CN117965776A - 一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性dna及其检测引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA及其检测引物和应用，属于微生物检测技术领域。一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段或在SEQ ID NO:1的基础上截取长度50％以上的DNA片段。本发明还提供了一种检测细菌、真菌和支原体的通用引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物。利用本发明提供的通用引物进行分qPCR检测能快速、特异性检测间充质干细胞制剂中是否存在细菌真菌和支原体污染，且方法简捷精准，比常规培养法耗时更短，结果可以进行定性分析。

Description

一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA及其检测引物 和应用

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA及其检测引物和应用。

背景技术

间充质干细胞具有良好的自我复制、自我分裂、自我更新和多向分化的特性，越来愈受到医药领域的关注。在临床上通过注射间充质干细胞，经常应用于血液系统疾病、结缔组织病以及心血管系统疾病和脑血管系统疾病的治疗，比如在骨髓移植的患者，同时注射间充质干细胞能够更快的促进造血功能的重建。另外间充质干细胞在治疗神经损伤、心肌梗死损伤等也有一定的作用，取得了较好的治疗效果。

间充质干细胞的大规模培养是临床医药的前提。间充质干细胞培养过程，需要符合严格的质控检测。质控检测包括无菌性、致瘤性、细胞纯度、细胞活性。其中无菌性包括支原体、细菌、真菌和内毒素的检测。

传统的支原体检测方法主要有培养法和指示细胞法，一般要求同时进行检测。这两种方法通常需要较长时间，如培养法至少28天。近年来，细胞治疗药物快速发展，且其上市周期快，货架期短，培养法和指示细胞法均无法满足药物放行的时间要求。核酸扩增技术(NAT)，如荧光探针qPCR检测方法由于其检测时间短和特异性好等优势而被用于支原体检测。作为替代方法，NAT检测方法需确证能达到法规所要求的检测灵敏度。

由于新鲜间充质干细胞制剂的使用具有时效性短的特点，而依据药典方法常规支原体检测(培养法)需28天，无菌检测(培养法)需要14天，这就无法满足快速、方便、准确和高灵敏度的要求。此外，细菌和真菌也是间充质干细胞重点排查的对象，虽然现有技术报道，采用PCR技术能够实现快速细菌和/或真菌的检测，但目前市面上检测病原微生物的PCR技术，由于细菌、真菌、支原体在系统进化关系上参差不齐，难以确定通用的特异性DNA片段，因此常常针对不同的物种DNA序列设计对应的检测引物，该检测方法不仅操作繁琐，而且相对成本偏高，难以在试剂生产中应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA，能够实现细菌、真菌和支原体的同时检测，为简化检测操作提供了基础。

本发明的目的还在于提供了一种用于检测细菌、真菌和支原体的通用引物，不仅可以针对中国药典涉及的若干种典型支原体，还能对多种细菌和真菌进行检测，快速、特异性检测间充质干细胞制剂中是否存在细胞、真菌、支原体的污染，简化实验操作，降低检测成本。

本发明提供了一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段或在SEQ ID NO:1的基础上截取长度50％以上的DNA片段。

优选的，为核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA片段。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测细菌、真菌和支原体的通用引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测细菌、真菌和支原体的试剂盒，包括所述通用引物和荧光定量PCR扩增用预混液。

优选的，所述荧光定量PCR扩增用预混液包括Master qPCR Mix(+UDG)。

本发明提供了所述通用引物在制备检测细菌、真菌和支原体的试剂盒中的应用。

本发明提供了一种检测间充干细胞培养体系中细菌、真菌和支原体污染的方法，包括以下步骤：

从待测间充干细胞培养体系中提取DNA；

以提取的DNA为模板，利用所述通用引物配制qPCR反应体系，进行qPCR扩增；

根据扩增曲线的形状和检测通道CT值判断待测间充干细胞培养体系中是否存在细菌、真菌和支原体污染：

阳性：检测通道CT值<29，且扩增曲线有明显的指数增长趋势；

阴性：样本检测结果CT≥30或无CT值且无明显指数增长趋势的扩增曲线；

可疑：29≤CT值＜30，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现CT值<29和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

优选的，所述qPCR反应体系以10μl计，包括MasterqPCR Mix-SYBR(+UDG)5μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL和DNA4μL。

