JPH0430279B2 - - Google Patents

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JPH0430279B2
JPH0430279B2 JP60502509A JP50250985A JPH0430279B2 JP H0430279 B2 JPH0430279 B2 JP H0430279B2 JP 60502509 A JP60502509 A JP 60502509A JP 50250985 A JP50250985 A JP 50250985A JP H0430279 B2 JPH0430279 B2 JP H0430279B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、未確認の病原体若しくは微生物の存
在を検出する方法に係り、より詳細には、臨床微
生物研究所に於て容易に且信頼性よく実施できる
手法を用いることによつて、より迅速に未確認の
病原体の存在を生体外にて検出する方法に係る。
感染症の臨床的処置に於いて、その感染症の原
因である病因物質や病原体を同定することは重要
な事項である。多くの場合、感染症に対して行わ
れるべき適切な療法の決定は、感染の原因となる
微生物を同定することによつて為される。この点
に関し、治療に関与する医師は、理にかなつた治
療を開始するために必要な必須のデータを得るべ
き、必然的に臨床微生物研究所に大きく依存する
こととなる。
現在用いられている手法を含めて、臨床試料中
の病原体を検出する方法に於て問題となるのは、
検出に要する時間、必ずしも全ての場合に病因物
質を迅速に培養することができないこと、臨床試
材から、直接、分析を行う際の試薬の交差反応性
に関する困難等である。
従来の病原菌の同定方法に於ける基本的な考え
方は、未確認の成分の代謝により生じる生産物を
検出すること、例えば、特異的な代謝最終物産の
基質としての特異的な作用及び構造を同定するこ
とにより微生物の種々の酵素的な能力を検出す
る、といつたものである。（レネツテ
（Lennette）等、マニユアル・オブ・クリニカ
ル・マイクロバイオロジー（Manual of
Clinical Micro biology）、1974年、米国微生物
協会（Amer.Soc.for Microbiol.））多くの場合、
未確認の生物の同定は、種のレベルの同定まで行
えるようにするために、多数の（20〜30もの）互
いに独立した反応を行い、それらに於ける色彩の
変化に基づいて為される。また、全ての場合に於
て、検出されるべき物質を蓄積できるようにする
ために、制限された条件下に於て微生物を相当に
増殖させておくことが必要となる。従来から不適
当にも採用されている試験は、多数の試薬や媒体
を必要とし、長時間を要し、また臨床研究員の側
に高度の熟練や訓練を要求するものである。
過去20有余年の間に、微生物固定法を単純化
し、且つ、これに必要とされる時間を短縮するた
めに、種々のシステムが開発されている。（ノー
ド（Nord）等、メド・マイクロバイオル・イム
ノル（Med Microbiol.Immuonl.、1974年、
159：211〜220頁）、（サカザキ、メデイア・サー
クル（Media Circle）、1975年、20：227〜235
頁）、ロバートソン（Robertson）等、ジエイ・
クリン・マイクロバイオル（J.Clin.Microbiol.）、
1976年、３：421〜424頁））しかしながら、これ
らのシステムは、基本的には、代謝産物の検出と
いう同一の課題に於ける種々の態様を示すもので
あり、また代謝産物の検出という基本原理に根ざ
したものである。
病因物質や微生物の迅速な同定に関する現状を
表わすものとして以下の文献を参照されたい。ト
ツテン（Totten）等は、1982年３月に米国微生
物協会より発行されたアブストラクトの「尿道炎
に感染した人体中の淋菌を検出するためのDAN
雑種形成法」と題する記事に於て、放射性標識さ
れたプロープとして淋菌の潜状プラスミドを用い
たDNAハイブリツド形成法を修正した方法を使
つて、患者からの試料中の淋菌を検出する方法を
開示している。モスリー（Moseley）等は、ジエ
イ・インフエクト・デイス（J.Infect.Dis.）の
145：863〜869頁の「三つのエンテロトキシン遺
伝子プローブを使用するコロニーハイブリツド形
成による腸管毒産生性大腸菌の同定」と題する記
事に於て、腸管毒産生性大腸菌（ETEC）を同定
するためのDNAハイブリツド形成法の適用とそ
の限界を開示している。
米国微生物協会の1982年の年次会議のアブスト
ラクトC87〜C95には、多管代謝産物試験システ
ムの評価及び比較（API）に関する事項が開示さ
れている。このシリーズの他のアブストラクト
（C120〜C123及びC125）には、代謝産物の検出
に依存する自動放射測定用血液培養システム（ジ
ヨンストン・ラボラトリーズ・インコーポレイテ
ツド（Johnston Laborat ories、Inc.）の「バク
テク（Bactec）」）の評価が開示されている。こ
のシリーズの更に他のアブストラクト（C124〜
C128）は、血液試料から細菌を濃縮化し分離す
るための血液培養システムが開示されている、こ
のシリーズのアブストラクトC254には、二段階
の、血液からの微生物の回収を促進する方法が開
示されている。
近年、組換えDNA分子を用いて、或る特定の
病因物質に対して特異性を有するDNA断片を多
量に製造することが可能になつた。或る病原体に
対して、或る特定の断片が特異性を有するという
ことが実験的に確立されれば、そのDNA断片又
はプローブを用い、これらのプローブが病原体に
於ける相補的な核酸配列とハイブリツド形成する
という能力を利用して、即ちDNA−DNAハイブ
リツド形式、或いは、RNAゲノムを含む感染ウ
イルスの場合にはDNA−RNAハイブリツド形成
を利用して、病原体の存在を検出することができ
るようになる。またこのような場合に於てRAN
プローブも用いることができる。
病原体の検出のための診断法に於て上述の如き
DNAプローブを使用することは、米国特許第
4358535号に開示されている。この米国特許は、
臨床分離体を培養して微生物を増殖し、得られた
コロニーを溶解し、ゲノムを変性して、しかる後
固定する方法を概ね開示している。同公報方法で
は、病原体を含む臨床試料を不活性の支持体上に
点状に付着し、次いで臨床試料を処理して溶解
し、臨床試料中に存在する微生物からDNAを分
離し、支持体上の、臨床試料から付着された同じ
部位にてかかるDNAを実質的に一本鎖の形態に
て固定する。その後、支持体上の一本鎖DNAが、
ハイブリツド形成条件下に於て、病原体のヌクレ
オチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する
標識されたポリヌクレオチドプローブと接触せし
められ、これにより、プローブが一本鎖DNAと
ハイブリツド形成を為すことで病原体の存在の診
断に役立てようというのである。また、この米国
特許には、溶菌条件が工夫され、細胞若しくはコ
ロニーが支持体の表面上で移動せず、これらの
DNAがそれらが配置された所定の位置に固定さ
れた状態に留まるようになつていることが述べら
れる。しかしながら、この米国特許の方法では病
原体の検出をするために数日間を要する。
フアルコウ（Falkow）による更に最近の論文
及び他の論文（トツテン（Totten）等、ジエ
イ・インフエクト・デイス（J.Infect.Dis.）、1983
年、148：462頁）に於て、DNAハイブリツド形
成法が、尿動炎に感染した人体中の淋菌を、臨床
試料から、直接、検出することに対し適用され
た。しかしながら、この方法は、患者からの試料
中の細菌を直接検出するために少なくとも三日間
の反応時間を要し、従つて臨床研究所に於て迅速
に用いることができない。
ブローテイガム（Brautigam）等（ジエイ・
クリン・マイクロバイオル（J.Clin.Microbil.）、
1980年、12：226〜234頁）は、臨床分離体中の単
純ヘルペスウイルスの型別を、感染した培地から
得られる標識されていないDNAとトリチウムの
標識されたウイルスのDNAとのハイブリツド形
式にから行う方法を記載している。この方法は、
１日のうちに完了するものであるが、高価で精巧
な装置を必要とし、容易に、一度に幾つかの臨床
試料を処理することができない。またこの方法は
核酸化学の分野に於て比較的経験を積んた者にし
か行えない。
モスリー（Moseley）等（ジエイ・インフエク
ト・デイス（J.Infect.Dis.）、1980年、142：892〜
898頁）は、腸管毒産生性大腸菌の多数の分離体
を検出する方法であつて、熱的に不安定な毒素若
しくは熱的に安定な毒素を暗号化している放射性
標識されたDNAの断片を、ニトロセルロースフ
イルタ上にて増殖され溶菌された大腸菌のコロニ
ー中の相同DNA配列に対するハイブリツド形成
プローブとして用いる方法を開示している。この
方法も長時間を要するものであり、完了するまで
に数日を要する。
ブレチヨツト（Brechot）等（ザ・ランセツト
（The Lancet）、1981年10月10日、765〜767頁）
は、肝臓及び血清中の肝炎Ｂ型ウイルスの検出に
DNA−DNAハイブリツド形成を使用することを
開示している。この方法は組織の生検を行い、し
かる後DNAを抽出するといつたものであり、完
了するのに約３日乃至４日を要する工程を必要と
する。
バーニンガー（Berninger）等（ジエイ・メ
ド・ビロル（J.Med.Virol.）、1982年、９：57−
68頁）は、核酸のハイブリツド形成に基づいて、
血清中に存在する粒子中の肝炎Ｂ型ウイルス
（HBV）DNAを検出し、その量を測定するとい
う分析方法を開示している。この方法は、プロー
