NO313557B1 - Diagnostisk anvendelse av D-lökkedannelse - Google Patents

Description

Denne søknad er en delvis fortsettelse av samtidig verserende, felles eiet, US søknad serie nr. 07/910791, registrert 9. juli 1992, som er en delvis fortsettelse av samtidig verserende, felles eiet, US søknad serie nr. 07/755462, registrert 4. september 1991, som er en delvis fortsettelse av samtidig verserende, felles eiet US søknad serie nr. 07/520321, registrert 7. mai 1990.

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til påvisning av en lineær duplex DNA-analytt ved dannelse av RecA-katalyserte, stabile, dobbelte D-løkkestrukturer som kan anvendes i flere forskjellige diagnostiske fremgangsmåter omfattende to probe innfangings/påvisningssystemer, RecA-befordret DNA oppformering, og in situ hybridisering.

Referanser

Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Bioloev. John Wiley and Sons, Inc., Media PA.

Bryant, F.R., et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 82:297 (1985).

Cassuto, E., et al., Mol. Ge. Genet. 208:10 (1987).

Chen, T.R., Cytogenet. Cell. Genet. 48:19-24 (1988).

Cheng, S., et al., J. Biol. chem. 263:15110 (1988).

Cheng, S., et al., Photochemical Probes in Biochemistry (P.E. Nielsen, ed.),sidene 169-177 (1989).

Corey, D.R., et al., Science 238:1401 (1987).

2 Cox, M.M. et al., Ann. /Rev. Biochem. 56:229-262 (1987).

Davis, L.G., et al., Basic Methods in Molecular Biologv. Elsevier Publishing Co.

(1986).

Dreyer, G.B., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 8

82:968 (1985).

Eisen, J., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:7481 (1988).

Fey, M.F., Schweiz. med. Wochenschr. 120(20^:731-737 (1990).

Fugisawa, H., et al., Nucleic Acids Res. 13:773 (1985).

Ganea, D., et al., Mol. Cell Biol. 7:7473 (1985).

Ganea, D., et al., Mol. Cell Biol. 7:3124 (1987).

Gonda, D.K., et al., Cell 34:647-654 (1983).

3 Griffith, J., et al., Biochem 24:158 (1985).

Halbrook, J., et al., J. Biol. Chem. 264:21403 (1989).

Harlow, E., et al., Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press (1988).

Haase, A.T., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 87:4971 (1990).

Hsieh, P., et al., Genes Dev. 4:1951 (1990).

Hsieh, P., et al., J. Biol. chem. 264:5089 (1989).

Hsieh, P., et al., Cell 44:885 (1986).

Keene, K., et al., PCT International Application, International Publication No. WO 90/06374 (Application No. 4 PCT/AU89/00526), 14 June 1990.

Kimeic, E.B., Cell 44:545 (1986.

Kimeic, E.B., Cold Spring Harbor Symp. 48:675 (1984).

Kingston, H.M., B.M.J. 299(6690):34-37 (1989).

Kolodner, R. e al., Pre. Nati. Acad. Sei. USA 84:5560 (1987).

Leahy et al., J. Biol. Chem. 26J.:6954 (1986).

Lowenhaupt, K., et al., J. Biol. Chem. 264:20568 (1989).

Madiraju, .W.S., et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:6592 (1988). Maniatis, T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982).

McCarthy, J., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:5854 (1988).

McEntee, K., et al., J. Biol Chem. 256:8835 (1981).

Moore, SO., et al., J. Biol. Chem. 19:11108 (1990).

Morrical, S.W., et al., Biochem. 29:837 (1990).

Moser, H.E., et al., Science 238:645 (1987).

Mullis, K.B., U.S. Patent No. 4,683,202, issued 28 July 1987.

Mullis, K.B., et al., U.S. Patent No. 4,683,195, issued 28 July 1987.

Nelson, M., et al., Nucl. Acids Res. 17:389 (1989).

Olson, M., et al., Science 245, 1434-1435 (1989).

Radding, C.M., Ann. Rev. Genet. 16:405 (1982) 25:1990.

Rigas, B., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:9591 (1986).

Roca, A.I., et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 25:415 (1990)

Saiki, R.K., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:6230 (1989).

Sambrook, J., et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2 (1989).

Scharf, S.J., et al., Science 233:1076-1078 (1986).

Shibata, T., et al.Proc. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:1638 (1979).

Shibata, T., et al., J. Biol. Chem. 256:7557 (1981).

Sluka, J.O., et al., Science 238:1129 (1987).

Strickler, J.G., et al., Am. J. Clin. Pathol. 93(4Suppl. l):S44-8 (1990). Sugino, A., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:3683 (1988).

Trask, B., et al., Hum. Genet. 78:251 (1988).

van Dekken, H., et al., Cytometry 11:153 (1990).

van dekken, H., et al., Cytometry 11_:579 (1990).

Wacsmuth, K., Rev. Infect. Dis. 8(5):a682-692 (1986).

Weier, H-U.G., et al., J. Histochem. and Cytochem. 38:421 (1990). Woodbury, C.P., et al., Biochemistry 22(20):4730-4737 (1983).

Zlvin, R.A., et al., European Patent Application No. 88307793.5,

Publication No. 0 305 145, 1 March 1989.

Bakgrunn for oppfinnelsen

RecA+ protein (villtype) er et 37 842 dal ton protein som finnes i bakterien Escherichia coli, som er viktig for homolog DNA rekombinasjon. Mest informasjon om dets biokjemi og enzymologi kommer fra in vitro studier ved anvendelse av renset RecA+ protein. Flere in vitro studier har vist at RecA+ protein er intimt involvert in parringsreaksjonen mellom homologe DNA sekvenser som til sist fører til homologe rekombinasjonsbegivenheter (Radding; se Cox et al. eller Roca et al. for ferske oversikter over RecA+ proteinegenskaper). Det er denne parringsreaksjon som gjør RecA+ protein svært anvendbart for DNA diagnostiske anvendelser.

I nærvær av ATP, vil RecA+ protein katalysere utveksling av tråder mellom flere substrater, de mest relevante for DNA probeanvendelser er enkelt- og dobbeltrådet DNA. RecA proteinbelagte enkelttrådete DNA prober samvirker med den homologe del av en dobbelttrådet ("naturlig") målsekvens, opprinnelig ved dannelse av et rekombinasjons-mellomprodukt inneholdende hybridiserte, delvis sammenføyde molekyler som kalles (enkle) D-sløyfer (eller i noen tilfeller trippel-trådete strukturer) (Shibata et al., 1979). Dette etterfølges av grenvandring og dannelse av fullstendig hybride molekyler mellom det opprinnelige enkelt- og dobbelttrådete DNA, avhengig av utstrekningen av deres homologi.

Korte forskyvningsløkker eller trippeltrådete D-løkkestrukturer i lineære mål er vanligvis ustabile etter D-proteinisering. Det er blitt vist at RecA protein danner stabile komplekser med korte oligonukleotider, mellom 9 og 20 bp (eller større) i lengde, i nærvær av ATPyS og overskudd av RecA protein (Leahy et al.). Når det anvendes lineære dobbelttrådete mål, synes stabil probemålparring etter RecA-fjerning å kreve (i) en homolog region på minst 38 til 56 bp, og (ii) plassering av probemålhomologien i enden av den lineære dupleks (Hsieh et al. 1990; Gonda et al.).

Rigas et al. rapporterte at en enkelt-trådet 43-mer kunne danne et enkelt D-løkke kompleks stabilt mot deproteinisering når det ble anvendt dobbelttrådet negativt superkveilet sirkulært plasmid DNA som mål.

