CN114480690A - 金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法及试剂盒，该方法包括以下步骤：1)待测样品核酸提取；2)核酸恒温扩增：对金黄色葡萄球菌特有的nuc1基因或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特有的mecA基因的核酸进行环介导核酸恒温扩增；3)扩增产物检测：利用CRISPR‑Cas12a体系检测扩增后的nuc1基因或mecA基因。本发明首次采用CRISPR‑Cas12a荧光探针法检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势；能方便用于基层实验和临床一线对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸的基层快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物科技领域，特别涉及一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法及试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌，又名金黄色球菌或葡萄球菌，通常寄居在人体皮肤上，在约25-30％的成人鼻腔中可发现该细菌。金黄色葡萄球菌寄居人体表皮时，既不危害宿主也不引发临床症状。然而，当宿主皮肤表面有创口或接受外科手术时，抑或机体自身免疫力低下时，寄居的金黄色葡萄球菌会引发感染。葡萄球菌常引起局部皮肤感染，如毛囊炎、疖和脓疱，也可以导致脓肿和扩散到骨组织(骨髓炎)、肺(葡萄球菌性肺炎)、血液(菌血症或败血症)、心脏(心内膜炎，会损伤心脏瓣膜)及其他器官。葡萄球菌可以通过接触患者或宿主的皮肤或共用被污染的用具如毛巾、剃刀等而感染他人。
目前金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌学检查方法主要是金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药敏试验、Xpert MTB/RIF、荧光定量PCR溶解曲线法和全基因组测序法。药敏试验仍是许多国家诊断葡萄球菌及其对甲氧西林耐药性的“金标准”，但由于该类实验耗费时间过长，通常需要十二个小时以上才能出结果，不利于疾病的早期诊断和治疗；此外，Xpert MTB/RIF、荧光定量PCR溶解曲线法需要特定的仪器，样本要求高，敏感性一般，检测成本昂贵；全基因组测序法耗时长、仪器设备要求高、样本要求高、费用较高，绝大部分地区未普及。这给临床金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的诊断带来了很大的局限性，由于缺乏快速灵敏的检测手段，很大一部分金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌病患者未能得到及时正规救治，进而引起更为严重的细菌感染。诊断的延误是金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染引起死亡的主要原因，尽快检测出金黄色葡萄球菌及其对甲氧西林的耐药性可以有效的阻止感染的进一步恶化，因此，早期、快速、灵感的检测手段尤为重要。金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的早期诊断作为阻断感染的必要条件，我们迫切需要找到更敏感、特异更高且成本较低的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床检测手段，以期通过早发现、早诊断、进一步的针对性的规范化治疗，及早消除由金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引发的细菌感染。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白在与外来核酸互补的向导RNA的引导下与外来核酸特异性结合，进而利用其核酸酶活性对外来核酸进行特异性切割。其中，CRISPR-Cas12a(Cpf1)属于Cas酶第二家族，可以在向导RNA的引导下对双链DNA进行特异性切割。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine,T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，在CRISPR RNA(crRNA)的引导下，切割与crRNA互补配对的双链DNA(dsDNA)。当Cas12a蛋白特异性的识别并切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性，能够随机切割周围的非特异性单链DNA。
基于Cas12a上述特性，其有望应用于构建金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速检测方法，但现在未见公开可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法及试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，包括以下步骤：
1)待测样品核酸提取；
2)核酸扩增：
利用恒温扩增体系对金黄色葡萄球菌特有的nuc1基因或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特有的mecA基因的核酸进行环介导核酸恒温扩增；
