CN115161383A - 一种检测b族链球菌的阳性质控品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测B族链球菌的阳性质控品及其制备方法。该质控品包括GBS灭活菌株、内标质粒和稀释液；所述GBS灭活菌株包括Ia、Ib、III、V型中的至少一种；所述稀释液由P300、P950、硅酮、EDTA·2Na和HEPES缓冲液组成。实验结果表明，本发明提供的质控品具有良好的稳定性，37℃热加速可稳定保存超过14天，2‑8℃环境稳定保存至少18个月，稳定性明显优于现有产品。该质控品与实际GBS临床拭子样本具有一致性，可作为一种标准质控品被上市厂家检测出来，能够真实地模拟GBS在体外核酸检测过程，通用性强；且产品具有成本低廉、稳定性高、便于存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产，具有重要的价值与应用前景。

Description

一种检测B族链球菌的阳性质控品及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测B族链球菌的阳性质控品及其制备方法。

背景技术

B族链球菌(Group B Streptococci,GBS)为兼性厌氧的革兰氏阳性链球菌，是一种无症状的肠道和泌尿生殖道共有细菌，属于条件致病菌，正常寄居于阴道和直肠，正常妇女带菌率30％以上。GBS感染孕妇可通过产道传播给新生儿，引起新生儿的败血症、脑膜炎、肺炎等，是目前引发新生儿感染的主要致病菌之一。

1996年美国疾病控制中心(CDC)与其他机构共同制定了《围产期B族链球菌感染筛查及防治指南》，2002年、2010年美国CDC对该指南进行2次修订，针对妊娠期产妇GBS预防与治疗最终决定采用普遍筛查方案。其中提及到，在孕妇分娩时，如无培养结果或培养结果未知，且存在以下任一危险因素(分娩胎龄<37周、胎膜破裂≥18h、产前体温≥38℃)的孕妇应及时给予治疗；对没有任何危险因素的孕妇，可直接阴道和直肠取样进行核酸扩增，快速检测GBS阴阳性结果。

核酸检测主要通过孕妇生殖道和直肠道拭子中GBS靶标DNA的特异性扩增监测病人有无感染GBS，而B族链球菌核酸检测质控品则用于GBS核酸检测时的质量控制。但目前临床试验室所使用的GBS质控品基本上是上市核酸检测产品的附属产品，存在着稳定性不好，批间变异较大，各个单位标定的靶值不一致等诸多不稳定因素；而且，各厂家试剂盒中的阳性质控品有效成分均为含有靶标序列的质粒或利用靶标质粒构建的重组菌株，各厂家所选择扩增的靶标序列又不尽相同，只能被本试剂盒中的扩增试剂扩增检测出来，不能用于其他厂家试剂盒的质量控制，对于GBS核酸检测质量控制的统一性和规范性非常不利。另外，国内目前尚无单独生产质控品的厂家，且各厂家质控品需储存于-20℃条件下，使用不便，更重要的是，反复的冻融对检测结果有较大影响。因此，急需提供一种通用性强、可稳定保存的B族链球菌核酸检测阳性质控品。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测B族链球菌的阳性质控品及其制备方法。该阳性质控品具有良好的稳定性、通用性和一致性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种检测B族链球菌的阳性质控品，包括GBS灭活菌株、内标质粒和稀释液；

所述GBS灭活菌株包括Ia、Ib、III、V型中的至少一种；

所述稀释液由P300、P950、硅酮、EDTA·2Na和HEPES缓冲液组成。

在一个具体实施例中，本发明考察了不同稀释液制成的阳性质控品的加速稳定性和长期稳定性，结果表明，本发明稀释液制得的阳性质控品能够有效防止质控品靶标和内标物质的降解，为质控品提供稳定的环境，延长质控品的保存时间，使得采用所述质控品保存液制得的B族链球菌核酸检测质控品不易降解，可稳定保存。