Når det anvendes et dobbelttrådet, negativt, superkveilet, sirkulært mål-DNA, kan RecA-belagte enkelttrådete oligonukleotid prober også stabiliseres ved psoralen tverrbinding før fjerning av RecA-proteinet: Det kan gjenvinnes probemål enkel D-løkke produkter dersom oligoene er av minst 30-mer størrelse (Cheng et al., 1989). For å oppnå psoralen tverrbindingsstabiliserte enkel D-løkke probemålkomplekser når det anvendes dobbelttrådete lineære DNA duplekser som mål-DNA, må probene være av minst 80 til 107-mer størrelse (Cheng et al., 1988): Disse reaksjoner har svært lav virkningsgrad sammenlignet med lignende reaksjoner med negativt, superkveilede, sirkulære mål.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe en diagnostisk fremgangsmåte for påvisning av lineær dupleks DNA analytt uten ovennevnte ulemper. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Eksperimenter gjennomført til støtte for den foreliggende oppfinnelse har vist at probe:mal DNA-komplekser, som er stabile mot deproteinisering, kan dannes i RecA proteinkatalyserte reaksjoner under forutsetning av at dupleksprober, som inneholder sekvenser komplementære mellom probetråder, blir anvendt i hybridiseringsreaksjonene. Denne oppdagelse tilveiebringer flere muligheter for diagnostisk anvendelse som utnytter dette stabile RecA proteinkatalyserte probe:mål hybridiseringskompleks.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse omfatter en diagnostisk fremgangsmåte for påvisning av en lineær dupleks DNA analytt, som har første og andre tråder, hvor analytten inneholder en første indre DNA målsekvens. Fremgangsmåten går ut på å tilveiebringe et sett av to DNA-prober som hver inneholder sekvenser komplementære til den første målsekvens-tråd eller den andre målsekvenstråd, hvor disse prober også har en region av komplementær overlapping med hverandre.Begge probetråder blir deretter belagt med RecA protein i en RecA protein beleggingsreaksjon. De RecA belagte prober slås sammen med det lineære duplekse DNA, som inneholder målsekvensen, under betingelser som frembringer et probe:mål kompleks. Dette probermål kompleks inneholder begge probetråder og begge tråder fra den lineære dupleksanalytt. Probermål komplekset er stabilt mot deproteinisering, selv om det i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse ikke nødvendigvis er deproteinisert. Tilstedeværelsen av probe DNA i probe:mål komplekset blir deretter påvist.

I en utførelse av denne oppfinnelse er RecA proteinet den ville type RecA protein av Escherichia coli. Alternativt kan RecA proteinet være mutanten RecA-803 protein av Escherichia coli eller et RecA-lignende protein fra flere kilder.

RecA protein beleggingsreaksjonene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan utføres ved anvendelse av flere forskjellige kofaktorer, omfattende ATPyS, rATP (alene og i nærvær av et regenereringssystem), dATP, GTPyS, og blandinger av ATPyS og rATP, og av ATPyS og ADP.

I en utførelse av oppfinnelsen vil regionen av komplementær overlapping mellom probetrådene være minst ca. 78 base par og mindre enn ca. 500 base par. Probetrådene kan også inneholde en endeterminal-forlengelse av DNA som ikke er komplementær til noen av måltrådene. Når begge tråder inneholder en slik endeterminal-forlengelse, kan disse DNA-forlengelser være komplementære til hverandre.

En måte til å gjennomføre påvisningen ifølge fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelse er ved deproteinisering av probe:mål komplekset, etterfulgt av elektroforeseseparasjon av probe:mål komplekset fra fri probe. Probe:mål komplekset kan deproteiniseres etter flere forskjellige metoder, innbefattet behandling med SDS eller proteinase K, samt standard kjemiske deproteiniseringsmetoder, som f.eks. fenolbaserte metoder. Alternativt kan påvisningen omfatte anvendelse av et innfangingssystem som fanger inn probecmål komplekset, hvor den første probtråd er merket med en innfangingsgruppe og den andre probetråd er merket med en påvisningsgruppe. F.eks. kan en probetråd være biotin-merket og den andre digoksigenin-merket. Probermål komplekset kan deretter innfanges/påvises ved anvendelse av fast bærer-streptavidin (eller avidin)/merket anti-digoksigenin, eller fast bærer-antidigoksigenin antistoff/merket streptavidin (eller avidin). I en forskjellig utførelse inneholder den første probetråd en innfangingsgruppe og den andre probetråd inneholder en radioaktiv merking som skal anvendes for påvisning.

Probetrådene kan merkes for innfanging på flere måter, f.eks. ved anvendelse av biotin eller digoksigenin bundet til proben og henholdsvis streptavidin (eller avidin) eller et anti-digoksigenin antistoff for innfanging. Probetrådene kan også være merket for påvisning ved anvendelse av flere forskjellige grupper innbefattet: Radioaktivt biotin, digoksigenin. Radioaktive merkinger kan identifiseres ved f.eks. autoradiografi eller scintillasjonstelling. Tilstedeværelsen av biotin eller digoksigenin kan påvises ved henholdsvis streptavidin eller et anti-digoksigenin antistoff, hvor streptavidinet (eller avidinet) eller anti-digoksigenin er radioaktivt merket, enzym-merket (f.eks. alkalisk fosfatase, peroksidase, beta-galaktosidase eller glukose-oksidase) eller fluorokrom-merket (f.eks. fluorescein, R-phykoerythrin eller rodamin). Påvisning av probetrådene i probe:mål komplekset kan også gjennomføres ved DNA polymerase befordret primer ekstensjon fra 3-endede av hver probetråd, hvor primerekstensjonen gjennomføres i nærvær av alle fire dNTPer og en eller flere dNTP inneholder en påvisbar gruppe.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter dessuten å tilveiebringe et andre sett av to DNA prober, som har første og andre tråder, komplementært til en andre dupleks målsekvens, hvor den første tråd av proben inneholder sekvenser som er komplementære med en tråd av den andre målsekvens og den andre tråd av proben inneholder sekvenser som er komplementære til den andre tråd av den andre målsekvens, hvor (i) disse prober også har en region av komplementær overlapping med hverandre, og (ii) det andre sett av prober ikke hybridiserer med det første sett av prober. De to probesett blir belagt med RecA protein i en RecA protein beleggingsreaksjon. De RecA belagte probesett blir sammenslått med den lineære duplekse DnA som inneholder de to målsekvenser. Sammenslåingen blir gjort under betingelser som frembringer probe:mål komplekser som inneholder alle fire probetråder. Det resulterende probe:mål kompleks er stabilt mot deproteinisering. Tilstedeværelsen av probe DNA blir deretter påvist i probermål kompleksene.

Fremgangsmåten som involverer to probesett kan anvendes på mange av de samme måter som beskrevet ovenfor for et enkelt probesett. F.eks. kan det første probesett merkes med en innfangingsgruppe og det andre probesett merkes med en påvisningsgruppe.

De dobbelttrådete probe:dupleks mål komplekser som involverer to probesett kan også anvendes i en RecA protein-befordret DNA oppformeringsmetode. F.eks. kan de to probesett hybridiseres til sine duplekse målsekvenser i nærvær av ATPyS (eller rATP (med eller uten et egnet ATP regenereringssystem), dATP, og blandinger av ATPyS og ADP) og omsettes i en reaksjonsblanding som også inneholder alle fire dNTPer, RecA protein og DNA polymerase. Denne omsetning gjennomføres under den temperatur som kreves for termisk dissosiering av de to måltråder, og fortsettes inntil det er oppnådd en ønsket grad av oppformering av målsekvensen. Oppformeringsreaksjonene kan dessuten innbefatte gjentatte tilsetninger av (i) DNA polymerase og (ii) RecA proteinbelagte prober i løpet av oppformeringsreaksjonene. Andre fremgangsmåter for oppformering som kan anvendes på den foreliggende oppfinnelse, er fremsatt i samtidig verserende US søknad nr. 07/520,321, registrert 7. mai 1990.1 hvert probesett vil 3'-enden av en tråd være intern for regionen definert ved de to primersett: Disse ender er nødvendig for oppformerings-reaksjonen. De motsatte 3'-ender av hvert primerpar, eksterne for regionen definert ved de to primersett, kan imidlertid blokkeres for å inhibere dannelsen av ekstensjonsprodukter fra disse ender. Denne oppformeirngsmetode kan også anvendes som påvisningsmetode, hvor påvisningen av proben i probe:mål komplekset oppnås ved DNA polymerase formidlet primer ekstensjon fra 3'-endene av hver probetråd, hvor primer ekstensjonsreaksjonen gjennomføres i nærvær av alle fire dNTPer og ett eller flere dNTP inneholder en påvisbar gruppe.

De dobbelttrådete probe:dupleks mål komplekser kan også anvendes til å blokkere spalting av et eventuelt målbestemt restriksjonssete. Blokkerende spalting kan oppnås på flere måter omfattende: (i) dannelse av probe:mål komplekset og behandling med restriksjonsenzymet før deproteinisering av komplekset; (ii) anvendelse av metylerte eller ikke-metylerte prober, avhengig av sensitiviteten til et utvalgt enzym overfor tilstedeværelsen av metylgrupper; og (iii) innføring av en sekvensmistilpasning i hver tråd av proben som, når proben hybridiserer til målet, eliminerer restriksjonssetet.