3)扩增产物检测：
利用CRISPR-Cas12a体系检测扩增后的nuc1基因或mecA基因，CRISPR-Cas12a体系中，nuc1基因用nuc1-crRNA进行检测，mecA基因用mecA-crRNA进行检测；
nuc1-crRNA的序列为：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUGGUAAAGAUAAAGUACA-3’；
mecA-crRNA的序列为：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCAAUAACUGCAUCAUCUUU-3’。
优选的是，所述步骤2)中，核酸扩增采用聚合酶链式反应、重组酶聚合酶扩增或环介导核酸恒温扩增方法。
优选的是，所述步骤2)中，核酸扩增采用环介导核酸恒温扩增方法，核酸恒温扩增体系包括用于nuc1基因的扩增引物组和用于mecA基因的扩增引物组；
用于nuc1基因的扩增引物组包括：
nuc1-F3：5’-TCGCTTGCTATGATTGTGG-3’；
nuc1-B3：5’-ACATACGCCAATGTTCTACC-3’；
nuc1-FIP：
5’-GTACAGTTTCATGATTCGTCCCGCCATCATTATTGTAGGTGT-3’；
nuc1-BIP：
5’-TGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGTACAGGCGTATTCGGTT-3’；
nuc1-FLP：5’-TTGAAAGGACCCGTATGATTCA-3’；
nuc1-BLP：5’-GATACGCCAGAAACGGTGA-3’。
优选的是，用于mecA基因的扩增引物组包括：
mecA-F3：5’-GGTACAAGATGATACCTTCGTT-3’；
mecA-B3：5’-ATAGCAGTACCTGAGCCAT-3’；
mecA-FIP：
5’-TCTTCAGAGTTAATGGGACCAAACAGAAAGTCGTAACTATCCTC-3’；
mecA-BIP：
5’-AAGCTCCAACATGAAGATGGCTTGTATGTGCGATTGTATTGC-3’；
mecA-FLP：5’-ACCTAATAGATGTGAAGTCGCT-3’；
mecA-BLP：5’-CGTGTCACAATCGTTGACG-3’。
优选的是，CRISPR-Cas12a体系还包括LaCas12a和ssDNA荧光探针，ssDNA荧光探针的序列为：5’-6FAM-TTTATTT-3’-BHQ1。
所述步骤1)中采用酶解法、反复冻融法、煮沸法、磁珠法或吸附柱法进行核酸提取。
优选的是，所述步骤1)中酶解法进行核酸提取，具体方法为：取待测样品，离心后去上清，加入TE溶液，混匀，离心去上清，加入溶菌酶和Triton X-100，混匀，37℃，反应，得到待测样品的核酸提取液。
优选的是，所述步骤2)包括：取步骤1)得到的核酸提取液加入到恒温扩增体系中，于65℃下恒温反应，扩增nuc1基因或mecA基因。
优选的是，恒温扩增体系中还包括Primer mix、Isothermo Buffer、Mg2+、dNTP、H2O和聚合酶。
优选的是，所述步骤3)包括：取经步骤2)扩增后的产物加入到CRISPR-Cas12a体系中，混合均匀后于37℃反应，检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm。
优选的是，其中，CRISPR-Cas12a体系包括LaCas12a、ssDNA荧光探针、nuc1-crRNA或mecA-crRNA、TOLO Buffer和H2O。
本发明还提供一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测试剂盒，包括如上所述的恒温扩增体系和CRISPR-Cas12a体系。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过利用LAMP核酸恒温扩增技术和CRISPR-Cas12a特异识别核酸荧光检测技术，能实现对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸的高灵敏度、高特异性及快速化检测；本发明针对金黄色葡萄球菌特有的nuc1基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特有的mecA基因分别设计特异性的crRNA；为保证检测特异性，对设计的crRNA序列检索NCBI核酸数据库中包括人、动物、植物和微生物等基因，确定没有高同源性匹配；
(2)本发明基于LAMP恒温核酸扩增和CRISPR-Cas12a核酸检测，构建了用于金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸检测的试剂盒，利用该试剂盒，只需要实验室常用的恒温水浴锅或金属浴就能够快速的对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸进行检测；能本发明为基层实验和临床一线提供了一个准确、快速、简便的检测方法；
(3)本发明公开了一系列用于金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸提取、LAMP核酸恒温扩核和CRISPR-Cas12a核酸检测反应体系；本发明系首次采用CRISPR-Cas12a荧光探针法检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势；这些优势使得本发明开发的基于LAMP核酸恒温扩增技术和CRISPR-Cas12a特异识别核酸荧光检测技术的核酸检测方法方便用于基层实验和临床一线对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸的基层快速检测和鉴定诊断。