ブとして完全な肝炎Ｂ型ウイルスのDNAを使用
しており、この分析を完了させるに要する時間は
比較的長い。
かくして、核酸のハイブリツド形成の原理は、
従来から認識されており、病原体の検出に使用さ
れているのであるが、臨床微生物研究所によつて
行われるサービスの有用性を向上させるべく、臨
床試料から、直接、病原体を検出でき、更に迅速
且実際的で正確な方法が依然として必要となつて
いる。
発明の概要 本発明の目的は、或る特定のDNA／RNAヌク
レオチド配列を有すると思われる未確認の遺伝子
実体（遺伝情報を担持する物質）を生体内にて検
出し同定する方法を提供することと、体液、滲出
液、組織の如き臨床試料から、直接、未確認の病
原体の存在を生体外にて検出する改善された方法
を提供することと、より迅速に実施可能でありし
かも信頼し得る結果を与える上述の如き方法を提
供することと、病原体DNA若しくはRNAを、そ
れがその配列と相補的なポリヌクレオチドプロー
ブのDNA若しくはRNAの配列とハイブリツド形
成するのに好ましい条件下に於て該ポリヌクレオ
チドプローブと反応し得る状態で効果的に分離す
る上述の如き方法を提供することと、これらの方
法に使用される新規な溶菌溶液を提供することと
である。
端的にいえば、本発明は、病原体を含んでいる
ものと疑われる臨床試料中の未確認の病原体の存
在を生体外にて検出する方法であつて、(a)アルカ
リ及び陰イオン又は双性イオン表面活性剤を含有
する溶菌溶液にて臨床試料中の病原体を溶菌し
て、病原体のDNA／RNAを一本鎖の形態にして
溶菌溶液中に遊離する過程と、(b)病原体の溶解物
を含有する溶菌溶液を、DNA／RNA結合能力を
有し正に帯電した多孔質で不活性の支持体と接触
させ、毛細管作用により支持体上にて、一本鎖の
形態の病原体DNA／RNAを表面活性剤より大き
い距離移動させ、該病原体DNA／RNAを支持体
上の移動領域に集合させて固定した状態になるよ
うにする過程と、(c)上記の病原体の一本鎖
DNA／RNAを担持する支持体を、該病原体
DNA／RNAのヌクレオチド配列に対して実質的
に相補的なヌクレオチド配列を有するハイブリツ
ド形成プローブと接触させ、ハイブリツド形成に
よるかかるプローブのDNA／RNAが、実質的
に、未確認の病原体のDNA／RNAに対してのみ
結合されるようにする過程と、(d)ハイブリツド形
成によりプローブのDNA／RNAが未確認の病原
体のDNA／RNAに結合したことを判定すること
により未確認の病原体の存在を検出する過程を含
む方法に関するものである。
広義には、本発明は、或る特定のDNA／RNA
ヌクレオチド配列を有する未確認の遺伝子実体
が、それを含んでいるものと疑われる試料中に存
在することを生体外にて検出し、該遺伝子実体を
同定する方法であつて、DNA／RNAが一本鎖の
形態にて試料より遊離され支持体上に付着される
よう構成されている方法を改善するものであり、
本発明に於ける改善点は、試料から遊離された
DNA／RNAとアルカリと陰イオン又は双性イオ
ン表面活性剤とを含有する溶液を正に帯電した多
孔質で不活性の支持体に接触させ、毛細管作用に
よつて支持体上にて試料の一本鎖の形態の
DNA／RNAを前記表面活性剤より大きい距離移
動させ該DNA／RNAを支持体の移動領域に集合
させて固定し、固定された一本鎖DNA／RNAを
担持する支持体を、試料のDNA／RNAのヌクレ
オチド配列に対し実質的に相補的なヌクレオチド
配列を有するハイブリツド形成プローブと接触さ
せて、ハイブリツド形成によりプローブの
DNA／RNAを、実質的に、未確認の病原体の
DNA／RNAに対してだけに結合させ、ハイブリ
ツド形成によりプローブのDNA／RNAが未確認
の病原体のDNA／RNAに対し結合したことを判
定するこにより未確認のDNA／RNAの存在を検
出することを含んでいる。
また本発明は、上述の各工程に付け加える工程
又は各工程の修正を含む上述の如き方法の他の実
施例に関するものである。本発明のその他のさほ
ど好ましいとは言えない一つの局面に於ては、臨
床試料中の未確認の病原体の検出は、臨床試料の
プレ溶菌を行い、その後、溶菌を行つてから病原
体DNA／RNAを多孔質且不活性の支持体上に付
着し、しかる後未確認の病原体の存在を検出すべ
くハイブリツド形式を行う方法によつて達成され
る。更に本発明はグラム陰性及びグラム陽性細菌
細胞及びウイルス又はウイルスに関係のある物質
を迅速に溶菌するために使用される新規な溶菌溶
液を含んでいる。
好ましい実施例の説明 本発明によれば、臨床試料中に含まれる未確認
の病原体が、本発明の新規な方法を採用すること
によつて、従来可能であつたよりも更に迅速に且
正確に検出されることが明らかになつた。従来の
方法では、臨床試料から、直接、未確認の病原体
を検出するのに一般に数日間必要であつたのであ
るが、本発明の方法を採用すれば、病原体の培養
は不要であり、１〜２時間という短時間のうちに
できるようになる。本発明の方法は、幾つかの体
液（例えば血液試料、尿試料等）、滲出液、及び
組織などについて、直接、適用することができ、
用いられる試料の組成はかなり変化してもよい。
また本発明の方法によれば、DNA／RNAが、グ
ラム陽性又はグラム陰性の細菌、ウイルス、若し
くは真核細胞の溶解物から直接、ハイブリツド形
成可能な形態で迅速に且容易に得ることができる
ようになる。
本発明の方法は、病原体を含んでいるものと疑
われる試料を収集した後、或いは、病原体を含ん
でいるものと思われる臨床分離体を溶離した後
に、病原体のDNA／RNAの溶解及び変性を行う
べく、アルカリ及び陰イオン表面活性剤（例えば
ドデシル硫酸ナトリウム）又は双性イオン表面活
性剤を含有する溶菌溶液にて病原体を処理し、こ
れにより病原体のDNA／RNAが一本鎖の形態に
て溶菌溶液中に遊離されるようにすることにより
実施される。次いで得られたDNA／RNAを含有
する溶菌溶液は、DNA結合能力を有する正に帯
電した多孔質で不活性の支持体、即ちマトリツク
スと接触せしめられ、毛細管作用により支持体上
へ移動し、即ち、支持体上へウイツク（wick）
し、一本鎖の形態の病原体DNA／RNAが表面活
性剤より大きい距離移動せしめられ、それらの移
動領域に於て集められて支持体に非可逆的に結合
した状態となる。本願発明者等は、上記の如く、
DNA／RNAを含有する溶菌溶液が正に帯電した
支持体に接触せしめられると、「ウイツク」作用
（毛細管現象により流体が移動していくこと）が
発生し、まず陰イオン表面活性剤が支持体に結合
された状態になり、病原体のDNA／RNAが更に
先へ搬送されることを見出した。ウイツク作用に
よつて、溶菌溶液が支持体上にて拡がり移動し続
けると、溶菌溶液中の陰イオン表面活性剤が支持
体に連続的に結合されていくこととなり、該陰イ
オン表面活性剤の濃度が比較的小さくなり、前方
へ搬送されていく病原体DNA／RNAの濃度が比
較的高くなる。かくしてかかるウイツク作用によ
り、病原体DNA／RNAは、陰イオン表面活性剤
が正に帯電した支持体上の反応領域、即ち、結合
領域に対して反応しなくなる程度にまで減少する
まで、移動する相の中に保持される。陰イオン表
面活性剤が実質的に完全に支持体に付着し結合す
ると、病原体DNA／RNAが一本鎖の形態にて支
持体上の幾分か良好に制限された領域に結合し、
固定された状態になる。その段階に於ては病原体
DNA／RNAは、ハイブリツド形成プローブと接
触される準備がなされた状態となり、或る特定の
病因物質又は病原体に対して特異性を有するプロ
ーブを用いることにより未確認の病原体の存在の
検出が行われる。
より広く言えば、本願発明者等は、ウイツク作
用即ち上述の如き移動していく作用を用いること
により、或る特定のDNA／RNAヌクレオチド配
列を有する未確認の遺伝子実体を生体外にて検出
し固定すること及び臨床試料中の病原体を検出し
同定することに有用且有効に適用され得るという
ことを見出した。例えば、本発明は、鐘型赤血球
貧血、テー・ザツクス病、地中海貧血の如き、遺
伝病を生じる特定の遺伝子の変異を診断するため
に使用されてよい。更に本発明は、欠陥遺伝子の
遺伝を診断するための非常に高感度且迅速な手段
を提供する。或る特定の遺伝的な乱れについての
正確な特徴は現在のところ解つていないのだが、
異常な遺伝子の存在が表現に発現される有害な影
響の原因であるものと考えられている。従つて、
正常な遺伝子ではなく、欠陥遺伝子に対する相補
性を有する特定のDNAプローブを分離し使用す
れば、本発明を実施することによつて有害な特性
を生体外にて早期に診断することができるのであ
る。
更に機能的な遺伝子を、動物の細胞や植物の細
胞中に挿入することを可能にする方法の出現によ
り（動物細胞については、ワグナー（Wagner）
等、プロク・ナト・アカド・ソシ・ユー・エス・
エー（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）、78：6376〜
6380頁、1981年、植物細胞については、シエパー
ド（Shepard）等、サイエンス（Science）、
219：683〜688頁、1983年）、或る特定の遺伝子の
存在及び挿入された遺伝物質の存在に起因する遺
伝子表現のレベルを迅速に判定する方法が必要に
なつている。本発明の方法は、受容細胞中に存在
しているDNA／RNA分子若しくは受容細胞中に
外来遺伝物質を導入することにより発生された
DNA／RNA分子に対してDNA／RNAプローブ
をハイブリツド形成させるために使用されてよ
い。これにより、大きな動物の中に遺伝子を導入
した後に遺伝子の検出を早々に行うことができ、
また転移された遺伝子の同定を行うために、かな
りの犠牲を払つて関心を持つている遺伝子発現が
表現型にて観察されるほどの進んだ段階までその
分析を遅延させる必要がなくなる。
かくして本発明の方法を適用できる範囲は広い
のであるが、以下に於いては、本発明を、未確認
