JPS61502376A - 未確認の病原体或いは遺伝子実体を生体外にて検出し同定する方法 - Google Patents
未確認の病原体或いは遺伝子実体を生体外にて検出し同定する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
未知の病原体或いは遺伝的実在物を
生体外にて検出し同定する方法
発明の背景
本発明は、未知の病原体或いは微生物の存在を検出する方法に係り、更F詳細に
は臨床微生物研究所に於て容易に且信頼性よ〈実施し得る手法を採用することに
よってより迅速に未知の病原体の存在を生体外にて検出する方法に係る。
感染症の臨床処置に於ける一つの重要な因子は、感染の原因である病因物質や病
原体の同定法を確立することにある。多くの場合、感染の原因となる微生物を同
定することは、行われるべき適切な療法を決定することに関する中心的存在であ
る。この点に関し参加する医師は治療の合理的な摂生を開始するに必要な必須の
データを得るべく必然的に臨床微生物研究所に大ぎく依存する。
臨床試料中の病原体を検出づる点に於て現在使用されている手法を含む因子は、
検出に要する時間、必ずしも全ての場合に病因物質を迅速に培養することができ
ないこと、臨床試料より直接アッヒイを行う場合に於ける試薬の交差反応に関す
る困Mvrを含んでいる。
従来より病原菌を同定するための主要な根本原理は、未知の生物の代謝により生
じる産物を検出すること(レネッテ(L annetta )等、マニュアル・
オブ・クリニカル◆マイクロバイオロジー(Manual or Cl1nlc
al M icr。
blologV ) 、 1974年、米l微生物協会(7’Bcr、5ocf
or Mlcrobiol、 ) ) 、例、tば特fの物ffの使用又は特定
の代謝最終産物の形成を同定することにより微生物の種々の酵素能力を検出する
ことを含んでいる。多くの場合未知の生物の同定は、種のレベルの同定に到達す
べく、多数のく20〜30もの)互いに独立した反応に於ける色彩変化に基づい
ている。全ての場合に検出されるべき物質が蓄積されるためには、υ1限された
条件下に於て微生物をかなり増殖させることが必要とされる。従来より不適当に
も採用されている試験は多数の試薬や媒体を必要とし、長時間を要し、また臨床
01究員の側に高度の熟練や訓練を要求するものである。
過去20有余年の間に、微生物同定法を単純化し微生物同定法に必要とされる時
間を短縮すべく種々のシステムが開発されている(ノード(Nord)等、メト
・マイクロバ974年、159:211〜220頁)、(1ナカザキ、メゾ−r
7”サークル(lvledia C1rcle ) 、1975年、20:22
7〜235頁)、(ロバートソン(Robertson)等、ジエイ・タリノ・
マイクロパイオル(J、Cl1n。
M 1croblo1. ) 、 1976年、3:421〜424頁)。
しかしこれらのシステムは基本的には代謝産物の検出という同一のテーマに基づ
くバリエーションを代表するものであり、また代謝産物検出という基本原理に依
存するものである。
病因物質や微生物の迅速な同定に関する現状の代表的なものとして以下の文献を
参照されたい。1ヘツテン(T onen)等は、1982年3月に米国微生物
協会より発行されたアブストラクトの[尿道束に感染した人体中の淋菌を検出ゴ
るだめのDNAハイブリッド形成法」と題する記事に於て、放射性標識された消
息子とし−C淋菌性陰窩プラスミドを使用するDNAハイブリッド形成法の修正
例を使用して患者の試料中の淋菌を検出する方法を開示している。モスリー(M
oscley)等は、ジェイ・インフェクト・ディス(J、fnrect、[
)Is、)の145:863〜869頁の「三つのエンテロトキシン遺伝子消息
子を使用するコロニーハイブリッド形成による腸管m産生性大腸菌の同定」と題
する記事に於て、腸管か産生性大腸菌(ETEC)を同定するためのDNAハイ
ブリッド形成法の適用及び限界を開示している。
一連のアブストラクト(米国微生物協会の1982年の年次会議のアブストラク
ト087〜C95)は多管代謝産物試験システムの評価及び比較(API)を開
示している。
このシリーズの他のアブストラクト(C120〜C123及びC125>は代謝
産物の検出に依存する自動放射測定用血液培養システム(ジョンストン・ラボラ
トリーズ・インコーホレイテッド(J ohnston L aborator
les 、 1nc、 )の「バクチク(Bactec ) J )の評価を開
示している。このシリーズの更に他のアブストラクト(CI24〜C128)は
血液試料よりバクテリアを濃縮化し分離するための血液培養システムを開示して
いる。このシリーズの7ブス1−ラクトC254は血液より微生物を回収するこ
とを促進する二段階の方法を開示している。
和換え型DNA分子を使用して成る特定の病因物質に対する特異性を有する多聞
のDNA断片を製造することが近年可能になった。成る病原体に対する任意の特
定の断片の特異性が実験的に確立されると、そのDNA断片又は消息子はその消
息子が病原体の相補的核酸連鎖とハイブリッド形成する能力を利用して、即ちR
NAゲノムを含む感染ウィルスの場合にはDNA−DNAハイブリッド形成又は
DNA−RNAハイブリッド形成を利用して、病原体の存在を検出するために使
用されてよい。またRNA消息子も使用されてよい。
病原体の検出のための診断法に上述の如きDNlt!l息子を使用することは米
国特許第4.358.535号に開示されている。この米国特許は臨床分離体が
培養され、微生物の数が増大され、得られたコロニーが溶解され、ゲノムが変性
せしめられ、しかる模固定される方法を開示している。或いは病原体を含む臨床
試料が不活性の支持体上に付着され、次いで臨床試料中に存在する微生物よりD
NAを分離し、臨床試料が付着された支持体上の部位にてそのDNAを実質的に
単一ストランドの形態にて固定すべく、臨床試料が処理され溶解される。しかる
後支持体上の単一ストランドのDNAがハイブリッド形成条件下にて病原体のヌ
クレオチド連鎖に対する相補的ヌクレオチド連鎖を有する標識されたポリヌクレ
オチド消息子と接触せしめられ、これにより病原体の単一ストランドのDNAに
対する消息子のハイブリッド形成が病原体の存在の診断に役にたつようになる。
この米国特許に於ては、細胞又はコロニーが移行せずそれらのDNAがそれらが
配置された支持体の表面上の所定の位置に固定された状態に留まるよう溶菌条件
が工夫されることが示されている。この米国特許の方法は病原体の検出に数日を
要する。
フフルコウ(Falkow)によるより最近の論文及び他の論文(1〜ツテン(
7”o(ten )等、ジェイ・インフエクト・ディス(J、rnrect、D
is、 ) 、1983年、148:462頁)に於ては、臨床試料より直接尿
道束に感染した人体中の淋菌を検出することに対しDNAハイブリッド形成法が
適用された。しかしこの方法は患者の試料中のバクテリアを直接検出するために
は少なくとも三日間の反応時間を弱し、従ってすぐには臨床研究に適用すること
ができないものである。
ブローティガム< B rat+ttgam)等(ジェイ・タリノ・マイクロハ
イオル(J、ClIn、Microbiol、 ) 、1980年、12 :
226〜234頁)は、感染した培養物よりの標識されていないDNAとトリチ
ウムの4M識されたウィルスのDNAとの間に於けるハイブリッド形成を使用し
て、単純ヘルペスウィルスの臨床分離体を型別する方法を記載している。この方
法は1日のうちに完了するものであるが、この方法は高価且巧妙な装置を必要と
し、一度に幾つかの臨床試料の処理をすることに容易に適用することができない
ものである。またこの方法は核酸化学の分野に於て比較的経験を積んだ人により
行われることを要づる。
モスリー(M oseley)等〈ジエイ・インフエク1−・ディス(J、In
fect、Dis、 ) 、 1980年、142:892〜898頁)は、腸
管毒産生性大腸菌の多数の分離体を検出する方法であって、熱的に不安定な毒素
又は熱的に安定な毒素を符号化するDNAの放射性標識された断片が、ニトロセ
ルロースフィルタ上にて増殖され溶解された大腸菌コロニー中の同種のDNA連
鎖のためのハイブリッド形成消息子として使用される方法を開示している。この
方法も長時間を要するものであり、完了に数日を!!する。
ブレチョット(3rechot)等(ザ・ランセット(Thel−ancet
) 、1981年10月10日、765〜767頁)は、肝臓及び血清中の肝炎
B型ウィルスの検出にDNA−DNAハイブリッド形成を使用することを開示し
ている。
この方法は組織のバイオプシーを行い、しかる後DNAを抽出し、また完了に約
3日乃至4日を要する工程を必要とする。
バーニンガー([3erningcr)等(ジエイ・メト・ビロル(J 、 M
ad、 V trol。 )、1982ff、9 : 57−68頁)は、血清
中に存在する粒子中の肝炎B型ウィルス(+−IBV)DNAを検出しその出を
測定するt4Mのハイブリッド形成に基づくアッセ・イを開示している。このア
ッセイは消息子として完全な肝炎B型ウィルスのD NAを使用してJ3す、こ
のアラ1?イを完了させるに要する時間は比較的長い。
かくして核酸のハイブリッド形成の原理は従来より認識され病原体の検出に使用
されているが、臨床微生物研究所により行われるサービスの有用性を向上さ「る
べく臨床試料より直接病原体を検出するより迅速で実際的で正確な方法に対する
必要性が依然として存在でる。
発明の概要
水元11の目的は、成る特定のDNA/RNAヌクレオチド連鎖を有する未知の
遺伝的実在物を生体外にて検出し同定する方法を提供すること、体液、滲出液、
組織の如き臨床試料より直接未知の病原体の存在を生体外にて検出する改善され
た方法を提供すること、より迅速に実施可能でありしかも信頼し得る結果を与え
る上述の如き方法を提供すること、消息子のDNA若しくはr<NA中の相補的