优选的，所述qPCR扩增的反应体系为50℃2min；95℃2min；95℃15S，55℃30S，72℃30S，32个循环，72℃采集荧光信号。

优选的，所述细菌包括以下至少一种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌；

所述真菌包括白色念珠菌和/或黑曲霉；

所述支原体包括口腔支原体和/或肺炎支原体。

本发明提供了一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段或在SEQ ID NO:1的基础上截取长度50％以上的DNA片段。本发明首先对7种细菌真菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉)和2种支原体(口腔支原体和肺炎支原体)的全基因组进行序列比对，找到一段同源保守序列，然后根据该同源保守序列设计扩增引物，利用所述引物进行荧光定量PCR检测验证，可实现细菌、真菌和支原体的检测，大大简化了检测操作，为同时检测细菌、真菌和支原体提供了基础。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测细菌、真菌和支原体的通用引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物。利用本发明提供的通用引物能快速、特异性检测间充质干细胞制剂中是否存在细菌真菌和支原体污染。本发明实施例通过实时荧光定量PCR方法，以药典记载的7种细菌真菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉)和2种支原体(口腔支原体和肺炎支原体)作为代表，以其灭活的DNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，结果表明所述通用引物能够同时检测细菌、真菌和支原体，而且具有良好的检测特异性，同时检测灵敏度高于中国药典记载的传统培养法灵敏度。所述通用引物的开发为快速高效检测细菌、真菌和支原体的应用环境提供了极大便利，并且能大大降低检测成本，降低劳动力投入。

本发明提供了一种检测间充干细胞培养体系中细菌、真菌和支原体污染的方法，通过实时荧光定量PCR方法利用扩增曲线的形状和检测通道CT值判断待测间充干细胞培养体系中是否存在细菌、真菌和支原体污染。本发明提供的方法满足快速高效的检测要求，大大简化间充干细胞培养体系污染微生物的检测步骤，有极大的工业推广应用价值。

附图说明

图1为细菌、真菌和支原体(共计九种)保守序列比对结果；

图2为金黄色葡萄球菌-通用引物的熔解曲线；

图3为枯草芽孢杆菌-通用引物的熔解曲线；

图4为生孢梭菌-通用引物的熔解曲线；

图5为大肠埃希菌-通用引物的熔解曲线；

图6为白色念珠菌-通用引物的熔解曲线；

图7为黑曲霉-通用引物的熔解曲线；

图8为铜绿假单胞菌-通用引物的熔解曲线；

图9为口腔支原体-通用引物的熔解曲线；

图10为肺炎支原体-通用引物的熔解曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC)所示的DNA片段或在SEQ ID NO:1的基础上截取长度50％以上的DNA片段。

在本发明中，所述特异性DNA的获得方法优选是对7种细菌真菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉)和2种支原体(口腔支原体和肺炎支原体)的全基因组进行序列比对，得到一段同源保守序列。

在本发明中，所述特异性DNA优选为在SEQ ID NO:1的基础上截取长度55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％的DNA片段。在本发明中，优选以核苷酸序列如SEQID NO:2(TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG)所示的DNA片段为例加以说明，基于所述特异性DNA片段能够同时实现细菌、真菌和支原体的检测，但不能理解为对本发明保护范围的限制。实验结果表明，基于所述特异性DNA，能够同时检测到细菌、真菌和支原体的污染微生物的存在，且经过特异性检测实验结果表明，所述DNA片段仅存在于细菌、真菌和支原体中，培养目标细胞和病毒中不保守，无法获得阳性扩增结果，说明所述DNA片段具有良好的特异性。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测细菌、真菌和支原体的通用引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3(TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4(CGCTCGTTGCGGGACTTA)所示的反向引物。

在本发明中，所述通用引物的来源优选委托基因合成公司合成。

在本发明中，灵敏度检测实验表明，检测灵敏度高于中国药典记载的传统培养法灵敏度(10CFU/ml)，其中口腔支原体的检测灵敏度为5CFU/ml，对肺炎支原体的检测灵敏度为2.5CFU/ml。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测细菌、真菌和支原体的试剂盒，包括所述通用引物和荧光定量PCR扩增用预混液。

本发明对所述荧光定量PCR扩增用预混液的种类和来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的预混液的种类和来源即可。在本发明实施例中，所述荧光定量PCR扩增用预混液优选包括MasterqPCRMix(+UDG)，购自北京擎科新业生物技术有限公司，批号OFC19901。

本发明提供了所述通用引物在制备检测细菌、真菌和支原体的试剂盒中的应用。

在本发明中，所述试剂盒适合所有种类的细菌、真菌和支原体的检测。在本发明实施例中，为了详细说明所述试剂盒所取得的效果，以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌为细菌代表，以白色念珠菌和/或黑曲霉为真菌代表，以口腔支原体和肺炎支原体为支原体代表。结果表明，所述试剂盒不仅能够同时检测到细菌、真菌和支原体，还能区分培养细胞和病毒，具有良好的检测特异性。此外，所述试剂盒的检测灵敏度符合检测要求。

