ３ｃｉ、 ＵＳＡ７９：５６７５（１９
８２）及びＢｅｍｉｎｇｅｒ等、Ｊ、 Ｍａｄ。
Ｖｉｒｏｌ、 ９：５７（１９８２）：ｌ。
異なった細菌からの変性されフラグメント化された１本
鎖ＤＮＡ間の核酸ハイブリダイゼーションに基づく各種
細菌の属の関係についてのいくつかの研究が報告されて
いる（ Ｂｒａｎｎｅｒ、 Ｔｈｅ ｐｕｂ−１ｉｅ
Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎ ｐｕｂｌ、 Ｔｎｅ、。
鎖ＤＮＡ間の核酸ハイブリダイゼーションに基づく各種
細菌の属の関係についてのいくつかの研究が報告されて
いる（ Ｂｒａｎｎｅｒ、 Ｔｈｅ ｐｕｂ−１ｉｅ
Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎ ｐｕｂｌ、 Ｔｎｅ、。
Ｖｏｌ、 ３２（１９７４） ｐｐ、 １１Ｂ−１３０
：及びＢｒｅｎｎｅｒとｐｐ−ｊｋｏｗによるレビュー
、Ａｄｖ、 ｉｎ Ｇａｎ６ｔｉｏｎ１６：８ｌ−１１
９（１９７２））。リポソームＲＮＡ 、リポソーム蛋
白質、転移ＲＮＡ等のような種々の生成物をコードする
細菌ゲノムＤＮＡの保存の問題も検討対されている（
Ｂｉｏｐｈｙ８． Ｊ、 ８：１１０５ １１１ｇ （
１９６８）： ＰＮＡＳ ７６：３’８］−３８５（１
９７９）：Ｊ、Ｂａｃｔ。
：及びＢｒｅｎｎｅｒとｐｐ−ｊｋｏｗによるレビュー
、Ａｄｖ、 ｉｎ Ｇａｎ６ｔｉｏｎ１６：８ｌ−１１
９（１９７２））。リポソームＲＮＡ 、リポソーム蛋
白質、転移ＲＮＡ等のような種々の生成物をコードする
細菌ゲノムＤＮＡの保存の問題も検討対されている（
Ｂｉｏｐｈｙ８． Ｊ、 ８：１１０５ １１１ｇ （
１９６８）： ＰＮＡＳ ７６：３’８］−３８５（１
９７９）：Ｊ、Ｂａｃｔ。
１３３：１０８９（１９７Ｂ）： Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、２５５ニア２８−７３４ （１９８０）：及びＪ
、 Ｂａｃｔ、 １２’ｌ：１４３５（１９７７））。
ｅｍ、２５５ニア２８−７３４ （１９８０）：及びＪ
、 Ｂａｃｔ、 １２’ｌ：１４３５（１９７７））。
ファイラー（Ｆｉｆｅｒ）等〔Ｅｕｒ、 Ｊ。
Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ、 １２０ ： ７９−７７ （１９
８１）、１は、成る原核生物の遺伝子、例えば、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ ｔｕｆ遺伝子に相同のＤＮＡ配列が、いくつか
の分類学的に無関係な秤々の属に存在することを報告し
ている。
８１）、１は、成る原核生物の遺伝子、例えば、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ ｔｕｆ遺伝子に相同のＤＮＡ配列が、いくつか
の分類学的に無関係な秤々の属に存在することを報告し
ている。
核酸ハイブリダイゼーション法は種々の試験試料中の、
特に体液など診断的に重要な媒体中の細菌の定量に適用
可能であることが判った。従って、この方法は問題とな
っている試験媒体、特に、血液又は尿など通常は無菌状
態の媒体中に細菌が有意量存在するか否かを決定する便
利なスクリーニングに験を与えるものである。
特に体液など診断的に重要な媒体中の細菌の定量に適用
可能であることが判った。従って、この方法は問題とな
っている試験媒体、特に、血液又は尿など通常は無菌状
態の媒体中に細菌が有意量存在するか否かを決定する便
利なスクリーニングに験を与えるものである。
供試試料は先ず、この中に存在する細菌から核酸を遊離
し、変性させる（１本鎖にする）条件に曝される、次に
、得られた１本鎖核酸は、適切な方法でポリヌクレオチ
ド・プローブと接触せしめられるが、このプローブは恐
らく供試試料中に存在すると思われる各種の個々の細菌
の＃丘は全てに含まれる核酸の少なくとも１つの塩基配
列に相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）の塩基配列を有する
。前記プローブと変性された試料核酸の接触はこのプロ
ーブと前記の各々の細菌の塩基配列のノ・イブリダイゼ
ーションが起こシ易い条件の下で行われる。次に、得ら
れたハイブリダイゼーションは供試試料中の細菌の存在
の程度の関数として決定される。
し、変性させる（１本鎖にする）条件に曝される、次に
、得られた１本鎖核酸は、適切な方法でポリヌクレオチ
ド・プローブと接触せしめられるが、このプローブは恐
らく供試試料中に存在すると思われる各種の個々の細菌
の＃丘は全てに含まれる核酸の少なくとも１つの塩基配
列に相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）の塩基配列を有する
。前記プローブと変性された試料核酸の接触はこのプロ
ーブと前記の各々の細菌の塩基配列のノ・イブリダイゼ
ーションが起こシ易い条件の下で行われる。次に、得ら
れたハイブリダイゼーションは供試試料中の細菌の存在
の程度の関数として決定される。
プローブの相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）の塩基配列の
長さは好ましくは、少なくとも約１０塩基、通常は少な
くとも２０塩基である。′このポリヌクレオチド・プロ
ーブの選択は、相同配列、おるいは複数個の相同配列に
ついての、供試試料中に含まれると予測される細菌の経
験的なスクリーニング又は保存された（ 、ｏｏｎｓｅ
ｒｎｅｄ ）もしくは実質的に保存された遺伝子の予め
定められた選択をはじめとする幾つかの方法で選択する
ことが出来る。
長さは好ましくは、少なくとも約１０塩基、通常は少な
くとも２０塩基である。′このポリヌクレオチド・プロ
ーブの選択は、相同配列、おるいは複数個の相同配列に
ついての、供試試料中に含まれると予測される細菌の経
験的なスクリーニング又は保存された（ 、ｏｏｎｓｅ
ｒｎｅｄ ）もしくは実質的に保存された遺伝子の予め
定められた選択をはじめとする幾つかの方法で選択する
ことが出来る。
最も具体的には、細菌を検出するための核酸ノ・イブリ
ダイゼーション法の最も有利な方法は、蛋白質の合成機
構中に含まれる核酸又は蛋白質の合成をコードする遺伝
子鎖の１つの少なくとも１部分を含むプローブを用いる
ことによって提供されることが見出されている。このよ
うな遺伝子の重要な例としては、転移ＲＮＡ、リポソー
ムＲＮＡ。
ダイゼーション法の最も有利な方法は、蛋白質の合成機
構中に含まれる核酸又は蛋白質の合成をコードする遺伝
子鎖の１つの少なくとも１部分を含むプローブを用いる
ことによって提供されることが見出されている。このよ
うな遺伝子の重要な例としては、転移ＲＮＡ、リポソー
ムＲＮＡ。
リポソーム蛋白質、アミノアシル−ｔ ＲＮＡ合成酵素
、開始因子、鎖伸長因子、及び開放因子をコードする遺
伝子が誉げられる。
、開始因子、鎖伸長因子、及び開放因子をコードする遺
伝子が誉げられる。
雑種分子を形成したプローブの検出はラベルした形のプ
ローブを用いる固相ハイブリダイゼーション法により達
成するのが好ましい。このラベル（標識）としては、放
射性同位元累、又は、螢光体、化学発光体もしくは直接
検出可能な成分（例えば、酵素や酵素基質、助因子又は
モジュレータ、螢光体、化学発光体）を包含した結合対
手（例えば抗体）に対して特異的な結合部位を形成する
分子（例えばハプテン）のような非放射性要素（成分）
のごとき便利で検出可能な部分（成分）であればいかな
るものであってもよい。
ローブを用いる固相ハイブリダイゼーション法により達
成するのが好ましい。このラベル（標識）としては、放
射性同位元累、又は、螢光体、化学発光体もしくは直接
検出可能な成分（例えば、酵素や酵素基質、助因子又は
モジュレータ、螢光体、化学発光体）を包含した結合対
手（例えば抗体）に対して特異的な結合部位を形成する
分子（例えばハプテン）のような非放射性要素（成分）
のごとき便利で検出可能な部分（成分）であればいかな
るものであってもよい。
細菌を検出するための本発明の方法は、従来技術、特に
古典的な培養法に比し、多くの利点を有している。本発
明方法においては、場合によっては強い感染因子となシ
得る被検出細菌を単離したり増殖させる必要がない。更
に、測定を行うために、成る代謝産物あるいは表面抗原
の発現に頼る必要がない。更に、本方法は、供試試料が
存在する細菌が生きた状態に保たれるように取り扱う必
要がない。従来の方法は、一般に、試料に含まれる生き
た細胞だけを検出するものである。微生物は、試験のた
めに実臆室に試料を輸送する最中に死んでしまう場合が
多い。更に、試料は、種々の生育上の制約や要件を有す
る異なった微生物を含有している可能性がある。従って
、先行技術の方法を用いた場合は、可能な細菌の存在の
検出を保証するため幾つかの異なった条件の下で試料を
培養しなければならない。このような厳しい制限は本発
明の方法では全く必要とされないが、これは試料中に存
在する安定な核酸成分が本試験法の目的だからである。
古典的な培養法に比し、多くの利点を有している。本発
明方法においては、場合によっては強い感染因子となシ
得る被検出細菌を単離したり増殖させる必要がない。更
に、測定を行うために、成る代謝産物あるいは表面抗原
の発現に頼る必要がない。更に、本方法は、供試試料が
存在する細菌が生きた状態に保たれるように取り扱う必
要がない。従来の方法は、一般に、試料に含まれる生き
た細胞だけを検出するものである。微生物は、試験のた
めに実臆室に試料を輸送する最中に死んでしまう場合が
多い。更に、試料は、種々の生育上の制約や要件を有す
る異なった微生物を含有している可能性がある。従って
、先行技術の方法を用いた場合は、可能な細菌の存在の
検出を保証するため幾つかの異なった条件の下で試料を
培養しなければならない。このような厳しい制限は本発
明の方法では全く必要とされないが、これは試料中に存
在する安定な核酸成分が本試験法の目的だからである。
分析手段としての核酸ハイブリダイゼーションの使用は
、基本的には、ＤＮＡの二本鎖相補構造に基づいている
。二本鎖ＤＮＡにおける各々の鎖のプリン及びピリミジ
ン塩基間の水嵩結合は可逆的に切断することができる。
、基本的には、ＤＮＡの二本鎖相補構造に基づいている
。二本鎖ＤＮＡにおける各々の鎖のプリン及びピリミジ
ン塩基間の水嵩結合は可逆的に切断することができる。
ＤＮＡの、この「融解」あるいは「変性」から生ずるＤ
ＮＡの２本の相補的−重鎖は相補的二重構造の再現を伴
う。（これは再アニーリングあるいは）−イプリダイゼ
ーションと呼ばれることが多い）。現在では公知のよう
に、適肖な溶液条件の下で２番目の一本鎖核酸に十分に
相補的な（即ち、２番目の核酸に相同の）塩基配列から
なる第１の一重鎖核１１１２（それがＤＮＡであろうと
ＲＮＡであろうと）の接触は、場合によって、ＤＮＡ／
ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡノ・イブ
リッドの形成をもたらす。
ＮＡの２本の相補的−重鎖は相補的二重構造の再現を伴
う。（これは再アニーリングあるいは）−イプリダイゼ
ーションと呼ばれることが多い）。現在では公知のよう
に、適肖な溶液条件の下で２番目の一本鎖核酸に十分に
相補的な（即ち、２番目の核酸に相同の）塩基配列から
なる第１の一重鎖核１１１２（それがＤＮＡであろうと
ＲＮＡであろうと）の接触は、場合によって、ＤＮＡ／
ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡノ・イブ
リッドの形成をもたらす。
本発明によれば、ポリヌクレオチド（通常、−重鎖ＤＮ
ＡもしくはＲＮＡ）は、これが問題のほぼ全ての細菌に
見出される塩基配列と相同の、即ち、十分に相補的な塩
基配列からな□るということに基づいた分析試薬として
選択される。従って、このポリヌクレオチド−プローブ
と供試試料からの一本鎖形態で遊離された核酸との間の
ノ・イブリダイゼーションは試料中の細菌の存在−を示
すもの−である。
ＡもしくはＲＮＡ）は、これが問題のほぼ全ての細菌に
見出される塩基配列と相同の、即ち、十分に相補的な塩
基配列からな□るということに基づいた分析試薬として
選択される。従って、このポリヌクレオチド−プローブ
と供試試料からの一本鎖形態で遊離された核酸との間の
ノ・イブリダイゼーションは試料中の細菌の存在−を示
すもの−である。
本発明は、主として、ハイブリダイゼーション源として
、細菌、特に、Ｅ、ｃｏｌｉ中のｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝
子の選択に基づいている。このｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝子
は、それぞれ、細菌細胞における蛋白質合成の翻訳過程
に関与する、ＥＦ−Ｔｕ及びＥＦ−Ｇ伸長因子の合成を
コードしている。一般に、伸長因子は、リポソームの入
部位へのアミノアシル−ｔＲＮＡの移入を取シ持つ。こ
のＥＦ−Ｔｕ蛋白質はグアニンヌクレオチド（ＧＴＰ）
を有しておシ、この複合体は、アミノアシル−ｔＲＮＡ
と結合する。ＥＦ−Ｔｕは、分子量約４３．００’Ｏの
、３９３個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖から々ると
考えられているＯＥ、 ｃｏｌｉには、ＥＦ−Ｔｕをコ
ードする二つの遺伝子、ｔｕｆ Ａ及びｔｕｆ Ｂが存
在する。一つの細胞当シ、平均で約７０，０００分子の
Ｅ Ｆ −Ｔｕがあり、それらは、全蛋白質の５％にあ
たシ、Ｅ、 ｃｏｌｉに於ける主要蛋白質となっている
。
、細菌、特に、Ｅ、ｃｏｌｉ中のｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝
子の選択に基づいている。このｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝子
は、それぞれ、細菌細胞における蛋白質合成の翻訳過程
に関与する、ＥＦ−Ｔｕ及びＥＦ−Ｇ伸長因子の合成を
コードしている。一般に、伸長因子は、リポソームの入
部位へのアミノアシル−ｔＲＮＡの移入を取シ持つ。こ
のＥＦ−Ｔｕ蛋白質はグアニンヌクレオチド（ＧＴＰ）
を有しておシ、この複合体は、アミノアシル−ｔＲＮＡ
と結合する。ＥＦ−Ｔｕは、分子量約４３．００’Ｏの
、３９３個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖から々ると
考えられているＯＥ、 ｃｏｌｉには、ＥＦ−Ｔｕをコ
ードする二つの遺伝子、ｔｕｆ Ａ及びｔｕｆ Ｂが存
在する。一つの細胞当シ、平均で約７０，０００分子の
Ｅ Ｆ −Ｔｕがあり、それらは、全蛋白質の５％にあ
たシ、Ｅ、 ｃｏｌｉに於ける主要蛋白質となっている
。
このｔｕｆ遺伝子は、約１２００個の塩基対からなると
考えられている。Ｅ、 ｃｏｌｉにおいては、ｉｔｒオ
ペロンは、ＥＦ−Ｇに対するｆｕｓ遺伝子及びＥＦ−Ｔ
ｕに対するｔｕｆ Ａ遺伝子の両者を含むと共に、リボ
ンーム蛋白質Ｓ７及び８１２に対する遺伝子を含む。Ｋ
ｐｎ （Ｋ）及びＥｃｏ Ｒ１（Ｂ）制限酵素部位によ
って輪郭づけられたＥ、 ｃｏｌｉ ｔｕｆ Ａ遺伝子
の、約８００塩基対（ｂｐ）から寿るフラグメントを用
いることが好ましい。ｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝子フラグメ
ントをクローニングする有用な技術は、ジャスフナス（
Ｊａｓｋｕｎａｓ ）らによって、Ｎａｔｕｒａ ２５
７ ：４５８−４６２（１９７５）に記載されている〇
一旦、所望のプローブ配列が単離されるか、あるいは、
よシ有用なことであルカ、そレカ、ｐＢＲ３２２、ｐＨ
Ｖ３３、ｐＵＢｌｌｏ、Ｌａｍｂｄａ及びそれらの誘導
体並びにｐＹＩＰ１２のような適当なベクター中でクロ
ーニンニゲされると、それは、直接、ノ・イブリダイゼ
ーションによる試験に用いることができる０ 核酸再会合の程度と特異性は次のものによって影響を受
ける。
考えられている。Ｅ、 ｃｏｌｉにおいては、ｉｔｒオ
ペロンは、ＥＦ−Ｇに対するｆｕｓ遺伝子及びＥＦ−Ｔ
ｕに対するｔｕｆ Ａ遺伝子の両者を含むと共に、リボ
ンーム蛋白質Ｓ７及び８１２に対する遺伝子を含む。Ｋ
ｐｎ （Ｋ）及びＥｃｏ Ｒ１（Ｂ）制限酵素部位によ
って輪郭づけられたＥ、 ｃｏｌｉ ｔｕｆ Ａ遺伝子
の、約８００塩基対（ｂｐ）から寿るフラグメントを用
いることが好ましい。ｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝子フラグメ
ントをクローニングする有用な技術は、ジャスフナス（
Ｊａｓｋｕｎａｓ ）らによって、Ｎａｔｕｒａ ２５
７ ：４５８−４６２（１９７５）に記載されている〇
一旦、所望のプローブ配列が単離されるか、あるいは、
よシ有用なことであルカ、そレカ、ｐＢＲ３２２、ｐＨ
Ｖ３３、ｐＵＢｌｌｏ、Ｌａｍｂｄａ及びそれらの誘導
体並びにｐＹＩＰ１２のような適当なベクター中でクロ