連鎖に対する病原体のDNA若しくはRNAの連鎖のハイブリッド形成に好まし
い条件下に於てポリヌクレオチド消息子にてその後処理し得るよう反応性病原体
DNA若しくはRNAを効果的に分離する上述の如き方法を提供すること、これ
らの方法に使用される新規な溶菌溶液を提供することである。
端的にいえば、本発明は、病原体を含/uでいるものと疑われる臨床試料中の未
知の病原体の存在を生体外にて検出する方法であって、(a )病原体のD N
A / RNAを里−スl〜ランドの形態にて溶菌溶液中に遊離させるべく、
アルノJり及び陰イオン又は双性イオン表面活性剤を含有する溶菌溶液にて臨床
試料中の病原体を溶解し、(b)溶菌溶液が毛m管作用により支持体上に移(う
し、14!−ストランドの形態の病原体DNA/RNΔが該病原体D N A
/ RNAが移行した支持体上のfn域に固定された状態になるよう、病原体の
溶解物を含有ゴる溶菌溶液をDNA/RNA結合能力を有する正電荷を有する多
孔質重不活性の支持体と接触させ、(C)単一ストランドの病原体DNA/RN
Aを担持する支持体を、病原体DNA/RN△のヌクレオチド連鎖に対し実質的
に相補的なヌクレオチド連鎖を有するハイブリッド形成消息子と接触させ、これ
によりハイブリッド形成によって消息子のDNA/RNAが実質的に未知の病原
体のDNA/RNAに対してのみ結合される状態になるようにし、(d)ハイブ
リッド形成により消息子のDNA/RNAが未知の病原体のDNA/RNAに結
合したか否かを判定することにより未知の病原体の存在を検出することを含む方
法に関するものである。
広義には、本発明は、遺伝的実在物を含んでいるものと疑われる試料中に存在プ
る特定のDNA/RNAヌクレオチド連鎖を有する未知の遺伝的実在物を生体外
にて検出し同定する方法であって、DNA/RNAがIJl−ス1−ランドの形
態にて試料より遊離され支持体上に付着される方法を改善するものであり、本発
明に於ける改善点は試料の遊離されたDNA/RNAとアルカリと陰イオン又は
双性イオン表面活性剤とを含有ダる溶液が毛細管作用により正電荷を有する多孔
質重不活性の支持体上へ移行し、試料の単一ストランドの形態のDNA/RNA
が該DNA/RNAが移行した支持体上の領域に固定された状態になるよう、溶
液を支持体と接触させ、ハイブリッド形成により消息子のDNA/RNAが実質
的に未知の病原体のDNA/RNAに対してのみ結合された状態になるよう、固
定された単一ス1〜ランドのDNA/RNAを担持する支持体を試料のDNA/
RNAのヌクレオチド連鎖に対し実質的に相補的なヌクレオチド連鎖を有するハ
イブリッド形成消息子と接触させ、ハイブリッド形成により消息子のDNA/R
NAが未知の病原体のDNA/RNAに対し結合したか否かを判定することによ
り未知のDNA/RNAの存在を検出することを含んでいる。
また本発明は追加の工程又は上述の各工程に於ける修正を含む上述の如き方法の
他の実施例に関するものである。
本発明の好ましさの程度が低い他の一つの局面に於ては、臨床試料中の未知の病
原体の検出は、臨床試料を溶菌溶液にて予め溶解し、病原体DNA/RNΔを多
孔質重不活性の支持体上に付着し、しかる後未知の病原体の存在を検出すべくハ
イブリッド形成を行う方法にJ二って達成される。
更に本発明はグラム陰性及びグラム陽性のバクテリア細胞及びウィルス又はウィ
ルスに関係のある物質を迅速に溶解するために使用される新規な溶菌溶液を含ん
でいる。
図面の簡単な説明
第1図は本発明の方法を使用して臨床試料を処理し臨床試料のDNA/ RN
Aをフィルタ支持体に適用する種々の工程を示す解図的工程図である。
第2図は本発明の方法を使用して消息子DNA/RNAを臨床試料DNA/RN
Aに対しハイブリッド形成する種々の工程を示す解図的工程図である。
第3図は本発明に従ってフィルタ支持体を洗浄し、ハイブリッド形成が発生した
か否かを検出する種々の工程を示す解図的工程図である。
第4図はバクテリアのゲノムDNへのアガロースゲルの電気泳動分析の結果を示
している。
第5図はクローニングベクトルであるプラスミドpUc9及びIkbの大きさの
回収されたゲノム断片のアガロースゲルの電気泳動分析の結果を示している。
第6図は組換え型プラスミドを含有する転換されたバクテリア細胞の選定を示す
写真である。
第7図は転換されたバクテリアより回収された組換え型プラスミドのアが[〕−
ズゲルの電気泳動分析の結果を示している。
第8図は本発明の実施に際しハイブリッド形成消息子として使用されるクローニ
ングされたゲノム断片の7ガローズゲルの電気泳動分析の結果を示している。
第9図はシーンスクリーン(Gene 5creen )支持体(A−C)及び
ニトロセルロース(D−F)上にウィック作用により移行されハイブリッド形成
された、種々のNacps度にて500 noのグループへのβ型連鎖球菌(G
ABH8)DNAを含有する溶菌溶液を用いて得られたー・連のオートラジオグ
ラフ(A−F)を示している。
第10図は支持体材料としてのゼータバインド(Z etabind )及びシ
ーンスクリーン(Qene 3CrQOn >の本発明の実施に於ける同様の機
能を示す一連のオートラジオグラフを示している。
第11図はハイブリッド形成反応性に対するウィック作用を11′する支持体の
寸法の影響を示づ二つのオートラジオグラフA及びBを示している。
第12図は臨床用膣スワブのONΔハイブリッド形成分析の四つの′A−+−ラ
ジAグラフを示しており、特にA及びDを付されたオートラジオグラフは陰性の
結果を示しており、B及びCを何されたオートラジオグラフは陽性の結果を示し
ている。
第13図は三つのA−トラジオグラフ、即ちX線写真を示しており、特に八を付
されたオートラジオグラフは咽頭スワブ中のグループΔのβ型連鎖球菌(G A
B l−I S )の陽性の検出結果を示しており、B及びCを付されたオー
トラジオグラフは陰性の結果を示している。
好ましい実施例の説明
本発明によれば、臨床試料中に含まれる未知の病原体は本発明の新規な方法を採
用することにより従来可能であったよりもより迅速に且正確に検出されることが
解った。本発明の方法を採用すれば、病原体の培養は不要であり、従来の方法に
於て一般に必要であった数日とは対照的に1〜2時間という短時間のうちに臨床
試料より直接未知の病原体を検出することができる。本発明の方法は広範囲に組
成が変化していてよい幾つかの体液(例えば血液試料、尿試料等)、滲出液、及
び組織に対し直接適用可能であり、グラム陽性又はグラム陰性のバクテリア、ウ
ィルス、若しくは真核細胞の容易にハイブリッド形成可能な形態の溶解物より直
接DNA/RNAを迅速に製造することを可能にするものである。
病原体を含んでいるものと疑われる臨床分離体より病原体又は病原体の溶離物を
含んでいるものと思われる試料が収集された模に、病原体DNA/RNΔの溶解
及び変性を行うべくアルカリ及び陰イオン表面活性剤(例えばドデシル硫酸ナト
リウム)又は双性イオン表面活性剤を含有する溶菌溶液に゛C病原体を処理し、
これにより病原体のDNA/RNAが111−ストランドの形態にて溶菌溶液中
にTI離されるようにすることにより本発明の方法が実施される。次いで(qら
れたDNA/RNAを含有する溶菌溶液は、その溶菌溶液が毛細管作用により支
持体上へ移行し又はfクイック作用により支持体上に付着し、単一ストランドの
形態の病原体DNA/RNAIfi該病原体DNA/RNAが移行した領域に於
て支持体に非可逆的に結合した状態になよう、DNA結合能)jを有する正電荷
を有する多孔質重不活性の支持体、即らマトリックスと接触せしめられる。本願
発明者等1ま、かくしてDNA/RNAを含有する溶菌溶液が正電荷を41する
支持体に接触「しめられると、ウィック作用が発生し、これによりまず陰イオン
表面活性剤が支持体に結合された状態になり、病原体のDNA/RNAが前方へ
搬送されることを見出した。ウィック作用による広がり又は移行が継続すると、
溶菌溶液は支持体に連続的に結合されている陰イオン表面活性剤の濃度が比較的
小さくなり、前方へ搬送される病原体DNA/RNAの濃度が比較的高くなる。
かくしてかかるウィック作用により、病原体ON△/RN△は正電荷を有1J′
る支持体上の反応性領域、即ら結合ft′lll1l!には不十分なレベルにま
で陰イオン表面活性剤が消費されるまで、移動性の相中に保持される。陰イオン
表面活性剤が実質的に完全に支持体に付着され結合されると、病原体DNA/R
NAは単一ス1−ランドの形態にて幾分か良好に制限された領域に於て支持体に
結合され固定された状態になる。その段階に於ては病原体DNA/RNAはハイ
ブリッド形成接触子と接触される準備がなされた状態にあり、成る特定の病因物
質又は病原体に対する特異性を有する接触子を使用することにより未知の病原体
の存在の検出が行われる。
より広義には、本願発明者等は、上述のウィック作用や移行は、成る特定のDN
A/RNAヌクレオチド連鎖を有する未知の遺伝的実在物を生体外にて検出し同
定すること及び臨床試料中の病原体を検出し同定することに有用且有効に適用さ
れ得ることを見出した。例えば本発明は鐘状血球貧血、サクス病、地中海貧血の
如ぎ遺伝的欠陥を生じる特定の遺伝的変異を診断するために使用されてよい。更
に本発明は欠陥遺伝子の遺伝を診断するための非常に高感成型迅速な手段を提供
するものである。成る特定の遺伝内乱れの正確な特徴は現在のところ解っていな
いが、異常な遺伝子の存在が表現型的に発現される有害な影響の原因であるもの
と考えられる。かくして正常な遺伝子ではなく欠陥遺伝子に対する相補性を有す
る特定のDNA消息子を分離し使用することにより、本発明の実施によって有害
な特性を早期に生体外にて診断することができる。
更に動物の細胞(ワグナ−(Wagncr )等、ブロク・ナトル・アカド・ソ
シ・ニー・ニス・ニー(P roe、N atl。
Acad、Sci、U、 S、△、)、78:6376〜6380頁、1981
年)及び植物の細胞(シェパード(Shepard)等、クイ1ンス(Scie