本发明提供的阳性质控品中，所述稀释液中各组分占所述稀释液的百分比为：

0.1～0.2vol％P300、0.15～0.3vol％P950、0.01～0.02vol％硅酮消泡剂和0.035～0.07wt％EDTA·2Na。

一些具体实施例中，所述稀释液中各组分占所述稀释液的百分比为：

0.1vol％P300、0.15vol％P950、0.01vol％硅酮和0.035wt％EDTA·2Na；

或，0.2vol％P300、0.3vol％P950、0.02vol％硅酮和0.07wt％EDTA·2Na。

本发明中，所述内标质粒为含有人源性β珠蛋白基因的质粒。

进一步的，所述人β珠蛋白基因包括sequence ID为MK476491.1、MK476483.1、MK476464.1中的至少一种基因。

本发明中，所述GBS灭活菌株和人源性β珠蛋白基因的内标质粒的浓度可根据临床需要进行选择，一般为临床中低浓度。本发明中，所述GBS灭活菌株在所述阳性质控品中的浓度优选为1×10⁴～1×10⁵CFU/mL；所述有人源性β珠蛋白基因的内标质粒在所述阳性质控品中的浓度为1×10⁴～1×10⁵copies/mL。

本发明还提供了所述的阳性质控品的制备方法，包括以下步骤：

将GBS菌株活化、传代、扩大培养；经离心、重悬、灭活，获得GBS菌株菌悬液；

将GBS菌株菌悬液和含有人β珠蛋白基因的内标质粒溶液混合，加入P300、P950、硅酮消泡剂和EDTA·2Na，获得阳性质控品。

本发明还提供了所述的阳性质控品在制备检测B族链球菌的核酸检测试剂盒中的应用。

在一个具体实施例中，本发明经实验发现，上市各厂家的阳性质控品只能被各自配套试剂盒扩增检测出，不能被其他厂家试剂盒扩增检测出；本发明制备的GBS核酸检测阳性质控品可以被所有厂家试剂盒扩增出来，说明本发明质控品能作为一种通用阳性质控物，可广泛用于GBS核酸检测时的质量控制。

本发明提供的质控品具有良好的稳定性，37℃中稳定保存超过14天，2-8℃环境稳定保存至少18个月，稳定性明显优于现有产品。该质控品与实际GBS临床拭子样本具有一致性，通用性强，可真实地模拟GBS在体外核酸检测过程，从而实现对GBS核酸检测的全方位监控；且产品具有成本低廉、稳定性高、便于存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产，具有重要的价值与应用前景。

具体实施方式

本发明提供了一种检测B族链球菌的阳性质控品及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明稀释液和质控品的制备

稀释液组成：0.1vol％P300、0.15vol％P950、0.01vol％硅酮消泡剂、0.035wt％EDTA·2Na和HEPES缓冲液。

阳性质控品：含有靶核酸序列的GBS菌株-浓度1×10⁴CFU/mL、人β珠蛋白基因质粒-浓度1×10⁴copies/mL、0.1vol％P300、0.15vol％P950、0.01vol％硅酮消泡剂、0.035wt％EDTA·2Na和HEPES缓冲液。

阳性质控品的制备方法包括以下步骤：

(1)人β珠蛋白基因质粒的制备：根据NCBI数据库中人β珠蛋白基因核酸序列，设计保守引物序列，合成目的基因。利用含有目的基因序列的核酸为模板进行PCR扩增，引物序列如表2所示。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对含有目的基因片段的条带切胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行目的基因的回收。②含目的基因的质粒载体构建和验证：分别用限制性内切酶对目的基因片段和载体进行双酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收。将酶切产物进行连接，得到连接产物，然后将连接产物转化感受态细胞，涂在LB培养基平板上，37℃倒置培养，挑选单个白色阳性菌落。提取阳性菌落的DNA，进行PCR验证，将PCR验证为目的基因阳性的菌落进行测序验证。③含有目的基因质粒溶液的制备：将经测序确认的单个阳性菌落接种至LB液体培养基中，经培养后，离心，弃上清，留沉淀。加入超声缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；2mmol/L EDTA；体积分数为20％的甘油；100mmol/LNaCl；体积分数为0.1％的TritonX-100)，进行冰浴超声处理，超声条件为：350W，间歇5s，超声5s，30个循环。然后将超声产物于6000rpm离心10分钟，收集上清，即为质粒溶液。④质控品制备：将RNaseI加入到质粒溶液中，消化溶液中的RNA，稀释至一定浓度即得人β珠蛋白基因质粒。