ーニンニゲされると、それは、直接、ノ・イブリダイゼ
ーションによる試験に用いることができる０ 核酸再会合の程度と特異性は次のものによって影響を受
ける。
１、核酸試料の純度。
２、 プローブの塩基組成。
ここで、Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔ塩基対より大きい熱安
定性を示す。従ってＧ−Ｃ含量が高いノ・イブリダイゼ
ーショｙは高温で安定である。
定性を示す。従ってＧ−Ｃ含量が高いノ・イブリダイゼ
ーショｙは高温で安定である。
３、相同塩基配列の長さ。
塩基配列が短い（例えば、６垣基以下）ものは多くの核
酸に高い確率で存在する。従って、かかる短いシーケン
スが係るハイブリダイゼーションでは殆んど、あるいは
如伺なる特異性も得られない。本発明の′相同プローブ
配列は少なくとも１０塩基、通常は２０塩基以上、好ま
しくは１００塩基以上である。実用的観点からは、相同
プローブ配列は、３００〜１０００ヌクレオチドの間で
用いられることが多い。
酸に高い確率で存在する。従って、かかる短いシーケン
スが係るハイブリダイゼーションでは殆んど、あるいは
如伺なる特異性も得られない。本発明の′相同プローブ
配列は少なくとも１０塩基、通常は２０塩基以上、好ま
しくは１００塩基以上である。実用的観点からは、相同
プローブ配列は、３００〜１０００ヌクレオチドの間で
用いられることが多い。
４、 イオン強度。
再アニーリンク速度ハ、インキュベーション溶液のイオ
ン強度の増加に従って増加する。ハイブリッドの熱安定
性も増加する。
ン強度の増加に従って増加する。ハイブリッドの熱安定
性も増加する。
５、 インキュベーション温度。
所与の相補鎖に対する融解温度（Ｔｍ）以下の約２５〜
３０℃の温度で最適再アニーリングが起きる。インキュ
ベーション温度が最適温度より十分低いと、関係する塩
基配列のノ・イブリダイゼーションは、起とシ難くなる
。
３０℃の温度で最適再アニーリングが起きる。インキュ
ベーション温度が最適温度より十分低いと、関係する塩
基配列のノ・イブリダイゼーションは、起とシ難くなる
。
６、 核酸濃度とインキュベーション時間。
通常は、ハイブリダイゼーションへの反応全促進するた
めに、ハイブリダイゼーション可能な試料核酸或いはプ
ローブ核酸の１つは過剰に存在せしめるが、通常は１０
０倍あるいはそれ以上の過剰である。
めに、ハイブリダイゼーション可能な試料核酸或いはプ
ローブ核酸の１つは過剰に存在せしめるが、通常は１０
０倍あるいはそれ以上の過剰である。
７、変性試薬
ホルムアルデヒドや尿素などの水素結合切断試薬の存在
はハイブリダイゼーションの厳密性を高める。
はハイブリダイゼーションの厳密性を高める。
８、 インキュベーション時間。
インキュベーション時間が長い程ハイブリダイゼーショ
ンが完全になる。通常は、インキュベーション時間は、
６〜２４時間の間にある。
ンが完全になる。通常は、インキュベーション時間は、
６〜２４時間の間にある。
９、体積排除試薬。
デキストランやデキス）シン硫酸により例示されるこれ
らの試薬の存在は、ハイブリダイゼーション要素の濃度
を有効に増加させ、これにより、生じるハイブリダイゼ
ーションの速度を増加させる。
らの試薬の存在は、ハイブリダイゼーション要素の濃度
を有効に増加させ、これにより、生じるハイブリダイゼ
ーションの速度を増加させる。
上記の基準及び従来から公知の関連因子に基づいて、プ
ローブと変性核酸試料との接触がハイブリダイゼーショ
ンに好ましい条件の下で達成されることになる。条件が
より厳しくなるに従って、プローブハイブリッドの形成
にはより十分な相補性が要求される。低塩濃度、高温度
のハイブリダイゼーション濃度はアニーリングの厳密性
を増加させる。ハイブリダイゼーションに対する最も良
く用いられる条件の１つは６５℃における２×ＳＳｃ
（ＩＸＳＳＣ＝Ｏ１１５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、ｆ！１７．０ ）中の場合に
与えられる。かかる条件の下では、一般に、ハイブリダ
イゼーションは少なくとも約１５〜２０個の連続した、
正確に整合された塩基対をプローブ内に必″要とする。
ローブと変性核酸試料との接触がハイブリダイゼーショ
ンに好ましい条件の下で達成されることになる。条件が
より厳しくなるに従って、プローブハイブリッドの形成
にはより十分な相補性が要求される。低塩濃度、高温度
のハイブリダイゼーション濃度はアニーリングの厳密性
を増加させる。ハイブリダイゼーションに対する最も良
く用いられる条件の１つは６５℃における２×ＳＳｃ
（ＩＸＳＳＣ＝Ｏ１１５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１
５Ｍクエン酸ナトリウム、ｆ！１７．０ ）中の場合に
与えられる。かかる条件の下では、一般に、ハイブリダ
イゼーションは少なくとも約１５〜２０個の連続した、
正確に整合された塩基対をプローブ内に必″要とする。
ある応用においては、相補的配列がよシ少ないものの間
のハイブリダイゼーションが望ましい場合もあり、例え
ば、全体にわたる細胞の機能や構造ではなく核酸配列に
影響を与える進化の問題としての突然変異に対しては上
記のハイブリダイゼーションが望ましくなる。関連はす
るが同等ではない相補的シーケンスの再ア−二一ルする
能力は条件を厳しくすることにより制御可能である。高
い厳密条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ）、例えば温度の
上昇などは、再会合が密接に関係するシーケンスに限ら
れるので、所与の長さの相補鎖においてより多くの個数
の塩基対を必要とする。温度が低くなると、即ち、厳密
性が減少すると、関係がより薄いシーケンスの再アニー
リングが可能となる。更に、インキュベーション時間を
増しても、よシ関係の少ないシーケンスのアニーリング
が可能となる。
のハイブリダイゼーションが望ましい場合もあり、例え
ば、全体にわたる細胞の機能や構造ではなく核酸配列に
影響を与える進化の問題としての突然変異に対しては上
記のハイブリダイゼーションが望ましくなる。関連はす
るが同等ではない相補的シーケンスの再ア−二一ルする
能力は条件を厳しくすることにより制御可能である。高
い厳密条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ）、例えば温度の
上昇などは、再会合が密接に関係するシーケンスに限ら
れるので、所与の長さの相補鎖においてより多くの個数
の塩基対を必要とする。温度が低くなると、即ち、厳密
性が減少すると、関係がより薄いシーケンスの再アニー
リングが可能となる。更に、インキュベーション時間を
増しても、よシ関係の少ないシーケンスのアニーリング
が可能となる。
本発明の分析法を実施する場合、これは特定のハイブリ
ダイゼーション形式に限定されるものではない。プロー
ブと試料核酸との間で生ずるハイブリダイゼーションが
測定される手法は、主として、便利さの問題である。従
来の如何なるハイブリダイゼーション法でも使用可能で
ある。改良が重ねられ、新しいハイブリダイゼーション
法が開発されているので、それ等は本方法の実施に容易
に適用可能である。
ダイゼーション形式に限定されるものではない。プロー
ブと試料核酸との間で生ずるハイブリダイゼーションが
測定される手法は、主として、便利さの問題である。従
来の如何なるハイブリダイゼーション法でも使用可能で
ある。改良が重ねられ、新しいハイブリダイゼーション
法が開発されているので、それ等は本方法の実施に容易
に適用可能である。
特別に有用な従来のハイブリダイゼーション法には、核
酸もしくはポリヌクレオチド・プローブが固相上で固定
されたもの（固相ハイブリダイゼーション）やポリヌク
レオチド種が全て溶液中に溶解されている（溶液ハイブ
リダイゼーション）ものが挙げられる。
酸もしくはポリヌクレオチド・プローブが固相上で固定
されたもの（固相ハイブリダイゼーション）やポリヌク
レオチド種が全て溶液中に溶解されている（溶液ハイブ
リダイゼーション）ものが挙げられる。
Ａ、固相ハイブリダイゼーション
この方法においては、ハイブリダイゼーションに関与す
るポリヌクレオチド種の１つは適当な方法で、一本鎖の
形で固体支持体に固定される。有用な固体支持体は、従
来からよく知られており、共有的あるいは非共有的に核
酸を結合するものが添げられる、非共有結合による支持
体としては、一般には、これは疎水結合によるものと考
えられているが、天然に存在する、もしくは、合成の高
分子材］」、例えば、フィルターあるいは固体シートな
どの種々の形態をなすニトロセルロース、ナイロン誘導
体、及びフッ雰化ポリ炭化水素などが挙げられる。共有
Ｘト合による支持体も有用であるが、これは化学的に反
応性の基を有する物質、例えば、ジクロロトリアジン、
ジアゾベンジルオキシメチルなどからなり、それらはポ
リヌクレオチドへ結合するために活性にすることができ
る。
るポリヌクレオチド種の１つは適当な方法で、一本鎖の
形で固体支持体に固定される。有用な固体支持体は、従
来からよく知られており、共有的あるいは非共有的に核
酸を結合するものが添げられる、非共有結合による支持
体としては、一般には、これは疎水結合によるものと考
えられているが、天然に存在する、もしくは、合成の高
分子材］」、例えば、フィルターあるいは固体シートな
どの種々の形態をなすニトロセルロース、ナイロン誘導
体、及びフッ雰化ポリ炭化水素などが挙げられる。共有
Ｘト合による支持体も有用であるが、これは化学的に反
応性の基を有する物質、例えば、ジクロロトリアジン、
ジアゾベンジルオキシメチルなどからなり、それらはポ
リヌクレオチドへ結合するために活性にすることができ
る。
典型的な同相ハイブリダイゼーション技術は、核酸試料
を、一本かの形で、支持体上へ固定することから始まる
。この最初の段階は、本質的には□試料からの相補的鎧
の再アニーリングをさまたげ、また、支持体上で試料物
質を濃縮し検出感度を増強する手段として用いることが
できる。次に、ポリヌクレオチド・プローブは、次に、
一本鎖のラベルされた形で、この支持体に接触せしめら
れる。それによって支持体上に生じたハイブリダイゼー
ションが検出される適切な標識（ラベル）が用いられる
。通常、固相ハイブリダイゼーション法は次のように進
められる： 〔１〕 供試試料を、細菌の核酸を遊離させ、変性させ
る条件に曝し、得られた一本鎖核酸を固体支持体上に固
定する。例えば、体液などの液体試料を二′トロセルロ
ース薄膜に塗布し、付着した細胞を溶菌せしめ、遊離さ
れたＤＮＡ ４変性し、その薄膜を、真空中、８０℃で
２時間ベークして一本鎖ＤＮＡ を膜に固定するか、あ
るいは、前記の細胞を先ず溶解し、遊離されたＤＮＡを
変性し、次に、これを、ニトロセルロース膜に塗布し；
（２）前記支持体を、好ましいハイブリダイゼーション
条件の下で、例えば股上の全てのＤＮＡの非特異的結合
部位を４０〜６０℃で、緩衝液（例えば、２×５ＳＣ）
、仔ウシ血清アルブミンなどの蛋白貢、Ｆｉｃｏｌｌ
にューレヤージー州、ピスキャタウエイ（ｐｉｓｃａｔ
ｎｗａｙ ）のＰｈａｒｍａｏｉａ ＦｉｎｅＣｈｅｐ
ｉｃａｌｇから市販されている蔗糖とエビクーロヒドリ
ンの共重合体を示す商標）、ポリビニルピロリドン、及
び仔つシ胸藤またはサゲ精子などの変性された外来性Ｄ
ＮＡなどからなるブリ（予＠）ハイブリダイゼーション
溶液での処理により飽和させた後、過剰骨のラベルされ
たプローブと接触せしめるが、通常は、ハイブリダイゼ
ーション条件はインキュベーション時間が、通温、より
長い点を除くとブリハイブリダイゼーション染付と同じ
である。
を、一本かの形で、支持体上へ固定することから始まる
。この最初の段階は、本質的には□試料からの相補的鎧
の再アニーリングをさまたげ、また、支持体上で試料物
質を濃縮し検出感度を増強する手段として用いることが
できる。次に、ポリヌクレオチド・プローブは、次に、
一本鎖のラベルされた形で、この支持体に接触せしめら
れる。それによって支持体上に生じたハイブリダイゼー
ションが検出される適切な標識（ラベル）が用いられる
。通常、固相ハイブリダイゼーション法は次のように進
められる： 〔１〕 供試試料を、細菌の核酸を遊離させ、変性させ
る条件に曝し、得られた一本鎖核酸を固体支持体上に固
定する。例えば、体液などの液体試料を二′トロセルロ
ース薄膜に塗布し、付着した細胞を溶菌せしめ、遊離さ
れたＤＮＡ ４変性し、その薄膜を、真空中、８０℃で
２時間ベークして一本鎖ＤＮＡ を膜に固定するか、あ
るいは、前記の細胞を先ず溶解し、遊離されたＤＮＡを
変性し、次に、これを、ニトロセルロース膜に塗布し；
（２）前記支持体を、好ましいハイブリダイゼーション
条件の下で、例えば股上の全てのＤＮＡの非特異的結合
部位を４０〜６０℃で、緩衝液（例えば、２×５ＳＣ）
、仔ウシ血清アルブミンなどの蛋白貢、Ｆｉｃｏｌｌ
にューレヤージー州、ピスキャタウエイ（ｐｉｓｃａｔ
ｎｗａｙ ）のＰｈａｒｍａｏｉａ ＦｉｎｅＣｈｅｐ
ｉｃａｌｇから市販されている蔗糖とエビクーロヒドリ
ンの共重合体を示す商標）、ポリビニルピロリドン、及
び仔つシ胸藤またはサゲ精子などの変性された外来性Ｄ
ＮＡなどからなるブリ（予＠）ハイブリダイゼーション
溶液での処理により飽和させた後、過剰骨のラベルされ
たプローブと接触せしめるが、通常は、ハイブリダイゼ
ーション条件はインキュベーション時間が、通温、より
長い点を除くとブリハイブリダイゼーション染付と同じ
である。
次に、（３）ハイブリダイゼーションによる支持体との
会合がなされていないラベルされたプローブを、例えば
、薄膜を単に洗浄することにより除去する：そして （４）支持体上のラベルを該ラベルの検出可能な特性に
従って測定する。
会合がなされていないラベルされたプローブを、例えば
、薄膜を単に洗浄することにより除去する：そして （４）支持体上のラベルを該ラベルの検出可能な特性に
従って測定する。
通常、ラベルは３２Ｐなどの放射性同位元素からなシ、
シンチレーション計数又はオートラジオグラフィーによ
シ検出されるが、以下に詳述するように、非放射性同位
元素による検出も可能でちる。
シンチレーション計数又はオートラジオグラフィーによ
シ検出されるが、以下に詳述するように、非放射性同位
元素による検出も可能でちる。
上記の典型的な手法には、他の付加的な工程を含ませる
ことができる。例えば、特に短いＤＮＡ断片（例えば、
約１０００塩基以下）もしくはＲＮＡ類を固定せんとす
る場合には、かかるポリヌクレオチドは先ずグリオキサ
ールで誘導体とし、次に、これを支持体に塗布する。他
の方法として、反応性セルロースを用いて、通常は標準
法に従って試料を最初に純化して核酸を分離した後、ポ
リヌクレオチドを共有結合させることができる。
ことができる。例えば、特に短いＤＮＡ断片（例えば、
約１０００塩基以下）もしくはＲＮＡ類を固定せんとす
る場合には、かかるポリヌクレオチドは先ずグリオキサ
ールで誘導体とし、次に、これを支持体に塗布する。他
の方法として、反応性セルロースを用いて、通常は標準
法に従って試料を最初に純化して核酸を分離した後、ポ
リヌクレオチドを共有結合させることができる。
ジアゾベンジルオキシメーテルセルロースのような共有
結合によシ結合する、化学的に処理された紙を用いたハ
イブリダイゼーションを例示すると、次の通シである： （１）試料中に存在する細菌から核酸を取り出して精製
し、 （２）１００℃で数分加熱することによって試料核酸を
変性させ、 （３）変性混合物を、化学的に活性化された紙上にスポ
ットし、 （４） 風乾し、次に密閉容器中で１２〜１６時間保存
し、 （５） この紙を水及び０．４Ｎ水酸化ナトリウムで洗
浄し、再び水で洗浄し、 （６）前記の紙をプリハイブリダイゼーション用緩衝液
で洗浄し、 （７） この紙を、溶出用緩衝液〔例えば、９９チ（ｖ
／ｖ）脱イオンホルムアミドを１０ ｍＭ ）リスｌＩ
Ｃ２緩衝液（…７．８）に溶解させたもの〕中で１時間
インキュベーション、 （８）得られた紙をプリノ・イブリダイゼーション用溶
液によシ再び洗浄し、 （９） ハイブリダイゼーション用溶液に含まれるラベ
ルされたプローブを加え、 （１０）得られた紙を洗浄して・・イブリッドが形成し
ていない過剰のプローブを除去し、 （１１）紙上のラベルを測定する。
結合によシ結合する、化学的に処理された紙を用いたハ
イブリダイゼーションを例示すると、次の通シである： （１）試料中に存在する細菌から核酸を取り出して精製
し、 （２）１００℃で数分加熱することによって試料核酸を
変性させ、 （３）変性混合物を、化学的に活性化された紙上にスポ
ットし、 （４） 風乾し、次に密閉容器中で１２〜１６時間保存
し、 （５） この紙を水及び０．４Ｎ水酸化ナトリウムで洗
浄し、再び水で洗浄し、 （６）前記の紙をプリハイブリダイゼーション用緩衝液
で洗浄し、 （７） この紙を、溶出用緩衝液〔例えば、９９チ（ｖ
／ｖ）脱イオンホルムアミドを１０ ｍＭ ）リスｌＩ
Ｃ２緩衝液（…７．８）に溶解させたもの〕中で１時間