nce) 、219 : 683〜688頁、1983年)中に機能遺伝子を挿
入することを可能にする方法の出現により、成る特定の遺伝子の存イf及び挿入
された遺伝物質の存在に起因する遺伝的表現のレベルを迅速に判定する方法が必
要になっている。本発明の方法は、レシピ1ントの細胞中に存在し若しくはレシ
ピ1ントのm胸中に外来遺伝物質を導入することの関数として発生されたDNA
/RN八分子に対へDNA/RNΔ消息子をハイブリッド形成させるために使用
されてよい。これにより大きな11J物中に遺伝子を導入した後に行われる早I
Iの検出が行われ、また関心を持っている遺伝子の表現ががなり多大の出費にて
表現型的に監視される後の増殖段階まで転換された遺伝子の同定を理延させる必
要性が排除される。
か(して本発明の方法は広範囲の用途を有するものであるが、これより本発明を
病原体を含んでいるものと疑われる臨床試料中の未知の病原体の存在を検出する
ことに関し説明する。
未知の病原体を含んでいるものと疑われ本発明の方法が適用される臨床試料は、
血液、尿、痰(例えば咽頭スワブ)、膣スワブ、便の如き従来より使用されてい
る試料の何れであってもよい。最良の結果を得るためには、一般に臨床試料は通
常105〜10”の′a度のバクテリア細胞又は病原体Im胞を含有しているこ
とを認識して、出発材料である病原体DNA/RNAが最大限に回収されること
が重要である。かくして例えば咽頭スワブの場合には、本願発lI者等は、スワ
ブ上に存在する材料をバクテリアに害を及ぼさない溶液中に溶離さU−ることが
、バクテリア細胞を回収する上′cRも効率的である訳ではないが、十分である
ことを見出した。しかし未知のバクテリアや病原体に加えて、他の咽頭分泌産物
と共に上皮細胞や他の人体細胞(即t5感染に応答する白血球)も溶離される。
従って人体細胞よりバクテリアを選択的に分離することが行われな昏ノれば、多
量の人体DNA、蛋白質若しくは多糖類が混在することになる。これら全ての産
物は、臨床試料溶離物が直接溶解され、これにより本発明のアラ廿イが幾分か鈍
感にされな番プれば、本発明の方法に於て採用される正電荷を有する多孔質重不
活性の支持体上の領域に結合することに関し、関心を持っているバクテリア又は
病原体のDNA (例えばグループへの連鎖DNA)と競争でる。従って必ずし
も必須という訳ではないが、病原体を溶解することなく臨床溶離物より競争成分
、即ち阻害成分の実質的な部分を除去すべく、試料はまず予備溶菌溶液にて処理
されることが好ましい。多くの場合、かかる予備溶菌溶液による処理は必須では
なく、臨床試料が溶菌溶液中に直接溶離されても有意11イ【結果が得られる。
この点に関し、前述のウィック作用の現象は蛋白質及び異質の多糖類の分離を行
うのに有用であることが解っている。何故ならば、これらの材料は病原体DNA
/RNAと共にではなく陰イオン表面活性剤と共に正電荷を右でる支持体上に(
=J着する傾向を有し、従って支持体上の部位について、即らハイブリッド形成
消息子とのハイブリッド形成に関し病原体DNA/ RN Aと有効に競争しな
いからである。
一般的には必要ではないが、より多量の病原体DNA/RN△を製造すべく臨床
試料はまず培養されてよく、培養された病原体は細菌学的ループや鏡状の器具に
より成果されてよい。
始めに臨床試料より潜在的な競争要素、即ち阻害物質を実質的に除去すべく予備
溶菌溶液が使用される場合には、人体のll111泡を選択的に溶解する非イオ
ンデタージェント、即ち純粋り゛ボニンを低濃度にて含有する溶液を使用するこ
とが好ましい。典型的には予備溶菌溶液は純粋ザボニン、ポリプロピレングリコ
ール、ボリアネトールスルホネ−1へ、ジソジウム・エチレンジニトリロ・テ1
−ラアセテートを含有している。また予備溶菌溶液はトリス(Trts)緩衝液
又は酵素の如き他の適当な成分を含有していてよい。
臨床試料がマイクロ遠心分離管中にて予備溶菌溶液(使用される場合)中に溶離
された後、予備溶菌/試料懸濁液が30〜60秒間遠心分離され、上澄み液が廃
棄された。
バクテリア細胞及び破片よりなる残存J゛るベレッl−が50〜100μqの溶
菌溶液(その主成分はアルカリ及び陰イオン又は双性122表面活性剤である)
中に再度懸濁され、次いで激しくl!!1?された。典9IJ的な溶菌溶液は1
2611Mの塩化ナトリウムと、811Mのエチレン・ジアミンテトラアセテー
トと、1011Mのトリス(pH7,5)と、2゜35%のドデシルli[ナト
リウム(SO3>とよりなっており、使用直前に上述の溶液に対し1ONの水酸
化ナトリウムを添加づることにより水酸化ツートリウム中にて0.5N形成され
る。水酸化ナトリウムの代りに水酸化カリウムや水酸化アンモニウムの如ぎ他の
アルカリが使用されてもよい。
ドデシル@酸ナトリウムは溶菌溶液の主成分として本発明の実施に於て使用され
る好ましい表面活性剤である。ドデシル硫酸ナトリウムはアルカリとの組合U′
に於て病原体のDNA/RNAを単一ストランドの形態にて溶菌溶液中に遊離さ
せる機能を果ずだけでなく、得られた溶菌溶液が正電荷を有する多孔質重不活性
の支持体と接触される場合に於ける病原体DNA/RNAのウィック作用、即ち
移行作用を促進する。当業者に知られている他の種々の陰イオン又は双性イオン
表面活性剤が採用されてもよく、かがる表面活性剤としてはデシル5Auナトリ
ウム、テトラデシル@酸ナトリウム、ソジウム・ドデカノエート、ソジウム・チ
ョレート、ソシセウム・デ第4:シチョレート、リソ・小スフ?ティジルチョリ
ン、N−ドデシル・ベタイン、N−テトラデシル・ベタイン、N−へキシル−N
、N−ジメチル−3−アミノ−1−プロパンスルホネート、N−オクチル−N、
N−ジメチル−3−アミノ−1−プロベンスルホネート、N−デシル−N、N−
ジメチル−3−アミノ−1−プロパンスルホネート、N−ドデシル−N、N−ジ
メチル−3−デモニオ−1−プロパンスルホネート、N−テトラデシル−N、N
−ジメチル−3−アセニオ−1−ブ[]パンスルホネート、N−ヘキサデシル−
N、N−ジメチル−3−アセニオ−1−プロパンスルボネートがある。非イオン
又は陽イオン表面活性剤又はデタージエントは溶菌溶液の目的に番よ有用ではな
い。
必須の成分としてアルカリ及び陰イオン又は双性イオン表面活性剤を含有する溶
菌溶液は本発明の更に他の一つの局面を構成している。従来、特にグラム陰性の
細胞の場合には、ブロネーズ(pronase )やリソチームの如きIn素を
含有する溶菌溶液を採用することが必須であるものと考えられでいた。かくして
グラム陰性のバクテリア、特にグループAの連鎖球菌の溶解は従来より常に10
ネーズやりソヂームの如き酵素を使用して行われており、その場合バクテリアの
細胞壁がバシトラシンやペニシリンの如ぎ細胞弱化物質中に於ける45〜60分
間に亙る増殖により弱化された後に於てのみ溶解が行われている。クリユーウェ
ル(Clcwel l )により認識されている如く(マイクロバイオロジカル
・レビューズ(M icrobiological Reviews)、Vol
、45.409−36頁、1981年)、連鎖球菌は溶解する・ことが幾分か困
難なものであり、通常ドデシル硫酸ナトリウムやサーコシル(3arkosyl
)の如きイオンブタ−ジエンl−が溶菌をもたらす前にリソチーム又は他の溶
解酵素中にて長時間に亙り培lI!することを要し、かかる条件下に於ても溶菌
が不完全であることが多い。同様にグラム陰性のバクテリアの場合にも、リソチ
ームの如き酵素とpl−1条件との組合せが従来J:り採用されている。
更に本発明によれば、グラム陰性及びグラム陽性のバクテリア細胞及びウィルス
の溶菌は、唯一の必須の成分として水酸化ナトリウムの如きアルカリ及びドデシ
ル硫酸ナトリウムの如き隘イオン又は双性イオン表面活性剤又は既に列挙された
他の特定の表面活性剤の何れかを含有する溶菌溶液を使用することにより、酵素
の助けを借りずに迅速に且効果的に達成されることが解っている。ががる溶菌溶
液はバクテリア細胞を溶解する迅速な手段を与え、本発明の方法が適用されてよ
い1床試料中に見出される任意の感染物質を溶解するために自在の溶菌溶液とし
て使用されてよい。アルカリは変性剤として機能し、試料のDNA/RNAを単
一ストランドの形態に転換するものと考えられ、また表面活性剤はアルカリとの
組合せに於て細胞を溶解し細胞よりDNA/RNAを遊離するものと考えられる
。
溶菌溶液中に於けるアルカリ及び陰イオン又は双性イオン表面活性剤の濃度は変
化されてよいが、一般には溶菌溶液は035Nの水酸化ナトノウム又は他のアル
カリであり、表面活性剤の濃度は約Q、5wt%〜約5.Owt%、好ましくは
約2.35wt%であることが好ましい。また溶菌溶液は一つの特殊な例として
、101Mのトリス(pH7,5)と、126mMのNa C1と、8 嗣Mの
エチレンジアミンテトラアビテート(EDTA)とを含有していてよく、これら
の量も本発明の実施の範囲内に於て変化されてよい。
溶菌溶液の特殊な必須の成分として水酸化ナトリウムやドデシル硫酸す1−リウ
ムを使用することが特に好ましく、これらの何れか一方を使用することは溶解が
一層困難なグラム陰性の微生物の溶解を行うには適していない。
上述の如く溶菌の達成に必須という訳ではないが、溶菌溶液は若し必要ならば蛋
白質分解酵素、リパーゼ、多糖類を加水分解する酵素、リソスタフィンを含有し
ていてよい。
予備溶菌溶液にて既に処理された臨床試料を溶解する場合には、得られる溶菌溶
液中に含まれている病原体DNA/RN△は該病原体DNA/RNAを正電荷を
有する多孔質重不活性の支持体に固定し結合ずべく支持体と接触される準備がで
きた単一ストランドの状態にある。本発明に於て使用されるに適したかかる特徴
を有する好ましい支持体としては、アメリカ合衆国コネチカツ1〜州メリデン所
在のエイ・エム・エフ・クツ(AMF Cuno)のマイクロフィルトレージョ
ン・プロダクツ・デヴイジョン(M 1croNItratlOn P rod
ucts D 1vlslon )より「ゼータバインド(zetabind