De dobbelttrådete proberdupleks mål komplekser kan oså anvendes til å danne setespesifikk spalting av dobbelttrådet mål DNA. Den dobbelttrådete probe kan modifiseres med grupper som er istand til å spalte hver tråd av mål duplekset. Denne probemodifisering kan foregå før eller etter deproteinisering avhengig av den spaltende gruppes karakter. Eksempler på slike grupper er jern Fell (for jern/EDTA befordret spalting) ikke-spesifikke fosfodiesteraser, og restriksjonsendonukleaser. I begge tilfeller bibringes spaltespesifiteten av målsekvensen som er definert ved den dobbelttrådete oligonukleotid probe.

Både restriksjonssete beskyttelsesmetoden og den setespesifikke spaltemetode kan anvendes ved restriksjonsfragment lengde polymorfisme analyse.

En annen utførelse av den foreliggende oppfinnelse inkluderer en fremgangsmåte for isolering av en lineær dupleks DNA analytt, som har første og andre tråder, inneholdende en første intern DNA målsekvens, hvor dupleks DNA-analytten er tilstede i en blanding av nukleinsyremolekyler. I denne fremgangsmåte tilveie-bringes ett sett av to DNA prober som har første og andre probetråder, hvor den første og andre probetråd (i) inneholder komplementære sekvenser til den første og andre målsekvenstråd, og (ii) hvor disse komplementære sekvenser også inneholder komplementær overlapping mellom probetrådene. Probene belegges deretter med RecA protein. De belagte prober blir sammenslått med det lineære dupleks DNA som inneholder målsekvensen under betingelser som frembringer et probe:mål kompleks inneholdende probetrådene og begge måltråder: Det resulterende probe:mål kompleks er stabilt mot deproteinisering. Probe:mål komplekset blir utskilt fra blandingen av nukleinsyremolekyler. Dupleks DNA analytten som inneholder målsekvensen, blir deretter isolert.

I denne fremgangsmåte kan komplekset utskilles fra nukleinsyreblandingen ved anvendelse av f.eks. prober som inneholder biotin-grupper som er innfanget med streptavidin eller avidin. Streptavidinet eller avidinet kan være bundet til en fast bærer, slik som paramagnetiske kuler.

Fremgangsmåten omfatter videre varmedenaturering av det isolerte probe:mål kompleks ved en temperatur (i) som er tilstrekkelig til å frigjøre dupleks DNA analytten inneholdende målsekvensen fra komplekset, og (ii) under smeltetemperaturen for dupleks DNA analytten som inneholder målsekvensen. Dette tillater isolering av intakte dupleksmolekyler. Duplekset kan deretter denatureres til enkelttråder om så ønskes. Alternativt kan komplekset varmedenatureres ved en temperatur (i) som er tilstrekkelig til å frigjøre dupleks DNA analytten inneholdende målsekvensen fra komplekset, og (ii) ved eller over smeltetemperaturen for dupleks DNA analytten inneholdende målsekvensen. Dette fører til isolering av enkelttrådete DNA molekyler avledet fra det innfangede dupleks.

En annen utførelse av den foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for påvisning av en lineær dupleks DNA analytt i en blanding av nukleinsyremolekyler. Fremgangsmåten omfatter isolering av den lineære dupleks DNA analytt som beskrevet ovenfor og å oppnå enkelttrådete DNA molekyler avledet fra dupleks DNA analytten: Dette blir typisk oppnådd ved oppvarming av duplekset over dupleksets smeltetemperatur (varmedenaturering). Til de enkelttrådete mål DNA analytt molekyler tilsettes minst en DNA syntese primer som er komplementær til målsekvensen og som ikke inneholder sekvenser som var tilstede i noen av de to opprinnelige DNA prober. Påvisning av DNA analytten oppnås ved DNA polymerase befordret primer ekstensjon fra 3'- enden av primeren, hvori primerekstensjonen gjennomføres i nærvær av alle fire DNTPer og minst ett DNTP inneholder en påvisbar gruppe.

De dobbelttrådete probe dupleks mål komplekser ifølge den foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for diagnostiske in situ påvisningsteknikker.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 illustrerer forholdene mellom probene og primerne oppført i tabell 1, og lambda genomet. Fig. 2 representerer nukleotid sekvensen for en 500 bp lambda genom region: Denne sekvens representeres også som SEQ ID nr. 1. Fig. 3 viser et autoradiogram av en DNA båndskifte gel elektroforese assay for å illustrere RecA proteinbinding til DNA prober. Fig. 4A viser en etidium bromid farget gel hvorpå komponentene av deproteiniserte hybridiseringsreaksjoner som anvendte 500-mere og 280-mere prober ble oppløst.

Fig. 4B viser en autoradiografi av gelen vist i fig. 4A.

Fig. 5A viser en etidium bromid farget gel hvori komponentene av deproteiniserte hybridiseringsreaksjoner som anvender 280-mere, 121-mere, og 79-mere prober ble oppløst. Fig. 5B viser en autoradiografi av gelen vist i fig. 5A. Fig. 6A viser en etidium bromid farget gel hvori komponentene av deproteiniserte hybridiseringsreaksjoner som anvender forskjellig merkede 121-mere DNA prober ble oppløst. Fig. 6B viser en autoradiografi av gelen vist i fig. 6A. Fig. 6B illustrerer at to DNA probetråder er nødvendig for fremstilling av stabile deproteiniserte RecA proteinkatalyserte hybirdiseringskomplekser. Fig. 7 illustrerer en modell av stabile dobbelttrådete probe:dupleks lineære mål DNA komplekser. Fig. 8 viser en gel hvorifra det ble isolert stabile dobbelttrådete probe:dupleks lineære mål DNA komplekser, hvor dupleks probetrådene var forskjellig merket. Fig. 9 illustrerer flere forskjellige dobbelttrådete probe:dupleks lineære mål DNA komplekser. Figurene 10A, 10B og 10C illustrerer flere påvisningssystemer basert på et enkelt dobbelttrådet proberdupleks lineært mål DNA kompleks. Figurene 1 IA og 1 IB illustrerer flere påvisningssystemer basert på et mangfoldig dobbelttrådet proberdupleks lineært mål DNA kompleks. Fig. 12 viser RecA protein katalysert todobbelt D-løkke primer posisjonering på naturlig mål DNA (fig. 12A) og DNA oppformering med DNA polymerase etterfulgt av ligering med DNA ligase (i fravær av primer probe forskyvning) (fig. 12B). Fig. 13 viser et DNA polymerase mediert signal oppformeringsreaksjon som anvender en enkelt dobbel D-løkke probe (fig. 13 A) eller sammensatte dobbel D-løkke prober (flg. 13B). I fig. 13 kan X og X' være de samme eller forskjellige: F.eks. kan X være radioaktivt merket og X1 kan bære en digoksigenin gruppe. Fig. 14. illustrerer et påvisningssystem som involverer anvendelse av restriksjonsendonuklease spalting av ikke-mål kompleksert dobbelttrådet probe hvor innfanging av det resulterende produkt blir oppnådd før (fig. 14B) eller etter (fig. 14A) restriksj onsenzymspalting. Fig. 15 illustrerer beskyttelse av et restriksjonssete ved enten metylering eller RecA protein. I tilfelle metyleringsbeskyttelse blir dobbel D-løkke komplekset deproteinisert før restriksjonsendonukleasespaltingen (fig. 15A). I tilfelle RecA protein beskyttelse blir dobbel D-løkke komplekset deproteinisert etter restriksjonsendonukleasespaltingen (fig. 15B). Fig. 16 viser en etidium bromid farget agarose gel hvorpå komponentene av deproteinisert RecA mediert dobbel D-løkke hybridiseringsreaksjoner som anvendte varmedenaturert 280-mer probe og forskjellige kofaktorer, ble oppløst ved elektroforese.

Fig. 17 viser et autoradiogram av gelen vist i fig. 16, etter tørking.

Fig. 18 viser en etidium bromid farget agarose gel hvorpå komponentene av deproteinisert RecA mediert dobbel D-løkke hybridiseringsreaksjoner som anvendte varmedenaturert 500-mer probe og ATPyS og ATPyS/rATP blandinger som kofaktorer, ble oppløst ved elektroforese.

Fig. 19 viser et autoradiogram av gelen vist i fig. 18 etter tørking.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I. Dannelse av RecA katalyserte probe:mål hybridiseringskomplekser som er stabile mot deproteinisering.