附图说明
图1为本发明的基于CRISPR-Cas12a快速检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸方法示意图；
图2为本发明的实施例中利用CRISPR-Cas12a系统检测人工合成的nuc1基因和mecA基因的结果；
图3为本发明的实施例中利用CRISPR-Cas12a系统检测经LAMP扩增后的nuc1基因和mecA基因的结果；
图4为本发明的实施例中利用CRISPR-Cas12a系统对不同浓度金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行核酸检测的结果；
图5为本发明的实施例中利用CRISPR-Cas12a系统对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行特异性核酸检测的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速检测方法，本发明的总体技术示意图如附图1所示，首先，对待测样品进行灭活处理，释放待检样品中金黄色葡萄球菌特有的nuc1基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特有的mecA基因的核酸；然后在恒温条件下，对nuc1基因和mecA基因的核酸进行环介导核酸恒温扩增(LAMP)；再用Cas12a-crRNA复合物结合并切割靶标dsDNA(nuc1基因或mecA基因)，同时，其对ssDNA的反式切割活性被激活，对ssDNA荧光探针进行切割；ssDNA荧光探针被切割后，荧光报告分子与荧光淬灭基团分离，产生荧光信号；对荧光信号进行检测，就可以判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
具体的，本发明的一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，包括以下步骤：
1)待测样品核酸提取：取待测样品，离心后去上清，加入TE溶液，混匀，离心去上清，加入溶菌酶和Triton X-100，混匀，37℃，反应，得到待测样品的核酸提取液。
2)核酸恒温扩增：
取步骤1)得到的核酸提取液加入到恒温扩增体系中，于65℃下恒温反应，扩增金黄色葡萄球菌特有的nuc1基因或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特有的mecA基因。
恒温扩增体系包括用于nuc1基因的扩增引物组、用于mecA基因的扩增引物组、Primer mix、Isothermo Buffer、Mg2+、dNTP、H2O和聚合酶等。
3)扩增产物检测：
取经步骤2)扩增后的产物加入到CRISPR-Cas12a体系中，混合均匀后于37℃反应，检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm；
利用CRISPR-Cas12a体系检测扩增后的nuc1基因或mecA基因，CRISPR-Cas12a体系中，nuc1基因用nuc1-crRNA进行检测，mecA基因用mecA-crRNA进行检测；
CRISPR-Cas12a体系还包括LaCas12a、ssDNA荧光探针、TOLO Buffer和H2O等。
本发明还提供一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测试剂盒，包括上述的恒温扩增体系和CRISPR-Cas12a体系，基于该试剂盒采用以上的方法可实现金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速检测。
以上为本发明的总体构思，以下再提供更为详细的实施例，以对本发明做进一步说明。
试剂来源说明：
LAMP核酸恒温扩增反应所需的Bst 3.0DNA聚合酶、10X扩增缓冲液和100mM MgSO4购自哈尔滨新海基因检测有限公司，10mM dNTP购自生工生物工程(上海)股份有限公司，扩增引物由苏州泓迅生物公司合成；nuc1基因和mecA基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；crRNA和ssDNA-FQ由苏州金唯智生物科技有限公司合成；常规试剂如溶菌酶，NaCl，Triton X-100，Tris-HCl，EDTA等购生工生物工程(上海)股份有限公司；LbCas12a蛋白及反应缓冲液购自吐露港生物科技有限公司。
实施例1利用CRISPR-Cas12a系统检测人工合成的nuc1基因和mecA基因
1-1、nuc1基因和mecA基因的人工合成
本实施例中，金黄色葡萄球菌特有基因nuc1和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特有基因mecA由生工生物合成，克隆到pUC57-kana载体中。nuc1基因和mecA基因的序列信息分别如下表SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。
1-2、crRNA制备
设计针对nuc1基因和mecA基因的crRNA：nuc1-crRNA和mecA-crRNA，交由苏州金唯智生物科技有限公司合成RNA片段，其序列信息如下表所示。
1-3、ssDNA荧光探针制备
ssDNA荧光探针的具体序列信息为：5’-6FAM-TTTATTT-3’-BHQ1，即被6-羧基荧光素和荧光淬灭基团BHQ1标记的ssDNA。交由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