) Jなる商品名にて販売されているナイロンをベースとする薄膜、又はアメリ
カ合衆国マサチューセッツ州ボストン所在のニュー・イングランド・ニュークリ
ア・コーポレイション(N OVI E ngland N uclear C
orpOratlon)より「シーンスクリーン(Gene 5creen )
Jなる商品名にて販売されている同様の簿膜がある。「ピータバインド」は製
造中に多数の第三アミノ基を導入することにより修正されたナイロン66マトリ
ックス(ポリへキサメチレン・アジバミン)よりなっている。この薄膜は本来的
に親水性及び可撓性を有し、広範囲1に亙る溶媒との両立性を有し、ナイロン薄
膜構造体の共有修正に起因して正味の正電荷を呈する。この固有の正電荷により
陰イオン高分子が高度に結合される。「ゼータバインド」はアメリカ合衆国カリ
フォルニア州すッチモンド所在のバイオ・ラド・ラボラトリーズ(Blo−Ra
d 1−aboratories )より[ゼータ・プローブ(zeta Pr
obe) Jとしても得られる。
「シーンスクリーン」も同様に正電荷を有する支持体材料である。「ゼータバイ
ンド」又は「シーンスクリーン」よりも正電荷の少ないニトロセルロースも好ま
しさの程度は低いが本発明の実施に於て正電荷を有する支持体として有用である
。正電荷を有する樹脂等にて被覆され又は含浸された繊維材料の如ぎ他の多孔質
重不活性の支持体材料も本発明の実施に於て使用されてよい。
ウィック作用又は移行の現象を説明し、またDNAが種々のsos′a度の溶液
中に存在する場合にDNAが何れの部位に移行するかを測定ずべく、DNAが0
.59%、1゜18%、1.77%、2.35%のSDSを含有する溶菌溶液中
に分散された。これらの溶液は「シーンスクリーン」フィルタ@膜支持体上にウ
ィック作用により付着され、得られた支持体は溶媒及びSDSの最前部に対する
支持体上のDNAの位置を測定すべく、DNA消患子に対しハイブリッド形成せ
しめられた。ハイブリッド形成侵に於ける支持体のオーミーラジオグラフィは、
反応性DNAの大部分がSDSの最前部のすぐ前方に位置し、反応性DNAの残
りの部分はウィック作用が開始された元の位置とSO8の最前部との間の種々の
位置に無作為に位置しでいることを示した。更に反応性は5DS(7)111度
の関数として増大し、このことは多量のDNAが支持体に結合されたこと、又は
よりアクセシビリティの高い、従ってハイブリッド形成可能な形態にてDNAが
存在することによるものと考えられる。
ウィック作用による浸透は正電荷を有する多孔質重不活性の支持体を例えば水平
線より90゛の角度であってよい成る角度にて病原体DNA/RNΔを含有する
溶菌溶液と接触させることにより、又は支持体をほぼ垂直の角度にて溶液と接触
させることにより好ましく達成される。浸透現象を使用してSDS又は陰イオン
表面活性剤の増大された濃度の関数として達成される増大された反応性は、ニト
ロセルロースの如き支持体又はフィルタ薄PM基質材利の小さい表面領域上に病
原体BN八を含有する溶液を点状に付着する従来の方法とは対照内である。かく
して本願発明者等は、例えばDNAが「シーンスクリーン」支持体の小さい限ら
れたW4域上に点状に付着される場合には、DNA試料中のSDSの濃度が増大
することにより、上述の条件下にてフィルタ結合アッセイ中に放射性DNAの損
失により明らかである如く基質又は目標DI’JAの保持性が低下することを見
出した。このことはSDSの陰イオン性がDNAのポリ陰イオン性に比肩し、D
NAのポリ陰イオン性が「シーンスクリーン」支持体の正電荷を有り−る表面と
相互作用することを阻害していることを示している。
本発明の実施に於ける浸透現象及びSO8又は他の陰イオン表面活性剤の増大さ
れた濃度に伴なって観察される増大される反応性により達成される正電荷を有す
る支持体上に於ける病原体DNA/RNAの位置は以下のことを示している。ま
ず第一に、大部分の反応性病原体DNA/RN△はSDSよりも比較的弱い陰イ
オンであるので、大部分の反応性病原体DNA/RNAは支持体上のsDsの最
前部の僅かに前方に見Iうれ、かくしてDNA/RNA1.tSO8がその支持
体上の反応性領域には不十分なレベルにまで消費されるまで浸透中移動性の相中
に保持される。第二に、増大されたsosm度は病原体DNA/RNAに加えて
SDSを支持体表面の浸透開始点より更に長い距離に亙り移行さぼる。5DSI
I度の関数としてのDNA移行の増大により反応性DNAがより大きい表面領域
に亙り広げられ、その結果付随的により多量のDNA分子が単一ストランドの形
態にて支持体に結合され、これによりその後のハイブリッド形成に適したより高
品質の!質が形成される。
上述の如き浸透により溶菌溶液の病原体DNA/RNAが正電荷を有する多孔質
■不活性の支持体に結合された状態になると、病原体DNA/RN△を支持体に
対し非可逆的に結合ずべ(、得られた支持体は短時間(例えば1〜2分間)空気
乾燥されることが好ましい。次いで支持体に対するハイブリッド形成消息子の不
特定の結合を低減し、また溶菌溶液よりアルカリを繍し取るべく、支持体はデン
ハルト(Qcnhardt ’ s )溶液(それぞれ0.02%ノフィml/
l/ (Ficoll )(MW400000) 、ポリヒニルビロリジン(M
W360000) 、3倍のSSC(0; 15MのNa Cl 、0.015
Mのクエン酸ナトリfクム1lH6゜5)中の牛の血清アルブミン(フラクショ
ンV))中にすばやく浸漬される。その段階に於ては支持体はハイブリッド形成
消息子と接触ぜしめられる状態にある。
本発明の実施に使用されるハイブリッド形成消息子は、微生物又は病原体の任意
の十分定義された種に於ては、遺伝物質中にその種に特有の特定のヌクレオチド
連鎖が存在し、またこれらの連鎖は成る特定の相補性を有するDNA−0N△ハ
イブリツド形成消息子が未知の微生物のDNAと反応し、これによりその同一性
が示されるDNA−DNAハイブリッド形成の方法(パリシュ(Parish
)、[拡散に関する原理及び実験の実m (P rlnclples and
P ractIce of Experlmants with Nuclel
c Ac1ds) J 、 Dング? ン(1,onBan) 、ロンドン、1
972年、355〜368頁)により検出され得るという原理に基づくものであ
る。例えば微生物である黄色ぶどう球菌より分離されたハイブリッド形成消息子
の形態をなす特異なり NAヌクレオチド連鎖はその種の溶解物中に見られるD
NAとのみ反応する。
本発明に於て使用されるDNA−DNAハイブリッド形成消息子は、既知の微生
物のゲノムDNAのクローニングされたポリヌクレオチド断片よりなっている。
この消息子はその消息子が導き出された種以外の如何なる微生物とも実質的に交
差反応しないことを特徴としている。即ちこの消息子は高度の生体特異性を呈す
る。前述の如く、消息子を構成する断片は成る種の代表的な生体のゲノムDNA
より導かれ、本発明の目的で生体外に於けるDNA−0N△ハイブリツド形成に
使用されるに」−分なm及び純度にて増幅及びその後の分離を行うべく、公知の
方法により適当なプラスミドベクトル中にりO−ニングされる。本発明に於て使
用されるDNA−DNAハイブリッド形成消息子を形成する場合には、適当に培
養されたバクテリアの細胞よりバクテリアのゲノムDNAを(憚るべく、十分定
義された種の既知の微生物の宿主バクテリア細胞が当技術分野に於て公知の従来
の方法により増殖される(上述のレネッテ(Lennette )等及びパリ’
/、=t (parish ) ) 。次イテハクテリアの全てのゲノムON△
が例えば酵素とデタージェントと抗生物質との組合Uを使用する公知の方法によ
ってバクテリアを溶解することによりバクテリア細胞より分離され、しかる模フ
ェノール、クロロホルム、イソアミル・アルコール、エチルエーテルを使用して
細胞DNAを選択的に抽出することにより精製される。(りられる細胞ゲノムD
NAの純度は紫外線分光鏡検査及びアガロースゲルの電気泳動により確定されて
よい。
次いで分離されたバクテリアのゲノムDNAは、基質として特定のヌクレオチド
連鎖のみを認識する限定エンドヌクレアーt!酵素を使用して消化される。この
消化処理は使用される特定の限定エンドヌクレアーゼに応じて特定の基本の連鎖
及び特異な末端ヌクレオチド#を造を有する断片を発生する。断片の末端ヌクレ
オチド構造はその後選択された断片をプラスミドベクトル中にクローニングする
場合にm¥ICある。
かくして製造される断片はDNA源及び消化に使用される限定酵素に応じて種々
の大きさの断片である。酵素により消化されたDNA中に見られる断片の大きざ
の範囲は40 kbpより幾つかの塩基対の小さいオリゴヌクレオチドまでの範
囲である。DNA−DNAハイブリッド形成消息子として使用されるに適した大
ぎさの断片はアガローズゲル中の分離又は蔗糖密度勾配による分離により選択さ
れる。
選択された断片は例えば予備的なアガロースゲルの電気泳動により酵素消化物の
ゲノムDNAより分離される。
次いで特定のバクテリア種より分離された断片は組換え型プラスミドを製造すべ
くプラスミドベクトル中のクローニング宿主中に酵素的に結紮される。プラスミ
ド中のクローニング領域は分離された断片の末端に対する相補性を有する特定の
末端を発生ずる限定エンドヌクレアーゼ切断領域である。かかる適合化のために
、断片は結紮酵素リガービの作用により共有原子価的にプラスミド中に挿入され
てよい。
次いでかくして製造された新たな組換え型プラスミドは、同一の限定酵素により
発生されたことに起因して同一の末端ヌクレオチド構造を有する多数の特異な断
片の増幅又は製造を行うべく、適当なバクテリアのクローニング宿主中に導入さ
れる。宿主バクテリア中への組換え型プラスミドの導入は、形質転換のブ[1セ
ス、即ら受容能ツノのあるバクテリア細胞による裸の二重らせんのDNAの取込
みにより行われる。良好に転換されたこれらの細胞は組換え型プラスミドを含む