の病原体を含んでいるものと疑われる臨床試料中
に於ける未確認の病原体の存在を検出することに
関して説明する。
未確認の病原体を含んでいるものと疑われ本発
明の方法が適用される臨床試料は、血液、尿、痰
（例えば咽頭スワブ）、膣スワブ、便の如き従来よ
り使用されている試料の何れであつてもよい。最
良の結果を得るために重要なことは、出発材料で
ある病原体DNA／RNAが最大限に回収できるこ
とである。一般に臨床試料は通常105〜106の濃度
の細胞細胞又は病原体細胞を含有している。例え
ば、咽頭スワブの場合について言えば、本願発明
者等は、該スワブ上に存在する細菌に害を及ぼさ
ない溶液中に溶離させることが、細菌細胞を回収
する上で最も効率的である訳ではないが、十分で
あることを見出した。しかしながら、このような
場合、未確認の細菌や病原体の他に、その他の咽
頭分泌産物と共に上皮細胞や他の人体細胞（即ち
感染に応答する白血球）も溶離される。従つて細
菌を人体細胞から選択的に分離することが行われ
なければ、多量の人体のDNA、蛋白質若しくは
多糖類等が混在することになる。もし臨床試料の
溶離物が直接溶解されると、上記の全ての物質
は、本発明の方法に於て採用される正に帯電した
多孔質且不活性の支持体上の領域に結合すること
について、関心のある細菌若しくは病原体の
DNA（例えばグループＡの連鎖球菌DNA）と競
争することとなり、これにより本発明の分析の精
度が幾分か低くなつてしまう。従つて、必ずしも
必須という訳ではないが、病原体を溶解すること
なく、臨床溶離物より競争成分、即ち阻害成分の
実質的な部分を除去すべく、試料はまずプレ溶菌
溶液にて処理されることが好ましい。多くの場
合、かかるプレ溶菌溶液による処理は必須ではな
く、臨床試料が溶菌溶液中に直接溶離されても有
意義な結果が得られる。この点に関し、前述のウ
イツク現象は蛋白質及び異質の多糖類の分離を行
うのに有利に働くということが解つている。何故
ならば、これらの物質は、病原体DNA／RNAと
共にではなく、陰イオン表面活性剤と共に正に帯
電した支持体上に付着する傾向を有しており、従
つて支持体上の部位について、即ちハイブリツド
形成プローブとのハイブリツド形成について、病
原体DNA／RNAと有効に競争しないからであ
る。
一般的には必要でないが、より多量の病原体
DNA／RNAを調製するべく、臨床試料を初めに
培養しておいてもよく、培養された病原体は細菌
学的ループや鏡状の器具により収集されてよい。
始めに、臨床試料から潜在的な競争要素、即ち
阻害物質を実質的に除去すべくプレ溶菌溶液が使
用される場合には、非イオンデタージエント、即
ち純粋サポニンを低濃度にて含有し人体の細胞を
選択的に溶解する溶液を使用することが好まし
い。典型的には、プレ溶菌溶液は、純粋サポニ
ン、ポリプロピレングリコール、ポリアネトール
スルホンネート、ジソジウム・エチレンジニトリ
ロ・テトラアセテートを含有している。またプレ
溶菌溶液はトリス（Tris）緩衝液又は酵素の如
き他の適当な成分を含有していてよい。
臨床試料がマイクロ遠心分離管中にてプレ溶菌
溶液（もし使用されるならば）中へ溶離された
後、プレ溶菌／試料懸濁液は、30〜60秒間遠心分
離され、上澄み液が廃棄される。細菌細胞及び破
片から成る残りの沈澱物が、50〜100μの溶菌
溶液（その主成分はアルカリ及び陰イオン又は双
性イオン表面活性剤である。）中に再度懸濁され、
次いで激しく撹拌される。典型的な溶菌溶液は、
126ｍＭ塩化ナトリウムと、８ｍＭエチレン・ジ
アミンテトラアセテートと、10ｍＭトリス（PH
7.5）と、2.35％のドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）とを含んでおり、使用直前に上述の溶液
に対し10Nの水酸化ナトリウムを添加することに
よつて0.5Nの水酸化ナトリウム溶液に調製され
る。水酸化ナトリウムの代りに水酸化カリウムや
水酸化アンモニウムの如き他のアルカリが使用さ
れてもよい。
ドデシル硫酸ナトリウムは、溶菌溶液の主成分
として本発明の実施に於て使用される好ましい表
面活性剤である。ドデシル硫酸ナトリウムは、ア
ルカリと共働して病原体のDNA／RNAを一本鎖
の形態にて溶菌溶液中に遊離させる機能を果すだ
けでなく、得られた溶菌溶液を正に帯電した多孔
質且不活性の支持体と接触させる場合に於いて病
原体DNA／RNAのウイツク作用、即ち移動作用
を促進する。当業者に知られている他の種々の陰
イオン又は双性イオン表面活性剤が採用されても
よく、かかる表面活性剤としては、デシル硫酸ナ
トリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデカ
ン酸ナトリウム、塩素酸ナトリウム・デオキシ塩
素酸ナトリウム、リゾホスフアチジルコリン、Ｎ
−ドデシル・ベタイン、Ｎ−テトラデシル・ベタ
イン、Ｎ−ヘキシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ア
ミノ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−オクチル
−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロペン
スルホネート、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−
３−アミノ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ド
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アモニオ−１−
プロパンスルホネート、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，
Ｎ−ジメチル−３−アモニオ−１−プロパンスル
ホネート、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル
−３−アモニオ−１−プロパンスルホネートがあ
る。非イオン又は陽イオン表面活性剤又はデター
ジエントは溶菌溶液の目的には有用でない。
必須の成分としてアルカリ及び陰イオン表面活
性剤又は双性イオン表面活性剤を含有する溶菌溶
液は、本発明の更に他の一つの局面を構成してい
る。従来では、特にグラム陽性の細胞の場合に
は、プロナーゼ（pronase）やリゾチームの如き
酵素を含有する溶菌溶液を採用することが必須で
あると考えられていた。グラム陽性細菌、特にグ
ループＡの連鎖球菌の溶菌は、従来より常に、プ
ロナーゼやリゾチームの如き酵素を用い、その後
細菌の細胞壁をバシトラシンやペニシリンの如き
細胞弱化物質中にて45〜60分間増殖させることに
より弱化させた後に、行われているようになつて
いる。クリユーウエル（Clewell）により認識さ
れている如く（マイクロバイオロジカル・レビユ
ーズ（Microbiological Reviews）、Vol.45、409
−36頁、1981年）、連鎖球菌の溶菌は、幾分か困
難であり、通常ドデシル硫酸ナトリウムやサーコ
シル（Sarkosyl）の如きイオン性デタージエン
トによつて溶菌を行う前に、該連鎖球菌をリゾチ
ーム又は他の溶菌酵素中にて長時間に亙りインキ
ユベーシヨンすることが必要であり、かかる条件
下に於ても溶菌が不完全であることが多い。同様
にグラム陰性細菌の場合にも、リゾチームの如き
酵素とPH条件との組合せが従来より採用されてい
る。
更に本発明によれば、グラム陰性及びグラム陽
性細菌細胞及びウイルソンの溶菌は、本質的な成
分として、水酸化ナトリウムの如きアルカリ及び
ドデシル硫酸ナトリウムの如き陰イオン又は双性
イオン表面活性剤又は既に列挙された他の特定の
表面活性剤の何れかを含有す溶菌溶液を使用する
ことにより、酵素の助けを借りずに迅速に且効果
的に達成されることが見出された。かかる溶菌溶
液は、細菌細胞を溶菌する迅速な手段を提供し、
本発明の方法が適用されていてよい臨床試料中に
見出される任意の感染媒体を溶解する上で溶菌溶
液として用いることができるようになる。アルカ
リは変性剤として機能し、試料のDNA／RNAを
一本鎖の形態に転換するものと考えられ、また表
面活性剤は、アルカリと共働して細胞を溶解し、
細胞からDNA／RNAを遊離するものと考えられ
る。
溶菌溶液中に於けるアルカリ及び陰イオン又は
双性イオン表面活性剤の濃度は変化されてよい
が、概ね、溶液は、0.5Nの水酸化ナトリウム又
は他のアルカリであり、表面活性剤の濃度は約
0.5wt％〜約5.0wt％、好ましくは約2.35wt％であ
ることが好ましい。また溶菌溶液は、一つの特殊
な例として、10ｍＭのトリス（PH7.5）と、126ｍ
ＭのNaClと、８ｍＭのエチレンジアミンテトラ
アセテート（EDTA）とを含有していてよく、
これらの量も本発明の実施の範囲内に於て変化さ
れてよい。溶菌溶液の特殊な必須の成分として水
酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムを使用
することが特に好ましく、これらの何れか一方だ
けを使用することは、溶菌が一層困難であるグラ
ム陽性の微生物の溶菌を行う場合には適用してい
ない。
上述の如く溶菌を達成するために必須という訳
ではないが、溶菌溶液は、若し必要ならば、蛋白
質分解酵素、リパーゼ、多糖類を加水分解する酵
素、シリスタフインを含有していてよい。
臨床試料、若しくは、プレ溶菌溶液にて既に処
理された臨床試料を溶菌することにより、得られ
る溶菌溶液中に含まれている病原体DNA／RNA
は、一本鎖の状態となり、正に帯電した多孔質且
不活性の支持体に固着され、即ち結合されるべく
支持体と接触される準備ができた状態となる。本
発明に於て使用されるに適した。前記の如き特徴
を有する好ましい支持体としては、アメリカ合衆