インキュベーション、 （８）得られた紙をプリノ・イブリダイゼーション用溶
液によシ再び洗浄し、 （９） ハイブリダイゼーション用溶液に含まれるラベ
ルされたプローブを加え、 （１０）得られた紙を洗浄して・・イブリッドが形成し
ていない過剰のプローブを除去し、 （１１）紙上のラベルを測定する。
、核酸試料を固定しラベルされたプローブと接触させる
代りに、公知の方法によりその場で（１ｎｓｉｔｕ）試
料核酸をラベルし、その後固定化された、形のプローブ
に加えることもできる。最後の測定は同じで、支持体に
会合したラベルの検出である。
代りに、公知の方法によりその場で（１ｎｓｉｔｕ）試
料核酸をラベルし、その後固定化された、形のプローブ
に加えることもできる。最後の測定は同じで、支持体に
会合したラベルの検出である。
興味ある他の方法としてサンドイッチハイブリダイゼー
ション法があり、とれは、プローブの相同配列の２つの
相互に排他的な断片の１つが固定され、他のものがラベ
ルされるものである。細菌核酸が存在すると、固定され
たプローブセグメントとラベルされたプローブセグメン
トに対する二重ハイブリダイゼーションが起き、支持体
に会合したラベルを同様にして最終的に測定するもので
ある。これは、Ｍ＠ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ ６Ｆ１：４６８（１９８０）及びＧｅｎ５２１
ニア７〜８５（１９８３）に更に詳述してあり、これ
らを参照されたい。 。
ション法があり、とれは、プローブの相同配列の２つの
相互に排他的な断片の１つが固定され、他のものがラベ
ルされるものである。細菌核酸が存在すると、固定され
たプローブセグメントとラベルされたプローブセグメン
トに対する二重ハイブリダイゼーションが起き、支持体
に会合したラベルを同様にして最終的に測定するもので
ある。これは、Ｍ＠ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ ６Ｆ１：４６８（１９８０）及びＧｅｎ５２１
ニア７〜８５（１９８３）に更に詳述してあり、これ
らを参照されたい。 。
更に他の分析法においては、５Ｓ、１６Ｓまたは２３８
ＲＮＡ のようなＲＮＡの保存されたシーケンス（保存
シーケンス、ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ５ｅｑｕｅｎｃｅ
）に相補的なりＮＡプローブを用いる。このプローブを
、固体支持体上に固定し、試料由来のＩｊＮ Ａとハイ
ブリダイズすることができ、ＲＮＡ／ＤＮＡ相補鎖（二
重鎖）は、従来の方法、例えばＲＮＡ／ＤＮＡ ハイブ
リッドに特異的なラベルされた抗体による方法（Ｒｕｄ
ｋｉｎとＳｔｏ目ａｒ、 Ｎａｔｕｒｅ ２６５：４７
２及び４７３ （ｊ９７７”ｌ、３ｔｕａｒｔ等、ＰＮ
Ａ８７８：３７５１（３９８１）、］１ｅ４ｄｙと５ｏ
ｆａｒ、 ＢＢＲＣ１０３ ： ９５９−９６７（１９
８１）、及びＮａｋａｚａｌ、ｏ 。
ＲＮＡ のようなＲＮＡの保存されたシーケンス（保存
シーケンス、ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ５ｅｑｕｅｎｃｅ
）に相補的なりＮＡプローブを用いる。このプローブを
、固体支持体上に固定し、試料由来のＩｊＮ Ａとハイ
ブリダイズすることができ、ＲＮＡ／ＤＮＡ相補鎖（二
重鎖）は、従来の方法、例えばＲＮＡ／ＤＮＡ ハイブ
リッドに特異的なラベルされた抗体による方法（Ｒｕｄ
ｋｉｎとＳｔｏ目ａｒ、 Ｎａｔｕｒｅ ２６５：４７
２及び４７３ （ｊ９７７”ｌ、３ｔｕａｒｔ等、ＰＮ
Ａ８７８：３７５１（３９８１）、］１ｅ４ｄｙと５ｏ
ｆａｒ、 ＢＢＲＣ１０３ ： ９５９−９６７（１９
８１）、及びＮａｋａｚａｌ、ｏ 。
Ｂｉｏｃｂｅｍ、］ ９ ： ２８３５−２８４０（１
９８０）］により検出されることになる。この方法は、
１細胞当り相補ＲＮＡの幾６、幾千というコピーが起こ
りうるため、改良さ扛だ検出法を提供する。
９８０）］により検出されることになる。この方法は、
１細胞当り相補ＲＮＡの幾６、幾千というコピーが起こ
りうるため、改良さ扛だ検出法を提供する。
Ｂ、溶液ハイブリダイゼーション
本発明方法は溶液、の形式で、細菌核酸を検出するため
にも用いることが出来る。これは、通常、相同シーケン
スが、ＲＮＡであれＤＮＡであれ、１本鎖形態にあると
いうことを必要とする。これはプローブポリヌクレオチ
ドと呼ばれる。
にも用いることが出来る。これは、通常、相同シーケン
スが、ＲＮＡであれＤＮＡであれ、１本鎖形態にあると
いうことを必要とする。これはプローブポリヌクレオチ
ドと呼ばれる。
溶液法（形式）においては、試料の核酸が先ず試料中の
細菌細胞から溶菌によって遊離され、次に変性される。
細菌細胞から溶菌によって遊離され、次に変性される。
これらの段階（工程）は、試料を１００℃に加熱するか
、あるいは、それを塩基にＨＢすことによって同時に行
うことができる。大過別号のプローブを含有する溶液を
加えた後、所望のプローブ特異性とプローブ感受性を与
える、経験的に定められたイオン強度と温度条件の下で
、ハイブリダイゼーションを起こさしめる。
、あるいは、それを塩基にＨＢすことによって同時に行
うことができる。大過別号のプローブを含有する溶液を
加えた後、所望のプローブ特異性とプローブ感受性を与
える、経験的に定められたイオン強度と温度条件の下で
、ハイブリダイゼーションを起こさしめる。
ハイブリッドは多くの手法によシ検出され、定量され得
る。例えば、ハイブリダイゼーション後、残シの１本鎖
核酸を１本鎖に特異的なヌクレアーゼＳ１により小片に
加水分解することができる。酸による沈澱及びそれに続
く遠心又は濾過を利用１−てハイブリッドを濃縮し、そ
れ等を加水分解された１本鎖ポリヌクレオチドから分離
することができる。次に収集された沈澱物の量が定量す
る・もう一つの方法では、ハイブリダイズされた１本鎖
ポリヌクレオチドを、ヒドロキシアパタイトクロマトゲ
シフイーにより分離することができる０その他の溶液法
も公知であり、又発展せしめられるであろう。
る。例えば、ハイブリダイゼーション後、残シの１本鎖
核酸を１本鎖に特異的なヌクレアーゼＳ１により小片に
加水分解することができる。酸による沈澱及びそれに続
く遠心又は濾過を利用１−てハイブリッドを濃縮し、そ
れ等を加水分解された１本鎖ポリヌクレオチドから分離
することができる。次に収集された沈澱物の量が定量す
る・もう一つの方法では、ハイブリダイズされた１本鎖
ポリヌクレオチドを、ヒドロキシアパタイトクロマトゲ
シフイーにより分離することができる０その他の溶液法
も公知であり、又発展せしめられるであろう。
Ｃ，ラベル
好ましくは、プローブのポリヌクレオチドは、ラベルさ
れた試薬として使用される場合には、１本鎖ＤＮＡもし
くはＲＮＡであり、これによシハイプリダイゼーション
前のプローブの変性の必要性がなくなる。これはプロー
ブのシーケンスを１本領ＤＮＡバタテリオファージ（例
えば、Ｍ１３）に挿入することによって、或いはインビ
トロの重合反応の後ラベルされたプローブを分離するこ
とによって実施可能であるロブローブ、もしくはラベル
されるべきその他の物質には種々の２ベルを組込むこと
ができる０有用なラベルＫｆｌ−１放射性同位元素と非
放射性同位元素の両方が含まれる。同位元素のラベルは
３Ｈ，３５８、３２ｐ 、 １２５Ｉ、及び１４ｃを含
むが、これ等に限定されるものではない。グローブ或い
はその他の物質を放射能でラベルすることはその特定の
性質に依存する（例えば、ＲＮＡ対Ｄ Ｎ Ａ ％ １
重鎖対２本鎖）０ 殆んどのラベル法は酵素的である。
れた試薬として使用される場合には、１本鎖ＤＮＡもし
くはＲＮＡであり、これによシハイプリダイゼーション
前のプローブの変性の必要性がなくなる。これはプロー
ブのシーケンスを１本領ＤＮＡバタテリオファージ（例
えば、Ｍ１３）に挿入することによって、或いはインビ
トロの重合反応の後ラベルされたプローブを分離するこ
とによって実施可能であるロブローブ、もしくはラベル
されるべきその他の物質には種々の２ベルを組込むこと
ができる０有用なラベルＫｆｌ−１放射性同位元素と非
放射性同位元素の両方が含まれる。同位元素のラベルは
３Ｈ，３５８、３２ｐ 、 １２５Ｉ、及び１４ｃを含
むが、これ等に限定されるものではない。グローブ或い
はその他の物質を放射能でラベルすることはその特定の
性質に依存する（例えば、ＲＮＡ対Ｄ Ｎ Ａ ％ １
重鎖対２本鎖）０ 殆んどのラベル法は酵素的である。
これ等は、限定されるものではないが、ニック翻訳（ｎ
１ｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ） ＋末端ラベル（
ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ）、第２鎖合成（５ｅｃｏ
ｎｄｓｔｒａｎｄ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、逆転写、及
び転写の公知の方法を利用するものである。これ等の方
法の全ては一般に酵素基質として機能する同位元素的に
ラベルされたヌクレオチドを必要とする。
１ｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ） ＋末端ラベル（
ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ）、第２鎖合成（５ｅｃｏ
ｎｄｓｔｒａｎｄ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、逆転写、及
び転写の公知の方法を利用するものである。これ等の方
法の全ては一般に酵素基質として機能する同位元素的に
ラベルされたヌクレオチドを必要とする。
もう一つの方法においては、放射性ラベルを、ポリヌク
レオチドプローブを化学的に修飾することによって該ブ
ａ−ブに組込むことができる口この方法は １２５１ラ
ベルを用いて最も普通に用いられる。
レオチドプローブを化学的に修飾することによって該ブ
ａ−ブに組込むことができる口この方法は １２５１ラ
ベルを用いて最も普通に用いられる。
放射性標識化ポリヌクレオチドプローブについては、ハ
イブリダイゼーションはオートラクオグ２フイー、シン
チレーショ・ン計数、又はガンマ線計数などの方法によ
って検出可能である。使用される方法は、ハイブリダイ
ゼーションの形式、試験のタイプ（定性的か定量的かン
、及びラベルとして用いられる同位元素などに依存する
。
イブリダイゼーションはオートラクオグ２フイー、シン
チレーショ・ン計数、又はガンマ線計数などの方法によ
って検出可能である。使用される方法は、ハイブリダイ
ゼーションの形式、試験のタイプ（定性的か定量的かン
、及びラベルとして用いられる同位元素などに依存する
。
非放射性同位元素物質もラベルとして使用可能である。
かかるラベルは、以上に概説した酵素的手順の一つを用
いて修飾したヌクレオチドを酵素的に組込むことにより
ポリヌクレオチドプローブもしくはラベルされるべき他
の物質に組込むことが出来、この場合、このラベルされ
たヌクレオチドは適当な酵素に対して酵素基質として働
く。さらに今一つの方法にお′いては、ラベルを、従来
のプローブの化学的修飾によってポリヌクレオチドプロ
ーブに導入することができる。
いて修飾したヌクレオチドを酵素的に組込むことにより
ポリヌクレオチドプローブもしくはラベルされるべき他
の物質に組込むことが出来、この場合、このラベルされ
たヌクレオチドは適当な酵素に対して酵素基質として働
く。さらに今一つの方法にお′いては、ラベルを、従来
のプローブの化学的修飾によってポリヌクレオチドプロ
ーブに導入することができる。
有用なラベルとしては、限定はされないが、）１ブテン
もしくは他のリガンド、けい光体、化学発光体１発色団
、及び酵素反応に関与する物質（例えば、酵素、酵素補
足因子、酵素基質、及び酵素モジュレータ−１例えばイ
ンヒビター）が挙げられる。これ等のラベルは、それら
自身の物理的性質（例えば、けい光体や発色団について
）又はこれ等の反応特性（例えば、リストした他のもの
について）に基づいて検出される。例えば、酵素補足因
子でラベルされたグローブは、ラベルが酵素に対する補
足因子であるところの該酵素及び基質を添加することに
よシ検出することができる・ハプテン及びリガンドでラ
ベルされたポリヌクレオチドプローブは、検出可能な分
子が付加された、ハプテンに対すく抗体もしくはりガン
トに結合する蛋白質を添加することにより検出すること
ができる０かかる検出可能力分子としては、測定可能な
物理的性質（例えば、けい元もしくは吸光度）を有する
分子、あるいは、酵素反応に関するもの（例えば、上記
のリストを参照）であってもよい。
もしくは他のリガンド、けい光体、化学発光体１発色団
、及び酵素反応に関与する物質（例えば、酵素、酵素補
足因子、酵素基質、及び酵素モジュレータ−１例えばイ
ンヒビター）が挙げられる。これ等のラベルは、それら
自身の物理的性質（例えば、けい光体や発色団について
）又はこれ等の反応特性（例えば、リストした他のもの
について）に基づいて検出される。例えば、酵素補足因
子でラベルされたグローブは、ラベルが酵素に対する補
足因子であるところの該酵素及び基質を添加することに
よシ検出することができる・ハプテン及びリガンドでラ
ベルされたポリヌクレオチドプローブは、検出可能な分
子が付加された、ハプテンに対すく抗体もしくはりガン
トに結合する蛋白質を添加することにより検出すること
ができる０かかる検出可能力分子としては、測定可能な
物理的性質（例えば、けい元もしくは吸光度）を有する
分子、あるいは、酵素反応に関するもの（例えば、上記
のリストを参照）であってもよい。
例えば、基質に作用して測定可能な物理的性質を有する
生成物を産生ずる酵素を用いることが出来る◎後者の例
としては、これに限定はされないが、β−カラクトシダ
ーゼ、アルカリ性フォスファターゼ及びペルオキシダー
ゼなどを挙げることが出来る。インシチュー（ｉｎ ５
ｉｔｕ ）のハイブリダイゼーション実験の場合、最終
産物は理想的には水に不溶である。
生成物を産生ずる酵素を用いることが出来る◎後者の例
としては、これに限定はされないが、β−カラクトシダ
ーゼ、アルカリ性フォスファターゼ及びペルオキシダー
ゼなどを挙げることが出来る。インシチュー（ｉｎ ５
ｉｔｕ ）のハイブリダイゼーション実験の場合、最終
産物は理想的には水に不溶である。
特に有用なラベル法は、プローブ配列の５′側に定義さ
れたシーケンス領域を有する１本鎖ＤＮＡベクターに適
用可能なｉ４！２＠合成法の変法である。
れたシーケンス領域を有する１本鎖ＤＮＡベクターに適
用可能なｉ４！２＠合成法の変法である。
（ＨｕとＭｅｓｓｉｎｇ、 Ｇｏｎｅ １７ ： ２７
１〜２７７（１９８２））この方法では、プローブの５
′側のシーケンスに相補的なオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼと共に第２鎖の合成
を開始する０適当々ラベル（これは上記のように放射性
であっても非放射性であってもよい）を第２のＤＮＡ鎖
に組込むことが山−来る。この方法は、プローブ領域で
は１本鎖であるが、プローブシーケンスの５′側に多重
ラベル２本鎖領域を有するポリヌクレオチドを与える〇 ポリヌクレ°オチドグローブに２ベルの組込みを要し々
い方法は、Ｒｕｄｋｉｎと８１ｏｌｌａｒ （Ｎａｔｕ
ｒｅ２６５： ４７２〜４７３（１９７７））によシ報
告されており、又インシチュー（ｉｎ ａｉｔｕ）ハイ
ブリダイゼーションの検出のために細胞化学者によシ利
用されている０この方法においては、所望のシーケンス
を有する１本鎖ＲＮＡが試料からのＤＮＡにハイブリダ
イズされる。ハイブリダイゼーションはＲＮＡ／ＤＮＡ
ハイブリッドに特異的なラベルされた抗体（これ等の抗
体は２本鎖ＤＮＡ、又は１本鎖ＲＮＡ或いはＤＮＡには
結合しない。）を用いて検出される０この方法は本発明
の方法に適用可能である〇好ましい抗体ラベルは上述の
ものである〇一般に、免疫試験法に用いるために開発さ
れてきたラベル及びラベル法は、当業者に明瞭な若干の
修正と共に本ハイブリダイゼーション法に適用可能であ
る０これに関しては、米国特許第４．３８０゜ｓｓｏ
； ４，２７９，９９２ ： ４，２３８，５６５ ：
４，１３４，７９２： ４，２７３，８６６ ： ３
，８１７，８３７ ： ４，０４３，８７２ ：４．２
３８，１９５ ： ３，９Ｂ５，０７４ ： ３，９９
８，９４３ ： ３，６５４゜０９０ ： ３，９９２
．６３１ ： ４，１６０，０１６ ；及び３，９９６
゜３４５号；及び英ｌ特許明細書第１，５５２，６０７
及び３．０１９，４０８号；更に欧州特許出願第７０．
６８７；７０．６８５：及び６３，８７９号に開示され
ておシ、うベル法に関係するそれらの該当部分は本明細
書に引用される。
１〜２７７（１９８２））この方法では、プローブの５
′側のシーケンスに相補的なオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼと共に第２鎖の合成