細胞のみの増殖を許す好適な選択的な媒体(例えばx−Galアンピシリン寒天
平板)上にて検出される。かくして選択された大ぎさく例えば1kbo)の多数
のクローニングされた断片が各バクテリア種ごとに発生される。断片は特定の限
定エンドヌクレアーゼ領域にてプラスミドベクトル中に挿入された事実に鑑みれ
ば、断片は同一の特定の酵素による組換え型プラスミドの消化により切開され得
る。かかる消化により所望の断片が製造され、所望の断片は繰返し抽出により適
宜に精製されたプレパラート用アガローズゲルの電気泳動によりベクトルプラス
ミドより分離され、その段階に於ては後述の如く未知のバクテリアや微生物を検
出し同定するためのDNA−DNAハイブリッド形成消息子として使用し得る状
態にある。また断片は7ガローズゲルの電気泳動によるのではな(蔗糖の密度勾
配法により隔離され分離されてもよい。
本発明の実施に於て未知の病原体を生体外にて検出するためのDNA−DNAハ
イブリッド形成消息子として使用するための準備として、鋳型として断片を使用
するDNA中に32P dATPを組込むべく、消息子の断゛片は例えばDNA
ポリメラーゼ1を使用して放射性リン(32P)にて?lyl内素標識化されて
よい。消息子として使用される断片を標識化することにより、未知の目標DNA
試料に対するハイブリッド形成が行われた後にオートラジオグラフィ又は液体シ
ンチレーション分光鏡検査により断片を検出することができ、これによりDNA
−DNAハイブリッド形成により未知の微生物のDNAに対する消息子のDNA
の結合が生じたか否かを判定することができる。
放射性リンの代りに、放射性硫黄(358)やヨウ素(1251)の如き他の放
則性元素も標識化剤として使用されてよい。更に螢光標識化やバイオ螢光標識化
の如き当技術分野に於て公知の他の形式の標識化や化学的標識化も採用されてよ
い。更に本発明の生体外試験方法に於て未知の微生物のDNAに対する消息子の
DNAの結合が生じたか否かの判定を行う目的で、消息子のDNAに対し水銀の
如き重金属を複合化又は結合し、しかる後放射性セレン(7580)にて処理し
、シンチレーション分光鏡検査法や原子吸光分析により検出することが行われて
よい。採用されてよい他の標識としては、標識された抗体、螢光剤、化学発光剤
、酵素等に対し特異に結合するビオチンやリガンドがある。
ハイブリッド形成は上述の如く得られた固定された単一ストランドの病原体DN
A/RNAを担持する支持体を、病原体DNA/RNAのヌクレオチド連鎖に対
し実質的に相補的なヌクレオチド連鎖を有するハイブリッド形成消息子と接触さ
Uることにより達成される。消息子は例えば50%のホルムアミドと160o/
mlの鮭の剪断された精子のDNAと0.5MのNa Ql と0.05Mのク
エン酸ナトリウムと10%の硫酸デキストランとを含有するハイブリッド形成溶
液中にて搬送されてよく、消息子は例えば50nMlllの溶液中に存在する。
ハイブリッド形成はプラスチック製のベトリ皿又は他の好適な容器内に貯容され
たハイブリッド形成消息子溶液中に50℃にて約20〜90分間支持体を配置す
ることにより行われてよい。しかし本発明ににれば、ハイブリッド形成を行うた
めに1′サンドイツヂ法」が採用されることが好ましい。この方法によれば、1
枚ノフ7yトマン(Whatmann > 3MMフィルタベーバ(支持体の寸
法よりも僅かに大きい寸法に切断されていることが好ましい)の如き一片の適当
なm質がハイブリッド形成溶液にて湿潤される。次いで病原体DNA/RNAを
担持する支)、1体がベーパ上に配置され、追加のハイブリッド形成溶液が適用
される。次いで他の1枚の同一のベーパが支持体上に配置され、これにより二つ
のベーパの間に支持体が1ナンドイツチ状に挾まれ、更にハイブリッド形成溶液
が適用される。かくして得られたプラスチック製のベトリ皿内のサンドイッチ構
造体は約50℃に約20〜90分間、好ましくは60分間加熱される。かかる特
定の条件は生物や病原体の種類に応じて変化されてよいが、任意の特定の病原体
について実験的に容易にめられる。この加熱即ち培養工程はより完全なハイブリ
ッドの形成を促進し、交差反応を回避するという目的を果す。かくしてハイブリ
ッド形成工程により、消息子のDNA/RNAは実質的に未知の病原体のDNA
/RNAに対してのみ結合された状態になり、又は実質的に未知の病原体のDN
A/RNAとのみ反応する。
ハイブリッド形成が行われた後には支持体は取出され、例、tば100m1の1
%のsDs及び0.2倍(7)SSC(0゜03M Na C1,0,003M
クエン酸ナトリウム)を含有する溶液中に於て73℃にて約10分間に屋り洗浄
され、更に0.2倍のSSC中に於て73℃にて約10分間洗浄され、これによ
り結合していない消息子が除去される。
最後に支持体は乾燥され、例えばガンマカウンタ内にてカランI・され、これに
よりハイブリッド形成による未知の病原体のDNA/RNAに対する消息子のD
NA/RNAの結合が生じたか否かが判定される。支持体はX線フィルムに露呈
ηることによってオートラジオグラフの搬影が行われるか、シンチレーションカ
ウンタ又は他のカウンタ又はこれらの両方中にて1)ラントされるか、結合が生
じたか否かの判定を容易に行うことを可能にする前述の他の手段により判定され
てよい。かくして標識された消息子はその消息子の発生源である種の病原体のD
NA/RNAに対してのみ結合し、これにより適切な療法を開始するための準備
として臨床試料中の未知の病原体を容易に検出し同定することができる。
以上詳細に説明した本発明の方法が、成る特定の順序の工程について第1図乃至
第3図に解図的に示されており、本発明の実施に際しては上述の如く種々の修正
が行われてよい。
かくして本発明は種々の臨床試料より直接未知の病原体を検出するための実際的
な手段を提供するbのであり、現在得られる方法の場合よりも短い時間のうちに
、即ち1〜2時間のうちに所望の感度、精度、及び病原体特異性にて好まし〈実
施されるものである。また従来の方法による検出に必要な濃度よりも低い濃度に
て未知の病原体を検出することができる。
本発明はP;、ilI!I(DNA又はRNA)を含む任意の病原体又は他の生
物の検出に広く適用され得るものであり、本明綱出に於てDNA/RNAはDN
A若しくはRNAを意味する。かかる病原体又は他の生物としては、例えば大I
IQ菌、大便連鎖球菌(連鎖球菌グループD)、黄色ぶどう球菌、緑膿菌、連鎖
球菌グループA1肺炎連鎖球菌、酵母カンジダアルビカンス、インフルエンザ菌
、肺炎杆菌、ミラピリス変形菌、尋常変形菌、霊菌、ベブト連鎮球菌、ウェルシ
ュ菌、プロピオニバクテリウムSP、バタテロイデス・フラギリス、及び他の公
知のグラム陽性及びグラム陰性の球菌、杆菌、又は真菌がある。また単純ヘルペ
スウィルス■型の如きウィルスも含まれる。
必要と思われる場合には、8時間までの時間に亙り適当な増11ri基質上にて
培養することにより、採用される臨床試料のバクテリア細胞の密度が増大されて
よい。
下記の例は本発明の実施に使用される特定のDNA−DNAハイブリッド形成消
息子を用意するための例示的手順である。
1、選定されたバクテリア種よりのゲノムDNAの分離及び精製
大腸菌の如き臨床的に重要なバクテリア及び真菌の欅よりのDNAが、酸素、デ
タージェント、若しくは抗生物質にJ:る溶菌法により微生物の一晩に亙るブロ
ス培養物より分離された。本明細由に記載された大腸菌のゲノムDNAの形成は
僅かな変動を伴なうが他の微生物や病原体よりDNAを分離するために使用され
てもよい。
1qの一晩に亙るブロス培養物よりの細胞が601の150 iMノNa Cl
、10 mMのEDTA(pH8,0)中にて洗浄された。次いで細胞は遠心
分離により沈澱せしめられ、151の3011MのNaC1,21aMのEDT
A(IIH8,0)中に再度懸濁された。次いで1011(+のリソチームが添
加され、混合物が37℃にて30分間培養された。培養後0.4111(7)5
MのNa C1,0,2mlの0.5MのEDTA、2.0mlの20%SDS
(ドデシル硫酸ナトリウム)が添加された。この混合物は60℃に15分間加
熱され、次いで室温に冷却された。61の5MのNaC+04が添加され、次い
で混合物は24:1の混合比の同体積のCHCl3及びイソアミル・アルコール
にて繰返し抽出された。水溶性の相が収集され、DNAが2.5体積の低温(−
20宅)の95%エタノールにて析出された。
次イr D N A析出物が0.1倍のTNE(5oIIIMのトリス−HCl
(pH7,5> 、100 aMのNaCl、5mMのEDTA)中に溶解さ
れた。リボヌクレアーゼが209/1のR終濃度になるよう添加され、しかる後
37℃にて1時間培養が行われた。次いでDNA試利試料5 : 24 :1の
混合比のフェノール、CHCl、、イソアミル・アルコールにて抽出され、2,
5体積の低温の95%エタノールにて析出された。
添付の第4図には、上述の如く形成されたバクテリアのゲノムD N Aのアガ
ロースゲルの電気泳動の結果が示されている。第4図のレーン1は−L述の如く
形成された100nQの精製されたゲノムDN△であり、レーン2はサイズマー
カーとして使用されるバクテリオファージのヒント(Hind ) IIIエン
ドヌクレアーゼ消化物である。最上のものより児て対の帯5及び6はそれぞれ2
,2kb及び2.1kbの対であり、レーン3はゲノムD NΔのヒント(Hi
nd ) II[の完全な消化物である。同様の試料用ゲルFにて完全な消化物
中に約1kbのゲノム断片を含む領域が切開され、その領域より後に更に説明す
る如<DNAが回収された。
2、約1キロベース(kbp)の大ぎさのバクテリアDNAゲノム断片の分離
バクテリアのプラスミドクローニングベクトル中に組込むための断片を形成づべ
く、を述の如く形成された精製されたバクテリアゲノムDNAが適当な限定エン
ドヌクレアーげにて処理された。1kbp以下のゲノム断片がハイブリッド形成