国コネチカツト州メリデン所在のエイ・エム・エ
フ・クノ（AMF Cuno）のマイクロフイルトレ
ーシヨン・プロダクツ・デヴイジヨン（Micro
filtration Products Division）より「ゼータバ
インド（Zetabind）」なる商品名にて販売されて
いるナイロンをベースとする薄膜、又はアメリカ
合衆国マサチユーセツツ州ボストン所在のニユ
ー・イングランド・ニユークリア・コーポレイシ
ヨン（New England Nuclear Corporartion）
より「ジーンスクリーン（Gene Screen）」なる
商品名にて販売されている同様の薄膜がある。
「ゼータバインド」は製造工程中に多数の第三ア
ミノ基を導入することにより修正されたナイロン
66マトリツクス（ポリヘキサメチレン・アジパミ
ン）から成つている。この薄膜は本質的に親水性
及び可撓性を有し、広範囲に亙る溶媒との両立性
を有し、ナイロン薄膜の構造体を共有結合的に修
飾することにより正味の正電荷を有する。この固
有の正電荷により陰イオン性高分子が高度に結合
されることとなるのである。「ゼータバインド」
はアメリカ合衆国カリフオルニア州リツチモンド
所在のバイオ・ラド・ラボラトリーズ（Bio−
Rad Laboratories）より「ゼータ・プローブ
（Zeta Probe）」として得られる。「ジーンスクリ
ーン」も同様に正に帯電した支持体材料である。
「ゼータバインド」又は「ジーンスクリーン」よ
りも正に帯電した度合の低いニトロセルロース
も、好ましさの程度は低いが、本発明の実施に於
て正に帯電した支持体として有用である。正に帯
電した樹脂等にて被覆され又は含浸された繊維材
料の如き他の多孔質且不活性の支持体材料も本発
明の実施に於て使用されてよい。
ウイツク作用、即ち、移動の現象を説明するた
めに、及び、DNAが種々のSDS濃度の溶液中に
存在する場合にDNAがどこへ移動するかを測定
するために、先ず、DNAを0.59％、1.18％、1.77
％、2.35％のSDSを各々含有する溶菌溶液中に分
散した。そして、これらの溶液を、「ジーンスク
リーン」フイルタ薄膜の支持体上へウイツクせし
め、次いで、得られた支持体を、DNAプローブ
に対しハイブリツド形成させて、該支持体上の、
溶媒及びSDSの最前部に対するDNAの位置を測
定した。ハイブリツド形成後に於ける支持体のオ
ートラジオグラフイは、反応のあつたDNAの大
部分がSDSの最前部のすぐ前方に位置し、他の反
応性を残す部分がウイツクを開始した元の位置と
SDSの最前部との間に無作為に位置していること
を示した。更にこの反応性はSDSの濃度に対応し
て増大した。このことは、より多くのDNAの支
持体に結合されたということ、若しくは、DNA
が、より接触し易い形態、従つてハイブリツド形
成可能な形態にて存在することによるものと考え
られる。
ウイツク作用は、正に帯電した多孔質且不活性
の支持体を、水平線から或る角度にて、例えば、
90°にて病原体DNA／RNAを含有する溶菌溶液
と接触させることによつて、或いは、該支持体を
ほぼ垂直の角度にて該溶液と接触させることによ
つて好ましく達成される。ウイツク現象を利用
し、SDS又は陰イオン表面活性剤の濃度を増大す
ると、これに対応して反応性が増大するというこ
とは、従来の方法、即ちニトロルロースの如き支
持体又はフイルタ薄膜基質材料の小さい表面領域
上に病原体DNAを含有する溶液を点状に付着す
るという方法に於ては全く逆の現象である。本願
発明者等によれば、例えば、DNAが「ジーンス
クリーン」支持体の小さい限られた領域上に点状
に付着される場合には、DNA試料中のSDSの濃
度が増大すると、基質若しくは目標のDNAの反
応性が低下するということが、上述の条件下にて
フイルタ結合分析中に放射性DNAが損失するこ
ということによりはつきりと見出された。このこ
とは、SDSの陰イオン性が、DNAのポリ陰イオ
ン性に拮抗し、DNAのポリ陰イオン性による
「ジーンスクリーン」支持体の正に帯電した表面
に対する相互作用をすることを阻害していること
を示している。
本発明を実施する上で、ウイツク現象によつて
与えられる正に帯電した支持体上に於ける病原体
DNA／RNAの位置と、SDS若しくは他の陰イオ
ン表面活性剤の濃度が増大されうことに伴なつて
観察される反応性の増大とは、以下のことを示し
ている。まず第一に、大部分の反応性を示す病原
体DNA／RNAは、SDSよりも比較的弱い陰イオ
ンであるので、大部分の反応性を示す病原体
DNA／RNAは支持体上のSDSの最前部の僅かに
前方に見られる、即ち、DNA／RNAは、ウイツ
クしていく間、SDSの濃度がその支持体上の反応
性に対して反応しない程度にまで減少するまで移
動相中に保持される。第二に、SDS濃度が増大す
るということは、病原体DNA／RNAに加えて
SDSを支持体表面にウイツク開始した部位から更
に遠くへ移動させることとなるのである。SDS濃
度の増大に対応してDNAの移動距離が増大し、
これにより反応性DNAがより大きい表面領域に
亙り広げられ、これに伴つて、多量のDNA分子
が一本鎖形態で支持体に結合され、その後続いて
行われるハイブリツド形成に適した、より高品位
の基質が形成されることとなるのである。
上述の如きウイツク作用により、溶僅溶液の病
原体DNA／RNAを正に帯電した多孔質且不活性
の支持体に結合された状態にした後、得られた支
持体を短時間（例えば１〜２分間）空気乾燥し、
病原体DNA／RNAを支持体に対し非可逆的に結
合することが好ましい。次いで支持体を、デンハ
ルト（Denhardt′s）溶液（それぞれ0.02％のフイ
コル（Ficoll）（MW400000）、ポリビニルピロリ
ジン（MW360000）、３倍のSSC（0.15MのNaCl、
0.015Mのクエン酸ナトリウムPH6.5）中の牛の血
清アルブミン（フラクシヨンＶ））中へすばやく
浸漬することにより、ハイブリツド形成プローブ
が非特異的に支持体へ結合することを抑えると共
に、溶菌溶液からアルカリ成分を取り除く。かく
して支持体をハイブリツド形成プローブと接触せ
しめる準備ができたこととなる。
本発明の実施に使用されるハイブリツド形成プ
ローブは、次の原理に基くものである。即ち、種
が十分に限定された任意の微生物若しくは病原体
の如何なるものに於ても、遺伝物質中にその種に
特有の特異的なヌクレオチド配列が存在し、かか
る配列は、或る特定の相補性を有するDNA−
DNAハイブリツド形成プローブが未確認の微生
物のDNAと反応し、これによりその同一性が示
されるというDNA−DNAハイブリツド形成の方
法（パリシユ（Parish）、「拡散に関する原理及び
実験の実施（Principles and Practice of
Experiments with Nucleic Acids）」、ロングマ
ン（Longman）、ロンドン、1972年、355〜368
頁）により検出することができるというものであ
る。例えば、微生物である黄色ぶどう球菌より分
離されたハイブリツド形成プローブの形態をなす
特異的なDNAヌクレオチド配列は、その種の溶
菌液中に見られるDNAとのみ反応するものであ
る。
本発明に於て使用されるDNA−DNAハイブリ
ツド形成プローブは、既知の微生物のゲイム
DNAをクローニングしたポリヌクレオチド断片
より構成されている。このプローブは、そのプロ
ーブが誘導された種以外の如何なる微生物とも実
質的に交差反応しないことを特徴としている。即
ちこのプローブは、高度の生体的特異性を呈する
のである。前述の如く、プローブを構成する断片
は、本発明の目的で生体外にてDNA−DNAハイ
ブリツド形成に使用されるに十分な量及び純度で
増幅されその後の分離されるように、公知の方法
により、或る種の代表的な生体のゲイムDNAか
ら誘導され、適当なプラスミドベクタを介してク
ローニングされる。本発明に於て使用される
DNA−DNAハイブリツド形成プローブを調製す
る際には、種が十分限定された既知の微生物の宿
主細菌細胞が当技術分野に於て公知の従来の方法
により増殖され、適当に培養された細菌細胞より
細菌のゲノムDNAを得る。（上述のレネツテ
（Lennette）等及びパリシユ（Parish））次いで
細菌の全てのゲノムDNAは、例えば、酵素とデ
タージエントと抗生物質とを組合せて使用する公
知の方法によつて、細菌の溶菌することによつて
細菌細胞から分離され、しかる後フエノール、ク
ロロホルム、イソアミル・アルコール、エチルエ
ーテルを使用して細胞DNAを選択的に抽出する
ことにより精製される。得られる細胞ゲノム
DNAの純度は、紫外線分光鏡検査及びアガロー
ズゲルの電気泳動法により確定されてよい。
次いで分離された細菌のゲノムDNAは、制限
エンドヌクレアーゼ、即ち、特定のヌクレオチド
配合のみを基質として認識する酵素を用いて消化
（酵素的反応）される。この消化処理により、使
用される特異的な制限エンドヌクレアーゼに応じ
て特異的に塩基配列と特異的な末端ヌクレオチド
構造を有する断片が生成される。断片の末端のヌ
クレオチド構造は、続いて行われる、選択された
断片をプラスミドベクタ中へクローニングする場
合に重要となる。
かくして製造される断片は、元のDNA及び消
化に使用される制限酵素に応じて、様々な大きさ
を有する。消化されたDNA中に見られる断片の
大きさの範囲は、40kbpから幾つかの塩基対より
成る小さいオリゴヌクレオチドまでに亙る。
DNA−DNAハイブリツド形成プローブとして使
用されるに適した大きさの断片は、アガローズゲ
ル中の分離又は庶糖密度勾配による分離により選
択される。選択された断片は、調製用アガローズ
ゲル電気泳動法の如き手法により酵素により消化
されたゲノムDNAから分離される。
次いで或る特定の細菌種から分離された断片
は、プラスミドベクタ中のクローニング位置へ酵
素的に連結され組換えプラスミドを形成する。プ
ラスミド中のクローニング位置は、分離された断