を開始する０適当々ラベル（これは上記のように放射性
であっても非放射性であってもよい）を第２のＤＮＡ鎖
に組込むことが山−来る。この方法は、プローブ領域で
は１本鎖であるが、プローブシーケンスの５′側に多重
ラベル２本鎖領域を有するポリヌクレオチドを与える〇 ポリヌクレ°オチドグローブに２ベルの組込みを要し々
い方法は、Ｒｕｄｋｉｎと８１ｏｌｌａｒ （Ｎａｔｕ
ｒｅ２６５： ４７２〜４７３（１９７７））によシ報
告されており、又インシチュー（ｉｎ ａｉｔｕ）ハイ
ブリダイゼーションの検出のために細胞化学者によシ利
用されている０この方法においては、所望のシーケンス
を有する１本鎖ＲＮＡが試料からのＤＮＡにハイブリダ
イズされる。ハイブリダイゼーションはＲＮＡ／ＤＮＡ
ハイブリッドに特異的なラベルされた抗体（これ等の抗
体は２本鎖ＤＮＡ、又は１本鎖ＲＮＡ或いはＤＮＡには
結合しない。）を用いて検出される０この方法は本発明
の方法に適用可能である〇好ましい抗体ラベルは上述の
ものである〇一般に、免疫試験法に用いるために開発さ
れてきたラベル及びラベル法は、当業者に明瞭な若干の
修正と共に本ハイブリダイゼーション法に適用可能であ
る０これに関しては、米国特許第４．３８０゜ｓｓｏ
； ４，２７９，９９２ ： ４，２３８，５６５ ：
４，１３４，７９２： ４，２７３，８６６ ： ３
，８１７，８３７ ： ４，０４３，８７２ ：４．２
３８，１９５ ： ３，９Ｂ５，０７４ ： ３，９９
８，９４３ ： ３，６５４゜０９０ ： ３，９９２
．６３１ ： ４，１６０，０１６ ；及び３，９９６
゜３４５号；及び英ｌ特許明細書第１，５５２，６０７
及び３．０１９，４０８号；更に欧州特許出願第７０．
６８７；７０．６８５：及び６３，８７９号に開示され
ておシ、うベル法に関係するそれらの該当部分は本明細
書に引用される。
本発明が特定のハイブリダイゼーション形式又はラベル
に限定されないことは明らかである。新しい方法と２ベ
ルが開発された場合、それ等は本発明の方法に適用可能
である。上記のＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ 、
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照する
ことにより、核酸ハイブリダイゼーションに関する更に
詳しい情報が１０られる。
に限定されないことは明らかである。新しい方法と２ベ
ルが開発された場合、それ等は本発明の方法に適用可能
である。上記のＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ 、
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照する
ことにより、核酸ハイブリダイゼーションに関する更に
詳しい情報が１０られる。
細菌の存在を知るために分析される供試試料は、興味の
ある媒体ならばいかなるものであってもよいが、通常は
、医学的、獣医学的、環境学的もしくは栄養学的な液状
試料或いは、産栗上重要が液状試料である。特に、ヒト
や動物からの試料並びに体液は本発明方法によｐ分析可
能であ夛、それらの試料には、尿や血液（血清又は血漿
）、牛乳。
ある媒体ならばいかなるものであってもよいが、通常は
、医学的、獣医学的、環境学的もしくは栄養学的な液状
試料或いは、産栗上重要が液状試料である。特に、ヒト
や動物からの試料並びに体液は本発明方法によｐ分析可
能であ夛、それらの試料には、尿や血液（血清又は血漿
）、牛乳。
又、脳を髄液、喀痰、排せつ物、肺吸引器からの物質、
咽喉部消毒綿の付着物、生殖器部塗薬スポンジ付着物並
びに滲出物、直腸消毒締付着物及び上咽頭部吸引器付着
物などが含まれる。
咽喉部消毒綿の付着物、生殖器部塗薬スポンジ付着物並
びに滲出物、直腸消毒締付着物及び上咽頭部吸引器付着
物などが含まれる。
本発明は、尿中細菌（細菌尿）の検出に特に有利である
。１ミリリツトル当１） １０８個以上の細菌コロニー
形成ユニットが検出されると、尿路感染症の疑いが持た
れる。複雑でない感染症の場合には、病因学的試薬は罹
病率に従って次の２つの一般的なカテゴリーを含む： カテゴリー１ （罹病率９０％） 科二 エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ
ｔａｒｉａｃｅａｅ）〔グラム陽性の条件的（任意）嫌
気性桿菌〕エツシエリヒア（Ｅｓｈａｒｉｃｈｉａ）
（Ｒｃｏｌｉ ）クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌｇ
）（Ｋ、Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）エンテロバクタ−（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ） （Ｅ、ｃｌｏａｃａｅ、、
。
。１ミリリツトル当１） １０８個以上の細菌コロニー
形成ユニットが検出されると、尿路感染症の疑いが持た
れる。複雑でない感染症の場合には、病因学的試薬は罹
病率に従って次の２つの一般的なカテゴリーを含む： カテゴリー１ （罹病率９０％） 科二 エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ
ｔａｒｉａｃｅａｅ）〔グラム陽性の条件的（任意）嫌
気性桿菌〕エツシエリヒア（Ｅｓｈａｒｉｃｈｉａ）
（Ｒｃｏｌｉ ）クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌｇ
）（Ｋ、Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）エンテロバクタ−（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ） （Ｅ、ｃｌｏａｃａｅ、、
。
Ｅ、 ａｅｒｏｇａｎｅｓ ）
プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ） （Ｐ、 ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ 、 Ｐ、 ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ Ｉ Ｍｏｒｇａ
ｎｅｌ ｌａ ｍｏｒｇａｎｉ ｉ ）カテゴリー２
（５〜１０Ｘ罹病率） 科： シュードモナダセアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ
ａｃｅａｅ ） （グラム陰性の好気的桿菌及び球菌） シュードモナス（Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓ ） （Ｐ、
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）科： ミクロコッカセアエ（Ｍ
ｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ） （グラム陽性球菌） スタフィロコッカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
（Ｓ、 ａｕｒａｕｓ）科： ストレプトコッカセア
エ（Ｓｔｒｓｐｆｏｃｏｃｃａｃｅａｅ） （グラム陽
性球菌） ストレプトコッカス・グループＤ （５ｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ＧｒｏｕｐＤ ） （Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｉ） 複雑な感染症の場合には、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ） ＊セラチア（Ｓ’ｅｒｒａｔｉａ）
及びプロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄａｎｃｉａ）菌株も
、出現するＯこれらすべての群もしくはその下位の集合
に相同のプローブを、特定の細菌試験に要望される特異
性と感度の程度に従って、本発明によシ得ることができ
る。
ｉｓ 、 Ｐ、 ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ Ｉ Ｍｏｒｇａ
ｎｅｌ ｌａ ｍｏｒｇａｎｉ ｉ ）カテゴリー２
（５〜１０Ｘ罹病率） 科： シュードモナダセアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ
ａｃｅａｅ ） （グラム陰性の好気的桿菌及び球菌） シュードモナス（Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓ ） （Ｐ、
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）科： ミクロコッカセアエ（Ｍ
ｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ） （グラム陽性球菌） スタフィロコッカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
（Ｓ、 ａｕｒａｕｓ）科： ストレプトコッカセア
エ（Ｓｔｒｓｐｆｏｃｏｃｃａｃｅａｅ） （グラム陽
性球菌） ストレプトコッカス・グループＤ （５ｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ＧｒｏｕｐＤ ） （Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｉ） 複雑な感染症の場合には、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ） ＊セラチア（Ｓ’ｅｒｒａｔｉａ）
及びプロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄａｎｃｉａ）菌株も
、出現するＯこれらすべての群もしくはその下位の集合
に相同のプローブを、特定の細菌試験に要望される特異
性と感度の程度に従って、本発明によシ得ることができ
る。
本発明は、細菌の検出に関して具体的に記載され、又そ
れに適用するの・が最も有利であるが、本発明方法は、
原生動物、酵母・、ウィルスのよう力他の型の微生物を
検出するために用いることができることが判るであろう
。
れに適用するの・が最も有利であるが、本発明方法は、
原生動物、酵母・、ウィルスのよう力他の型の微生物を
検出するために用いることができることが判るであろう
。
供試試料は、細菌の核酸を１本鎖の形で１遊離させるた
めに、多くの公知の方法で処理することができる。核酸
の遊離は、例えば、機械的々分解（凍結／氷解、摩擦、
高周波処理）、物理的／化学的分解（’Ｔｒｉｔ’Ｏｎ
、 ＴＷｅｅｎ 、ドデシル硫酸ナトリウム欧どの洗
剤、アルカリ処理、浸透圧によるショック、加熱沸騰水
）、或いは、薄紫的な分解（リゾチーム、プロテナーゼ
に、ペプシン）などによシ行うことができる。遊離核酸
の変性は、好ましくは、沸騰水中での加熱又はアルカリ
処理（例えば１．６． Ｉ Ｎ水酸化ナトリウム）にょ
シ実施され、これ等は、細胞を溶解するために必要に応
じて、同時に使用可能である。
めに、多くの公知の方法で処理することができる。核酸
の遊離は、例えば、機械的々分解（凍結／氷解、摩擦、
高周波処理）、物理的／化学的分解（’Ｔｒｉｔ’Ｏｎ
、 ＴＷｅｅｎ 、ドデシル硫酸ナトリウム欧どの洗
剤、アルカリ処理、浸透圧によるショック、加熱沸騰水
）、或いは、薄紫的な分解（リゾチーム、プロテナーゼ
に、ペプシン）などによシ行うことができる。遊離核酸
の変性は、好ましくは、沸騰水中での加熱又はアルカリ
処理（例えば１．６． Ｉ Ｎ水酸化ナトリウム）にょ
シ実施され、これ等は、細胞を溶解するために必要に応
じて、同時に使用可能である。
本発明は、更に、試薬システム、即ち、所望の、試験法
の実施に必要な必須要素の全てからなる試薬の組合わせ
、又は手段を与える・この試薬システムは、試薬の適合
性によシ許容される組成物もしくは混合物として、試験
装置の形をした市販品としてパッケージとして、あるい
は、試験用キット、即ち、通常は試験を行うための説明
書を含む、必要々試薬を保持した１つ以上の容器ζ装置
などのパッケージされた組合せとして与えられる、本発
明の試薬システムは、ここに記載された各種のハイブリ
ダイゼーション法を実施する全ての形式と構成とを有す
る。特に、（１）試験試料を処理して核酸を遊離、変性
せしめることによって得られる１本鎖核酸を固定するこ
とができる固体支持体と、（２〕本明ｎ’ｍ ＠に記載
の各種のものから選択された標識化ポリヌクレオチドプ
ローブとから々る固相ハイブリダイゼーション法を実施
するための試験用キットが好ましい。かかるキットは、
好ましくは、更に、核酸試料の固定後に支持体上の核酸
吸着部位をほぼ飽和させるのに必要な外米性の核酸及び
場合によシ、プリハイブリダイゼーション溶液用の必要
な他の成分とからなる。又、本キットは、試料を処理し
てこれから１本鎖核酸を遊離するだめの化学的溶解、変
性試薬、例えば、アルカリを有する。ハイブリダイゼー
ション反応用の成分は、プリハイブリダイゼーション溶
液と異なる場合は、好ましくは、前記のキットに含まれ
る。勿論、該試薬システムは、従来公知で、緩衝液や希
釈液、標準液々どの商業的里場及び使用者の立場から望
ましい、その他の物質や溶液を含むことができる。
の実施に必要な必須要素の全てからなる試薬の組合わせ
、又は手段を与える・この試薬システムは、試薬の適合
性によシ許容される組成物もしくは混合物として、試験
装置の形をした市販品としてパッケージとして、あるい
は、試験用キット、即ち、通常は試験を行うための説明
書を含む、必要々試薬を保持した１つ以上の容器ζ装置
などのパッケージされた組合せとして与えられる、本発
明の試薬システムは、ここに記載された各種のハイブリ
ダイゼーション法を実施する全ての形式と構成とを有す
る。特に、（１）試験試料を処理して核酸を遊離、変性
せしめることによって得られる１本鎖核酸を固定するこ
とができる固体支持体と、（２〕本明ｎ’ｍ ＠に記載
の各種のものから選択された標識化ポリヌクレオチドプ
ローブとから々る固相ハイブリダイゼーション法を実施
するための試験用キットが好ましい。かかるキットは、
好ましくは、更に、核酸試料の固定後に支持体上の核酸
吸着部位をほぼ飽和させるのに必要な外米性の核酸及び
場合によシ、プリハイブリダイゼーション溶液用の必要
な他の成分とからなる。又、本キットは、試料を処理し
てこれから１本鎖核酸を遊離するだめの化学的溶解、変
性試薬、例えば、アルカリを有する。ハイブリダイゼー
ション反応用の成分は、プリハイブリダイゼーション溶
液と異なる場合は、好ましくは、前記のキットに含まれ
る。勿論、該試薬システムは、従来公知で、緩衝液や希
釈液、標準液々どの商業的里場及び使用者の立場から望
ましい、その他の物質や溶液を含むことができる。
本発明は、以下に示す実施例により説明されるが、これ
らに限定されるものでは々い。
らに限定されるものでは々い。
実施例１
微生物、エツシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）Ｎα０６３（＝−Ｌ−ヨーク）（（、ロチ
ェスターノユニヴアーシティー・オブ・ロチニスター・
メディカル・センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）
］を、試鹸の結果、尿路感染が陽と出た患者の尿から得
た。対照の非尿路感染性株として、微生物、バチルス・
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）
［オハイオ州、コロンブスのバチルス・ジュネテイツ
ク・ストック・センター、オハイオ州立大学からのＮＩ
ＬＩＡ２８９株〕を用いた。それぞれの微生物を次のよ
うにして、液体栄養培地中で培養した。
ａｃｏｌｉ）Ｎα０６３（＝−Ｌ−ヨーク）（（、ロチ
ェスターノユニヴアーシティー・オブ・ロチニスター・
メディカル・センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）
］を、試鹸の結果、尿路感染が陽と出た患者の尿から得
た。対照の非尿路感染性株として、微生物、バチルス・
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）
［オハイオ州、コロンブスのバチルス・ジュネテイツ
ク・ストック・センター、オハイオ州立大学からのＮＩ
ＬＩＡ２８９株〕を用いた。それぞれの微生物を次のよ
うにして、液体栄養培地中で培養した。
各振盪フラスコ中に、Ｅ、 （ｏｌｉもしくはＢ、５ｕ
ｂ−ｔｉｌｉｓ ｔ−接種した。この振盪フラスコ中に
は、２ｘＹＴブロス５０ゴが含まれて′いた。２ｘＹＴ
は１．６−％のバクトドリブトン、１．０％の酵母エキ
ス及び０、５９ｇの塩化ナトリウムからなっていた。）