1-4、利用CRISPR-Cas12a系统检测nuc1基因和mecA基因，采用20μL体系，成分如下
| 成分 | 用量 |
| sample | 10μL |
| 10×TOLO Buffer 3 | 2μL |
| LaCas12a(0.5μM) | 1μL |
| crRNA(0.5μM) | 1μL |
| ssDNA-FQ(5μM) | 1μL |
| H<sub>2</sub>0(RNase free) | 5μL |
1-5、全波长酶标仪荧光检测
酶标仪荧光检测中，CRISPR-Cas12a对目的基因检测体系依次加入2μL10×TOLOBuffer 3、1μL LaCas12a(0.5μM)、1μL nuc1-crRNA(0.5μM)或mecA-crRNA(0.5μM)、1μLssDNA-FQ(5μM)、10μL dsDNA sample和5μLH20(RNase free)。各组分混合均匀后于37℃反应30min。使用全波长酶标仪Synergy H1用于测量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取反应30min时的荧光数值为反应值。针对nuc1基因和mecA基因的不同浓度，其反应检测结果如图2所示。结果表明，CRISPR-Cas12a系统对nuc1基因和mecA基因的检测灵敏度都可以达到10-9M级别，即nM级别。
实施例2利用CRISPR-Cas12a系统检测经LAMP扩增后的nuc1基因和mecA基因
2-1、LAMP核酸恒温扩增引物制备
根据nuc1基因和mecA基因的序列信息，设计相应的用于nuc1基因和mecA的扩增引物组，由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成，引物的序列信息如下表所示。
2-2、利用LAMP核酸恒温扩增技术扩增nuc1基因和mecA基因
采用25μL反应体系，具体成分及用量如下。其中Primer mix为FIP/BIP(16μM)、F3/B3(2μM)和FLP/BLP(4μM)。向扩增反应体系中以此加入2.5μLPrimer mix、2.5μL 10×Isothermo Buffer(Mg2+free)、2μL 100mM Mg2+、3.5μLdNTP(10mM each)、3.5μL H2O、10μLsample和1μL Bst 3.0DNA/RNA Polymerase(8U/μL)。各组分混合均匀后于65℃反应60min。
| 成分 | 用量 |
| Primer mix | 2.5μL |
| Bst 3.0DNA/RNA Polymerase(8U/μL) | 1μL |
| 10×Isothermo Buffer(Mg<sup>2+</sup>free) | 2.5μL |
| 100mM Mg<sup>2+</sup> | 2μL |
| dNTP(10mM each) | 3.5μL |
| sample | 10μL |
| H<sub>2</sub>O | 3.5μL |
2-3、利用CRISPR-Cas12a系统检测LAMP扩增后的nuc1基因和mecA基因
以10μL LAMP扩增后的产物为检测对象，进行CRISPR-Cas12a核酸检测。其中，nuc1基因用nuc1-crRNA进行检测，mecA基因用mecA-crRNA进行检测具体检测方案如实施例1中的1-5所示；针对nuc1基因和mecA基因初始浓度的不同，其反应检测结果如图3所示；结果表明，经过LAMP扩增后，CRISPR-Cas12a系统对nuc1基因和mecA基因的检测灵敏度都可以达到10-18M级别，即aM级别。
实施例3利用CRISPR-Cas12a系统对不同浓度金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行核酸检测
3-1、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速提取
取1mL菌液，8000g，离心2分钟，去除900μL上清，加入900μL TE溶液，混匀，8000g，离心2分钟，去除920μL上清，加入10μL 20mg/mL溶菌酶和10μL 10％Triton X-100，混匀，37℃，反应15分钟。所得溶液即为核酸快速提取液。
3-2、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸恒温扩增及检测
以10μL核酸快速提取液为扩增模板，按实施例2中2-2的方法进行核酸恒温扩增。其中，用nuc1基因的扩增引物对金黄色葡萄球菌核酸进行扩增，用mecA基因的扩增引物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸进行扩增；扩增后，按2-3的方法进行核酸检测；针对金黄色葡萄球菌(29213)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(43300)的初始浓度的不同，其反应检测结果如图4所示；结果表明，本发明所采用的方法对金黄色葡萄球菌(29213)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(43300)的检测灵敏度都可以达到10CFU/mL，灵敏度非常高。
实施例4利用CRISPR-Cas12a系统对金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行特异性核酸检测