A. DNA prober og primere.

Eksperimenter gjennomført til støtte for den foreliggende oppfinnelse viser at korte dobbelttrådete DNA molekyler eller komplementære enkelttrådete molekyler kan anvendes til å danne hybridiseringskomplekser med lineære mål DNA molekyler i interne regioner, og at disse komplekser er stabile mot deproteinisering. Som et eksempel på disse stabile hybridiseringskomplekser ble det fremstilt dobbelttrådete og komplementære enkelttrådete DNA molekyler av varierende lengde for anvendelse som prober og primere (eksempel 1, tabell 1). Disse DNA molekyler ble valgt til å ha homologi med forskjellige deler av en 500 bp region i lambda fag genomet. Forholdene mellom probene og primerne, oppført i tabell 1, og lambda genomet er illustrert i fig. 1. Nukleotidsekvensen av 500 bp lambda genom regionen er presentert i fig. 2.

B. Fremstilling av RecA protein og probebelegging.

I den foreliggende oppfinnelse skal RecA protein referere til en familie av RecA lignende rekombinasjonsproteiner som alle har i alt vesentlig alle eller de fleste av de samme funksjoner, særlig: (i) proteinets evne til korrekt å plassere primere og deres homologe mål for påfølgende utvidelse ved DNA polymeraser; (ii) RecA proteinets evne til lokalt å fremstille DNA for DNA syntese; og (iii) evnen til RecA protein/DNA primer komplekser til effektivt å finne og binde seg til komplementære sekvenser. Det best karakteriserte RecA protein er fra E. coli; i tillegg til villtype proteinet er det identifisert flere mutante RecA-lignende proteiner (f.eks. RecA-803, Madiraju, et al). Videre har mange organismer RecA-lignende tråd-overføirngsproteiner (Fugisawa, H., et al.; Hsieh, P., et al., 1986; Hsieh, P., et al., 1989; Fishel, R.A., et al.: Cassuto, E., et al.: Ganea, D., et al.; Moore, S.P., et al.; Keene, K., et al.; Kimeic, E.B., 1984; Kimeic, E.B. 1986; Kolodner, R., et al.; Sugino, A., et al.; Halbrook, J., et al.; Eisen, A., et al.; McCarthy, J., et al., Lowenhaupt, K., et al.)

RecA protein oppnås typisk fra bakteriestammer som har overproduksjon av proteinet: Eksempel 2 beskriver rensig av villtype E. coli RecA protein og mutant RecA-803 protein fra slike stammer. Alternativt kan RecA protein også kjøpes fra f.eks. Pharmacia (Piscataway NJ).

De betingelser som anvendes til å belegge DNA prober med RecA protein og ATPyS er beskrevet i eksempel 3. Alternativt kan prober belegges ved anvendelse av GTPyS, rATP (alene eller i nærvær av et rATP genererende system (Boerhinger Mannheim), dATP, blandinger av ATPyS og rATP, eller blandinger av ATPyS og ADP. Anvendelse av ATPyS, rATP, dATP og GTPyS som kofaktorer i RecA proteinbeleggingsreaksjonen er beskrevet i eksempel 10.

Resultatene av dobbel D-løkke kompleksdannelse ved anvendelse av disse kofaktorer er presentert i figurene 16 og 17. Fig. 17 viser at i nærvær av hvert av ATPyS, rATP, dATP og GTPyS ble det dannet dobbel D-løkke hybridiseringskomplekser, som er stabile mot deproteinisering. Videre beskriver eksempel 11 anvendelse av blandinger av ATPyS/rATP som kofaktorer for RecA protein beleggingsreaksjonene. Resultatene vist i figurene 18 og 19 viser at i nærvær av slike blandinger ble det dannet dobbel D-løkke hybridiseringskomplekser som er stabile mot deproteinisering. I tillegg til ATPyS/rATP er det også blandinger av andre kofaktorer som arbeider i RecA proteinbeleggingsreaksjonen.

Beleggingen av prober med RecA protein kan evalueres på forskjellige måter. Først kan proteinbindingen til DNA undersøkes ved anvendelse av bånd-skift gel assay (McEntee et al.). Eksempel 3 beskriver anvendelsen av DNA bånd-skift gel assay for å illustrere RecA proteinbinding til DNA prober. Merkede prober ble belagt med RecA protein i nærvær av ATPyS, og produktene av beleggingsreaksjonene ble adskilt ved agarose gel elektroforese: Fig. 3 viser et autoradiogram av det resulterende DNA i gelen. De data som er presentert i fig. 3 illustrerer at etter inkubering av RecA protein med denaturert dupleks probe DNA vil RecA proteinet effektivt belegge enkelttrådete DNA prober avledet ved denaturering av dupleksprobe. Ettersom forholdet av RecA protein monomerer til nukleotider i proben øker fra 0, 1:27, 1:2,7 til 3,7:1 for 121-mer (henholdsvis sporene 1-4) og 0, 1:22, 1:2,2 til 4,5:1 for 159-mer (henholdsvis sporene 5-8) vil DNA probens elektroforetiske mobilitet gå ned, d.v.s. retarderes, p.g.a. RecA-binding til DNA proben. Den delvise retardering av DNA probens mobilitet observert i sporene 2,3 og 6,7 reflekterer ikke-metningen av probe DNA med RecA protein. Som ventet (Leahy et al.), kreves det således et overskudd av RecA monomerer til DNA nukleotider for effektiv RecA belegging av korte DNA prober.

En andre fremgangsmåte for evaluering av proteinbinding til DNA er anvendelsen av nitrocellulose filter bindingsassay (Leahy et al.; Woodbury et al.). Nitrocellulose filter bindingsmetoden er særlig nyttig til bestemmelse av dissosiasjonshastighetene for protein:DNA komplekser ved anvendelse av merket DNA. I en filterbindingsassay blir DNA:protein kompleksene holdt tilbake på et filter, mens fritt DNA passerer gjennom filteret. Denne assay-metode er mere kvantitativ for bestemmelse av dissosiasjonshastighet, fordi separasjonen av DNA:protein komplekser fra fri probe er svært hurtig.

Typisk, for å gjennomføre en slik filterbindingsassay blir nitrocelluloseskiver (Schleicer og Schuell, BA85 filtere eller HAW P0025 nitrocellulose filtere) for-behandlet, gjennomfuktet med buffer og deretter plassert på et vakuumfilter-apparat. DNA:proteinbindingsreaksjoner blir ofte fortynnet for å redusere konsentrasjonen av komponenter uten dissosierende komplekser. Reaksjonene passeres gjennom skivene med vakuum påført. Under lave saltbetingelser vil DNA:protein komplekset klebe til filteret, mens fritt DNA passerer gjennom. Skivene blir plassert i scintillasjonstellevæske (New England Nuclear, National Diagnostics, Inc.), og cpm bestemt ved anvendelse av en scintillasjonsteller.

C. DNA mål.

For å studere spesifisiteten av den RecA katalyserte hybridisering av prober med homologe dobbelttrådete lineære DNA mål på interne seter ble det anvendt flere modell lambda DNA mål systemer innbefattet følgende: 1) En blanding av 14 DNA fragmenter i størrelsesområde fra 92 til 8 598 bp dannet ved Dral (Promega) restriksjonsenzymspalting av fullstendig lambda genomisk DNA (48,5 kb; Bethesda Research Laboratories Gaithersburg MD). Det målfragment som er homologt med regionen definert i figurene 1 og 2 er et 8 370 bp Dral fragment. Regionene i homologi med probene, oppført i tabell 1, var alle minst 832 baser inn fra 3'-enden av det dobbelttrådete mål DNA fragment. 2) En blanding av to fragmenter (38 412 og 10 090 bp) dannet ved Apal restriksjonsenzymspalting av komplett lambda genomisk DNA. Fragmentet på ca. 10 kb inneholder regionen definert i figurene 1 og 2. Denne homologiregionen ligger minst 2 460 bp fra 3'-enden av det dobbelttrådete mål DNA fragment. 3) Fragmentet på 10 kb fra en Apal lambda DNA spalting, agarose gel renset og deproteinisert. 4) En dobbeltspalting av lambda med Dral og BamHI hvori mål DNA fragmentet er 2 957 bp, med probemål homologi minst 832 baser fira 3' enden av det dobbelttrådete mål DNA fragment. 5) Helt lambda virus DNA ble også anvendt som mål. I dette tilfelle var probemål homologien minst 7.131 baser fra 5'-enden av det hele lambda genom. D. RecA-befordret dannelse av hybridiseringskomplekser mellom dobbelttrådet probe og mål DNA sekvenser.