片の末端に対して相補性を有する特異的な末端を
形成する制限エンドヌクレアーゼの切断部位であ
る。かる整合性、即ち相補性により、断片は連結
酵素リガーゼの作用により共有結合的にプラスミ
ド中に挿入されることとなる。
次いで、かくして製造された新たな組換えプラ
スミドは、特異的な断片を増幅するために、即
ち、かかる断片を多量に生成するために、適当な
細菌のクローニング宿主の中へ導入される。これ
らの特異的な断片は全て、同一の制限酵素によつ
て形成されているので同一の構造を有するヌクレ
オチド末端を有している。宿主細菌中への組換え
プラスミドの導入は、形質転換のプロセス、即
ち、受容能力のある細菌細胞による裸の二重らせ
んのDNAの取込みにより行われる。良好に形質
転換されたこれらの細胞は、組換えプラスミドを
含む細胞のみの増殖を許す好適な選択的な媒体
（例えばｘ−Galアンピシリン寒天平板）上にて
検出される。かくして、選択された大きさ（例え
ば1kbp）の多数のクローニングされた断片が、
各細菌種ごとに生成される。断片が、特定の制限
エンドヌクレアーゼの活性領域にてプラスミドベ
クタ中に挿入されたという事実に鑑みれば、断片
は同い特定の酵素により組換えプラスミドの反応
によつて切断することができる。従つてこの消化
により所望の断片が生成され、所望の断片は調製
用アガローズゲル電気泳動によりプラスミドベク
タから分離され、そして繰返し抽出することによ
り適宜に精製され、後述の如く、未確認の細菌や
微生物を検出し同定するためのDNA−DNAハイ
ブリツド形成プローブとして使用し得る状態にす
ることができるようになるのである。また断片
は、アガローズゲル電気泳動法ではなく、庶糖密
度勾配法により隔離され分離することもできる。
本発明の実施に於て未確認の病原体を生体外に
検出するためのDNA−DNAハイブリツド形成プ
ローブとして使用するための準備として、鋳型と
して断片を使用するDNA中へ32P ｄ ATPを組
込むべく、プローブの断片は、例えばDNAポリ
メラーゼを使用して放射性リン（32P）にて酵
素的に標識化されてよい。プローブとして使用さ
れる断片を標識化することにより、未確認の標的
DNA試料に対するハイブリツド形成が行われた
後に、オートラジオグラフイ又は液体シンチレー
シヨン分光鏡検査によつて断片を検出することが
できるようになり、これによりDNA−DNAハイ
ブリツド形成により未確認の微生物のDNAに対
するプローブのDNAの結合が生じたか否かを判
定することができるようになるものである。
放射性リンの代りに、放射性硫黄（35S）やヨ
ウ素（125I）の如き他の放射性元素も標識化媒体
として使用されてよい。更に螢光標識化やバイオ
螢光標識化の如き当技術分野に於て公知の他の形
式の標識化や科学的標識化も採用されてよい。更
に本発明の生体外試験方法に於て、プローブの
DNAへ水銀の如き重金属を複合し、即ち、係合
して、しかる後、放射性セレン（75Se）にて処
理し、シンチレーシヨン分光鏡検査法や原子吸光
分析により検出する手法によつて未確認の微生物
のDNAに対するプローブのDNAの結合が生じた
か否かの判定を行うようにしてもよい。その他の
作用し得る標識としては、ピオチンや標識された
抗体、螢光試薬、化学的発光試薬、酵素等に対し
て特異的に結合するリガンドがある。
ハイブリツド形成は、上述の如く得られた固定
された一本鎖の病原体DNA／RNAを担持する支
持体を、病原体DNA／RNAのヌクレオチド配列
に対し実質的に相補的なヌクレオチド配列を有す
るハイブリツド形成プローブと接触させることに
より達成される。プローブは、例えば、50％のホ
ルムアミドと、160ｇ／mlの鮭の剪断された精子
のDNAと、0.5MNaClと0.05Mクエン酸ナトリウ
ムと、10％の硫酸デキストランとを含有するハイ
ブリツド形成溶液中にて、例えば50nｇ／mlで存
在する状態で搬送されてよい。ハイブリツド形成
は、支持体を、プラスチクツク製のペトリ皿又は
他の好適な容器内に貯容されたハイブリツド形成
プローブ溶液中で50℃にて約20〜90分間置くこと
により行うことができる。しかしながら、本発明
によれば、ハイブリツド形成を行うために、「サ
ンドイツチ法」を採用するのが好ましい。この方
法によれば、１枚のフアツトマン（Whatmann）
3MMフイルタペーパー（支持体の寸法よりも僅
かに大きい寸法に切断されていることが好まし
い）の如き一片の適当な基体がハイブリツド形成
溶液にて湿潤される。次いで病原体DNA／RNA
を担持する支持体がペーパ上に配置され、更にハ
イブリツド形成溶液が与えられる。次いで、もう
１枚の同一のペーパを支持体上に配置して、二つ
のペーパの間に支持体をサンドイツチ状に挾み、
更にハイブリツド形成溶液を加える。そして、プ
ラスチツク製のペトリ皿内に得らえらサンドイツ
チ状に重ねられたペーパと支持体とを約50℃にて
約20〜90分間、好ましくは60分間加熱する。かか
る特定の条件は、生物や病原体の種類に応じて変
更されてよく、任意の特定の病原体についての条
件は、実験的に容易に求められる。この加熱、即
ちインキユベーシヨン工程は、より完全なハイブ
リツドの形成を促進し、交差反応を回避するとい
う目的を果す。かくして、このハイブリツド形成
工程により、プローブのDNA／RNAは、実質的
に未確認の病原体のDNA／RNAに対してのみ結
合された状態となる、即ち、実質的に未確認の病
原体のDNA／RNAとのみ反応することになるの
である。
ハイブリツド形成が行われた後に、支持体を取
出し、例えば100mlの１％のSDS及び0.2倍のSSC
（0.03M NaCl、0.003Mクエン酸ナトリウム）を
含有する溶液中で73℃にて約10分間に亙り洗浄
し、更に0.2倍のSSC中に於て73℃にて約10分間
洗浄し、結合していないプローブを除去する。最
後に支持体は、乾燥され、例えばガンマカウンタ
内にてカウントされ、これによりハイブリツド形
成による未確認の病原体のDNA／RNAに対する
プローブのDNA／RNAの結合が生じたか否かが
判定される。支持体はＸ線フイルムに露呈するこ
とによつてオートラジオグラフの撮影が行われる
か、シンチレーシヨンカウンタ又は他のカウンタ
又はこれらの両方中にてカウントされるか、結合
が生じたか否かの判定を容易に行うことを可能に
する前述の他の手段により判定されてよい。かく
して標識されたプローブは、そのプローブの発生
源である種の病原体のDNA／RNAに対してのみ
結合し、これにより適切な療法を開始するための
準備として臨床試料中の未確認の病原体を容易に
検出し同定することができることとなるのであ
る。
以上詳細に説明した本発明の方法が、或る特定
の順序の工程について第１図乃至第３図に解図的
に示されており、本発明の実施に際しては上述の
如く種々の修正が行われてよい。
かくして本発明は、種々の形式の臨床試料か
ら、直接、未確認の病原体を検出するための実際
的な手段を提供するものであり、現在実施されて
いる方法の場合よりも短い時間のうちに、即ち１
〜２時間のうちに所望の感度、精度、及び病原体
に対する特異性をもつて好ましく実施することが
できるものである。また、本発明によれば、従来
の方法による検出に於て必要な濃度よりも低い濃
度にて、未確認の病原体を検出することができ
る。
本発明は核酸（DNA又はRNA）を含む任意の
病原体又は他の生物の検出に広く適用され得るも
のである。本明細書に於てDNA／RNAは、
DNA若しくはRNAを意味する。かかる病原体又
は他の生物としては、例えば大腸菌、大便連鎖球
菌（連鎖球菌グループＤ）、黄色ぶどう球菌、緑
膿菌、連鎖球菌グループＡ、肺炎連鎖球菌、酵母
カンジダアルビカンス、インフルエンザ菌、肺炎
杆菌、ミラビリス変形菌、尋常変形菌、霊菌、ペ
プト連鎖球菌、ウエルシユ菌、プロピオニバクテ
リウムSP、バクテロイデス・フラギリス、及び
他の公知のグラム陽性及びグラム陰性の球菌、杆
菌、又は真菌がある。また単純ヘルペルスウイル
ス型の如きウイルスも含まれる。
必要に応じて、採用される臨床試料の細菌細胞
の濃度は、適当な増殖用部材上にて培養すること
により、増大されてよく、その時間もたかだか８
時間でよい。
下記の例は本発明の実施例に使用される或る特
異的なDNA−DNAハイブリツド形成プローブを
用意するための例示的手段である。
１ 選定された細菌種からのゲノムDNAの分離
及び精製 大腸菌の如き臨床的に重要な細菌及び真菌の
種を一晩ブロス培養した物から、その微生物の
DNAを、酵素、デタージエント、若しくは抗
生物質による溶菌法によつて分離した。ここに
記載される大腸菌のゲノムDNAの調製は、僅
かに変更するだけで、他の微生物や病原体から
DNAを分離するのに用いることができる。
１の一晩、ブロス培養した物から得た細胞
を60mlの150ｍMNaCl、10ｍMEDTA（PH8.0）
中にて洗浄した。次いで、細胞を遠心分離によ
り沈澱せしめ、15mlの30ｍMNaCl、２ｍ
MEDTA（PH8.0）中に再度懸濁した。次いで、
10mgのリゾチームを添加し、混合物を37℃にて
30分間培養した。培養後0.4mlの５ｍMNaCl、
0.2mlの0.5MEDTA、2.0mlの20％SDS（ドデシ
ル硫酸ナトリウム）を添加した。この混合物を
60℃に15分間加熱し、次いで室温まで冷却し
た。６mlの5MNaClO4を添加し、次いで、混
合物を24：１の混合比の同体積のCHCl3及びイ
ソアミル・アルコールにて繰返し抽出した。水
相を収集し、しかる後、2.5体積の低温（−20
℃）の95％エタノールにて、DNAを析出した。
次いで、DNA析出物を0.1倍のTNE（50ｍＭト
リス−HCl（PH7.5）、100ｍMNaCl、５ｍ
MEDTA）中で溶解した。リボヌクレアーゼ
をその最終的な濃度が20ｇ／mlになるよう添加
し、しかる後、インキユベーシヨンを37℃にて
１時間行つた。次いで、DNA試料を、25：