消息子DNAとして選択され、以下の如く分離された精製された断片がクローニ
ングベクトルであるプラスミドDLJCQ中にクローニングされた。
精製された大腸菌DNAが限定エンドヌクレアーぜエコ(ECO)111にて完
全に消化された。消化物は0.5%の低融点アガローズゲル中にて4℃に於て8
0Vにて2時間に亙り電気泳動処理された。1 kbD領域に対応するゲルの領
域が17℃間され、アガロースゲルを60℃に300mM加熱し、しかる後10
信Mのトリス及び1 IBMのEDTAにて飽和されたフェノールを用いてpH
8,0にて抽出を行うことによりDNAが回収された。
添付の第5図には、クローニングベクトルであるプラスミド+1(JC9及び約
1 kbpの回収されたゲノム断片の7ガローズゲルの電気泳動の結果が示され
ている。第5図のレーン1は精製されたプラスミドpLJc9である。図示の幾
つかの帯はけづめ状コイル(形態I’llいた円く形fliII)、及びそれら
の組合せの形態を表わしてJ3す、レーン2は後に説明する如くヒント(ト1i
nd)lの作用により線状(形ll11)にされたプラスミドplJc9である
。線状にされたプラスミドは組換え型プラスミド(レーン3、DNAのヒント(
Hind)ll[消化物)を与えるべり、(レーン4に於て分w!されf1g製
されることが示された)ゲノム断片にて酵素的に和換えられてよい。
3、バクテリアゲノムDNAを含有する組換え型プラスミドの構造
バクテリアの精製されたゲノムDNAがエコ(ECO)R1、ヒント(Htnd
)[又はブスト(PSt) Iの限定領域に於て線状にされたプラスミドoUc
Q中に結紮された。
結紮反応は1:3のモル比にてプラスミドと断片とを混合し、しかる後95%の
エタノール中にてDNAを共同析出させることにより行われた。次いで析出され
たDNA混合物は2.4μQの10mM(7)トリス、I IBMのE D T
’ A中に再度懸濁され、0,4μ9の100mMのジシオスレイトール、0.
4aQの10mMの△T +)、0゜4 tt Q 010倍の再焼戻し耕笥液
(50mMのトリス(pH8,0)、7.5mMのMgCl p 、0.02%
のゼラチン)、及び0.4μQ (1,0ユニツトμq)のT4リガーゼの各試
薬が添加された。結紮混合物は15℃にて14時間培養され、次いでEDTAを
添加することにより反応が停止された。混合物はフェノール、CHCl8、イソ
アミル・アルコールにて一旦抽出され、結紮されたDNAが95%エタノールに
て析出された。組換え型プラスミドを含有するDNA析出物は5μQの10mM
の1へリス、1 11MのE D TA中に溶解され、受容能力のあるバクテリ
ア宿主大腸菌JM83を転換するために使用された。
4、バクテリアの転換二紺換え型プラスミドのクローニング
大腸菌株J M 83がCaC1p中にて処理されることにより転換能力を有す
るようにされた。大腸菌株JM83の迅速に増殖づるブロス培養物がOD !:
90: 0.L に増殖された。20m1の培養物が4℃に於て6000 rp
mにて6分間遠心分11111され、細胞ベレットが20m1の低温の0.1M
のCa C1P中に再度懸濁された。細胞懸濁液は20分間に亙り氷−ヒに維持
され、低温状態にて遠心分離され、細胞が0.51の新鮮な低温の0.1MのC
a C1、、中に再度懸濁された。次いで50μqの細胞懸濁液が上述の結紮反
応により得られた5μQの組換え型プラスミド溶液と混合された。転yk混合物
は更に10分間氷上に維持され、次いで5分間に亙り37℃に維持された。温暖
なく37℃の)しBブロス(12当り10gのトリプトン、5gの酵母抽出物、
10aのNa C1)が添加されることにより体積が1゜51にされ、その懸濁
液が37℃にて30分間培養された。
混合物は細胞を沈澱させるべく遠心分離され、沈澱せしめられた細胞が200μ
Qの新鮮なLBプΩス中にrrI度懸濁され、100μa /mlの7ンビシリ
ンを含有する選択的なX−Ga1の寒天平板の表面に広げられた。寒天平板は3
7℃にて一晩培養された。組換え型プラスミドを含有する転換コロニーは、X−
Ga1媒体(X−Gal媒体1g当り10Ωのトリプトン、5gの酵母抽出物、
0.5(IのNa Cf、1.01の2NのNa0+−1,2,51のN、N−
ジメチルホルムアミド中の2%X−Ga1)上の白色のコロニーとしてそれらの
増殖により同定された。黄色ぶどう球菌、大便連鎖球菌、緑膿菌、又は大m菌よ
りゲノムDNAを含イ1する紺換え型プラスミドを有する種々の転換物質が分離
された。
第6図は組換え型プラスミドを含有する転換されたバクテリア細胞の選定を示す
写真である。バクテリアのゲノム挿入物を含むよう構成されバクテリアクローン
が宿るプラスミドが白色のコロニーとして見える。暗色のコロニーも再構成され
たプラスミドo(J C9を含んでいるが、該プラスミドはゲノム挿入物を含ん
でいない。引換え型プラスミドの同定を可能にする色の相違は、外来のDNA断
片が挿入された乳糖Wa酵遺伝子の不活性化の結果である。転換物質はアンピシ
リンを含有するX−Qal媒体上にて選定された。
組換え型プラスミドを含有する転換物質がX−Ga1アンピシリン平板にn1次
培養され、I[1挽え型プラスミドが限定エンドヌクレアーゼ消化及びアガロー
Xゲルの電気泳動により抽出され分析された。相撲え型プラスミドを含むクロー
ンが限定エンドヌクレアーゼ消化によりプラスミドより容易に切開された単一の
ゲノム挿入物の存在を基準に更に増殖さけ゛るへく選択された。選択されたこれ
らのクローンは副次培養され、組換え型プラスミドが抽出され、バクテリアのゲ
ノム挿入物が切開され、低融点アガローズ中の電気泳動により精製された。ニッ
ク(nick)翻訳による32P標深化を行うべく、ハイブリッド形成消息子と
して使用されるべき挿入物がフェノールによる抽出及びエタノールによる析出に
より更に精製された。
添付の第7図には転換されたバクテリアより回収された組換え型プラスミドにつ
いてのアガローXゲルの電気泳動分析の結果が示されている。種特異性を有する
消息子として使用されるべき増幅されたクローニングされたゲノム断片を回収ず
べく、転換物質よりのプラスミドDNAが抽出され、精製され、適当な限定エン
ドヌクレアーゼにて消化された。レーン1にはプラスミドI)UO3が示されて
おり、レーン2にはヒント(1−1ind ) Iにて消化後の2.7kbpの
線状形態のプラスミド0(JC9が示されており、レーン3にはλヒント(t」
1nd)[1サイズメーカが示されている。
残りのレーン(符号4〜8が付された対)はクローニングされたバクテリアのゲ
ノム断片を含む組換え型プラスミドを示している。各月の最初のレーンは精製さ
れた組換え型プラスミドを示しており、各月の第二のレーンはヒント(Hind
)I[にて消化された後に於ける同一のプラスミドを示している。かかる消化は
クローニングされたゲノム断片を切開し、かかるlIi片はレーン内の最も下の
帯として明瞭に観察される。上側の帯は線状(形態■)のプラスミドベクトルで
ある。無傷の組換え型プラスミド〈各月の最初のレーン)の移行距離をレーン1
内のベクトルプラスミド1)UO3と比較することにより、組換え型プラスミド
はより長いことが明らかである。また切開されたクローニングされたゲノム断片
を比較することによりそれらは互いに異なっていることが解る。種特異性を有す
るハイブリッド形成消息子として使用されるべきクローンはまずかくして篩にか
番プられた。
5゜32Pにて標識されたハイブリッド形成消息子の形成
精製されたクローニングされたバクテリアのゲノム断片のニック(nick)翻
訳*i化が、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(B ethesda Re
search L abs、 ) 1.:より与えられた公知のプロトコルによ
り行われた。DNAの32Pによる標識化の後に、0.2MのNa Cl 、1
0 mMのトリス(DH7,6) 、0.5 mMのEDTA中にセファデック
ス(Sephadex ) G −50を含むコラムを用いて1 kbp以下の
DNA分子のコラムクロマ1〜グラフイ的TlI製を行うことにより組込まれて
いない標識が除去された。ニック(nick)翻訳反応混合物はコラム中に通さ
れ、しかる(受10mMの1−リス、1 11MのEDTAの50μ(の溶離物
が連続的に通された。シンチレーションカウンタを使用して各断片の放射性が検
定され、最大の酸析用可能な標識を含む断片がハイブリッド形成消息子として保
存された。
第8図はハイブリッド形成消息子として使用されるクローニングされたゲノム断
片についてのアガローXゲルの電気泳動の結果を示している。選定された組換え
型プラスミドよりのクローニングされたゲノム断片が限定エンドヌクレアーゼを
使用して切開された後、その模32Pにて標識化され未知のバクテリアを同定す
るためにハイブリッド形成消息子試薬として使用される断片の分離及び精製が行
われた。第8図はかかる手続に使用されるクローニングされた断片の一つを示し
ている。レーン1.2.3はそれぞれクローニングベクトルpUC9、線状化さ
れたpUc9、λDNA−ヒント(Hlnd)■消化物を含んでいる。レーン4
は組換え型プラスミドO8Δ7(黄色ぶどう球菌のゲノム挿入物を有するDUC
9)である。レーン5はヒント(1−(ind)IIIにて消化された模のps
A7である。レーン6は1)SA7よりのクローニングされた黄色ぶとう球菌の
ゲノム挿入物である。
6、本発明の実施
500 noの精製されたグループAのβ型連鎖球菌(G△8l−Is)DNA
を含有する溶菌溶液(126mMの塩化ナトリウム、81Mのエチレン・ジアミ
ンテトラ・アセテート、101Mのトリス(c++7.5)、水酸化ナトリウム
中にて0.5N形成された2、35%の5O8)が、ハイブリッド形成について
の試験を行うべく、種々の塩濃度にて「シーンスクリーン」及びニトロセルロー
スのフィルタ支持体上に浸透により付着された。O,OM、0.126M、0.