Blandingen av RecA belagte enkelttrådete DNA prober og mål DNA initierer søkingen etter homologi mellom RecA belagte DNA prober og dupleks mål DNA molekyler. I tilfelle en enkelt probesekvens kan RecA:DNA probefilamentet når det er dannet, katalysere søkingen for homologi og D-løkkedannelse mellom komplementære probe- og mål DNA sekvenser. Tradisjonelle enkle D-løkker kan dannes mellom enkelttrådete RecA belagte DNA prober med ca. 500 baser eller mindre som er homologe med lineære dobbelttrådete mål DNAer. Disse D-løkker er ustabile etter proteinfjerning, når posisjonen for probe:mål homologi er på en intern posisjon på det lineære mål.

Eksperimenter gjennomført til støtte for den foreliggende oppfinnelse har vist at 500-mer og mindre prober kan danne stabile deproteiniserte RecA katalyserte dobbel D-løkke probermål komplekser på interne seter på dupleks lineære DNA mål. For imidlertid å danne slike stabile strukturer må det avendes minst to prober som har overlappende komplementære sekvenser med hverandre. De to prober er RecA belagte enkelttrådete DNA prober og blir anvedt i RecA katalyserte probe:mål hybridiseringsreaksjoner.

Eksempel 4 beskriver dannelsen av RecA proteinmedierte doble D-løkker, eller multiplekser. De 500- og 280-mere prober ble RecA protein-belagt, og mål-DNA var lambda DNA Dral fragmentet på 8 369 bp beskrevet ovenfor. Forholdet RecA protein til probe-nukleotid var 1,5:1 for 500-mer og 1,3:1 for 280-mer. Forholdet mellom den dobbelttrådete DNA probe og det homologe dobbelttrådete DNA målfragment var 11:1 for 500-mer og 22:1 for 280-mer. Fig. 4A viser en etidiumbromid farget DNA gel som DNA komponentene fra de deproteiniserte hybridiseringsreaksjoner ble oppløst på.

Fig. 4B viser en autoradiografi av DNA i gelen vist i fig. 4A. Resultatene presentert i fig. 4B viser dannelsen av 500-mer:mål og 280-mer:mål DNA hybridiseringsprodukter som er stabile mot deproteinisering. En sammenligning mellom reaksjonene med og uten RecA protein viser at RecA er nødvendig for dannelsen av homologe probe:mål DNA komplekser.

Det pUC18 dobbelttrådete sirkulære DNA ble inkludert som en positiv kontroll i eksempel 4. Negativt superkveilede dobbelttrådete DNA sirkulære molekyler er kjent for å danne probe:mål RecA proteinkatalyserte hybridiseringsprodukter med korte enkelttrådete prober som er stabile mot deproteinisering (Rigas et al.; og Cheng et al., 1988).

For å bekrefte identiteten av hybridiseringsproduktene dannet i eksperimentet ovenfor, ble RecA protein belagte prober reagert med målfragmenter avledet fra Dral/BamHI dobbeltspalting av lambda genomisk DNA. I dette eksperiment hadde det homologe målfragment dannet ved dobbeltspaltingen en lengde på 2.957 bp, og posisjonen for probe:målsekvens homologien var uforandret fra de tidligere eksperimenter (d.v.s. 832 bs fra 3'-enden av det homologe målfragment). Hybridiseringsreaksjonene ble gjennomført under betingelser identiske med dem nettopp beskrevet for lambda DNA Dral målfragmentet på 8 370 bp.

Elektroforese separasjon etterfulgt av autoradiografisk analyse av disse RecA proteinkatalyserte hybridiseringsreaksjoner, viste at deproteiniserte probe:mål DNA komplekser nu migrerte til posisjonen for målfragmentet på 2 957 bp, hvilket bekreftet at probermål DNA hybridiseringsreaksjonen i virkeligheten var med spesifikke homologe mål.

De RecA protein katalyserte probermål reaksjoner ble utført i nærvær av et overskudd av ikke-homologe lineære DNA målmolekyler.

Eksempel 5 beskriver dannelsen av komplekser som er stabile mot deproteinisering mellom små enkelttrådete prober og lineære dobbelttrådete mål DNAer. I hybridiseringsreaksjonene gjengitt i eksempel 5 ble denaturerte prober belagt ved et RecA protein til probe-nukleotid forhold pål,8:1, 0, 5,7:1, 5,9:1, 2,6:1 og 11,8:1, henholdsvis sporene 1-6 i figurene 5A og 5B. Forholdet mellom dobbelttrådet probe og dobbelttrådet målfragment var 4,8:1 (280-mer), 3,6:1 (121-mer), og 5,2:1 (79-mer). Fig. 5A viser DNA fra en etidium bromid farget gel som komponentene i de deproteiniserte hybridiseringsreaksjoner ble oppløst på.

Fig. 5B viser en autoradiografi av gelen vist i fig 5A. Resultatene gjengitt i

Fig. 5B viser at det stabile deproteiniserte hybridiserings probe:mål produkt kan dannes med prober som er kortere enn 280 baser i størrelse. Tilsetning av alt for mye RecA protein synes å nedsette mengden av stabilt produkt som dannes i DNA hybridiseringsreaksjonen (sammenlign sporene 4, 5 og 6). Fordi de 121-mere og 79-mere prober som ble anvendt i dette eksperiment, var avledet ved restriksjonsenzymspalting av <32>P ende-merkede 280-mere og 500-mere duplekse prober, inneholdt hver DNA-probe enten den 5' tråd eller den 3' tråd merket, ikke begge, som med 280-meren: De 5' og 3' ender av molekylene blir identifisert med hensyn til helt lambda DNA. Signalene observert i sporene 3-6 i fig. 5B viser at enten den 5' eller den 3' probetråd kan delta i probe:mål reaksjonen: Denne observasjon stemmer overens med den konklusjon at begge probetråder er involvert i dannelsen av probe:mål DNA hybridiseringskomplekset som er stabilt mot deproteinisering.