4-1、本实施案例中，为检测CRISPR-Cas12a系统能否对金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行特异性核酸检测，能否在混合菌液中检测出金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，进行以下检测。
4-2、将金黄色葡萄球菌(29213)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(43300)和大肠杆菌(25922)按不同比例混合得到金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌比例分别为100％、10％、5％、1％、0％的测试样品。按实施例3中3-1的方法进行核酸提取，按3-2的方法进行核酸扩增和核酸检测；针对金黄色葡萄球菌(29213)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(43300)在混合菌液中的比例不同，其反应检测结果如图4所示(control为无细菌空白对照)；结果表明，本发明所采用的方法对金黄色葡萄球菌(29213)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(43300)的检测的特异性非常高，可实现对1％含量金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检出。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
发明名称：金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法及试剂盒
序号 名称 序列 (5’ to 3’)
SEQ No. 1 ATAAATCGCTTGCTATGATTGTGGTAGCCATCATTATTGTAGGTGTATTAGCATTTCAATTTATGAATCATACGGGTCCTTTCAAAAAGGGAACAAATCATGAAACTGTACAAGATTTAAATGGTAAAGATAAAGTACATGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGATACATTTATTGCAAATCAAAATGGTAAAGAAATTAAAGTTAGGCTTATAGGGGTTGATACGCCAGAAACGGTGAAACCGAATACGCCTGTACAACCATTTGGCAAAGAAGCATCGAATTATAGTAAGAAGACATTAACAAATCAAGATGTTTATTTAGAATATGATAAAGAAAAACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGCGTATGTATGGAT
SEQ No. 2 GGATCAAAATTGGGTACAAGATGATACCTTCGTTCCACTTAAAACCGTTAAAAAAATGGATGAATATTTAAGTGATTTCGCAAAAAAATTTCATCTTACAACTAATGAAACAGAAAGTCGTAACTATCCTCTAGGAAAAGCGACTTCACATCTATTAGGTTATGTTGGTCCCATTAACTCTGAAGAATTAAAACAAAAAGAATATAAAGGCTATAAAGATGATGCAGTTATTGGTAAAAAGGGACTCGAAAAACTTTACGATAAAAAGCTCCAACATGAAGATGTCCAACATGAAGATGGCTATCGTGTCACAATCGTTGACGATAATAGCAATACAATCGCACATACATTAATAGAGAAAAAGAAAAAAGATGGCAAAGATATTCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAGAGTATTTATAACAACATGAAAAATGATTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCCTC
SEQ No. 3 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUGGUAAAGAUAAAGUACA
SEQ No. 4 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCAAUAACUGCAUCAUCUUU
SEQ No. 5 TCGCTTGCTATGATTGTGG
SEQ No. 6 ACATACGCCAATGTTCTACC
SEQ No. 7 GTACAGTTTCATGATTCGTCCCGCCATCATTATTGTAGGTGT
SEQ No. 8 TGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGTACAGGCGTATTCGGTT
SEQ No. 9 TTGAAAGGACCCGTATGATTCA
SEQ No. 10 GATACGCCAGAAACGGTGA
SEQ No. 11 GGTACAAGATGATACCTTCGTT
SEQ No. 12 ATAGCAGTACCTGAGCCAT
SEQ No. 13 TCTTCAGAGTTAATGGGACCAAACAGAAAGTCGTAACTATCCTC
SEQ No. 14 AAGCTCCAACATGAAGATGGCTTGTATGTGCGATTGTATTGC
SEQ No. 15 ACCTAATAGATGTGAAGTCGCT
SEQ No. 16 CGTGTCACAATCGTTGACG
Claims (12)