24：１の混合比のフエノール、CHCl3、イソア
ミル・アルコールにて抽出し、2.5体積の低温
の95％エタノールにて析出した。
添付の第４図には、上述の如く形成した細菌
ゲノムDNAのアガローズゲル電気泳動の結果
が示されている。第４図のレーン１は上述の如
く形成された100nｇの精製されたゲノムDNA
である。レーン２は、サイズマーカーとして使
用されるバクテリオフアージDNAのヒンド
（Hind）エンドヌクレアーゼによる反応生成
物である。最上のものから見て、対になつた帯
５及び６はそれぞれ2.2kb及び2.1kbの対であ
る。レーン３は、ゲノムDNAの、ヒンド
（Hind）による完全な反応生成物である。同
様の試料用ゲル上にて、完全な反応生成物中の
約1kbのゲノム断片を含む領域を切開し、その
領域から、後に更に説明する如く、DNAを回
収した。
２ 約１キロベース（kbp）の大きさの細菌
DNAゲノム断片の分離 プラスミドクローニングベクタ中へ組込むた
めの細菌DNAの断片を形成すべく、上述の如
く形成された精製された細菌ゲノムDNAを適
当な制限エンドヌクレアーゼにて処理した。
1kbp以下のゲノム断片をハイブリツド形成プ
ローブDNAとして選択し、以下の如く分離さ
れ精製された断片をクローニングベクタである
プラスミドpUC9中へクローニングした。
精製された大腸菌DNAを制限エンドヌクレ
アーゼエコ（Eco）R1にて完全に反応させた。
反応生成物を0.5％の低融点アガローズゲル中
にて４℃、80Vにて２時間に亙り電気泳動処理
した。1kbpの領域に対応する領域を切開し、
そのアガローズゲルを60℃に30分間加熱し、し
かる後10ｍＭのトリス及び１ｍＭのEDTAで
飽和したフエノールを用いてPH8.0にて抽出を
行うことにより、DNAを回収した。
添付の第５図には、クローニングベクタであ
るプラスミドpUC9及び約1kbpの回収されたゲ
ノム断片のアガローズゲル電気泳動の結果が示
されている。第５図のレーン１は精製されたプ
ラスミドpUC9である。図示の幾つかの帯は超
螺旋（形態）、開いた円（形態）、及びそれ
らの組合せの形態を表わしている。レーン２は
後に説明する如くヒンド（Hind）の作用に
より線状（形態）にされたプラスミドpUC9
である。線状にされたプラスミドは、（レーン
４に於て分離され精製されることが示された）
ゲノム断片にて酵素的に組換えられ、組換えプ
ラスミドを与える。レーン３は、DNAのヒン
ド（Hind）による反応生成物を示す。
３ 細菌ゲノムDNAを含有する組換えプラスミ
ドの構成 細菌の精製された細菌ゲノムDNAを線状に
されたプラスミドpUC9の、エコ（Eco）R1、
ヒンド（Hind）又はプスト（Pst）の制限
部位へ連結した。連結反応は、１：３のモル比
にてプラスミドと断片とを混合し、しかる後95
％のエタノール中にてDNAを共同析出させる
ことにより行われた。次いで析出されたDNA
混合物を2.4μの10ｍＭトリス、１ｍMEDTA
中に再度懸濁し、0.4μの100ｍＭジシオスレ
イトール、0.4μの10ｍMATP、0.4μの10倍
の再生緩衝液（50ｍＭトリス（PH8.0）、7.5ｍ
MMgCl2、0.02％のゼラチン）、及び0.4μ
（1.0ユニツトμ）のT4リガーゼの各試薬を添
加した。連結混合物を15℃にて14時間インキユ
ーベーシヨンし、次いでEDTAを添加するこ
とにより反応を停止した。混合物をフエノー
ル、CHCl3、イソアミル・アルコールにて一旦
抽出し、連結したDNAを95％エタノールにて
析出した。組換えプラスミドを含有するDNA
析出物は5μの10ｍＭのトリス、１ｍＭの
EDTA中に溶解され、受容能力のある細菌宿
主大腸菌JM83を形質転換するために使用され
た。
４ 細菌の形質転換：組換えプラスミドのクロー
ニング 大腸菌株JM8.をCaCln2中にて処理すること
により、形質転換能力を有するようにした。大
腸菌株JM83の迅速に増殖するブロス培養物を
OD590=0.2になるまで成長させた。20mlの培養
物を４℃に於て6000rpmにて６分間遠心分離
し、細胞沈澱物を20mlの低温の0.1MのCaCl2中
に再度懸濁した。細胞権濁液を20分間に亙り氷
上に保持し、低温状態にて遠心分離して、細胞
を0.5mlの新鮮な低温の0.1MのCaCl2中へ再度
懸濁した。次いて50μの細胞懸濁液を上述の
連結反応により得られた5μの組換えプラス
ミド溶液と混合した。形質転換のための混合物
を更に10分間氷上にて保持し、次いで５分間に
亙り37℃に保持した。温かい（37℃の）LBブ
ロス（１当りの10ｇのトリプトン、５ｇの酵
母抽出物、10ｇのNaCl）を添加することによ
り、体積を1.5mlにして、その懸濁液を37℃に
て30分間インキユベーシヨンした。そしてその
混合物を遠心分離して細胞を沈澱させ、沈澱さ
せた細胞を200μの新鮮なLBブロス中に再度
懸濁し、100μｇ／mlのアンピシリンを含有す
る選択的なＸ−Galの寒天平板の表面に広げ
た。そして、寒天平板を37℃にて一晩インキユ
ベーシヨンした。組換えプラスミドを含有する
形質転換したコロニーは、Ｘ−Gal媒体（Ｘ−
Gal媒体１当り10ｇのトリプトン、５ｇの酵
母抽出物、0.5ｇのNaCl、1.0mlの2NNaOH、
2.5mlのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２
％Ｘ−Gal）上でそれらが白色のコロニーとし
て増殖することにより同定された。かくして、
黄色ぶどう球菌、大便連鎖球菌、緑膿菌、又は
大腸菌よりゲノムDNAを含有する組換えプラ
スミドを有する種々の形質転換体が分離され
た。
第６図は組換えプラスミドを含有する形質転
換された細菌細胞の選定を示す写真である。細
胞のゲノム挿入体を含むように構成されたプラ
スミドを含有する細菌のクローンは、白色のコ
ロニーとして見える。暗色のコロニーも再構成
されたプラスミドpUC9を含んでいるが、ゲノ
ム挿入体を含んでいない。この、組換えプラス
ミドの同定を可能にする色の違いは、外来の
DNA断片が挿入された乳糖醗酵遺伝子が不活
性化することによつて生ずる。形質転換体は、
アンピシリンを含有するＸ−Gal媒体上にて選
定された。
組換えプラスミドを含有する形質転換体をＸ
−Galアンピシリン平板にて継代培養し、組換
えプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼによ
る反応及びアガローズゲル電気泳動によつて抽
出し分析した。そして、組換えプラスミドを含
むクローンを、制限エンドヌクレアーゼによる
反応により単一のゲノム挿入体がプラスミドか
ら容易に切断できるように、それが存在してい
るものを更に増殖させるべく選択された。選択
されたこれらのクローンを継代培養し、組換え
プラスミドを抽出し、細菌のゲノム挿入体を切
断し、低点アガローズ中の電気泳動により精製
した。ハイブリツド形成プローブとして使用さ
れるべき挿入体を、ニツクトランスレーシヨン
による32P標識化を行うべく調製する際に、フ
エノールによる抽出及びエタノールによる析出
により更に精製した。
添付の第７図には、形質転換された細菌から
回収された組換えプラスミドについてのアガロ
ーズゲルの電気泳動分析の結果が示されてい
る。或る種に対して特異性を有するプローブと
して使用するためにクローニングし増幅したゲ
ノム断片を回収すべく、形質転換体からのプラ
スミドDNAを抽出し、精製し、適当な制限エ
ンドヌクレアーゼにて消化した。レーン１に
は、プラスミドpUC9が示されており、レーン
２には、ヒンド（Hind）にて消化後の
2.7kbpの線状形態のプラスミドpUC9が示して
おり、レーン３には、λヒンド（Hind）サ
イズマーカが示されている。残りのレーン（符
号４〜８が付された対）はクローニングされた
細菌ゲノム断片を含む組換えプラスチツクを示
している。各対の最初のレーンは精製された組
換えプラスミドを示しており、各対の第二のレ
ーンはヒンド（Hind）にて消化された後に
於ける同一のプラスミドを示している。かかる
消化がクローニングされたゲノム断片を切断し
たということが、レーン内の最も下の帯として
明瞭に観察される。上側の帯は線状（形態）
のプラスミドベクタである。無傷の組換えプラ
スミド（各対の最初のレーン）の移動距離をレ
ーン１内のベクタプラスミドpUC9と比較する
と、組換えプラスミドはより長いことが明らか
である。また切開されたクローニングされたゲ
ノム断片を比較することによりそれらは互いに
異なつていることが解る。或る種に対して特異
性を有するハイブリツド形成プローブとして使
用されるべきクローンはこのようにして篩にか
けられた。
５ 32Pにて標識されたハイブリツド形成プロー
ブの調製 精製された、クローニングされた細菌ゲノム
断片のニツクトランスレーシヨン標識化を、ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
（Bethesda Research Labs.）により与えられ
た公知のプロトコルによる行つた。DNAの
32Pにより標識化の後に、0.2MNaCl、10ｍＭ
トリス（PH7.6）、0.5ｍMEDTA中にセフアデ
ツクス（Sephadex）Ｇ−50を含むカラムを用
いて1kbp以下のDNA分子のカラムクロマトグ
ラフイにより精製を行い、組込まれていない標
識を除去した。ニツクトランスレーシヨン反応
混合物をカラム中に透過し、しかる後、50μ
の10ｍＭのトリス、１ｍＭのEDTAの溶離物
を連続的に通した。シンチレーシヨンカウンタ
を使用して各断片の放射性を検定し、酸により
沈澱し得る標識を最も多く含む断片を、ハイブ
リツド形成プローブとして保存した。
第８図は、ハイブリツド形成プローブとして
使用されるクローニングされたゲノム断片につ
いてのアガローズゲルの電気泳動の結果を示し
ている。選定された組換えプラスミドのクロー