Flere hybridiseringseksperimenter ifølge hovedprotokollen beskrevet i eksempel 4 og 5 har bekreftet at den RecA proteinkatalyserte hybridiseringsreaksjon kan foregå under et bredt område av reaksjonsbetingelser. Når det anvendes forskjellige konsentrasjoner av mål DNA, er utbyttet av deproteinisert hybrid typisk proporsjonalt med mengden av homologt mål DNA i reaksjonen. Noen reaksjonsbetingelser kan sammenfattes som følger: (i)ATPyS konsentrasjoner mellom 1 og 12 mM ble testet i probe RecA-beleggingsreaksjoner. Konsentrasjonsområdet av ATPyS ga stabile hybridiseringsprodukter etter måladdisjon: Det foretrukne område var ca. 2,4 til 8 mM. ATPyS, rATP (alene og i nærvær av et regenereringssystem), dATP, GTPyS, og blandinger av ATPyS og rATP, virker også i probebeleggingsreaksjoner (eksemplene 10 og 11). Når det anvendes kommersielle preparater av ATPyS i en reaksjon kan renheten av preparatet dessuten variere fra preparat til preparat. ATPyS levert fra Pharmacia er vanligvis ca. 95-97% ATPyS. ATPyS levert fra Sigma varierer mellom ca. 75% og ca. 90% ATPyS: Disse preparater inneholder vanligvis mellom ca. 10% og 20% ADP. ATPyS fra både Pharmacia og Sigma kilder er blitt testet: Preparater fra begge disse kilder virker bra i RecA dobbel D-løkke reaksjoner. Kombinasjoner av ATPyS og ADP virker således også i RecA medierte dobbel D-løkke hybridiseringsreaksjoner. DNA prober ble dessuten effektivt belagt med RecA protein i nærvær av en blanding av ATPyS og rATP, idet foretrukne blandinger inneholdt henholdsvis ca. 1,4 og 1 mM av hver komponent. Resultatene av disse eksperimenter viser at RecA kan anvende et bredt område av kofaktorer og kofaktorkombinasjoner for dobbel D-løkke kompleksdannelse. (ii) Mg++ acetat konsentrasjoner i den endelige reaksjon inneholdende proben og mål DNA virket over et bredt område av Mg* konsentrasjoner: 4 til 25 mM med det foretrukte område mellom ca. 6 og 8 mM; (iii) RecA protein konsentrasjoner mellom 8,4 og 41 uM ble testet i probe beleggingsreaksjoner: Hver konsentrasjon var aktiv (iv) RecA protein til probe-nukleotid forhold under probebelegging mellom 1:3 og 6:1 var effektive med det foretrukte område mellom ca. 2:1 og 4:1 forhold (v) endelige (mikromolare) dobbeltrådet DNA probe til dobbelttrådet DNA mål molekyl forhold var mellom 2:1 og 22:1 alle ga stabile deproteiniserte probe:mål hybrider (vi) DNA hybridiseringsreaksjonen virker i en analog Tris-HCl reaksjons-buffer (pH7,5), selv om probebelegging og trådoverføring i acetatbuffer synes å gi mere produkter enn Tris systemet (vii) RecA-803 mutant protein var aktivt ved dannelse av stabile hybridiseringskomplekser (viii) Hybridiseirngsreaksjonen fungerer i nærvær av enkelttrådbindings (SSB) protein (Morrical et al.) ;(ix) RecA protein belagte enkeltrådete DNA prober, innbefattet blandinger av belagte denaturerte dobbeltrådete prober, lagret ved -20°C i flere dager var aktive i hybridiserings kompleks dannelse etter inkubering med mål ved 37°C ;(x) Hybridiseringsreaksjonen kan utføres med helt lambda genomisk DNA som mål. Probe:mål hybridiseringsreaksjonene kan også utføres når mål:DNA er innleiret i ;agaroseplugger eller mikrokuler: F.eks. er det blitt dannet stabile doble D-løkke hybrider ved anvendelse av RecA protein belagte prober med intakte 48,5 kb X DNA mål innleiret i agaroseplugger. ;(xi) Regionen av komplementær overlapping mellom probetrådene er typisk ca. 79 basepar og mindre enn ca. 500 basepar. Prober med denne grad av komplementær overlapping danner stabile produkter ved interne målseter i den RecA-katalyserte hybridiseringsreaksjon ifølge den foreliggende oppfinnelse. Dannelse av stabile hybridiseringsprodukter ble også demonstrert ved endene av lineære molekyler (f.eks. ved anvendelse av 80-mere prober og det 500-mere dupleks som mål (fig. 1). Standard probetråd til måltrådkomplementaritet er mellom 90 og 100%. RecA protein er imidlertid kjent for å katalysere dannelsen av hybridiseringskomplekser inneholdende noen ikke-spesifikke basepar interaksjoner (Cheng et al. 1989). Følgelig kan probe:mål komplementaritet reduseres avhengig av probestørrelse og den nødvendige spesifisitet for påvisningsreaksjonen: Typisk er komplementariteten ikke lavere enn 70% basepar overensstemmelse mellom hver probetråd og måltråd. ;(xii) Prober som har mindre enn ca. 79 basepar av overlapping kan anvendes i den foreliggende oppfinnelse: Stabilisering av den doble D-løkke, som følger etter deproteiniseringen, kan være fordelaktig når det anvendes prober av disse mindre størrelser. En fremgangsmåte for ytterligere stabilisering av dobbel D-løkke kompleksene er psoralen tverrbinding (Cheng et al, 1988): Slik tverrbinding er særlig nyttig in situ siden den tillater anvendelse av grove vaskebetingelser. ;Resultatene presentert i fig. 5B viste at de observerte probe:mål produkter var stabile mot deproteinisering fordi begge DNA probetråder var tilstede på det samme målmolekyl. En fremstilling av et slikt stabilt kompleks er vist i fig. 7. Denne struktur er referert til heri som en dobbel D-løkke- eller multipleks DNA struktur i motsetning til den tradisjonelle enkle D-løkke, eller trippeltrådet fortrengningsløkke eller tripleks struktur (to måltråder og en enkelt DNA probe komplementær til en bestemt enkel måltråd). ;Eksempel 6 gir data som bekrefter at to RecA proteinbelagte DNA probetråder er nødvendig for fremstilling av stabile deproteiniserte probe:mål hybridiseringsprodukter på et lineært mål DNA molekyl ved en intern region av DNA homologi. Individuelle 121-mere probetråder ble kjemisk syntfisert for å sikre at individuelle probetråder ikke skulle forurenses med små mengder av den komplementære (motsatte DNA tråd). For å adskille tilstedeværelsen av hver av de to individuelle komplementære DNA probetråder, ble probene forskjellig merket: En tråd med et 5' terminalt <32>P merke og den andre med et enkelt 5' terminalt biotin merke. ;Siden bare en tråd var radioaktivt merket var de <32>P spesifikke aktiviteter av hver dobbel D-løkke DNA hybridiseringsreaksjon de samme: Sammenligning mellom resultatene av alle eksperimenter var derfor mere beleilig. Hybridiseringsreaksjoner ble utført som beskrevet i eksempel 6. Fig. 6A viser en etidium promid farget gel som DNA komponentene av de deproteiniserte hybridiseringsreaksjoner ble oppløst ;På. ;Fig. 6B viser en autoradiografi av DNA i gelen vist i fig. 6A. Resultatene i fig. 6B viser at to probetråder er nødvendig for fremstilling av stabilt deproteinisert probermål hybrid. Dessuten virker reaksjonen uansett om begge prober er belagt med RecA protein sammen eller i adskilte reaksjoner. Dessuten danner hybridiseringsreaksjonen deproteiniserte stabile komplekser selv når DNA probene blir tilsatt til reaksjonen i rekkefølge (sporene 5 og 6). Tilsetning av <32>P tråden først til reaksjonsblandingen synes å gi mere DNA hybridiseringsprodukt. Det er mulig at det terminale biotinmerke er svakt inhiberende på grunn av størrelsen av den kjemiske spacer arm eller posisjonen av merkelappen på proben. Uansett rekkefølgen av probetilsetning til hybridiseringsreaksjonen, er det imidlertid nødvendig med to probetråder for å danne stabile deproteiniserte homologe komplekser. Den RecA medierte homolog probe målsøkingsreaksjon kan også anvise prober inneholdende biotin inkorporert i interne posisjoner. Slike prober kan - syntifiseres ved anvendelse av en modifikasjon av polymerase kjedereaksjon (Mullis; Mullis, et al.) hvor bio-14-dATP erstatter en viss prosentsats (f.eks. 5 til 25%) av det dATP som vanligvis anvendes ved syntese. ;Hastigheten av RecA-befordret homolog parring av korte DNA prober med deres beslektede målsekvenser er blitt vist å være positivt relatert til lengden av tilknyttede heterologe DNA haler (Gonda et al.). Følgelig kan prober anvendt ved hybridiseringsreaksjonene ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatte heterologe haler, d.v.s. terminale sekvenser som er ikke-homologe med mål DNA, for å sette fart i den homologe parring av probesekvensen til målsekvensen. ;E. Innfangnings/påvisningssystem. ;Tilstedeværelsen av både de <32>P- og biotin-merkede 121-mere probetråder på det samme målmolekyl ble ytterligere bekreftet ved anvendelse av et innfang-nings/påvisningssystem (eksempel 7). De deproteiniserte dobbel D-løkke produkter ble innfanget ved anvendelse av streptavidin-magnetiske kuler. Innfangning av den