表1人β珠蛋白基因序列信息

(2)阳性质控品的制备：①含有靶核酸序列的GBS菌株的制备：从美国ATCC菌种保藏中心购得GBS Ia，Ib，III，V型菌株，对应菌株编号见表3；取各菌株冻干粉加入1mL生理盐水进行活化，快速混匀器振荡1-2min后，取20μL活化后菌液涂布在B群链球菌显色平板(安图生物)上划线培养，共涂布3个血琼脂平板；37℃恒温培养箱培养24h后，按照B群链球菌显色平板说明书鉴定为GBS后，挑取平板上的菌落，接种入30mL LB液体培养基中，快速混匀器后置于37℃恒温培养箱培养中继续培养36h，得到GBS菌株培养液；将GBS培养液于6000rpm离心10分钟，收集上清，用无菌生理盐水重悬，即为GBS菌株菌悬液。②含有靶核酸序列的GBS菌株菌悬液灭活及验证：将GBS菌株菌悬液置于60℃水浴中加热1h，进行灭活处理。抽取0.1mL灭活后的GBS菌株菌悬液，加入B群链球菌显色平板上，共涂布3个平板，置于37℃培养箱中培养24h后观察确定无菌落生长，证明灭活效果合格。③质控品制备：将步骤(1)中得到的含有人β珠蛋白基因的质粒溶液(浓度1×10⁴copies/mL)和经灭活充分的含有靶核酸序列的GBS菌株菌悬液稀释到一定浓度(1×10⁴CFU/mL)，加入到P300、P950、硅酮消泡剂和EDTA·2Na，即得。

表2 GBS四种常见血清型来源

GBS菌株血清型	ATCC编号
		Ia型	ATCC 31574
Ib型	ATCC 12401
		III型	ATCC 31577
V型	ATCC BAA-611

实施例2本发明稀释液和质控品的制备

稀释液组成：0.2vol％P300、0.3vol％P950、0.02vol％硅酮消泡剂、0.07wt％EDTA·2Na和HEPES缓冲液。

阳性质控品：含有靶核酸序列的GBS菌株-浓度1×10⁵CFU/mL、人β珠蛋白基因质粒-浓度1×10⁵copies/mL、0.2vol％P300、0.3vol％P950、0.02vol％硅酮消泡剂、0.07wt％EDTA·2Na和HEPES缓冲液。

阳性质控品的制备方法同实施例1。

测试例1不同稀释液组成的质控品的稳定性比较

本实验考察了对比例1～7和实施例1共8种不同的稀释液质控品稳定性，具体组成如表3：

表3不同质控品稀释液的配方

2、质控品稀释液稳定性的研究

按照表3稀释液配方制备质控品，获得对比例1～7的质控品，其中，对比例1～7与实施例1的质控品不同之处仅在于稀释液配方不同，其他组分和条件均相同。

将以上质控品放置37℃加速3天、7天、14天，考核其配制的GBS质控品的热稳定性，并与第0天的Ct值对比，筛选出Ct差值变化最小的配方(质粒浓度值变化最小)，考核数据如下表4：

表4不同稀释液制得的质控品37℃加速验证

结果显示，实施例1提供的稀释液配制的低值浓度的质控品在热加速14天后，实施例1方案的靶标和内标Ct与0天相比变化均显著低于对比例1～7的方案。表明，相比其他稀释液，本发明提供的稀释液制成的质控品稳定性最高。

测试例2不同稀释液组成的质控品的稳定性比较

本实验考察了对比例1～7和实施例2共8种不同的稀释液质控品稳定性，具体组成见上表3。

稳定性考核方案同测试例1，考核数据如下表5：

表5不同稀释液制得的质控品37℃加速验证

结果显示，实施例2提供的稀释液配制的中值浓度的质控品在热加速14天后，实施例2方案的靶标和内标Ct与0天相比变化均显著低于对比例1～7的方案。表明，相比其他稀释液，本发明提供的稀释液制成的质控品稳定性最高。

测试例3通用性验证实验

质控品通用性验证实验：将本发明实施例2制备的阳性质控品(安图阳控)和福建泰普、上海之江、江苏硕世三家已上市厂家试剂盒配套质控品，各做两个重复，分别用泰普、之江、硕世各试剂盒配套提取、扩增试剂按照说明书操作进行提取、扩增。结果如表6所示，泰普、之江、硕世试剂盒配套阳性质控品只能被各自配套试剂扩增检测出，无法被其余厂家检测出阳性；而本发明制备的阳性质控品(安图阳控)可以被以上三家厂家试剂盒全部扩增为阳性，说明本产品有很好的通用性。