（クトトリプトンと酵母エキスは、ミシシッピー州、デ
トロイトのディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌ
−ａｂｒａｔｏｒｉｅｓ ）から入手した。二つの菌株
をロータリーシェーカー（回転式振どう機）中、３７℃
で６時間培養した。
ｂ−ｔｉｌｉｓ ｔ−接種した。この振盪フラスコ中に
は、２ｘＹＴブロス５０ゴが含まれて′いた。２ｘＹＴ
は１．６−％のバクトドリブトン、１．０％の酵母エキ
ス及び０、５９ｇの塩化ナトリウムからなっていた。）
（クトトリプトンと酵母エキスは、ミシシッピー州、デ
トロイトのディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌ
−ａｂｒａｔｏｒｉｅｓ ）から入手した。二つの菌株
をロータリーシェーカー（回転式振どう機）中、３７℃
で６時間培養した。
６時間培養後の各プロス中の単位容積当シの菌伴数を測
定するために、培゛会液を２ｘＹＴブロス中への１０倍
増分によって逐次希釈した。希釈液の各々を、トリプト
ース血液寒天樟養基（ＴＢＡＢ）及、び０．１％のカザ
ミノ酸（両成分ともＤｉｆｃｏよシ入手可能）を含む無
菌寒天培地に展塗した。これらの展塗したプレートを３
７℃で１２時間インキュベートしてコロニーを形成せし
めた。 ３０〜３ｏ、ｏ個のコロニーを含むプレートの
コロニーを計、数し、元のブロス中Ω単位容積当シの細
胞数を計算によってめた０ これらの６時間グロス培養液及び新たに調製したこれら
培養液の希釈液をニトロセルロース〔カリフォルニア洲
、リッチモンドのバイオラドＱラボラトリーズ（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ ）から入手可能な
バイオラド・トランスプロット（商標名）転移培地〕か
らなる固体支持体に施した。このニトロセルロースの一
定界面積への正確な数の細胞の添加は、ニューハンプシ
ャー州、キーンのシュライヒｚ 、１１７ 参アンド・
シュエル（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕ−ａｌ
ｌ）インコーホレーテッドから市販されているマニホー
ルド（Ｍａｎｔ ｆｏｌｄ ｌ登録商標名）と呼ばれる
装置を用いて々された０この装置は、戸−過もしくは固
定化工程中、−緒に締め具で留められて１サンドイツチ
〃構造にされる三つの部分からなる戸通用多岐管である
。このマニホールド装置に、４インチ（’）（１０，１
６ｃｒｎつｘ ５％ ’ （１３，３４ｃｍ）の二枚の
ワットマン３Ｍクロマトグラフィー用紙（英国のワット
マン・リミテッドから入手可能）に裏打ちされた４ ’
ｘ ５５ ’の一枚のニトロセルロース薄膜ｔ−？）付
けｆｃｏこのニトロセルロース及びワットマン紙は、５
ｍｌの１ｘ、５ＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５モルのＮ
ａＣ１、０，０１５Ｍのクエン酸三ナトリウム）中に予
め浸漬した。この薄膜及び裏打ち紙を、装置にクランプ
で留めた。そして、この装置を真空系に継ぎ、累を真空
にした。各ウェルには、０．１０ｍｇの６時間培養後の
Ｅ・、ｃｏｌｉ培養液を加え、それに続くウェルには、
この培養液の一連の希釈液０．１［。
定するために、培゛会液を２ｘＹＴブロス中への１０倍
増分によって逐次希釈した。希釈液の各々を、トリプト
ース血液寒天樟養基（ＴＢＡＢ）及、び０．１％のカザ
ミノ酸（両成分ともＤｉｆｃｏよシ入手可能）を含む無
菌寒天培地に展塗した。これらの展塗したプレートを３
７℃で１２時間インキュベートしてコロニーを形成せし
めた。 ３０〜３ｏ、ｏ個のコロニーを含むプレートの
コロニーを計、数し、元のブロス中Ω単位容積当シの細
胞数を計算によってめた０ これらの６時間グロス培養液及び新たに調製したこれら
培養液の希釈液をニトロセルロース〔カリフォルニア洲
、リッチモンドのバイオラドＱラボラトリーズ（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ ）から入手可能な
バイオラド・トランスプロット（商標名）転移培地〕か
らなる固体支持体に施した。このニトロセルロースの一
定界面積への正確な数の細胞の添加は、ニューハンプシ
ャー州、キーンのシュライヒｚ 、１１７ 参アンド・
シュエル（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕ−ａｌ
ｌ）インコーホレーテッドから市販されているマニホー
ルド（Ｍａｎｔ ｆｏｌｄ ｌ登録商標名）と呼ばれる
装置を用いて々された０この装置は、戸−過もしくは固
定化工程中、−緒に締め具で留められて１サンドイツチ
〃構造にされる三つの部分からなる戸通用多岐管である
。このマニホールド装置に、４インチ（’）（１０，１
６ｃｒｎつｘ ５％ ’ （１３，３４ｃｍ）の二枚の
ワットマン３Ｍクロマトグラフィー用紙（英国のワット
マン・リミテッドから入手可能）に裏打ちされた４ ’
ｘ ５５ ’の一枚のニトロセルロース薄膜ｔ−？）付
けｆｃｏこのニトロセルロース及びワットマン紙は、５
ｍｌの１ｘ、５ＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５モルのＮ
ａＣ１、０，０１５Ｍのクエン酸三ナトリウム）中に予
め浸漬した。この薄膜及び裏打ち紙を、装置にクランプ
で留めた。そして、この装置を真空系に継ぎ、累を真空
にした。各ウェルには、０．１０ｍｇの６時間培養後の
Ｅ・、ｃｏｌｉ培養液を加え、それに続くウェルには、
この培養液の一連の希釈液０．１［。
−を加えた。対照のＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓの６時間培
養液もＬｃｏｌｉ培養液に述べたと同様にしてフィルタ
ー上に収集した０さらなる対照として、栄養培地を、も
う一つの一組のウェルに加えた。
養液もＬｃｏｌｉ培養液に述べたと同様にしてフィルタ
ー上に収集した０さらなる対照として、栄養培地を、も
う一つの一組のウェルに加えた。
細胞を含んだこのニトロセルロース薄膜をマニホールド
装置から取シ外し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で
飽和させておいたワットマン３ＭＭ紙上に置いた。この
薄膜は、細胞が常に上面にくるように紙の上に置いた。
装置から取シ外し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で
飽和させておいたワットマン３ＭＭ紙上に置いた。この
薄膜は、細胞が常に上面にくるように紙の上に置いた。
このニトロセルロース薄膜を６５℃で１０分間３ＭＭ紙
に接触させたままにしておき、これをさらに、Ｉ Ｍ
Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，４）に予め浸漬しておいたワット
マン３ＭＭ紙上に置いた。このニトロセルロース薄膜を
この紙と１゜分間６５℃で接触させた。次に、このニト
ロセルロース薄膜を取少除いて、これを０．５ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ 。
に接触させたままにしておき、これをさらに、Ｉ Ｍ
Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，４）に予め浸漬しておいたワット
マン３ＭＭ紙上に置いた。このニトロセルロース薄膜を
この紙と１゜分間６５℃で接触させた。次に、このニト
ロセルロース薄膜を取少除いて、これを０．５ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ 。
１、５ Ｍ ＮａＣｔの溶液（ｐＨ７，４）で飽和させ
たワットマン３ＭＭ紙上に、６５℃で１ｏ分間飲いた。
たワットマン３ＭＭ紙上に、６５℃で１ｏ分間飲いた。
次に、このニトロセルロース薄膜を風乾し、真空オーブ
ン中で、２時間、８０℃でベータした。
ン中で、２時間、８０℃でベータした。
典型的な実験においては、１ｘ１０８，１ｘ１０７゜ｌ
Ｘｌ０’ 、ｌＸｌ０’ 、ｌＸｌ０’、ｌＸｌ０”
、１ｘｌＯ”。
Ｘｌ０’ 、ｌＸｌ０’ 、ｌＸｌ０’、ｌＸｌ０”
、１ｘｌＯ”。
１ｘｌＯ個の細胞を含む試料を各ウェルに入れた。
バタテリオファージＭｌ ３−１０ （ＡＴＣＣ３９４
０３−Ｂｌ）ｌ ｔｕｆ Ａ遺伝子７ラグメント源とし
て用いた。 Ｅ、 ｃｏｌｉのｔｕｆ遺伝子は、蛋白質
ＥＦ−Ｔｕをコードしている。ＥＦ−Ｔｕは、分子量４
３，２２５ の単一のポリペプチド鎖であシ、これは、
蛋白合成における伸長因子であって、アミノアシル−ｔ
ＲＮＡのリボンームＡ部位への移入を取シ持っ０ こ
のＥＦ−Ｔｕはグアニンーヌクレオチｌ’ （ＧＴＰ
）ｔ−ａラグメントである。このｔｕｆ Ａ遺伝子をベ
クターＭｌ ３ｍｐ ９ （ミネソタ州、ピーヴアリー
のニューイングランド・バイオラプズから入手）のＨｉ
ｎｄ ＩトＫ ｃｏ ＲＩの制限エンドヌンレアーゼ部
位Ｍでクローン化した＠ Ｍ１３−１０フアージを増殖させるために用いたエツシ
エリヒャ・コリ宿主微生物は、ＪＭｔｏａ（Δｌａｃ、
ｐｒｏ）、 ５ｕｐＥ 、 ｔｈｉ 、 ５ｔｒＡ 、
ｅｎｄ Ａ ＊ ５ｂｃＢ１５ 、 ｈｓｄ Ｒ４，
ｔｒａＤ３６ 、ｊａｃ ＩｑＺＭ１３であった。
０３−Ｂｌ）ｌ ｔｕｆ Ａ遺伝子７ラグメント源とし
て用いた。 Ｅ、 ｃｏｌｉのｔｕｆ遺伝子は、蛋白質
ＥＦ−Ｔｕをコードしている。ＥＦ−Ｔｕは、分子量４
３，２２５ の単一のポリペプチド鎖であシ、これは、
蛋白合成における伸長因子であって、アミノアシル−ｔ
ＲＮＡのリボンームＡ部位への移入を取シ持っ０ こ
のＥＦ−Ｔｕはグアニンーヌクレオチｌ’ （ＧＴＰ
）ｔ−ａラグメントである。このｔｕｆ Ａ遺伝子をベ
クターＭｌ ３ｍｐ ９ （ミネソタ州、ピーヴアリー
のニューイングランド・バイオラプズから入手）のＨｉ
ｎｄ ＩトＫ ｃｏ ＲＩの制限エンドヌンレアーゼ部
位Ｍでクローン化した＠ Ｍ１３−１０フアージを増殖させるために用いたエツシ
エリヒャ・コリ宿主微生物は、ＪＭｔｏａ（Δｌａｃ、
ｐｒｏ）、 ５ｕｐＥ 、 ｔｈｉ 、 ５ｔｒＡ 、
ｅｎｄ Ａ ＊ ５ｂｃＢ１５ 、 ｈｓｄ Ｒ４，
ｔｒａＤ３６ 、ｊａｃ ＩｑＺＭ１３であった。
この株は、メリーランド州、ガイサーズプルグのベテス
ダ・リサーチ自ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）がら市販
されている。
ダ・リサーチ自ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）がら市販
されている。
上記Ｅ、 ｃｏｌｉの一夜培養液１５−を２ｔのフェル
ンバツハ・フラスコ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ ｆｌａｓｋ
）中の２にＹＴプロス１を中に接種した。この菌株を、
二ニー・ブルンスクイック・ジャイロータ’） （Ｎｅ
ｗ Ｂ−ｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｇｙｒｏｔａｒｙ ＊登録
商標名）振盪機（２０Ｇｒｐｍ）上で、３７℃で３時間
培養した。３時間培養液にＭ１３−１０バタテリオフア
ージ２ｘｌＯ”ＰＦＵ （プラーク形成単位）を加えた
。この感染された株を、上記と同様にして１時間インキ
ュベートした。このとき、１５０＃９のクロラムフェニ
コールをこの培養株に加えた０さらに４５分間インキュ
ベーションを続けた。細胞を遠心（ＧＳＡロータ、ｓ、
Ｏｏｏｒｐｍ、１０分間）にょシ集め、冷２ｘ、ＹＴブ
ロス中で一回洗浄した。洗浄した細胞を４０−の冷１０
Ｘシヨ糖溶液に懸濁させた。溶菌は、２゜キのリゾチー
ム及び１６ｄの０．２５Ｍエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）を添加した後、水浴中で１゜分間インキュベー
トすることによってなされた。
ンバツハ・フラスコ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ ｆｌａｓｋ
）中の２にＹＴプロス１を中に接種した。この菌株を、
二ニー・ブルンスクイック・ジャイロータ’） （Ｎｅ
ｗ Ｂ−ｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｇｙｒｏｔａｒｙ ＊登録
商標名）振盪機（２０Ｇｒｐｍ）上で、３７℃で３時間
培養した。３時間培養液にＭ１３−１０バタテリオフア
ージ２ｘｌＯ”ＰＦＵ （プラーク形成単位）を加えた
。この感染された株を、上記と同様にして１時間インキ
ュベートした。このとき、１５０＃９のクロラムフェニ
コールをこの培養株に加えた０さらに４５分間インキュ
ベーションを続けた。細胞を遠心（ＧＳＡロータ、ｓ、
Ｏｏｏｒｐｍ、１０分間）にょシ集め、冷２ｘ、ＹＴブ
ロス中で一回洗浄した。洗浄した細胞を４０−の冷１０
Ｘシヨ糖溶液に懸濁させた。溶菌は、２゜キのリゾチー
ム及び１６ｄの０．２５Ｍエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）を添加した後、水浴中で１゜分間インキュベー
トすることによってなされた。
溶菌を、４ｄの２ＯＮドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ８
）を加えることにょυ完結せしめた。この溶解混合物を
緩かに混合せしめた。溶解物中の塩化ナトリウム濃度を
、２．９０ｔの塩化ナトリウムを加えることによ、ｂ、
ｉＭに調節した。溶解混合液を４０℃で一晩インキユベ
ートした。この溶解物（１ｙｒａｔａ ）を６０．００
０Ｘｆで３０分間、ベックマン遠心機を用いて４℃で遠
心することによシ清澄にした。得られた上清を、４部の
フェノールと１部のクロロホルムからなるフェノール−
クロロホルム混合物を同容量用いて３回抽出した。抽出
によって得られた水相を２倍容量の冷９５％工゛チルア
ルコールに加えた。この混合物を一７０℃で３０分間イ
ンキュベートした後、４℃で１５分間、１８００ ｘｒ
で遠心した。得られたペレットを７０％のエチルアルコ
ールで洗浄した後、風乾した。
）を加えることにょυ完結せしめた。この溶解混合物を
緩かに混合せしめた。溶解物中の塩化ナトリウム濃度を
、２．９０ｔの塩化ナトリウムを加えることによ、ｂ、
ｉＭに調節した。溶解混合液を４０℃で一晩インキユベ
ートした。この溶解物（１ｙｒａｔａ ）を６０．００
０Ｘｆで３０分間、ベックマン遠心機を用いて４℃で遠
心することによシ清澄にした。得られた上清を、４部の
フェノールと１部のクロロホルムからなるフェノール−
クロロホルム混合物を同容量用いて３回抽出した。抽出
によって得られた水相を２倍容量の冷９５％工゛チルア
ルコールに加えた。この混合物を一７０℃で３０分間イ
ンキュベートした後、４℃で１５分間、１８００ ｘｒ
で遠心した。得られたペレットを７０％のエチルアルコ
ールで洗浄した後、風乾した。
このＤＮＡベレットを０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ （ｐＨ８
）及び０．００１ Ｍ ＥＤＴＡを含む溶液１５ゴに溶
解した。このＤＮＡ溶液を、臭化エチジウムの存在下、
等密度塩化セシワムＳ度勾配遠心に付しミ′線状ＤＮＡ
から共有結合で閉環した環状複製中間体ＤＮＡを分離し
た。このＤＮＡ溶液に、雰囲気温度上、塩化セシウムを
、最終の屈折率が１．３９３０になるまで添加した。１
３０．０００ｘｆで４０分間遠心した後１複製中間体（
ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖａ ｆｏｒｍ ） ＤＮＡを含む
低位バンドを取シ出し、水で飽和せしめたｓｅｅ−プタ
ノールで６ｒｊ：！Ｊ抽出して臭化エチジウムを除去し
た。得られた抽出物を、４℃で、ＴＥ緩衝液（０，０１
ＭＴｒｉｓ 、ｐＨ８，ｏ 、 ０．００１ＭＥＤＴＡ
）に対し、長時間透析した。混在するＲＮＡを除去す
るためニ、透析物１ゴ当シ２５０■のりボヌクレアーゼ
（ＲＮａＳｅ）を加え、得られん溶液を３７℃で１時間
インキュベートした。ＲＮａ ｓｅを除去するために、
溶液を等容量のｏ、 ＩＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ３）で
飽和したフェノールを用いて抽出した。フェノール抽出
の上相をクエン酸三ナトリウム０．３ Ｍにし、−７０
℃で３０分間、２倍容量の冷エータノールを用いて沈澱
を生ぜしめた。この得られた７アージＤＮＡをＴＥ緩、
倶液中に溶かした。
）及び０．００１ Ｍ ＥＤＴＡを含む溶液１５ゴに溶
解した。このＤＮＡ溶液を、臭化エチジウムの存在下、
等密度塩化セシワムＳ度勾配遠心に付しミ′線状ＤＮＡ
から共有結合で閉環した環状複製中間体ＤＮＡを分離し
た。このＤＮＡ溶液に、雰囲気温度上、塩化セシウムを
、最終の屈折率が１．３９３０になるまで添加した。１
３０．０００ｘｆで４０分間遠心した後１複製中間体（
ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖａ ｆｏｒｍ ） ＤＮＡを含む
低位バンドを取シ出し、水で飽和せしめたｓｅｅ−プタ
ノールで６ｒｊ：！Ｊ抽出して臭化エチジウムを除去し
た。得られた抽出物を、４℃で、ＴＥ緩衝液（０，０１
ＭＴｒｉｓ 、ｐＨ８，ｏ 、 ０．００１ＭＥＤＴＡ
）に対し、長時間透析した。混在するＲＮＡを除去す
るためニ、透析物１ゴ当シ２５０■のりボヌクレアーゼ
（ＲＮａＳｅ）を加え、得られん溶液を３７℃で１時間
インキュベートした。ＲＮａ ｓｅを除去するために、
溶液を等容量のｏ、 ＩＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ３）で
飽和したフェノールを用いて抽出した。フェノール抽出
の上相をクエン酸三ナトリウム０．３ Ｍにし、−７０
℃で３０分間、２倍容量の冷エータノールを用いて沈澱
を生ぜしめた。この得られた７アージＤＮＡをＴＥ緩、
倶液中に溶かした。
とのＭ１３−１０複製中間体ＤＮＡを、次に、５ａｌＩ
。
。
ＥｃｏＲＩを用いて適当な条件下で二重消化することに
よ？）、ｔｕｆＡ遺伝子７ラグメントの８００ ｂｐ（
塩基対）の挿入部分がベクターから切り出されるように
、開裂せしめた。
よ？）、ｔｕｆＡ遺伝子７ラグメントの８００ ｂｐ（
塩基対）の挿入部分がベクターから切り出されるように
、開裂せしめた。
Ｅ、ｔｕｆＡフラグメントの単離及び放射性標識化Ｓａ
ｌ Ｉ 、 ＥｃｏＲに重油化Ｍ１３−１０ＤＮＡの濃
度を１００μを当＃）４０μ２の濃度になるように調節
した。
ｌ Ｉ 、 ＥｃｏＲに重油化Ｍ１３−１０ＤＮＡの濃
度を１００μを当＃）４０μ２の濃度になるように調節
した。
水平アカロースゲル電気泳動を、バイオラド・サブセル
（Ｂｉｏ −Ｒａｄ Ｓｕｂ −Ｃａｌ １ 、登録商
標）電気泳動室（バイオラド・ラボラトリーズから入手
）中で行った。０．５μｆ７ｍｌ臭化エチジウムを含む
０．０８９Ｍトリス・ボレート（トリス・ホウ酸５２１
） 、０．０８９Ｍホウ酸、ｏ、ｏ ０２Ｍ ＥＤＴ
Ａ （ＴＢＥ ） （ｐＨ８）緩衝液中の１％低ゲル化
点（ＬＧＴ）アカロースゲル（イリノイ州、ネーパーヴ
イルのマイルス・リサーチ・プロダクツから入手）を、
とのザブ・セル装置中に形成した。Ｍ１３−１０二重消
化ＤＮＡ溶液を１ウェル当り７μ２の濃度でこのゲルに
負荷した０ 電気泳動’１５０−ボルトの電圧をかけて
、雰囲気温度で３時間行った。挿入ｔｕｆ Ａフラグメ
ントＤＮＡをゲルから切シ出した。これらの切り出した
ゲル片を容３５０−のポリプロピレン管中に入れゲルが
融解するまで７０℃で加熱した。融解したゲルは、０．
２Ｍ＋ＮａＣ２，０，０２ｋｉ Ｔｒｉｓ 、 ｐＩ（
７，０、０，００１Ｍ ＥＤＴＡを用いて全量を１０ゴ
に調整した。ＤＮＡは、ニューハンプシャ州、キーンの
シュライヒエル・アンド・シュエルから市販されている
エルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ 、登録商標）ｄカラムを用
いて、このゲル溶液から単離した。手法は、このカラム
の供給元の推奨するものを用いた。エルチップｄカラム
を、１．０Ｍ ＮａＣ１、０，０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ 、 ｐＨ７，３、０，，００１Ｍ ＥＤＴＡの溶液
２ゴで洗浄した。次に、このカラムを、０．２Ｍ Ｎａ
Ｃ４，０，０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、 ｐＩ４６．３
。
（Ｂｉｏ −Ｒａｄ Ｓｕｂ −Ｃａｌ １ 、登録商
標）電気泳動室（バイオラド・ラボラトリーズから入手
）中で行った。０．５μｆ７ｍｌ臭化エチジウムを含む
０．０８９Ｍトリス・ボレート（トリス・ホウ酸５２１
） 、０．０８９Ｍホウ酸、ｏ、ｏ ０２Ｍ ＥＤＴ
Ａ （ＴＢＥ ） （ｐＨ８）緩衝液中の１％低ゲル化
点（ＬＧＴ）アカロースゲル（イリノイ州、ネーパーヴ
イルのマイルス・リサーチ・プロダクツから入手）を、
とのザブ・セル装置中に形成した。Ｍ１３−１０二重消
化ＤＮＡ溶液を１ウェル当り７μ２の濃度でこのゲルに
負荷した０ 電気泳動’１５０−ボルトの電圧をかけて
、雰囲気温度で３時間行った。挿入ｔｕｆ Ａフラグメ
ントＤＮＡをゲルから切シ出した。これらの切り出した
ゲル片を容３５０−のポリプロピレン管中に入れゲルが
融解するまで７０℃で加熱した。融解したゲルは、０．
２Ｍ＋ＮａＣ２，０，０２ｋｉ Ｔｒｉｓ 、 ｐＩ（
７，０、０，００１Ｍ ＥＤＴＡを用いて全量を１０ゴ
に調整した。ＤＮＡは、ニューハンプシャ州、キーンの
シュライヒエル・アンド・シュエルから市販されている
エルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ 、登録商標）ｄカラムを用
いて、このゲル溶液から単離した。手法は、このカラム
の供給元の推奨するものを用いた。エルチップｄカラム
を、１．０Ｍ ＮａＣ１、０，０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ 、 ｐＨ７，３、０，，００１Ｍ ＥＤＴＡの溶液
２ゴで洗浄した。次に、このカラムを、０．２Ｍ Ｎａ
Ｃ４，０，０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、 ｐＩ４６．３
。
０．００１ＭｇＤ’ｌ’Ａからなる溶液０．５−で洗浄
した００．４５８ｍ酢酸セルロースの使い捨て可能ｅＦ
紙をシリンジ（シュライヒエル・アンド・シュエルから
入手）に取シ付け、ＤＮＡ試料をカラムに負荷した。
ＤＮＡはカラムのマトリックスに吸着する〇カラムを０
．２ Ｍ ＮａＣＬ 、 ０．０２ Ｍ’Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＬ、 ｐＦｆ７．３゜０．００１ Ｍ ＥＤＴＡを含
む溶液３ ｍｅで洗浄した。カラムからのＤＮＡ試料の
溶出は、酢酸セルロースＦ紙を除去し、Ｉ Ｍ ＮａＣ
Ｌ 、 ０．０２Ｍ Ｔｒｉ・ｓ −ＨＣＬ 。
した００．４５８ｍ酢酸セルロースの使い捨て可能ｅＦ
紙をシリンジ（シュライヒエル・アンド・シュエルから
入手）に取シ付け、ＤＮＡ試料をカラムに負荷した。
ＤＮＡはカラムのマトリックスに吸着する〇カラムを０
．２ Ｍ ＮａＣＬ 、 ０．０２ Ｍ’Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＬ、 ｐＦｆ７．３゜０．００１ Ｍ ＥＤＴＡを含
む溶液３ ｍｅで洗浄した。カラムからのＤＮＡ試料の
溶出は、酢酸セルロースＦ紙を除去し、Ｉ Ｍ ＮａＣ
Ｌ 、 ０．０２Ｍ Ｔｒｉ・ｓ −ＨＣＬ 。
田６．３．０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む溶液０．４−
を加えることによって行ったｏ ＤＮＡを冷エタノール
で析出せしめ、４０μｔの水に溶かした。
を加えることによって行ったｏ ＤＮＡを冷エタノール
で析出せしめ、４０μｔの水に溶かした。
とのｔｕｆ Ａ遺伝子フラグメントを、以下に述べるよ
うにして、ニック翻訳によってａｌｐで２ベル（標識化
）した。０．９４ｔｔｔのｔｕｆ Ａ ＤＮＡ フラグ
メント、各２０マイクロモルのデオキシシチジン三リン
酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴ
Ｐ）及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）。
うにして、ニック翻訳によってａｌｐで２ベル（標識化
）した。０．９４ｔｔｔのｔｕｆ Ａ ＤＮＡ フラグ
メント、各２０マイクロモルのデオキシシチジン三リン
酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴ
Ｐ）及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）。
０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ −ＩＩＣｌ 、 ｐＨ７，８、
０，００５Ｍ塩化マグネシウム、０．０１Ｍ２−メルカ
プトエタノール。
０，００５Ｍ塩化マグネシウム、０．０１Ｍ２−メルカ
プトエタノール。
０．５０μｔめヌクレアーゼが存在し々い仔ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、 ２単位のＤＮＡポリメラーゼＩ
（メリーランド州、ガイセルスプルグのＢＲＬから入手
）、２００ピコグラムのＤＮａｓｅ Ｉ 、 ０．００
０５Ｍの酢酸マグネシウム、２５０μｔのグリセリン及
び４，８８マイクロモルの４１０ Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅ
の比活性を有する〔α３２Ｐ〕デオキシアデノシン三リ
ン酸（ｄＡＴＰ）からなる反応混合物を調製した。全反
応容量を、蒸留水を用いて５０マイクロリツトルの０．
３ Ｍ Ｎａ２ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ （ｐＨｓ、 ０ ）
ｆ添加することによって停止せしめ、等容量のトリス
で飽和したフェノールを用いて抽出した。抽出混合物を
、セファデックスＧ−５０カラムにュージャージー州、
ビスキャラタウエイのファルマシア・ファイン串ケミカ
ルス社戒）ヲ用いてクロマトグラフィーにかけ、未反応
のデオキシ三リン酸類を除去した。３２ｐ−標ＲＤ Ｎ
ＡフラグメントがＤＮＡ １マイクログラム当１）
８ ｘ １０’、ｃｐｍＯ比活性で全容量４００マイク
ロリツトル中に含まれていた。
ルブミン（ＢＳＡ）、 ２単位のＤＮＡポリメラーゼＩ
（メリーランド州、ガイセルスプルグのＢＲＬから入手
）、２００ピコグラムのＤＮａｓｅ Ｉ 、 ０．００
０５Ｍの酢酸マグネシウム、２５０μｔのグリセリン及
び４，８８マイクロモルの４１０ Ｃｉ／ｍ ｍｏｌｅ
の比活性を有する〔α３２Ｐ〕デオキシアデノシン三リ
ン酸（ｄＡＴＰ）からなる反応混合物を調製した。全反
応容量を、蒸留水を用いて５０マイクロリツトルの０．
３ Ｍ Ｎａ２ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ （ｐＨｓ、 ０ ）
ｆ添加することによって停止せしめ、等容量のトリス
で飽和したフェノールを用いて抽出した。抽出混合物を
、セファデックスＧ−５０カラムにュージャージー州、
ビスキャラタウエイのファルマシア・ファイン串ケミカ
ルス社戒）ヲ用いてクロマトグラフィーにかけ、未反応
のデオキシ三リン酸類を除去した。３２ｐ−標ＲＤ Ｎ
ＡフラグメントがＤＮＡ １マイクログラム当１）
８ ｘ １０’、ｃｐｍＯ比活性で全容量４００マイク
ロリツトル中に含まれていた。
Ｆ、ハイブリダイゼーション（雑種分子形成）の手法
本実施例のＢにおいて述べたニトロセルロース薄膜を、
ハイブリダイゼーションに先立って、薄膜を熱シール可
能な袋〔イリノイ州、シカゴのセ７ズールーバック拳ア
ントカンパニー（５ｅａｒｓ Ｒｕ−ｅｂｕｃｋ ＆
Ｃｏ、 ）からビオルー・ニー・ミール（Ｂｉｏｌ −
Ａ −Ｍｅａｌ 、登録商標）として市販〕 中に入れ
、５０％ホルムアミド〔マテンン・コールマンｅアンド
拳べ／ｌ／ （Ｍａｔｈｅｓｏｎ Ｃｏｌｅｍａｎ ＆
Ｂｅ１ｌ ）社ｆＪ４ ］ 、 ５ｘＳＳＰＥ（Ｉ
Ｘ Ｓ ５ＰＥ＝０．１８Ｍ ＮａＣｔ、０．０１Ｍリ
ン酸ナトリワム、０．００１ Ｍ Ｎａｇ ＥＤＴＡ
、ｐＨ７，０） 、５ Ｘ ＢＦＰ（１ｘＢＦＰ＝０．
０２％〃の仔ウシ血清アルブミン。
ハイブリダイゼーションに先立って、薄膜を熱シール可
能な袋〔イリノイ州、シカゴのセ７ズールーバック拳ア
ントカンパニー（５ｅａｒｓ Ｒｕ−ｅｂｕｃｋ ＆
Ｃｏ、 ）からビオルー・ニー・ミール（Ｂｉｏｌ −
Ａ −Ｍｅａｌ 、登録商標）として市販〕 中に入れ
、５０％ホルムアミド〔マテンン・コールマンｅアンド
拳べ／ｌ／ （Ｍａｔｈｅｓｏｎ Ｃｏｌｅｍａｎ ＆
Ｂｅ１ｌ ）社ｆＪ４ ］ 、 ５ｘＳＳＰＥ（Ｉ
Ｘ Ｓ ５ＰＥ＝０．１８Ｍ ＮａＣｔ、０．０１Ｍリ
ン酸ナトリワム、０．００１ Ｍ Ｎａｇ ＥＤＴＡ
、ｐＨ７，０） 、５ Ｘ ＢＦＰ（１ｘＢＦＰ＝０．
０２％〃の仔ウシ血清アルブミン。
フィニル（Ｆｉｃｏｌｌ） （ＭＷ、 ４０ ｏ、Ｏｏ
ｏ ）及びポリビニルピロリドン）、ＩＸグリシン韮
びに１００μｆ／ｄの変性され高周波処理した担体（キ
ャリアー）サケ精子ＤＮＡからなる溶液１０７！を加え
ることによりてへ処理した・ｉ専膜を・この溶液中で１
時間・４２℃でインキュベートした。次に、この予備ハ
イブリダイゼーション用溶液を除いた０５０％Ｖｖホル
ムアミド、５ Ｘ ５ＳＰＥ、１ｘＢＦＰ、１００μに
駕高周波処理すケ精子ＤＮＡ、１０％ｌデキストラン硫
酸す） ＩＪウム５００及び０．３％ＳＤＳを含む溶液
４−を調製した。この溶液の半分（２ゴ）を、薄膜を含
む袋（バッグ）中に加え、混合した。ラベルされたプロ
ーブＤＮＡを、該ＤＮＡｔ１０ｍＭ ）リス（ｐＨ７，
５） 、 １ ｍＭ ＥＤＴＡの溶液中で、１０分間、
９５℃で加熱し、続いて水浴中で迅速に冷やした。この
変性・されたプローブＤＮＡを１薄膜当シ５ ｘ４０６
Ｃｐｍを与えるに充分な量、残シの溶液２−に加えた
０このプローブを含む２艷の溶液を次に、袋に加え、内
容物を混合した。袋は、ヒート・シーラーを用いてシー
ルした。
ｏ ）及びポリビニルピロリドン）、ＩＸグリシン韮
びに１００μｆ／ｄの変性され高周波処理した担体（キ
ャリアー）サケ精子ＤＮＡからなる溶液１０７！を加え
ることによりてへ処理した・ｉ専膜を・この溶液中で１
時間・４２℃でインキュベートした。次に、この予備ハ
イブリダイゼーション用溶液を除いた０５０％Ｖｖホル
ムアミド、５ Ｘ ５ＳＰＥ、１ｘＢＦＰ、１００μに
駕高周波処理すケ精子ＤＮＡ、１０％ｌデキストラン硫
酸す） ＩＪウム５００及び０．３％ＳＤＳを含む溶液
４−を調製した。この溶液の半分（２ゴ）を、薄膜を含
む袋（バッグ）中に加え、混合した。ラベルされたプロ
ーブＤＮＡを、該ＤＮＡｔ１０ｍＭ ）リス（ｐＨ７，
５） 、 １ ｍＭ ＥＤＴＡの溶液中で、１０分間、
９５℃で加熱し、続いて水浴中で迅速に冷やした。この
変性・されたプローブＤＮＡを１薄膜当シ５ ｘ４０６
Ｃｐｍを与えるに充分な量、残シの溶液２−に加えた
０このプローブを含む２艷の溶液を次に、袋に加え、内
容物を混合した。袋は、ヒート・シーラーを用いてシー
ルした。
ハイブリダイゼーション混合物を４２℃、で２０時間イ
ンキュベートした。次に、ニトロセルロース薄膜をハイ
ブリダイゼーション溶液から取り出し、これを、２ＸＳ
ＳＰＥ及び０．２％ＳＤＳの溶液で洗浄した。この洗浄
を４５℃で４回縁シ返した。
ンキュベートした。次に、ニトロセルロース薄膜をハイ
ブリダイゼーション溶液から取り出し、これを、２ＸＳ
ＳＰＥ及び０．２％ＳＤＳの溶液で洗浄した。この洗浄
を４５℃で４回縁シ返した。
′薄膜を風乾し、Ｘ線フィルム（デュポンクロネツクス
４）と接触させ、１ライトニング・プラス（Ｌｉｇｈｔ
ｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ） ’増巾ｘｙリーンを備えたフ
ィルムカセット（デュポン社よシ入手）に入れた。
４）と接触させ、１ライトニング・プラス（Ｌｉｇｈｔ
ｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ） ’増巾ｘｙリーンを備えたフ
ィルムカセット（デュポン社よシ入手）に入れた。
フィルムを適当々時間（これは、プローブＤＮＡ６特異
性及び比活性並びにハイブリダイゼーション反応の速度
によって変わる）Ｘ線フィルムに曝したＯ 本実施例におけるような典型的な実験においては、エツ
シエリヒア・コリ随０６３からなるＩ Ｘ １０’の細
菌の存在を、グローブとしてｔｕｆ Ａ遺伝子で２グメ
ン）ｔ−用いて検出した。ダラム陽性菌バチルス・ズブ
チリス、すなわち、非尿路単離菌の存在は、たとえ、１
ｘｌＯ’コも存在していても、検出されなかった〇 実施例 ２ 試験菌がエンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａ
ｃｔ−ａｒｉａｃｅａｅ ）科メ圏と種で言えば、エツ
シエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍ１
ｒａｂｉｌｉｓ ）、エンテロバクター−クロアセアエ
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｅｔｅｒ ｃｌｏａｃａａｅ ）
、 ｘ：ｙテロバクター―エーロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｎｅｓ ） ＋シトロバクタ
ー・７０インデイイ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔａｒｆｒｅｕ
ｎｄｉｉ ）、 ハフニア・アルヴエイ（Ｈａｆｎｉａ
ａｌｖｅｉ）。
性及び比活性並びにハイブリダイゼーション反応の速度
によって変わる）Ｘ線フィルムに曝したＯ 本実施例におけるような典型的な実験においては、エツ
シエリヒア・コリ随０６３からなるＩ Ｘ １０’の細
菌の存在を、グローブとしてｔｕｆ Ａ遺伝子で２グメ
ン）ｔ−用いて検出した。ダラム陽性菌バチルス・ズブ
チリス、すなわち、非尿路単離菌の存在は、たとえ、１
ｘｌＯ’コも存在していても、検出されなかった〇 実施例 ２ 試験菌がエンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａ
ｃｔ−ａｒｉａｃｅａｅ ）科メ圏と種で言えば、エツ
シエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍ１
ｒａｂｉｌｉｓ ）、エンテロバクター−クロアセアエ
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｅｔｅｒ ｃｌｏａｃａａｅ ）
、 ｘ：ｙテロバクター―エーロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｎｅｓ ） ＋シトロバクタ
ー・７０インデイイ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔａｒｆｒｅｕ
ｎｄｉｉ ）、 ハフニア・アルヴエイ（Ｈａｆｎｉａ
ａｌｖｅｉ）。
クレプジエ？・ニューモニアエ（ＫｌｅｂＳｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕ −ｍｏｎｉａｅ ） 、クレブシェラ番オ
キシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ ’）
ｒモルカネラ・モルカンニ（Ｍｏｒｇａｎａｌｌａｍ
ｏｒｇａｎｎｉ） 、セラチア・ルビデアエ（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ ｒｕｂｉ−ｄ＠Ｉｌｅ ） ＋プロビデンシ
ア・スチュアルティイ（Ｐｒｏ−ｖｉｄａｎｃｉａ ５
ｔｕａｒｔｉｉ ）及びタレブジエラ・オザエナエ（Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ ）並びに科スト
レプトコツカセアエ（８ｔｒａ、ｐｔｏｃｏｃｃａｃｅ
ｂｅ ）＋エンテロコツカス（Ｅｎ−ｔｅｒＯｃｏｃｃ
ｕｓ ） ＊ミクロコツカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃ
ａｃａａ＊）＋さらにはスタフィロコッカス・アウレウ
ス（５ｔａ−ｐｈｙｌｏｃｏｃｅｕｓ ａｕｒｅｕｓ
）である場合には、ゲノムＤ役人の単離法は、スタフィ
ロコッカス・アウレウスの場合を除き、実質的に同じで
ある。
ｐｎｅｕ −ｍｏｎｉａｅ ） 、クレブシェラ番オ
キシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ ’）
ｒモルカネラ・モルカンニ（Ｍｏｒｇａｎａｌｌａｍ
ｏｒｇａｎｎｉ） 、セラチア・ルビデアエ（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ ｒｕｂｉ−ｄ＠Ｉｌｅ ） ＋プロビデンシ
ア・スチュアルティイ（Ｐｒｏ−ｖｉｄａｎｃｉａ ５
ｔｕａｒｔｉｉ ）及びタレブジエラ・オザエナエ（Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ ）並びに科スト
レプトコツカセアエ（８ｔｒａ、ｐｔｏｃｏｃｃａｃｅ
ｂｅ ）＋エンテロコツカス（Ｅｎ−ｔｅｒＯｃｏｃｃ
ｕｓ ） ＊ミクロコツカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃ
ａｃａａ＊）＋さらにはスタフィロコッカス・アウレウ
ス（５ｔａ−ｐｈｙｌｏｃｏｃｅｕｓ ａｕｒｅｕｓ
）である場合には、ゲノムＤ役人の単離法は、スタフィ
ロコッカス・アウレウスの場合を除き、実質的に同じで
ある。
ゲノムＤＮＡの一般的手法を、以下、先のパラグラフに
列挙した全ての微生物について述べる０前述の各微生物
を、１％トリプトース、０．３％ビーフ・エキス、０，
１％カザミノ酸（ディフコ・ラボラトリーズよシ入手）
及び０．５％塩化ナトリウムからなるＴＢＢ＋ＣＡＡ培
地ｌｔ中、空気を吹込みな 。
列挙した全ての微生物について述べる０前述の各微生物
を、１％トリプトース、０．３％ビーフ・エキス、０，
１％カザミノ酸（ディフコ・ラボラトリーズよシ入手）
及び０．５％塩化ナトリウムからなるＴＢＢ＋ＣＡＡ培
地ｌｔ中、空気を吹込みな 。
がら１８時間培養した。菌体を遠心によって集め、０、
１５ Ｍ ＮａＣＬ及び０．０１５Ｍクエン酸三ナトリ
ウムの溶液（４ＸＳＳＣ）７５ｄ中で洗浄した。次に、
この菌体を１ｘＳＳＣ２ｓ−と０．２５ Ｍ ＥＤＴＡ
１．５ ｔＭ ’の混合物中に懸濁せしめた。溶菌及
びＲＮＡ の分解を、１．２５ｆｆＶのリゾチーム（卵
白結晶性リゾチーム、イリノイ州、ネーバーヴイルのマ
イルス・ラボラトリーズから市販）及び７．５１１９の
ｉＮ’ｈ・ａｓｅを加えた後１３７℃で１時間インキュ
ベート”する。
１５ Ｍ ＮａＣＬ及び０．０１５Ｍクエン酸三ナトリ
ウムの溶液（４ＸＳＳＣ）７５ｄ中で洗浄した。次に、
この菌体を１ｘＳＳＣ２ｓ−と０．２５ Ｍ ＥＤＴＡ
１．５ ｔＭ ’の混合物中に懸濁せしめた。溶菌及
びＲＮＡ の分解を、１．２５ｆｆＶのリゾチーム（卵
白結晶性リゾチーム、イリノイ州、ネーバーヴイルのマ
イルス・ラボラトリーズから市販）及び７．５１１９の
ｉＮ’ｈ・ａｓｅを加えた後１３７℃で１時間インキュ
ベート”する。
ことによって行った。混合物に０．７−容量め２５％５
Ｄｊ９を加え、イン中ユベー？ けた後、１０ｄの蒸留水及び５−の５Ｍ過塩素酸ナトリ
ウムを添加した。蛋白質は、溶菌物（ライセード）を５
０ｍ１のクロロホルム−インアミルアルコール（比２４
：１）で抽出することによって除去した。上層を除き、
１０１９のプロナーゼを添加し得られた混合物を、ゆっ
〈シかきまぜながら３７℃で２時間インキュベートした
。この混合物を、５０ｄのクロロホルム−インアミルア
ルコールで抽出した。水層を、もう一度、クロロホルム
−インアミルアルコールで抽出した０上層のＤＮＡを２
倍容量の冷９５％エタノールで析出せしめた。
Ｄｊ９を加え、イン中ユベー？ けた後、１０ｄの蒸留水及び５−の５Ｍ過塩素酸ナトリ
ウムを添加した。蛋白質は、溶菌物（ライセード）を５
０ｍ１のクロロホルム−インアミルアルコール（比２４
：１）で抽出することによって除去した。上層を除き、
１０１９のプロナーゼを添加し得られた混合物を、ゆっ
〈シかきまぜながら３７℃で２時間インキュベートした
。この混合物を、５０ｄのクロロホルム−インアミルア
ルコールで抽出した。水層を、もう一度、クロロホルム
−インアミルアルコールで抽出した０上層のＤＮＡを２
倍容量の冷９５％エタノールで析出せしめた。
得られたＤＮＡを無菌蒸留水もしくは０．ｌＸ５ＳＣに
溶かした、 スタフィロコッカス・アウレウスの場合には、溶菌ヲリ
ンスタフイン〔ミズリー州、セントルイスのシグマ−ケ
ミカル・カン。
溶かした、 スタフィロコッカス・アウレウスの場合には、溶菌ヲリ
ンスタフイン〔ミズリー州、セントルイスのシグマ−ケ
ミカル・カン。
ｍ１ｃａｌ Ｃｏ、）から市販〕を用い、この酵素３７
５ ｔｔｔを加えて、ｌｔの培養物から回収されたバイ
オマス番溶菌することによって行った〇 ＤＮＡ濃度は、工−−−ル・そ−カン（Ａ、 Ｒ，、。
５ ｔｔｔを加えて、ｌｔの培養物から回収されたバイ
オマス番溶菌することによって行った〇 ＤＮＡ濃度は、工−−−ル・そ−カン（Ａ、 Ｒ，、。
Ｍｏｒｇａｎ ）らによってニュクレイツク醗アシズｄ
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄＳ Ｒ５５ｅａｒ
ｃｈ） ７ ： ５４７−５９４（１９７９）に記賊さ
れている螢光試験法を用いることによつ゛て測定した。
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄＳ Ｒ５５ｅａｒ
ｃｈ） ７ ： ５４７−５９４（１９７９）に記賊さ
れている螢光試験法を用いることによつ゛て測定した。
本実施例のＡにおいて各微生物から得られたのシグマ・
ケミカル・カンパニーから入手）９試 。
ケミカル・カンパニーから入手）９試 。
ｔｔｆ／ｐｔ、 ０．２０ ｎｆ／ｌｌＬ 、 ０．０
２ ｎｆ／ｐＬ及び２、Ｏｐｆ／ｌｉＬ 。
２ ｎｆ／ｐＬ及び２、Ｏｐｆ／ｌｉＬ 。
に調整した。これら６種のＤＮＡ濃度を有す不ものをジ
ーン・スクリーン（Ｇａｎｇ −５ｃｒｅｅｎ、登録商
標） 。
ーン・スクリーン（Ｇａｎｇ −５ｃｒｅｅｎ、登録商
標） 。
ｉ［マサチューセラ州、ボストンのニュニイ’７’ 、
′グランド・ニューフレアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｎｕｃｌｅａｒ、）社製〕に塗布した。この薄膜の一
定表面積に対ル゛ 。
′グランド・ニューフレアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｎｕｃｌｅａｒ、）社製〕に塗布した。この薄膜の一
定表面積に対ル゛ 。
て正確な容量のＤＮＡ溶液を塗布するには、シュライヒ
エル・アンド・シュエルから出ているＭａｎｊｆ６１ｄ
濾過装置を用いた（本実施例のＢ参照）。この凪−ｎｉ
ｆｏｌｄ装置は１ＸＳＳＣで予め湿らせておいた一枚の
４’ｘ５ｊｊ’（１０，１６ｘ１３．３４ｃｒｎ）のニ
トロセルロース薄膜を備えていた。Ｍａｎｉｆｏｌｄ装
置を真をにして上述した各微生物、生体からの各濃度の
ＤＮＡ溶液５マイクロリツトルを加えた。この薄膜を風
乾したのち、薄膜を２−５ Ｍ ＮａＣＬ及び０．５
Ｍ ＮａＯＨからなる変性用溶液に２分間浸漬した。続
いて、薄膜を３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｌ（５，５）から
なる中和用溶液に浸漬した０過剰の溶液は、ワットマン
３Ｍ紙を用いて吸い取って除去した。次に、この薄膜を
、８０℃で１時間、真壁オープ、ン中でベーてした０ 実施例１のＤ参照 標識化 実施例１のＥ参照 Ｅ、ハイブリダイゼーションの手法 実施例１のＦ参照 本実施例におけるごとき典型的な実験においては、結果
は表Ａに示すごときものであった。
エル・アンド・シュエルから出ているＭａｎｊｆ６１ｄ
濾過装置を用いた（本実施例のＢ参照）。この凪−ｎｉ
ｆｏｌｄ装置は１ＸＳＳＣで予め湿らせておいた一枚の
４’ｘ５ｊｊ’（１０，１６ｘ１３．３４ｃｒｎ）のニ
トロセルロース薄膜を備えていた。Ｍａｎｉｆｏｌｄ装
置を真をにして上述した各微生物、生体からの各濃度の
ＤＮＡ溶液５マイクロリツトルを加えた。この薄膜を風
乾したのち、薄膜を２−５ Ｍ ＮａＣＬ及び０．５
Ｍ ＮａＯＨからなる変性用溶液に２分間浸漬した。続
いて、薄膜を３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｌ（５，５）から
なる中和用溶液に浸漬した０過剰の溶液は、ワットマン
３Ｍ紙を用いて吸い取って除去した。次に、この薄膜を
、８０℃で１時間、真壁オープ、ン中でベーてした０ 実施例１のＤ参照 標識化 実施例１のＥ参照 Ｅ、ハイブリダイゼーションの手法 実施例１のＦ参照 本実施例におけるごとき典型的な実験においては、結果
は表Ａに示すごときものであった。
菌 本山ψ菌
これらの結果は、ｔｕｆＡ遺伝子プローブが腿感染症の
病因である殆んど全ての微生物のＤＮＡ と雑種分子形
成を行うことができることを示している。対照ＤＮＡ試
料、すなわち、バチルス・ズブチリス、土壌中機生物及
びヒトのＤＮＡはｔｕｆ遺伝子と雑種分子形成を行わな
い。
病因である殆んど全ての微生物のＤＮＡ と雑種分子形
成を行うことができることを示している。対照ＤＮＡ試
料、すなわち、バチルス・ズブチリス、土壌中機生物及
びヒトのＤＮＡはｔｕｆ遺伝子と雑種分子形成を行わな
い。
実施例３
二と
次に示す微生物をＴＢＡＢ［）リプドース・ブラッド・
アーガー・ペース（Ｔｒｉｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａ
ｇａｒ Ｂａ５ｅ 、）リプドース血液寒天培地）〕−
ディフコ寒天板＋カザミノ酸（ＣＡ）上で一夜培養し単
一コロニー株を得た。
アーガー・ペース（Ｔｒｉｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａ
ｇａｒ Ｂａ５ｅ 、）リプドース血液寒天培地）〕−
ディフコ寒天板＋カザミノ酸（ＣＡ）上で一夜培養し単
一コロニー株を得た。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ａ５Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ａ６Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｓ Ｂ４Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｓ Ｂ５Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍ１ｒａｂｉ
ｌｉｓ Ｃ２Ｅｎｔａｒｏｂａｃｔａｒ ｃｌｏａｃａ
ａ Ｄ４Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ Ｃ
７各タイプの微生物からの単一コロニー分離株を、１０
ｄ（７）ＴＢＡＢ＋ＣＡプロスへの接種に用いた。
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ａ６Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｓ Ｂ４Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｓ Ｂ５Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍ１ｒａｂｉ
ｌｉｓ Ｃ２Ｅｎｔａｒｏｂａｃｔａｒ ｃｌｏａｃａ
ａ Ｄ４Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ Ｃ
７各タイプの微生物からの単一コロニー分離株を、１０
ｄ（７）ＴＢＡＢ＋ＣＡプロスへの接種に用いた。
これらの菌株を３７℃で一夜培養した。各培養物を４℃
でＴＢＡＢ＋ＣＡ中で１０−２ないし１ｏ−７に希釈し
、すべての増殖を停止せしめた。それぞれの希釈物をＴ
ＢＡＢ＋ＣＡ寒天板に植え、培地ｌ−当シの生菌数を測
定した。また、各希釈物１ｍをシリコーン処理したチュ
ーブに移し、各チューブに次のものを添加した。すなわ
ち、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ 、 ｌ ｍＲ４ＥＤＴＡ緩
衝液、 ｐＨ８に溶かしたリゾチーム（１０ｑ／−）溶
液５０マイクロリツトル、０．２ Ｎ Ｎａ０Ｈ（水酸
化す） ＩＪウム）に溶かした１％ＳＤＳ溶液１００マ
イクロリットル、並びに３．６ Ｍ ＮａＣ１。
でＴＢＡＢ＋ＣＡ中で１０−２ないし１ｏ−７に希釈し
、すべての増殖を停止せしめた。それぞれの希釈物をＴ
ＢＡＢ＋ＣＡ寒天板に植え、培地ｌ−当シの生菌数を測
定した。また、各希釈物１ｍをシリコーン処理したチュ
ーブに移し、各チューブに次のものを添加した。すなわ
ち、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ 、 ｌ ｍＲ４ＥＤＴＡ緩
衝液、 ｐＨ８に溶かしたリゾチーム（１０ｑ／−）溶
液５０マイクロリツトル、０．２ Ｎ Ｎａ０Ｈ（水酸
化す） ＩＪウム）に溶かした１％ＳＤＳ溶液１００マ
イクロリットル、並びに３．６ Ｍ ＮａＣ１。
０．２ Ｍ ＮａＨ，ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０，１６Ｍ Ｎ
ａＯＨ及び０．０２０ＭＮａ！ＥＤＴＡからなる変性２
０ＸＳＳＰＩＯ，，５ｍｌで６る。
ａＯＨ及び０．０２０ＭＮａ！ＥＤＴＡからなる変性２
０ＸＳＳＰＩＯ，，５ｍｌで６る。
この８８ＰＥは、充分なｉｆ ＯＯ，２Ｎ ＮａＯＨを
加えて、２０ｘＳＳＰＥのｐｉ（を７．４に調整するこ
とによって変性した。この混合物の使用目的は、細菌の
細胞を破壊、溶解させ、菌体から遊離したＤＮＡを変性
することである。各タイプの菌体からの全溶菌混合物の
試料を、実施例１のＢの方法に従って、固形状のニトロ
セルロース支持体（相体）に施した〇Δ（ａｎｉｆｏｌ
ｄ装置の各ウェルに、各試料の細胞溶解物全量（細胞を
含むプロス希釈液及び溶菌剤１ｄを含む）を加えた。
加えて、２０ｘＳＳＰＥのｐｉ（を７．４に調整するこ
とによって変性した。この混合物の使用目的は、細菌の
細胞を破壊、溶解させ、菌体から遊離したＤＮＡを変性