biotinholdige probe innfanget samtidig den P-merkede probe. Fig. 8 viser DNA fra gelen som probe:målkompleksene ble isolert fra, før streptavidininnfangning av biotingruppen. DNA kompleksene ble isolert ved ekstraksjon fra gelfragmenter tilsvarende den forventede størrelse av probe:mål komplekset (eksempel 7). Det ekstraherte DNA ble deretter eksponert for streptavidinbelagte paramagnetiske kuler. Perlene ble deretter isolert og plassert i scintillasjonsvæske for påvisning av den <32>P-merkede DNA probetråd. Resultatene av denne analyse er gitt i tabell 2. Disse data viser at bare reaksjoner som anvender to probetråder og RecA protein gir et innfangningssignal over bakgrunnen. Dette eksperiment anvendte et isolert DNA mål som migrerte til 10kb mål DNA posisjonen for innfangning, og utelukket således den mulige tilstedeværelse av komplekse rekombinasjonsprodukter mellom sammensatte 1 Okb mål som kunne innfanges og påvises uten i virkeligheten å ha en dobbel D-løkke struktur på et individuelt 10kb mål molekyl. De hybride molekyler som dannes i disse reaksjoner er dessuten ganske stabile under de isoleringsbe-tingelser som anvendes, og underbygger den konklusjon at det innfangede <32>P-signal ikke var en artefakt av komplementær probe reassosiasjon. ;II. Anvendelighet. ;Fig. 9 viser et antall mulige dobbel D-løkke strukturer. Fig. 9A representerer dannelsen av en dobbel D-løkke struktur på et internt sete på et DNA målmolekyl. Fig. 9B representerer en lignende struktur bortsett fra at probe DNA molekylene har fått en hale med heterologt DNA (Gonda et al.). Slike haler kan tjene flere formål: (i) å lette RecA lading på små prober, (ii) å tilveiebringe et utvidelsesmolekyl for inkludering av merker i proben, f.eks. digoxigenin eller biotin, (iii) å tilveiebringe en innfangingssekvens; og (iv) å tilveiebringe en sekvens for hybridisering til et ytterligere reportermolekyl. Fig. 9C representerer situasjonen hvor det anvendes to prober som har en region av komplementær overlapping (d.v.s. en region hvor de er komplementære til hverandre) i tillegg til homologe terminale ekstensjoner (d.v.s. regioner komplementære til mål DNA men ikke til den andre probe). Fig. 9D representerer situasjonen hvor det anvendes to prober som har en region med komplementær overlapping i tillegg til heterologe terminale ekstensjoner (d.v.s. regioner som ikke er komplementære til mål DNA og den andre probe). Fig. 9F viser en lignenede situasjon hvor heterologe terminale ekstensjoner er tilstede i både 5' og 3<1> endene av hver probetråd. Fig. 9G illustrerer situasjonen hvor de homologe haler er komplementære til hverandre, men ikke til mål DNA. ;Dobbel D-løkke strukurene behøver ikke å være sammensatt av bare to prober. For eksempel viser fig. 9E en dobbel D-løkke struktur dannet fra 5 separate probetråder: De interne probetråder har regioner av komplementær overlapping til mer enn en annen probetråd. Den totale region av komplementær overlapping er typisk 79 - 500 basepar, men som diskutert ovenfor kan denne region være mindre. ;Strukturene i fig. 9 illustrerer flere men ikke alle mulige kombinasjoner av probe og mål DNA som kan danne dobbel D-løkke strukturer som er stabile mot deproteinisering. Et felles trekk ved dobbelttrådete prober som skal anvendes i dobbel D-løkke reaksjoner, er en region av komplementær overlapping mellom probetrådene. ;Evnen til å danne stabile RecA protein katalyserte deproteiniserte dobbel D-løkke probe:mål komplekser på interne seter tillater spesifikk identifikasjon av homologe lineære DNA mål. Denne dobbel D-løkke reaksjon gir nye muligheter for hybridiseringsdiagnostikk. Denne assay gir de fordeler at forskjellig merkede komplementære probetråder kan anvendes i en enkelt reaksjon, og bare en liten målsekvens behøver å være kjent. ;Reassosiasjon av komplementære prober blir inhibert når det anvendes metnings-nivå av RecA protein (Bryant et al.). Reassosiasjon av slike prober reduseres også ved introduksjon av ATPyS som kofaktor i probebeleggingsreaksjonene. ;Som beskrevet ovenfor vil kompleksene ifølge den foreliggende oppfinnelse, som er dannet mellom de RecA proteinbelagte prober og mål DNA, være stabile mot deproteiniseringsreaksjoner (som beskrevet). I noen anvendelser kreves det imidlertid ikke fjerning av RecA protein fra kompleksene for å praktisere anvendelsen. I slike tilfeller er den eneste begrensning at de gjenværende proteinmolekyler ikke interfererer med anvendelsen (f.eks. se avsnitt F nedenfor). ;A. Mål DNA. ;Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes til å diagnos-tisere smittsom sykdom som forårsakes av organismer i kliniske prøver. Disse organismer kan diagnostiseres ved påvisning av spesifikk DNA som er karakte-ristisk for den kausative organisme. Slike organismer omfatter følgende: Bakterier, som Salmonella, Neisseria, Chlamydia, Shigella og Streptomyces; virus, som Herpes simplex virus-1 (HSV-1), herpes simplex virus-2 (HSV-2), og adenovirus, alle dobbelttrådete DNA virus; parasitter, som Plasmodium og Giardia; og mycoplasma, som Mycoplasma pneumonia, M. genitalium og Pneumocystis. ;For en hvilken som helst diagnostisk assay blir det valgt probesekvenser til en kjent homologiregion i mål DNA. Mål DNA kan fremstilles fra flere forskjellige kilder ved standard teknikk: F.eks. vandige løsninger, pattedyrvev, dyrkede celler, plantevev, bakterier, gjær, blod og blodkomponenter (Ausubel et al.; Maniatis et al.; Sambrook et al.: Davis et al.: Fey; Strickler et al.; Kingston; Wachsmuth). ;Generelt kan påvisningsmetodene ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes til påvisning av dupleks DNA i en hvilken som helst nukleinsyreprøve. Anvendelser forskjellige fra klinisk diagnose av smittsom sykdom omfatter (i) screening av dyrkede pattedyrceller for tilstedeværelse av forurensninger, slik som mycoplasma (Zlvin et al), (ii) diagnose av visse genetiske sykdommer forårsaket av spesifikke del esj oner/-mutasj oner, innskudd eller rearrangement i pattedyr DNA, slik som a-thalassemia, (3-thalassemia, eller kronisk myelocytisk leukemi og (iii) hybridiseringsprober for å skille mellom tilstedeværelse eller fravær av en gitt målsekvens i et dupleks DNA molekyl. ;B. Bruk av en dobbel D-løkke struktur for diagnostisk anvendelse. ;Fig. 10 illustrerer flere utførelser av anvendelsen av en dobbel D-løkke struktur for isolering og identifikasjon av korresponderende sekvenser i duplekse DNA mål. En probe kan merkes med en innfangingsgruppe (f.eks. slik det ble gjort med biotin i eksempel 7). Den andre proben merkes deretter med en påvisningsgruppe, som f.eks. en radioaktiv merking, biotin, eller digoksigenin eller andre modifiserte baser. Probene belegges og hybridiseres til den nukleinsyreprøve som blir testet for tilstedeværelse av målsekvensen. Hybridiseringsreaksjonene kan deproteiniseres eller anvendes direkte. ;Proben som er merket med innfangningsgruppen blir innfanget. Denne innfanging kan gjennomføres ved f.eks. å merke proben med en biotingruppe og eksponere reaksjonsblandingen for streptavidin som er blitt bundet til en fast bærer. Alternativt kan innfangingsgruppen være digoksigenin, og innfangingen gjennomføres ved anvendelse av et anti-digoksigenin antistoff bundet til en fast bærer. Ytterligere grupper kan beleilig knyttes til endene av DNA molekylene som følger. Oligonukleotidproben kombineres med digoksigenin-11-dUTP (en analog av dTTP, 2'-deoksy-uridin-5'-trifosfat, koblet til digoksigenin via en 11-atom spacer arm, Boehringer Mannheim, Indianapolis IN) og terminal deoksynukleotidyl transferase (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Antallet dig-ll-dUTP-grupper inkorporert ved anvendelse av denne fremgangsmåte syntes å være mindre enn 5 (sannsynligvis bare 1 eller 2). Alternativt kan dig-11-dUTP gruppene inkorporeres i oligonukleotid sekvensen av en probe som med biotin. ;Typisk anvendes følgende kombinasjoner av dobbelttrådete prober i innfangings påvisningssystemet: (i) først probe/innfanging, merket med biotin eller digoksigenin, deretter probe/påvisning, radiomerket; (ii) først probe/innfanging, merket med biotin, deretter probe/påvisning, merket med digoksigenin; eller (iii) først probe/innfanging, merket med digoksigenin, deretter probe/påvisning, merket med biotin. ;En beleilig fremgangsmåte til kompleksbinding av innfanget DNA er anvendelsen av streptavidin-konjugerte superparamagnetiske