表6各厂家质控品通用性验证

测试例4实时稳定性评估实验：

将制备好的实施例1的阳性质控品，配套人β珠蛋白基因质粒和质控品稀释液制备的阴性质控品，放置于2-8℃环境下进行实时稳定性考核，从第0天开始，分别考核0/2/4/6/9/12/14/18个月，每个时间点抽取阴性质控品和阳性质控品各1支样本，每支样本从核酸提取开始平行做三份，使用荧光定量PCR对样本进行扩增检测。结果如表7、表8、表9所示，上市三家厂家试剂盒说明书声称的各自阳性质控品稳定性，需在-20℃环境下最长才能保存12个月；而本发明所制备的阴性质控品、阳性质控品可在37℃中稳定保存超过14天，2-8℃环境稳定保存至少18个月，避免反复冻融对质控结果的影响，明显优于上市三厂家。而且本发明所制备的质控保存液显著优于申请公布号为CN110511926A专利中的质粒、假病毒的保存液，该专利声称2-8℃仅可保存9个月。

表7上市各厂家质控品保存稳定性

上市试剂盒厂家	阳性质控品组成	储存条件	有效期
				福建泰普	含目的基因的质粒	-20℃	8个月
上海之江	/	-20±5℃	12个月
				江苏硕世	含cfb基因片段的质粒	-20℃	10个月

表8本发明质控品实时稳定性

表9本发明质控品实时稳定性

本发明提供的B族链球菌核酸检测质控品与实际GBS临床拭子样本具有一致性，可作为一种标准质控品被上市厂家检测出来，能够真实地模拟GBS在体外核酸检测过程，通用性强，从而实现对GBS核酸检测的全方位监控；且产品具有成本低廉、稳定性高、便于存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产。综上，本发明具有重要的价值与应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种检测B族链球菌的阳性质控品，其特征在于，包括GBS灭活菌株、内标质粒和稀释液；

所述GBS灭活菌株包括Ia、Ib、III、V型中的至少一种；

所述稀释液由P300、P950、硅酮、EDTA·2Na和HEPES缓冲液组成。

2.根据权利要求1所述的阳性质控品，其特征在于，所述稀释液中各组分占所述稀释液的百分比为：

0.1～0.2vol％P300、0.15～0.3vol％P950、0.01～0.02vol％硅酮消泡剂和0.035～0.07wt％EDTA·2Na。

3.根据权利要求2所述的阳性质控品，其特征在于，所述稀释液中各组分占所述稀释液的质量分数为：

0.1vol％P300、0.15vol％P950、0.01vol％硅酮和0.035wt％EDTA·2Na；

或，0.2vol％P300、0.3vol％P950、0.02vol％硅酮和0.07wt％EDTA·2Na。

4.根据权利要求1所述的阳性质控品，其特征在于，所述内标质粒为含有人源性β珠蛋白基因的质粒。

5.根据权利要求4所述的阳性质控品，其特征在于，所述人β珠蛋白基因包括sequenceID为MK476491.1、MK476483.1、MK476464.1中的至少一种基因。

6.根据权利要求1～5任一项所述的阳性质控品，其特征在于，所述GBS菌株在所述阳性质控品中的浓度为1×10⁴～1×10⁵CFU/mL。

7.根据权利要求1～5任一项所述的阳性质控品，其特征在于，所述有人源性β珠蛋白基因的内标质粒在所述阳性质控品中的浓度为1×10⁴～1×10⁵copies/mL。

8.权利要求1～7任一项所述的阳性质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将GBS菌株活化、传代、扩大培养；经离心、重悬、灭活，获得GBS菌株菌悬液；

将GBS菌株菌悬液和含有人β珠蛋白基因的内标质粒溶液混合，加入P300、P950、硅酮消泡剂和EDTA·2Na，获得阳性质控品。

9.权利要求1～7任一项所述的阳性质控品在制备检测B族链球菌的核酸检测试剂盒中的应用。