することである。各タイプの菌体からの全溶菌混合物の
試料を、実施例１のＢの方法に従って、固形状のニトロ
セルロース支持体（相体）に施した〇Δ（ａｎｉｆｏｌ
ｄ装置の各ウェルに、各試料の細胞溶解物全量（細胞を
含むプロス希釈液及び溶菌剤１ｄを含む）を加えた。
哺乳動物細胞の対照培養物〔濃度１ゴ当シｌｘ １０’
コ（血球計算器にて測定）〕及びこれらの細胞の逐次希
釈物もまた微生物培養物について述べたと同様にして溶
解せしめ、フィルター上に集めた。
コ（血球計算器にて測定）〕及びこれらの細胞の逐次希
釈物もまた微生物培養物について述べたと同様にして溶
解せしめ、フィルター上に集めた。
各試料及び対照について２回づつ行った。
本実施例において上述したニトロセルロース薄膜をハイ
ブリダイゼーションに先立ち、セアーズ会し−バック・
アンド・カンパニーから市販されている熱封止可能な袋
にこの薄膜を入れ、５ＸＢＦＰ（１ｘＢ、ＦＰ＝０．０
２％力仔ウシ血清アルブミン、分子＄４００，０００の
Ｆｉｃｏｌｌ及びポリビニルピロリドン）、５ＸＳＳＰ
Ｅ、０．３％ＳＤＳ並びに１００ ｆｉｔ／ｍｌのサケ
精子ＤＮＡからなる溶液１０−を加えることにより予備
処理した。この薄膜を、この溶液中で 。
ブリダイゼーションに先立ち、セアーズ会し−バック・
アンド・カンパニーから市販されている熱封止可能な袋
にこの薄膜を入れ、５ＸＢＦＰ（１ｘＢ、ＦＰ＝０．０
２％力仔ウシ血清アルブミン、分子＄４００，０００の
Ｆｉｃｏｌｌ及びポリビニルピロリドン）、５ＸＳＳＰ
Ｅ、０．３％ＳＤＳ並びに１００ ｆｉｔ／ｍｌのサケ
精子ＤＮＡからなる溶液１０−を加えることにより予備
処理した。この薄膜を、この溶液中で 。
１時間、？（１℃でインキュベートしたのち、予備ハイ
ブリダイゼーション用溶液を除去した。５×８ＳＰＥ、
ＩＸＢＦＰ、１１１０μｆ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ及び０
．３ Ｘ Ｓ Ｄ ８を含む溶液１０ゴを調委した。こ
の溶液の半分（５ｍｌ ）を薄膜を含む袋の中に加え、
混合した。ラベルされたプローブＤＮＡ（実施例１のＥ
からのｆｕｆフラグメント）を、１０ ｍ Ｍ Ｔｒｉ
ｓ（ｐＨ７，５） 、 １ ｍＭ ＥＤＴＡの溶液中で
、９５℃に加熱し、しかるのち、水浴中で素早く冷却す
ることによって変性した。かくして得られた変性プロー
ブＤＮＡを、薄膜１枚当、ｊ）５ｘｌＯ’ｃｐｍを与え
るに充分な量で、残シの５−の溶液に加えた。次に、こ
のプローブを含む溶液を袋に加え、袋を熱でシールした
。
ブリダイゼーション用溶液を除去した。５×８ＳＰＥ、
ＩＸＢＦＰ、１１１０μｆ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ及び０
．３ Ｘ Ｓ Ｄ ８を含む溶液１０ゴを調委した。こ
の溶液の半分（５ｍｌ ）を薄膜を含む袋の中に加え、
混合した。ラベルされたプローブＤＮＡ（実施例１のＥ
からのｆｕｆフラグメント）を、１０ ｍ Ｍ Ｔｒｉ
ｓ（ｐＨ７，５） 、 １ ｍＭ ＥＤＴＡの溶液中で
、９５℃に加熱し、しかるのち、水浴中で素早く冷却す
ることによって変性した。かくして得られた変性プロー
ブＤＮＡを、薄膜１枚当、ｊ）５ｘｌＯ’ｃｐｍを与え
るに充分な量で、残シの５−の溶液に加えた。次に、こ
のプローブを含む溶液を袋に加え、袋を熱でシールした
。
このハイブリダイゼーション用混合物を、７０℃で１６
時間インキュベートした。次に、ニトロセルロース薄膜
をハイブリダイゼーション用溶液から取シ出し、５ｘ８
ＳＰＥ及び０．５ＸＳＤ８Ｏ溶液中で洗浄した。この洗
浄を７０℃で４回繰返した・次に、薄膜を風乾し、続い
て、これらの薄膜を、Ｍａｎｉｆｏｌｄの各ウェルに包
含されたフィルター面精及び各ウェルと等しい境界面積
を切り出すように裁断した。この正方形のフィルター５
ｍｌのアクアゾル（Ａｑｕａｓｏｌ 、登録商標）フ
ルオｐｖ （ｆｌｕｏｒ ） （−ｑサチューセッ州、
ヴイレリヵのニュー・イングランド・ニューフレア社製
）を含む個々のシンチレーション・バイアル中に入れた
。もう−組の、各タイプの細胞の試料及びその逐次希釈
物についてハ、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ ）シンチ
レーションｅカウンターで計数した。
時間インキュベートした。次に、ニトロセルロース薄膜
をハイブリダイゼーション用溶液から取シ出し、５ｘ８
ＳＰＥ及び０．５ＸＳＤ８Ｏ溶液中で洗浄した。この洗
浄を７０℃で４回繰返した・次に、薄膜を風乾し、続い
て、これらの薄膜を、Ｍａｎｉｆｏｌｄの各ウェルに包
含されたフィルター面精及び各ウェルと等しい境界面積
を切り出すように裁断した。この正方形のフィルター５
ｍｌのアクアゾル（Ａｑｕａｓｏｌ 、登録商標）フ
ルオｐｖ （ｆｌｕｏｒ ） （−ｑサチューセッ州、
ヴイレリヵのニュー・イングランド・ニューフレア社製
）を含む個々のシンチレーション・バイアル中に入れた
。もう−組の、各タイプの細胞の試料及びその逐次希釈
物についてハ、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ ）シンチ
レーションｅカウンターで計数した。
この実験の結果は我Ｂに示されている。
本発明は、上述の通９詳細に記載され、例示された。本
発明の多くの他の変形及び修正を、本発明の範囲を逸脱
することなく、行うことができることは明白なことであ
る。
発明の多くの他の変形及び修正を、本発明の範囲を逸脱
することなく、行うことができることは明白なことであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 試験試料中の細菌を測定する方法であって、次の
工程、ずなわち、 （ａ） 試験試料を、試料中に存在する細菌に由来する
核酸を遊離し、変性せしめる条件に曝し； （ｂｌ −得られた一本鎖核酸を、ｔｕｆ及びｆｕｓ遺
伝子から選ばれる遺伝子の鎖の１つの少なくとも一部分
の塩基配列を含むポリヌクレオチドプローブと、該プロ
ーブと該細菌のゲノム核酸中の相同塩基配列間のハイブ
リダイゼーション（雑種分子形成）に好都合な条件下で
、接触せめ； （ｅ） 雑種分子形成に与ったプローブの存在を測定す
る、 ことを特徴とする測定方法。 ２、 該相同塩基配列の長さが少なくとも１０塩基であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 該遺伝子がＥ、ｃｏｌｉ ｔｕｆ遺伝子である特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ４、 該試験試料が哺乳動物の体液である特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ５、 該体液が尿である特許請求の範囲第４項記載の方
法。 ６、該遺伝子がｔｕｆ遺伝子である特許請求の範囲第５
項記載の方法。 ７、 該遺伝子がｆｕｓ遺伝子である特許請求の範囲第
５項記載の方法。 ８、検出さるべき該細菌が、科、エンテロバクテリアセ
アエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ）、シ
ュードモナダセアｘ （ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅ
ａｅ ）及びストレプトコッカセアエ（５ｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃａｃｅａｅ）に属する特許請求の範囲第５項記
載の方法。 ９、検出さるべき該細菌が、属、エツシュリヒア（ｌｉ
：５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂ
ｓｉｅ−１ｌａ）、エンテロバクタ−（Ｉｎｔｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ）、プロプウス（ｐｒｏｔｅｕｓ ）、シ
ュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）及びストレ
プトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ）に属す
る特許請求の範囲第５項記載の方法０ １０ 哺乳動物尿中の細菌を測定する方法であって、次
の工程、すなわち、 （ａｌ 該尿の試料を、該試料中に存在する細菌由来の
ゲノム核酸を遊離し、変性せしめる条件に曝し； （ｂｌ 得られた一本鎖核酸を固体状支持体（担体）に
固定し； （ｃｌ 該固体状支持体を、ｔｕｆ遺伝子配列の鎖の１
つの少なくとも１０塩基からなる塩基配列を有するラベ
ルされたポリヌクレオチド・プローブと接触せしめ； （ｄ） 雑種分子形成に与らなかったラベルされたプロ
ーブを、該固体状支持体から分離し；（ｅ） 該支部に
結びついた雑種分子形成に与ったラベルされたプローブ
を、該ラベル化プローブ中のラベルを測定することによ
り、測定する、 ことを特徴とする測定方法。 １１、該ｔｕｆ遺伝子がＥ、ｃｏｌｉ遺伝子である特許
請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ 工程（ｂ）において、工程（ａ）で生成した一本
鎖ＤＮＡを該固体状支持体に吸着せしめたのち、その支
持体妄外来性の核酸で処理して、支持体上に残っている
全ての核酸吸着部位を実質的に飽和せしめる特許請求の
範囲第１０項記載の方法。 １３、検出さるべき該細菌が、科、エンテロ了（クテリ
アセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ）
、シュードモナダセアエ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃ
ｅａｅ ）及びストレプトコッカセアエ（５ｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）に属する特許請求の範囲第１０
項記載の方法０１４、検出さるべき該細菌が、属、エツ
シュリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ） 、クレブシ
ェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ） 、エンテロバクタ−（
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ）、プロテウス（ｐｒｏｔ
ｅｕｓ ） 、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ）及びストレプトコッカス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ）に属する特許請求の範囲第１０項記載の方法
。 １５、試験試料中に口１菌検出用のラベルされたポリヌ
クレオチド・プローブであって、ｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝
子から選ばれる遺伝子の鎖の１つの少なくとも一部分の
塩基配列を有するポリヌクレオチド・プローブに組込ま
れたラベルを含むことを特徴とするプローブ。 １６、該ラベル化プローブ中の該塩基配列が少なくとも
約１０塩基を含む特許請求の範囲第１５項記載のラベル
されたプローブ。 １７ 該遺伝子がＥ、ｃｏｌｔ ｔｕｆ遺伝子である特
許請求の範囲第１５項記載のラベルされたプローブ０ １８、該ラベルが、抗ノ・ブテン抗体と、酵素、酵素基
質、酵素コファクター、酵素調節剤、螢光体及び化学発
光体から選ばれる検出可能な分子との複合体と結合する
ことによって検出可能なハブテンである特許請求の範囲
第１５項記載のラベルされたプローブ。 １９、検出さるべき該細菌が、科、エンテロバクテリア
セアｘ （Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ）
、シュードモナダセアｘ （ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａ
ｃｅａｅ ）及びストレプトコッカセアエ（５ｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）に属する特許請求の範囲第１
５項記載の方法。 ２０、検出さるべき該ｍ菌が、属、エツシエリヒア（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ） 、クレブシェラ（Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ、）、プロテウス（ｐｒｏｔｅｕｓ ）、シュ
ードモナｘ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏ−ｎａｓ ）及びスト
レプトコッカス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ−ｕｓ）に属
する特許請求の範囲ｇｉｓ項記載の方法。 ２１、核酸ハイブリダイゼーション技術によって、試験
試料中の細菌を検出するために用いられる試験用キット
であって、 （１）該試験試料を処理して、該試料中に存在する細菌
由来のゲノム核酸を遊離、変性せしめることによって生
成する一本鎖核酸を固定化することができる固体状支持
体；及（２１ｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝子から選ばれる遺伝
子の鎖の１つの少なくとも一部分の塩基配列を含むラベ
ルきれたポリヌクレオチド・プローブ からなることを特徴とする試験用キット０２２、該ラベ
ル化プローブの該遺伝子塩基配列が、少なくとも約１０
塩基からなる特許請求の範囲第２１項記載の試験用キッ
ト。 ２３、該遺伝子がＥ、ｃｏｌｉ ｔｕｆ遺伝子である特
許請求の範囲第２１項記載の試験用キット。 ２４、該固体状支持体が一本鎖核酸を吸着することがで
きる特許請求の範囲第２１項記載の試験用キット。 ２５、該試験用キットが、さらに、該試料中に存在する
細菌由来の該一本領核酸を固定したのちに該支持体上の
核酸吸着部位を実質的に飽和させるために用いられる外
来性の核酸を含む特許請求の範囲第冴項記載の試験用キ
ット。 ２６、試験試料を処理して、その中に存在する細菌に由
来する一本鎖ゲツム核酸を遊離せしめるための化学的な
分解、変性剤を、さらに、含む特許請求の範囲第２１項
記載の試験用キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52052583A | 1983-08-05 | 1983-08-05 | |
| US520525 | 1983-08-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60110299A true JPS60110299A (ja) | 1985-06-15 |
Family
ID=24072980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59164735A Pending JPS60110299A (ja) | 1983-08-05 | 1984-08-06 | ｔｕｆ及びｆｕｓ遺伝子プロ−ブを用いる核酸ハイブリダイゼ−シヨンによる細菌の検出方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0133288A2 (ja) |
| JP (1) | JPS60110299A (ja) |
| AU (1) | AU3138884A (ja) |
| ES (1) | ES534865A0 (ja) |
| IL (2) | IL71715A0 (ja) |
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| JP2010094133A (ja) * | 1996-11-04 | 2010-04-30 | Geneohm Sciences Canada Inc | 微生物研究室での診断のための臨床検体からの共通の細菌性及び真菌性病原体並びに関連する抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出及び同定するための種特異的、属特異的及び普遍的プローブ及びプライマー |
| JP2010207195A (ja) * | 2009-03-12 | 2010-09-24 | Toyo Suisan Kaisha Ltd | 細菌測定用プライマーおよび細菌測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8507178A1 (es) | 1985-08-16 |
| ES534865A0 (es) | 1985-08-16 |
| EP0133288A2 (en) | 1985-02-20 |
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