ニングされたゲノム断片を制限エンドヌクレア
ーゼを使用して切断した後、未確認の細菌を同
定するためにハイブリツド形成プローブ試薬と
して使用されるべく32Pにて標識化した断片の
分離及び精製を行つた。第８図は、かかる手続
に使用されるクローニングされた断片の一つを
示す。レーン１，２，３は、それぞれクローニ
ングベクタpUC9、線状化されたpUC9、
λDNA−ヒンド（Hind）消化物を含んでい
る。レーン４は、組換えプラスミドpSA7（黄色
ぶどう球菌のゲノム挿入体を有するpUC9）で
ある。レーン５は、ヒンド（Hind）にて消
化された後のpSA7である。レーン６はpSA7よ
りのクローニングされた黄色ぶどう球菌のゲノ
ム挿入体である。
６ 本発明の実施 500nｇの精製されたグループＡのβ型連鎖
球菌（GABHS）DNAを含有する溶菌溶液
（126ｍＭの塩化ナトリウム、８ｍＭのエチレ
ン・ジアミンテトラ・アセテート、10ｍＭのト
リス（PH7.5）、水酸化ナトリウム中にて0.5N形
成された2.35％のSDS）を、ハイブリツド形成
についての試験を行うべく、種々の塩濃度にて
「ジーンスクリーン」から成る支持体とニトロ
セルロースのフイルタ支持体とにウイツクさせ
た。0.0M、0.126M、0.256MのNaCl濃度を採
用した。ハイブリツド形成に使用されるDNA
プローブは、上述の如く調製され、約1/40000
のGABHS染色体DNAを有し、３×108cpm／
μｇの特定の活量にまで標識化されたものであ
つた。ハイブリツド形成を51℃にて１時間に亘
り行い、しかる後１％のSDS、0.2倍のSSC中
に於て73℃にて10分間の洗浄を行い、0.2倍の
SSC中に於て73℃にて10分間最終的な洗浄を行
つた。次いでフイルタ支持体を、Ｘ線フイルタ
上にて増感紙を使用してオートラジオグラフ撮
影した。このオートラジオグラフが第９図に示
されている（「Ｏ」は元の点を示している）。
オートラジオグラフは三つの特徴を示した。
まず第一に、反応性に於けるNaClの影響は、
ウイツクを行わせるべく使用される支持体に依
存する。「ジーンスクリーン」支持体が使用さ
れる場合には、塩の濃度が低くても良好な反応
性が得られる。逆にニトロセルロースを使用す
る場合には、塩を増量することにより反応性が
向上される。このことは塩が存在する場合に創
成されるイオン環境に起因して支持体に対する
基質DNAの結合性が増大することによるもの
と考えられる。第二に、「ジーンスクリーン」
支持体上に於ける元の点及び水の最前部に対す
るSDSの最前部の位置は、存在するNaClの濃
度に応じて変化する。塩が少なければ少ない程
SDSの最前部は、より遠くへ移動する。第三
に、マトリツクス又は支持体がウイツク作用を
有する基体又は材料として作用するための条件
が存在する。即ち、反応性の点に関して、溶菌
溶液中に0.256MのNaClが存在する状態で使用
されるニトロセルロースは、溶菌溶液中に殆ど
塩が存在しない状態にて使用される「ジーンス
クリーン」支持体に匹敵する。またニトロセル
ロースが支持体材料として使用される場合に
は、SDSの最前部は明瞭に形成されず、DNA
が溶媒の最前部のすぐ下に位置しているのに対
し、「ジーンスクリーン」支持体が使用される
場合には、DNAはSDSの最前部のすぐ上に位
置していることに留意されたい。
第三の支持体マトリツクスである「ゼータバ
インド」も「ジーンスクリーン」と同様に機能
する能力について試験された。精製された
GABHSのDNAを０及び0.126MのNaClを含有
する溶菌溶液（2.35％のSDS、0.5NのNaOH）
中に分散した。溶菌溶液の一部を「ジーンスク
リーン」支持体及び「ゼータバインド」支持体
上にウイツクさせ、それらの支持体をGABHS
に対して特異性を有するDNAプローブとハイ
ブリツド形成させた。各支持体をオートラジオ
グラフ撮影し、カウントし、その結果が第１０
図に示されている（「OX」は0.0MのNaClを表
わしており、「IX」は0.126MのNaClを表わし
ており、「GS」は「ジーンスクリーン」を表わ
しており、「ZB」は「ゼータバインド」を表わ
している）。
この結果は、「ジーンスクリーン」及び「ゼ
ータバインド」が互いに同様の要領にて機能す
ることを示している。第一に、SDSの最前部が
何れの支持体についても同定される。第二に、
ハイブリツド形式に関する反応性の大部分は
SDSの最前部を通過した直後に容易に同定され
る。第三に、液体シンチレーシヨンカウンテイ
ングにより得られたカウントに基づいて判断す
れば、発生したハイブリツド形式の量は量的に
同様である。また「ジーンスクリーン」支持体
について既に説明した如く、「ゼータバインド」
の場合にも塩の濃度が最小値である時、最適の
反応性が得られる。
「ジーンスクリーン」支持体を用いて、ウイ
ツク作用を有する支持体の寸法がハイブリツド
形成の反応性に与える影響についての測定が行
われた。少し前に得られた咽頭スワブから溶離
されたプールされた材料の一部を含有する50μ
の溶菌溶液中へ、精製されたGABHSの
DNAを分散した。二組の「ジーンスクリーン」
支持体を使用した。一方の組は幅６mmであり、
他方の組はベース部に於て12mmであり、18mmの
幅までテーパ状を成していた。何れの組もウイ
ツクされるべき溶菌溶液の総量を受入けるのに
十分なほど大きいものであつた。DNAを含有
する溶液がウイツクした後、二組の支持体を同
一のハイブリツド形成溶液中にてハイブリツド
形成せしめられた。支持体を洗浄し、オートラ
ジオグラフ撮影し、カウントした。その結果が
第１１図に示されている。
この結果はウイツク作用を有する幅の広い支
持体が使用されれば反応性が50％までの範囲に
て向上されることを示している（第１１図に於
てＡとＢとを比較されたい）。
三種類の臨床試料、即ち咽頭スワブ、尿、及
び膣スワブを使用して、臨床試料から、直接、
溶解せしめ細胞材料を、ウイツクすることの有
用性を試験した。
咽頭炎を有するものと疑われる複数の患者に
ついてのスワブを二つずつ培養した。グループ
Ａのβ型連鎖球菌（GABHS）を分離して、標
準的な分析法と本発明のDNAハイブリツド形
成法とを比較すべく、一方のスワブを用いて血
液寒天平板上にて培養した。GABHSをグルー
プＡ以外の連鎖球菌から区別するために、バシ
トラシン感授性度デイスクを寒天平板の第一及
び第二の線状領域に配置した。寒天平板上にβ
型連鎖球菌が存在するということと、デイスク
の周りに増殖が阻害された領域が存在すること
により、陽性の培養の同定が為された。幾つか
の第一の寒天平板は、少数のβ型連鎖球菌のコ
ロニーを有していたが、デイスクの周りには、
はつきりとした増殖が阻害された領域が示され
なかつた。これらの寒天平板からの代表的なコ
ロニーを継代培養し、それらのバシトラシンに
対する感授性を再度評価した。
各対の第二のスワブを、DNAハイブリツド
形成分析に使用した。咽頭スワブ材料を前述の
組成を有するプレ溶菌溶液中で、直接、溶離
し、遠心分離により収集した。この材料の沈澱
物を上述の溶菌溶液中に再度懸濁し、溶菌溶液
は存在する細菌を効果的に溶菌し、これらの細
胞内から核酸を遊離させた。細胞の破片を遠心
分離によつて溶液から除去した。得られた上澄
み液を「ジーンスクリーン」又はニトロセルロ
ースの固体の付活性且多孔質の支持体上にウイ
ツクしさせ、しかる後、支持体を、放射性リン
にて標識されたGABHSに特異的なDNAプロ
ーブとハイブリツド形成せしめた。ハイブリツ
ド形成は、オートラジオグラフイにより検出さ
れた。「ジーンスクリーン」支持体を用いて行
われたこれらの試験の代表的な結果が、第１３
図に図示されており、符号Ａが付された左側の
Ｘ線写真は陽性の検出結果を示しており、符号
Ｂ及びＣが付された他の二つのＸ線写真は陰性
の結果を示している。
標準的な分析方法では、試験された119人の
患者のうち65人がGABHSに関し陽性であるこ
とが示された。これに対し本発明の方法を用い
たところ、119人のうち63人が陽性であると判
定された。これら二つの方法の間の２人の差
は、第一の培養物に於けるバシトラシンに対す
る感度を呈するβ型連鎖球菌を有する培養物に
関するものであつた。継代培養及び型別を行つ
たところ、これら二人の試料からのβ型連鎖球
菌は、グループＣの球菌であると判定された。
上述と同一の方法が、放射性元素にて標識さ
れ大腸菌に対する特異性を有するプローブを用
いて、尿に於ける大腸菌の存在を検査するため
に使用された。細胞を同一のアルカリSDS溶菌
溶液にて溶菌し、「ジーンスクリーン」支持体
上へ直接ウイツクさせ、次いで支持体をハイブ
リツド形成せしめた。オートラジオグラフは、
この種の体液については病原体が容易に溶解さ
れ、病原体の核酸がハイブリツド形成可能な形
態にて容易に支持体上へウイツクすることを示
し、またオートラジオグラフは陽性の結果と陰
性の結果とを明瞭に区別した。
また本発明の方法が膣スワブ中の単純ヘルペ
スウイルス型の存在を検出するために使用さ
れた。かかるハイブリツド形成の代表的なオー
トラジオグラフが第１２図に図示されており、
符号Ａ及びＤが付されたオートラジオグラフは
陰性の結果を示しており、符号Ｂ及びＣが付さ
れたオートラジオグラフは陽性の結果を示して
いる。
７ 臨床咽頭試料中のグループＡのβ型連鎖球菌
の同定 咽頭スワブよりのグループＡのβ型連鎖球菌
の同定は、連鎖球菌性の咽頭炎の診断が確実に
施される前に行われることが必要である。以下
の例は実際の患者の臨床試料を使用してグルー
プＡのβ型連鎖球菌の同定を行う本発明の実施
態様の一例である。
患者の試料の収集は標準的な手続により行わ
れた。即ち、後咽頭及び扁桃を、無菌繊維を先
端に有するアプリケータを用いて激しく拭き取
つた。次いでスワブを以下の如く処理した。
(1) 容量1.5mlのポリプロピレン製の遠心分離
管内に貯容された400μの10ｍＭトリス