256MのNa C1maが採用された。ハイブリッド形成に使用されるDNA
消息子は上述の如く形成され、約1 / 400017) G A B I−I
S染色体DNA’E:示し、3×10’cpa/μ0の特異性活性にまで標識
化された。ハイブリッド形成は51℃にて1時間に亘り行われ、しかる後1%の
5DS10.2倍のSSC中に於て73℃にて10分間洗浄され、0.2倍のS
SC中に於て73℃にて10分間最終的に洗浄された。次いでフィルタ支持体は
増感紙を使用してX線フィルム上にオートラジオグラフ躍影された。
このオートラジオグラフが第9図に示されている( rOJは元の点を示してい
る)。
オートラジオグラフは三つの特徴を示した。まず第一に、反応性に対づるNa
Clの影響は浸透を行わせるべく使用される支持体に依存する。「シーンスクリ
ーン」支持体が使用される場合にlユ、塩の濁度が低くて0良好な反応性がVI
られる。逆に二1−口セルロースを使用づる場合には、塩を増mづることにより
反応性が向上さFtろ。このことは塩が存在でる場合に創成されるイオン環境に
起因して支持体に対する基質DNAの結合性が増大することによるものと考えら
れる。第二に、「シーンスクリーンJ支持体上に於ける元の点及び水の最前部に
対するSDSの最前部の位置は存在するNa Clの濃度に応じて変化する。塩
が少なければ少ない程S I) Sの最前部はより遠くへ移行する。第三に、マ
l−ワックス又(よ支持体がウィック作用を有1Jる基質又は材料として作用す
る能力の点で匹敵し得るようにされる条件が存在す−る、5かくして溶菌溶液中
に0.256Mのp4a Qlが存在する状態で使用されるニトロセルロースは
、溶菌溶液中に殆ど塩が存在しない状態にて使用される「シーンスクリーン」支
持体に反応性の点で匹敵する。またニトロヒルロースが支持体材料として使用さ
れる場合にはSDSの明瞭な最前部は形成されず、DNAは溶媒の最前部のプぐ
下に位置しているのに対し、「シーンスクリーン」支持体が使用される場合には
、DNAはSDSの最前部の寸ぐ上に位置していることに留意されたい。
第三の支持体マトリックスである「ゼータバインド」も「シーンスクリーン」と
同様に機能する能力について試験された。精製されたG A B HSのDNA
がO及び0.126MのNaC1を含有する溶菌溶液(2,35%のSO8゜0
.5NのNa0I−1)中に分散された。溶菌溶液の一部が1シーンスクリーン
」支持体及び「ゼータバインド」支持体上に浸透により付着され、それらの支持
体はGABH3に対する特異性を有するDNA消息子に対しハイブリッド形成せ
しめられた。各支持体がオートラジオグラフ韻彰され、カウントされ、その結果
が第10図に示されている( rOXJはO,OMのNa C1を表わしており
、rlXJは0.126MのN a CIを表わしており、r G S J ハ
「シーンスクリーン」を表わしており、rZBJは「ゼータバインド」を表わし
ている)。
この結果は[シーンスクリーン、1及び「ゼータバインド」が互いに同様の要領
にて機能することを示している。第一に、SDSの最前部は何れの支持体につい
ても同定される。
第二に、ハイブリッド形成に関する反応性の大部分はSDSの最前部を通過した
直後に容易に同定される。第三に、液体シンチレーションカウンティングにより
得られたカウントに基づいて判断すれば、発生したハイブリッド形成の量は量的
に同様である。また「シーンスクリーン」支持体について既に説明した如り、「
ゼータバインド」の場合にも塩の濃度が最小値であっても最適の反応性が得られ
る。
「シーンスクリーン」支持体を用いて、ウィック作用を有する支持体の司法がハ
イブリッド形成の反応性に与える影響についての測定が行われた。少し前に得ら
れた咽頭スワブより溶離されたプールされた材料の一部を含有する50μaの溶
菌溶液中にm製されたG A B l−I SのDNAが分散された。二組の[
シーンスクリーンJ支持体が使用され、一方の相は幅6111!1であり、他方
の組はベース部に於て12I11であり、1811mの幅までテーバ状を成して
いた。何れの紺乙浸透により付着されるべき溶菌溶液の18fftを受入れるに
十分なほど大きいものであった。DNAを含有する溶液が浸透ににり付着された
後、二組の支持体は同一のハイブリッド形成溶液中にてハイブリッド形成せしめ
られた。支持体は洗浄され、オー1−ラジオグラフ撮影され、カランl〜された
。その結果が第11図に示されている。
この結果はウィック作用を有する幅の広い支持体が使用されれば反応性が50%
までの範囲にて向上されることを示している(第11図に於てAとBとを比較さ
れたい)。
三種類の臨床試料、即ち咽頭スワブ、尿、及び腟スワブを使用して、臨床試料よ
り直接得られた溶解された[ll11材料を浸透により付着することの有用性が
試験された。
咽頭炎を有するものと疑われる患者が二つのスワブを用いて培養に付された。グ
ループAのβ型連鎖球菌(GABH8)を分l111 L、て本発明のDNAハ
イブリッド形成法を標準的なアッセイと比較すべく、一方のスワブが血液寒天平
板上にて培養するために使用された。G A B l−I SをグループA以外
の連鎖球菌よりG A B H8を区別ずべく、バシ]・ラシン感度ディスクが
寒天平板の第−及び第二の線状領域にl’ii!置された。寒天甲板上にβ型連
鎖球菌が存在することに加えて、感度ディスクの周りに抑制された増殖の領域が
存在することにより陽性の培養の同定が行われた。幾つかの第一の寒天平板は小
数のβ型連鎖球菌のコロニーを有していたが、感度ディスクの周りには抑制され
た増殖の明瞭な領域を示さなかった。これらの寒天平板よりの代表的なコロニー
が01次培養され、それらのバシトラシンに対する感度が再度評価された。
多対の第二のスワブがDNAハイブリッド形成分析に使用された。咽頭スワブ材
料が前述の組成を有する予備溶菌溶液中に直接溶離され、遠心分離により収集さ
れた。この材料のペレットは上述の溶菌溶液中に再度懸濁され、溶菌溶液は存在
するバクテリアを効果的に溶解し、これらの細胞内より核酸を遊離させた。細胞
の破片が遠心分離により溶液より除去された。得られた上澄み液が1シーンスク
リーン」又はニトロセルロースの固体の不活性且多孔質の支持体上に浸透により
付着され、しかる後支持体が放射性リンにて標識されたG A B l−I S
に特異なりNA消息子に対し支持体がハイブリッド形成ぼしめられた。ハイブリ
ッド形成はオートラジオグラフィにより検出された。「シーンスクリーン」支持
体を用いて行われたこれらの試験の代表的な結果が第13図に図示されて33す
、符号△が付された左側のX線写真は陽性の検出結果を示しており、符号B及び
Cが付された他の二つのXIQ写真は陰性の結果を示している。
標準的なアッヒイは試験された119人の患者のうち65人がG△8H8に関し
陽性であることを示した。これに対し本発明の方法を用いたところ、119人の
うち63人が陽性であると判定された。これら二つの方法の間の2人の差は第一
の培養物についてバシトラシンに対する感度を呈するβ型連鎖球菌をイiする培
養物に関するものであった。
副次16養及び型別を行ったところ、これら二つの分離体よりのβ型連鎖球菌は
グループCの球菌であると判定された。
上述の同一の方法が放射性元素にて標識された大腸菌に対する特異性を有する消
息子を用いて大腸菌の存在についで尿を検査するために使用された。細胞が同一
のアルカリSDS溶菌溶液にて溶解され、浸透により「シーンスクリーン」支持
体上に直接付着され、次いで支持体がハイブリッド形成せしめられた。オートラ
ジオグラフはこの種の体液については病原体が容易に溶解され、病原体の核酸が
ハイブリッド形成可能な形態にて浸透により容易に支持体上に付着されることを
示し、またオートラジオグラフは陽性の結果と陰性の結果とを明瞭に区別した。
また本発明の方法が腟スワブ中の単純ヘルペスウィルス■型の存在を検出するた
めに使用された。かかるハイブリッド形成の代表的なオートラジオグラフが第1
2図に図示されており、符号△及びDが付された。1−1−ラジオグラフは陰性
の結果を示しており、符号B及びCが付されたオートラジオグラフは陽性の結果
を示している。
7、臨床咽頭試料中のグループへのβ型連鎖球菌の同定咽頭スワブよりのグルー
プへのβ型連鎖球菌の同定は、連鎖球菌性の咽頭炎の診断が確立される前に行わ
れることが必要である。以下の例は実際の患者の臨床試料を使用してグループへ
のβ型連鎖球菌の同定を行う本発明の実施態様の一例である。
患者の試料の収集は標準的な手続により行われた。即ち後咽頭及び扁桃が無菌繊
維を先端に有するアプリケータを用いて激しく拭き取られた。次いでスワブが以
下の如く処理された。
(1)容ff11.5mlのポリプロピレン製の遠心分離管内に貯容された40
0μqの10mMの1−リス(+)H7,5)中にてスワブが手により激しく撹
拌された。
(2)次いでスワブより溶離された材料がエツベンドルフ(E ppendor
f)遠心分離装置内にて30秒(15,600xG)遠心分離により沈澱せしめ
られた。
(3)上澄み液がパスツールピペットを用いて吸引され、廃棄された。