1.一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)待测样品核酸提取；
2)核酸扩增：
利用核酸扩增体系对金黄色葡萄球菌特有的nuc1基因或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特有的mecA基因的核酸扩增；
3)扩增产物检测：
利用CRISPR-Cas12a体系检测扩增后的nuc1基因或mecA基因，CRISPR-Cas12a体系中，nuc1基因用nuc1-crRNA进行检测，mecA基因用mecA-crRNA进行检测；
nuc1-crRNA的序列为：
5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUGGUAAAGAUAAAGUACA-3’；
mecA-crRNA的序列为：
5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCAAUAACUGCAUCAUCUUU-3’。
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，核酸扩增采用聚合酶链式反应、重组酶聚合酶扩增或环介导核酸恒温扩增方法。
3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，核酸扩增采用环介导核酸恒温扩增方法，核酸扩增体系包括用于nuc1基因的扩增引物组和用于mecA基因的扩增引物组；
用于nuc1基因的扩增引物组包括：
nuc1-F3：5’-TCGCTTGCTATGATTGTGG-3’；
nuc1-B3：5’-ACATACGCCAATGTTCTACC-3’；
nuc1-FIP：
5’-GTACAGTTTCATGATTCGTCCCGCCATCATTATTGTAGGTGT-3’；
nuc1-BIP：
5’-TGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGTACAGGCGTATTCGGTT-3’；
nuc1-FLP：5’-TTGAAAGGACCCGTATGATTCA-3’；
nuc1-BLP：5’-GATACGCCAGAAACGGTGA-3’。
4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，用于mecA基因的扩增引物组包括：
mecA-F3：5’-GGTACAAGATGATACCTTCGTT-3’；
mecA-B3：5’-ATAGCAGTACCTGAGCCAT-3’；
mecA-FIP：
5’-TCTTCAGAGTTAATGGGACCAAACAGAAAGTCGTAACTATCCTC-3’；
mecA-BIP：
5’-AAGCTCCAACATGAAGATGGCTTGTATGTGCGATTGTATTGC-3’；
mecA-FLP：5’-ACCTAATAGATGTGAAGTCGCT-3’；
mecA-BLP：5’-CGTGTCACAATCGTTGACG-3’。
5.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，CRISPR-Cas12a体系还包括LaCas12a和ssDNA荧光探针，ssDNA荧光探针的序列为：5’-6FAM-TTTATTT-3’-BHQ1。
6.根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，所述步骤1)中采用酶解法、反复冻融法、煮沸法、磁珠法或吸附柱法进行核酸提取。
7.根据权利要求6所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，所述步骤1)中酶解法进行核酸提取，具体方法为：取待测样品，离心后去上清，加入TE溶液，混匀，离心去上清，加入溶菌酶和Triton X-100，混匀，37℃，反应，得到待测样品的核酸提取液。
8.根据权利要求7所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，所述步骤2)包括：取步骤1)得到的核酸提取液加入到恒温扩增体系中，于55-70℃下恒温反应，扩增nuc1基因或mecA基因。
9.根据权利要求8所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，恒温扩增体系中还包括Primer mix、Isothermo Buffer、Mg2+、dNTP、H2O和聚合酶。
10.根据权利要求9所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，所述步骤3)包括：取经步骤2)扩增后的产物加入到CRISPR-Cas12a体系中，混合均匀后于26-42℃反应，检测反应的荧光，其中激发波长为475-495nm，发射波长为510-530nm。
11.根据权利要求9所述的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测方法，其特征在于，其中，CRISPR-Cas12a体系包括LaCas12a、ssDNA荧光探针、nuc1-crRNA或mecA-crRNA、TOLO Buffer和H2O。
12.一种金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸快速检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-11中任意一项所述的核酸扩增体系和CRISPR-Cas12a体系。
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