（PH7.5）中にて、スワブを手により激しく撹
拌した。
(2) 次いでスワブより溶離された材料をエツペ
ンドルフ（Eppendorf）遠心分離装置内にて
30秒（15.600xG）遠心分離により沈澱せし
めた。
(3) 上澄み液をパスツールピペツトを用いて吸
引し、廃棄した。
(4) 沈澱物を、50μの迅速溶菌溶液（10Nの
NaOHを添加することにより0.5NのNaOH
中に形成された10ｍＭトリス（PH7.5）、1.6
ｍMNaCl、８ｍMEDTA、2.35％のSDS）
中へ再度懸濁し、渦流ミキサを用いて10秒間
激しく撹拌した。
(5) 溶菌試料をエツペンドルフ遠心分離装置内
にて30秒間遠心分離し、固体のDNA結合マ
トリツクス（「ジーンスクリーン・プラス
（Genescreen Plus）」なる商品名にて販売さ
れている）に適用すべく、50μの上澄み液
をマイクロピペツトの先端に収集した。
(6) 50μの溶菌液を、正に帯電したDNA結
合マトリツクス「「ジーススクリーン・プラ
ス」）の約20mm平行の領域に適用した。この
過程は、該溶菌液をパラフインの如き非湿潤
性の表面上に配置し、溶菌液が毛細管作用に
より吸収されるよう溶菌液の液滴をDNA結
合マトリツクスのエツジと接触させることに
より行つた。
(7) 次いでDNA結合マトリツクスの湿潤され
た20mm平行の領域を数分間に亙り空気乾燥し
た。
(8) 次いで乾燥されたマトリツクスをクエンチ
ング溶液（0.2％のポリビニルプロリドン）
M.W.360000）、0.2％の牛の血清アルブミン、
0.2％のフイコル（Ficoll）（M.W.400000））
中に数秒間浸漬した。
(9) 過剰のウエンチング溶液を20mm平方の領域
から除去し、20mm平行の領域を、溶液１ml当
り20nｇの32Pにて標識されたGpAに特異的
なハイブリツド形成プローブDNAを含有す
るハイブリツド形成溶液（下記の注１参照）
にて飽和された30×30mmのフアツトマン
（Whatman）3MMフイルタペーパの表面に
配置した。もう一つの30×30mmのフアツトマ
ンフイルタペーパを、DNA結合マトリツク
スの20mm平行の領域上に配置し、更にハイブ
リツド形成溶液にて飽和した。
フイルタペーパ及びDNA結合マトリツク
スをサンドイツチ状に重ねたものを100mmの
使い捨てプラスチツク製ペトリ皿内に配置し
50℃にて１時間に亙り水面に浮かばせた。
(11) １時間に亙るインキユベーシヨンの後
に、DNA結合マトリツクスを回収し、73℃
にて10分間１％のSDS、0.2倍のSSC（以下の
注２参照）中にて洗浄し、次いで５分間に亙
り0.2倍のSSC中にて洗浄した。
(12) 洗浄後DNA結合マトリツクスの20mm平
方の領域を、永久的な記録を残すべく、−100
℃にて１時間に亙りオートラジオウラフ撮影
し、次いで液体シンチレーシヨンカウンタ内
にてカウントした。
グループＡのβ型連鎖球菌について行われ
た典型的な試験の結果が第１３図のオートラ
ジオグラフに示されている。次いで第１３図
に示された各試験領域について放射性カウン
トを測定した。第１３図のＡ，Ｂ，Ｃについ
ての１分当りのカウント数はそれぞれ1971、
89、92であつた。これらの所見は本発明の方
法により試験された臨床試料の典型的な例で
ある。
注１：ハイブリツド形成溶液 ホルムアミド40％ｖ／ｖ ４倍のSSC（0.15MのNaCl、0.015Mのクエン
酸ナトリウム） 注２：剪断され変性された鮭の精子DNA 200μｇ／ml 硫酸デキストラン10％ｖ／ｖ 以上の説明より、本発明の幾つかの目的が達成
され、他の有利な結果が得られることが理解され
よう。
以上に於ては本発明を特定の実施例について詳
細に説明したが、本発明はかかる実施例に限定さ
れるものではなく、本発明の範囲内にて他の種々
の実施例が可能であることは当業者にとつて明ら
かであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の方法を使用して臨床試料を
処理し臨床試料のDNA／RNAをフイルタ支持体
に適用する種々の工程を示す解図的工程図であ
る。第２図は、本発明の方法を使用してプローブ
DNA／RNAを臨床試料DNA／RNAとハイブリ
ツド形成する種々の工程を示す解図的工程図であ
る。第３図は、本発明に従つてフイルタ支持体を
洗浄し、ハイブリツド形成が発生したか否かを検
出する種々の工程を示す解図的工程図である。第
４図は、細菌ゲノムDNAのアガローズゲル電気
泳動分析の結果を示している。第５図は、クロー
ニングベクタであるプラスミドpUC9及び概ね
1kbの回収されたゲノム断片のアガローズゲル電
気泳動分析の結果を示している。第６図は、組換
えプラスミドを含有する形質転換された細菌細胞
の選定を示す写真である。第７図は形質転換され
た細菌から回収された組換えプラスミドのアガロ
ーズゲルの電気泳動分析の結果を示している。第
８図は、本発明の実施に際しハイブリツド形成プ
ローブとして使用されるクローニングされたゲノ
ム断片のアガローズゲル電気泳動分析の結果を示
している。第９図は、種々のNaCl濃度にて、ジ
ーンスクリーン（Gene Screen）支持体Ａ〜Ｃ及
びニトロセルロースＤ〜Ｆ上へウイツクせしめら
れ、ハイブリツド形成された、500nｇのグルー
プＡのＢ型連鎖球菌（GABHS）DNAを含有す
る溶菌溶液を用いて得られた一連のオートラジオ
グラフＡ〜Ｆを示している。第１０図は、支持体
材料としてのゼータバインド（Zetabind）及び
ジーンスクリーン（Gene Screen）の本発明の実
施に於ける同様の機能を示す一連のオートラジオ
グラフを示している。第１１図は、ウイツク作用
を有する支持体の寸法のハイブリツド形成反応性
に対する影響を示す二つのオートラジオグラフＡ
及びＢを示している。第１２図は臨床用膣スワブ
のDNAハイブリツド形成分析の四つのオートラ
ジオグラフを示しており、特にＡ及びＤを付され
たオートラジオグラフは陰性の結果を示してお
り、Ｂ及びＣを付されたオートラジオグラフは陽
性の結果を示している。第１３図は三つのオート
ラジオグラフ、即ちＸ線写真を示しており、特に
Ａを付されたオートラジオグラフは咽頭スワブ中
のグループＡのβ型連鎖球菌（GABHS）の陽性
の検出結果を示しており、Ｂ及びＣを付されたオ
ートラジオグラフは陰性の結果を示している。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 或る特定のDNA／RNAヌクレオチド配列を
    有する未確認の遺伝子実体を含んでいるものと疑
    われる試料中に存在する該未確認の遺伝子実体
    を、そのDNA／RNAを前記試料から一本鎖の形
    態にて遊離せしめて支持体上に付着して生体外に
    て検出し同定する方法であつて、 前記遊離された試料DNA／RNAとアルカリと
    陰イオン又は双性イオン表面活性剤とを含有する
    溶液を正に帯電した多孔質且不活性の支持体に接
    触させて、毛細管作用により前記支持体上にて前
    記一本鎖の形態の試料DNA／RNAを前記表面活
    性剤より大きい距離移動させ該試料DNA／RNA
    を前記支持体上の移動領域に集合させて固定する
    過程と、 前記固定された一本鎖の形態のDNA／RNAを
    担持する前記支持体を、前記試料DNA／RNAの
    ヌクレオチド配列に対し実質的に相補的なヌクレ
    オチド配列を有するハイブリツド形成プローブと
    接触させて、前記ハイブリツド形成プローブの
    DNA／RNAをハイブリツド形成により実質的に
    前記試料DNA／RNAに対してのみ結合させる過
    程と、 前記プローブのDNA／RNAがハイブリツド形
    成により前記試料DNA／RNAに対して結合した
    ことを判定することにより前記試料DNA／RNA
    の存在を検出する過程と、 を含む未確認の遺伝子実体を生体外にて検出し同
    定する方法。 ２ 未確認の病原体を含んでいるものと疑われる
    臨床試料中に該病原体が存在していることを生体
    外にて検出する方法であつて、 アルカリ及び陰イオン又は双性イオン表面活性
    剤を含有する溶菌溶液にて前記試料中の前記病原
    体を溶菌し、これにより前記病原体のDNA／
    RNAを一本鎖の形態にて前記溶菌溶液中に遊離
    させる過程と、 前記病原体の溶菌物を含有する前記溶菌溶液を
    正に帯電した多孔質且不活性の支持体と接触させ
    て、毛細管作用により前記支持体上にて前記一本
    鎖の形態の前記病原体DNA／RNAを前記表面活
    性剤より大きい距離移動させ、該病原体DNA／
    RNAを前記支持体上の移動領域に集合させて固
    定する過程と、 前記固定された一本鎖の形態の病原体DNA／
    RNAを担持する前記支持体を前記病原体DNA／
    RNAのヌクレオチド配列に対し実質的に相補的
    なヌクレオチド配列を有するDNA／RNAを含む
    ハイブリツド形成プローブと接触させ、前記ハイ
    ブリツド形成プローブのDNA／RNAをハイブリ
    ツド形成により実質的に前記病原体DNA／RNA
    に対してのみ結合させる過程と、 前記プローブのDNA／RNAがハイブリツド形
    成により前記病原体DNA／RNAに対し結合した
    ことを判定することにより前記未確認の病原体の
    存在を検出する過程と、 を含む未確認の病原体を生体外にて検出し同定す
    る方法。
JP60502509A 1984-06-11 1985-06-06 未確認の病原体或いは遺伝子実体を生体外にて検出し同定する方法 Granted JPS61502376A (ja)

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