(4)ベレットが50ttQの迅速溶菌′1B液(1ONのNa0)(を添加す
ることにより005NのNa OH中に形成された10mMのトリス(pH7,
5)、、12.6 mMのNacl、8mMのED丁A、2.35%の5O8)
中に再度懸濁され、渦流ミキサを用いて10秒間激しく撹拌された。
(5)溶菌試料がエンドルフ遠心分離装置内にて30秒間遠心分離され、固体の
DNA結合マトリックス(「シーンスクリーン・プラス(QCncscraan
Plus ) Jなる商品名にて販売されている)に適用すべく50μ9の上
澄み液がマイクロピペットの先端に収集された。
(6〉50P党の溶菌液が該溶菌液をパラフィンの如き非湿潤性の表面上に1l
Si!置し、溶菌液が毛細管作用により吸収されるよう溶菌液の液滴をDNA結
合マトリックスのエツジと接触させることにより、正電荷を有するDNA結合マ
トリックス(「シーンスクリーン・プラス」)の約201Il平方の領域に適用
された。
(7)次いでDNA結合マトリックスのUnされた2011平方の領域が数分間
に屋り空気乾燥された。
(8)次いで乾燥されたマトリックスが焼戻し溶液(0゜2%のポリビニルピロ
IJ トン(M、W、360000)、0.2%の牛の血清アルブミン、0.2
%のフィコル(Ficoll )(M、W、400000))中に数秒間浸漬さ
れた。
(9)過剰の焼戻し溶液が20mm平方の領域より除去され、201111平方
の領域が溶液1ffl+当り20mgの32Pにて標識されたODAに特異なハ
イブリッド形成消息子DNAを含有するハイブリッド形成溶液(下記の注1参照
)にて飽和された30X30mmの77ツトマン(Whatn+an) 3MM
フィルタベーパの表面に配置された。他の一つの30X30−纏の77ツトマン
フイルタベーバがDNA結合マトリックスの20m−平方の領域上に配置され、
次いで追加のハイブリッド形成溶液にて飽和された。
100ffillの使い捨てのプラスチック製ベトリ皿内に配置されたフィルタ
ベーパ及びDNA結合マトリックスのサンドインチ構造体が50℃にて1時間に
亙り水面に浮かばされた。
(11)1時間に亙り培養後にDNA結合マトリックスが回収され、73℃にて
10分間1%のSDS、0.2倍のSSC(下記の注2参照)中にて洗浄され、
次いで5分間に亙り0.2倍のSSC中にて洗浄された。
〈12)洗浄後6NA結合マトリックスの20IDm平方の領域が永久的な記録
を残すべく一1oo℃にて1時間にIリオートラジオグラフ撮影され、次いで液
体シンチレーションカウンタ内にてカウントされた。
グループAのβ型連鎖球菌について行われた典型的な試験の結果が第13図のオ
ートラジオグラフに示されている。
次いで第13図に示された各試験領域について放射性カウントが測定された。第
13図のA、B、Cについての1分間当りのカウント数はそれぞれ1971.8
9.92であっだ。これらの所見は本発明の方法により試験された臨床資料の!
lI!型的な例である。
注1:ハイブリッド形成溶液
ホルムアミド40%V/V
4倍の830 (0,15MのNaC+、0.015Mのクエン酸ナトリウム)
汀219断され変性された鮭の精子DNA200μQ /II
硫酸デキストラン10%V/V
以上の説明より、本発明の幾つかの目的が達成され、伯の有利な結果が(qられ
ることが理解されよう。
以上に於ては本発明を特定の実施例についで詳細に説明したが、本発明はかかる
実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内にて他の種々の実施例が可能
であることは当業者にとって明らかであろう。
工
浄書(内容に変更なし)
O
匡
O)
(方式・自発)
手続補正m
1、事件の表示 PCT/US851010502o発明の名称 未知の病原体
或いは遺伝的実在物を生体外にて検出し同定する方法
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
住 所 〒45701アメリカ合衆国オハイオ州、アセンズ、ルー1−6、ボッ
クス 133
名 称 ダイアグノスティック・リサーチ・リミテッド・パートナ−シップ
4、代理人
居 所 の104東京都中央区新川1丁目5番19@5、補正の対象 特許法第
184条の5第1項の規定による書面、国際調査報告
Claims (6)
- (1)未知の遺伝的実在物を含んでいるものと疑われる試料中に存在する或る特 定のDNA/RNAヌクレオチド連鎖を有する未知の遺伝的実在物を生体外にて 検出し同定する方法であって、DNA/RNAが前記試料より単一ストランドの 形態にて遊離せしめられて支持体上に付着される方法にして、 前記遊離された試料DNA/RNAとアルカリと陰イオン又は双性イオン表面活 性剤とを含有する溶液が正電荷を有する多孔質且不活性の支持体上へ毛細管作用 により移行し、前記単一ストランドの形態の試料DNA/RNAが該試料DNA /RNAが移行した前記支持体上の領域に於て固定された状態になるよう、前記 冶液を前記支持体と接触させる過程と、 前記試料DNA/RNAのヌクレオチド連鎖に対し実質的に相補的なヌクレオチ ド連鎖を有するハイブリッド形成消息子のDNA/RNAがハイブリッド形成に より実質的に前記試料DNA/RNAに対してのみ結合された状態になるよう、 前記固定された単一ストランドの形態のDNA/RNAを担持する前記支持体を 前記ハイブリッド形成消息子と接触させる過程と、 前記消息子のDNA/RNAがハイブリッド形成により前記試料DNA/RNA に対し結合したか否かを判定することにより前記試料DNA/RNAの存在を検 出する過程と、 を含む方法。
- (2)未知の病原体を含んでいるものと疑われる臨床試料中の未知の病原体の存 在を生体外にて検出する方法にして、アルカリ及び陰イオン又は双性イオン表面 活性剤を含有する溶菌溶液にて前記試料中の前記病原体を溶解し、これにより前 記病原体のDNA/RNAを単一ストランドの形態にて前記溶菌溶液中に遊離さ せる過程と、病原体溶解物を含有する前記溶菌溶液が毛細管作用により正電荷を 有する多孔質且不活性の支持体上へ移行し、単一ストランドの形態の前記病原体 DNA/RNAが該病原体DNA/RNAが移行した前記支持体上の領域に於て 固定された状態になるよう、前記溶菌溶液を前記支持体と接触させる過程と、 前記病原体DNA/RNAのヌクレオチド連鎖に対し実質的に相補的なヌクレオ チド連鎖を有するハイブリッド形成消息子のDNA/RNAがハイブリッド形成 により実質的に前記病原体DNA/RNAに対してのみ結合された状態になるよ う、前記固定された単一ストランドの形態の病原体DNA/RNAを担持する前 記支持体を前記ハイブリッド形成消息子と接触させる過程と、 前記消息子のDNA/RNAがハイブリッド形成により前記病原体DNA/RN Aに対し結合したか否かを判定することにより前記未知の病原体の存在を検出す る過程と、を含む方法。
- (3)未知の病原体を含むものと疑われる臨床試料中の未知の病原体の存在を生 体外にて検出する方法にして、前記試料を処理し、これにより前記病原体を溶解 させることなく前記試料の病原体DNA/RNAより競争成分又は阻害成分を除 去する過程と、 アルカリ及び陰イオン又は双性イオン表面活性剤を含有する溶菌溶液にて前記病 原体を溶解し、これにより前記病原体のDNA/RNAを前記溶菌溶液中に遊離 させる過程と、 前記病原体DNA/RNAをより純粋な状態にて製造するよう構成された溶媒に て前記溶解物を抽出する過程と、前記病原体DNA/RNAが多孔質且不活性の 支持体の成る領域に付着されるよう、前記病原体DNA/RNAを前記支持体と 接触させる過程と、 前記病原体DNA/RNAのヌクレオチド連鎖に対し実質的に相補的なヌクレオ チド連鎖を有するハイブリッド形成消息子のDNA/RNAがハイブリッド形成 により実質的に前記未知の病原体のDNA/RNAに対してのみ結合された状態 になるよう、前記支持体を前記ハイブリッド形成消息子と接触させる過程と、 前記消息子のDNA/RNAがハイブリッド形成により前記未知の病原体のDN A/RNAに対し結合したか否かを判定することにより前記未知の病原体の存在 を検出する過程と、 を含む方法。
- (4)グラム陰性及びグラム陽性のバクテリア細胞及びウイルスを迅速に溶解す るための溶菌溶液にして、成分としてアルカリ及び陰イオン又は双性イオン表面 活性剤を含み、酵素を含んでいない溶菌溶液。
- (5)グラム陰性及びグラム陽性のバクテリア細胞を迅速に溶解するための溶菌 溶液にして、実質的に0.5〜5.0wt%の陰イオン又は双性イオン表面活性 剤を含有し、実質的に0.5Nアルカリであり、成分として酵素を含有していな い溶菌溶液。
- (6)グルーブAの連鎖球菌を迅速に溶解するための溶菌溶液にして、実質的に 8mMのエチレンジアミンテトラアセテートと、10mMのトリス(PH7.5 )と、2.35%のドデシル硫酸ナトリウムと、126mMの塩化ナトリウムと を含有し、0.5N水酸化ナトリウムである溶菌溶液。
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