本发明提供了一种检测间充干细胞培养体系中细菌、真菌和支原体污染的方法，包括以下步骤：

从待测间充干细胞培养体系中提取DNA；

以提取的DNA为模板，利用所述通用引物配制qPCR反应体系，进行qPCR扩增；

根据扩增曲线的形状和检测通道CT值判断待测间充干细胞培养体系中是否存在细菌、真菌和支原体污染：

阳性：检测通道CT值<29，且扩增曲线有明显的指数增长趋势；

阴性：样本检测结果CT≥30或无CT值且无明显指数增长趋势的扩增曲线；

可疑：29≤CT值＜30，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现CT值<29和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

本发明从待测间充干细胞培养体系中提取DNA。

本发明对提取DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取DNA的方法即可，例如试剂盒法。提取得到DNA后，优选对所述DNA进行质检，包括浓度和完整度的检测。将检测合格的DNA稀释后冷藏备用。

以提取的DNA为模板，本发明利用所述通用引物配制qPCR反应体系，进行qPCR扩增。

在本发明中，所述qPCR反应体系以10μl计，优选包括Master qPCRMix-SYBR(+UDG)5μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL和DNA4μL。所述qPCR扩增的反应体系优选为50℃2min；95℃2min；95℃15S，55℃30S，72℃30S，32个循环，72℃采集荧光信号。本发明对所述qPCR扩增所用的仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的qPCR仪即可。

在本发明中，所述细菌优选包括以下至少一种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌。所述真菌优选包括白色念珠菌和/或黑曲霉。所述支原体优选包括口腔支原体和/或肺炎支原体。

在本发明实施例中，所述引物检测浓度5CFU/ml的口腔支原体和2.5CFU/ml肺炎支原体DNA的CT值均低于29，说明所述引物能够检测口腔支原体和肺炎支原体。同时所述引物均能检测到7种细菌和真菌对应的DNA，说明所述引物能够检测细菌和真菌。本发明还开展了特异性实验，分别以培养的间充质干细胞和人多瘤病毒JCV为对照，检测结果为阴性。说明所述引物仅能检测细菌、真菌和支原体，而不能检测培养体系中间充质干细胞和常规病毒，所述引物具有良好的检测特异性。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA及其检测引物和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

细菌、真菌和支原体特异性DNA的筛选方法

根据九种细菌真菌和支原体的英文名称在NCBI和GenBank上查找对应的基因序列，然后进行同源序列比对分析，比对结果见图1，得到一段保守序列，核苷酸序列如SEQ IDNO:1(GTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC)所示。

表1菌种信息汇总

实施例2

细菌、真菌和支原体通用引物的设计及验证

1.引物设计

以实施例1得到的保守序列为模板，利用Primer Premier 5软件设计通用引物，结果见表2所示。

表2引物序列信息

2.验证方法

2.1菌株信息见表3。

表3实验所用菌株

3.提取菌株/菌液DNA

按照天根基因组DNA提取试剂盒的说明书提取上述九种标准菌株/菌液的基因组DNA，具体方法如下：

1.加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

2.加入20μl Proteinase K溶液，混匀。

3.加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4.加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

表4菌种DNA浓度

4.荧光定量PCR反应体系与程序

反应总体系10μl，包括以下试剂：2×TSINGKE Master qPCR Mix-SYBR(+UDG)5μl，上游引物(10μM)0.5μl，下游引物(10μM)0.5μl，样品DNA4μl。上下游引物的终浓度各为0.4μM。同一个模板进行复孔反应，所有反应均在LightCycler480荧光定量PCR仪上进行。实时荧光定量PCR的反应程序：50℃预变性2min；95℃预变性2min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，72℃采集荧光信号。

5.实验结果见表5和图2～图10。由检测结果可知，所述通用引物对细菌、真菌和支原体的检测CT值均低于30，且扩增曲线均由明显的指数增长，说明检测结果为阳性。

表5通用引物检测的CT值

熔解曲线	菌种	CT值
			单峰	金黄色葡萄球菌	22.81
单峰	枯草芽孢杆菌	24.04
			单峰	生孢梭菌	22.13
单峰	大肠埃希菌	23.43
			单峰	白色念珠菌	22.59
单峰	黑曲霉	22.72
			单峰	铜绿假单胞菌	20.56
单峰	口腔支原体	24.25
			单峰	肺炎支原体	27.91

实施例3

利用通用引物检验7种细菌真菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉)DNA的CT值

1.菌株信息，7种细菌真菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉)为中国药典推荐进行无菌常规检测的标准菌株，具有代表性。

按照天根基因组DNA提取试剂盒的说明提取7种细菌真菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉，100CFU/ml)的标准菌株基因组DNA。

2.荧光定量PCR反应体系与程序

反应总体系10μl，2×TSINGKE MasterqPCRMix-SYBR(+UDG)5μl，上游引物(10μM)0.5μl，下游引物(10μM)0.5μl，样品DNA4μl。上下游引物的终浓度各为0.5μM。同一个模板进行复孔反应，所有反应均在LightCycler480荧光定量PCR仪上进行。实时荧光定量PCR的反应程序：50℃预变性2min；95℃预变性2min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，72℃采集荧光信号。

4.实验结果见表6。

表6通用引物检测7种细菌和真菌的DNA得到的CT值

结论：以上通用引物均能检测到7种细菌和真菌对应的DNA，且灵敏度达到中国药典记载的传统培养法灵敏度100CFU/ml。可见，本发明提供的检测方法的灵敏度比传统方法更加优越，而且耗时短，3小时可以出结果，传统方法培养要14天。

实施例4

通用引物检验口腔支原体和肺炎支原体DNA的CT值

1.菌株信息，口腔支原体和肺炎支原体为中国药典推荐进行支原体常规检测的标准菌株，具有代表性。

按照天根基因组DNA提取试剂盒的说明提取两种支原体灭活菌液基因组DNA。

2.稀释两种支原体的DNA

用无菌水将两种支原体灭活菌液提取的DNA进行稀释，稀释后口腔支原体DNA对应原菌液浓度为5CFU/ml，肺炎支原体对应原菌液浓度为2.5CFU/ml。取2μl稀释后的DNA进行qPCR检测。

3.荧光定量PCR反应体系与程序

反应总体系10μl：2×TSINGKE MasterqPCRMix-SYBR(+UDG)5μl，上游引物(10μM)0.5μl，下游引物(10μM)0.5μl，样品DNA4μl。上下游引物的终浓度各为0.5μM。同一个模板进行复孔反应，所有反应均在LightCycler480荧光定量PCR仪上进行。实时荧光定量PCR的反应程序：50℃预变性2min；95℃预变性2min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，72℃采集荧光信号。

4.实验结果见表7。

表7通用引物检测两种支原体得到的CT值

5CFU/ml口腔支原体CT值	2.5CFU/ml肺炎支原体CT值
		24.25	27.91

结论：以上通用引物均能检测到口腔支原体和肺炎支原体对应的DNA，可视为本方法对口腔支原体的检测灵敏度为5CFU/ml，对肺炎支原体的检测灵敏度为2.5CFU/ml，高于中国药典记载的传统培养法灵敏度10CFU/ml。可见，本方法的灵敏度比传统方法更加优越，而且耗时短，3小时可以出结果，传统方法培养要28天。

实施例5

通用引物的特异性验证

采用实施例2的方法用通用引物对人羊膜间充质干细胞DNA和人多瘤病毒JCV的DNA进行qPCR检测，结果均为阴性，说明该通用引物具有特异性，能够检测样品中是否有细菌真菌和支原体(已验证的9种微生物，参见实施例3和4)污染。

表8通用引物检测人羊膜间充质干细胞和人多瘤病毒JCV的DNA

人羊膜间充质干细胞DNA	人多瘤病毒JCV的DNA
		阴性	阴性

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQID NO:1所示的DNA片段或在SEQ ID NO:1的基础上截取长度50％以上的DNA片段。

2.根据权利要求1所述用于检测细菌、真菌和支原体的特异性DNA，其特征在于，为核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA片段。

3.一种基于荧光定量PCR技术检测细菌、真菌和支原体的通用引物，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物。

4.一种基于荧光定量PCR技术检测细菌、真菌和支原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述通用引物和荧光定量PCR扩增用预混液。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增用预混液包括Master qPCR Mix(+UDG)。

6.权利要求3所述通用引物在制备检测细菌、真菌和支原体的试剂盒中的应用。

7.一种检测间充干细胞培养体系中细菌、真菌和支原体污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

从待测间充干细胞培养体系中提取DNA；

以提取的DNA为模板，利用权利要求3所述通用引物配制qPCR反应体系，进行qPCR扩增；

根据扩增曲线的形状和检测通道CT值判断待测间充干细胞培养体系中是否存在细菌、真菌和支原体污染：

阳性：检测通道CT值<29，且扩增曲线有明显的指数增长趋势；

阴性：样本检测结果CT≥30或无CT值且无明显指数增长趋势的扩增曲线；

可疑：29≤CT值＜30，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现CT值<29和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述qPCR反应体系以10μl计，包括Master qPCR Mix-SYBR(+UDG)5μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL和DNA4μL。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述qPCR扩增的反应体系为50℃2min；95℃2min；95℃15S，55℃30S，72℃30S，32个循环，72℃采集荧光信号。

10.根据权利要求7～9中任意一项所述方法，其特征在于，所述细菌包括以下至少一种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌；

所述真菌包括白色念珠菌和/或黑曲霉；

所述支原体包括口腔支原体和/或肺炎支原体。