polystyrenkuler som beskrevet i eksempel 7. Etter innfanging av DNA kan kulene gjenvinnes ved å plassere reaksjonsrørene i et magnetfelt. ;Alternativt kan det anvendes avidinbelagte agarosekuler. Biotinylerte agarosekuler (immobilisert D-biotin, Pierce) blir bundet til avidin. Avidin, i likhet med streptavidin, har fire bindingsseter for biotin. Et av disse bindingsseter anvendes til å binde avidinet til biotinet som er koblet til agarosekulene via en 16 atom spacer arm: De andre biotin bindingsseter blir fremdeles tilgjengelige. Kulene blir blandet med hybridiseringskomplekser for å fange inn biotinylert DNA (eksemple 7). Alternative fremgangsmåter (Harlow et al.) til kuleinnfangingsmetodene nettopp beskrevet, omfatter følgende streptavidinylerte eller avidinylerte bærere: Lav protein bindingsfiltere, eller 96-brønners plater, eller modifiserte biotin innfangingsmetoder som f.eks. iminobiotin (Rigas, B., et al.). ;For hvilken som helst av kulemetodene ovenfor blir kulene isolert, og mengden av hybridiseringskompleks som er blitt innfanget, blir kvantifisert. Kvantifise-ringsmetoden avhenger av hvordan DNA proben av den andre tråd er blitt fremstilt. Dersom den andre probe er radioaktivt merket, kan kulene telles i en scintillasjonsteller. Alternativt kan det innfangede DNA påvises ved anvendelse av et kjemiluminiserende, fluoriserende eller kolorimetrisk påvisningssystem. ;Mange av eksperimentene beskrevet ovenfor har gjort anvendelse av radio-merkede oligonukleotider: Eksempel 7 kombinerer anvendelse av en biotinmerket første probe med en radioaktivt merket andre probe. Teknikkene som involveres i radiomerking av oligonukleotider, er diskutert ovenfor. En spesifikk aktivitet på IO<8 >cpm pr. ug DNA oppnås rutinemessig ved anvendelse av standard metoder (f.eks. ende-merking av oligonukleotidet med adenosin ;[y-<32>P]-5' trifosfat og T4 polynukleotid kinase). Dette nivå av spesifikk aktivitet tillater måling av små mengder DNA enten ved autoradiografi av geler eller filtere eksponert på film eller ved direkte telling av prøven i scintillasjonsfluid. ;Radiomerking og kjemoluminiscens (i) er svært sensitive, og tillater påvisning av sub-femtomol kvantiteter av oligonukleotid, og (ii) anvender vel etablerte teknikker. Når det gjelder kjemoluminiserende påvisning, er det blitt laget protokoller for å tilpasse kravene til en masse-screening assay. Ikke-isotopiske DNA påvisningsteknikker har i prinsippet inkorporert alkalisk fosfatase som den påvisbare merking, gitt enzymets evne til å gi høy omsetning av substrat til produkt og tilgjengeligheten av substrater som gir kjemoluminiserende eller fargede produkter. ;For kjemoluminiserende påvisning kan biotinylerte eller digoksigenin-merkede oligonukleotidprøver påvises ved anvendelse av det kjemoluminiserende påvisningssystem "SOUTHERN LIGHTS", utviklet av Tropix, Inc. Basisteknikken kan anvendes til påvisning av DNA som er blitt innfanget på enten kuler, filtere eller i løsning. ;Alkalisk fosfatase blir koblet til det innfangede DNA kompleks. For å gjøre dette kan det anvendes flere fremgangsmåter, avledet fra de vanlige anvendte ELISA teknikker (Harlow et al.; Pierce, Rockford IL). F.eks. kan den andre tråd DNA probe endemerkes med dikoksigenin-11-dUTP (dig-11-dUTP) og terminal transferase (som beskrevet ovenfor). Etter at DNA er innfanget og fjernet fra hybridiseringsblandingen, blir et antidigoksigenin alkalisk fosfatase-konjugert antistoff deretter omsatt (Boehringer Mannheim, Indianapolis IN) med det digoksigenin-holdige oligonukleotide. Den antigene digoksigenin gruppen blir gjenkjent av antistoff-enzym konjugatet. ;Innfangede dNA hybridiseringsprodukter blir påvist ved anvendelse av de alkalisk fosfatase-konjugerte antistoffer til digoksigenin som følger: Et kjemoluminiserende substrat for alkalisk fosfatase er 3-(2'-spiroadamantan)-4-metoksy-4-(3'fosforyloksy) fenyl-l,2-dioksetan dinatriumsalt (AMPPD). Defosforylering av AMPPD fører til en ustabil forbindelse som spaltes under avgivelse av en forlenget, stabil emisjon av lys ved 477 nm. Lysmålingen er svært sensitiv og kan påvise svært små DNA mengder (f.eks. IO<2->IO<3>attomol). ;Kolorimetriske substrater for alkalisk fosfatase systemet er også blitt testet. Selv om de kolorimetriske substrater kan anvendes, er bruken av lysemisjonssystemet mer følsom. ;Et alternativ til biotininnfangingssystemet ovenfor er å anvende digoksigenin istedenfor biotin til modifisering av den første tråd probe: Biotin anvendes deretter til å erstatte digoksigenin-gruppene i det ovenfor beskrevne påvisningssystem. I dette arrangement anvendes anti-digoksigenin antistoffet til innfanging av DNA hybridiseringskomplekset. Streptavidin konjugert til alkalisk fosfatase anvendes deretter til påvisning av tilstedeværelsen av innfangede oligonukleotider. ;Andre alternative innfangingssystemer omfatter følgende: (i) Anvendelse av et DNA bindende protein og dets beslektede bindingssekvens, hvor den beslektede bindingssekvens er den innfangingsgruppen som er innbefattet som en 5' terminal sekvens i den første tråd probe (Kemp et al.); og (ii) anvendelsen av hybridi-seringsinnfanging hvor en ikke-mål-komplementær DNA sekvens, som f.eks. poly(T), blir inkorporert som en 5'terminal sekvens i den første tråd probe, og en komplementær nukleinsyre, som f.eks. poly(A), blir anvendt til innfanging av proben og assosiert nukleinsyre ved hybridisering. Hvilken som helst av disse to fremgangsmåter kan anvendes i forbindelse med en fast bærer. ;Et annet alternativt system er å feste en probe til en membran, (Saiki et al.), belegge proben, tilsette mål og den andre belagte probe, deproteinisere, vaske og påvise. Fig. 10 illustrerer flere arrangementer for påvisning av en dobbel D-løkke struktur. Fig. 10A viser en probetråd merket med en innfangningsgruppe, slik som biotin, og den andre probetråd merket med en påvisningsgruppe som f.eks. digoksigenin. Fig. 10B viser en probetråd merket med en innfangningsgruppe som f.eks. digoksigenin, og den andre probetråd som har en homolog haleforlengelse som er merket med sammensatte påvisningsgrupper slik som biotin. Fig. 10C illustrerer tilsetning av påvisningsgrupper (eller innfangningsgrupper) til heterologe haler knyttet til hvilken som helst og/eller begge tråder av den dobbelttrådete probe. C. Anvendelse av sammensatte dobbel D-løkke strukturer for diagnostiske anvendelser. ;I tillegg til å utnytte komplekser med en dobbel D-løkke struktur i innfang-nings/påvisningssystemer, kan det likeså anvendes sammensatte dobbel D-løkke strukturer. I tilfeller hvor reassosiasjon av probetråder kan være et problem, f.eks. med større prober, vil anvendelse av sammensatte dobbel D-løkke strukturer gi redusert bakgrunn. I denne fremgangsmåte må to eller flere sekvenser være kjent i målsekvensen. ;Fig. 11 illustrerer flere arrangementer for påvisning basert på to dobbel D-løkke strukturer. Fig. 1 IA viser et eksempel på merking av begge tråder i en første dupleks probe med innfangningsgruppen, og begge tråder i en andre dupleks probe med en rapporterende/påvisningsgruppe. Innfangningsgruppen kan inneholdes i enten en eller begge tråder av det første probesett. I dette system blir hybridiseringskompleksene innfanget som beskrevet ovenfor, men reassosiasjon av trådene av den første dupleks probe danner imidlertid ingen bakgrunn for reaksjonen siden ingen av trådene inneholder en raportør/påvisningsgruppe. Etter innfangning blir hybridiseringskompleksene påvist på basis av tilstedeværelsen av den andre dupleks probe i hybridiseringskomplekset. Påvisning av raporteringsgruppen gjennomføres som beskrevet ovenfor. ;En andre utførelse av dette system, basert på tilstedeværelsen av sammensatte dobbel D-løkke strukturer i målkomplekset, er illustrert i fig. 1 IB. I dette tilfellet er bare en tråd av den første dupleks probe merket med innfangningsgruppen, og bare en tråd av den andre dupleks probe er merket med raporteringsgruppen. ;Som beskrevet ovenfor for påvisning av en dobbel D-løkke struktur, kan det tilsettes heterologe haler og sekvenser som er homologe med mål DNA til dupleks probene. D. Anvendelse av dobbel D-løkke strukturer i RecA protein befordrede DNA oppformeringsreaksjoner. ;Det er beskrevet DNA oppformeringsreaksjoner som overveiende beror på termisk denaturering (Mullis; Mullis et al.; Scharf et al.) for separasjon av tråder til forberedelse av fortsatt oppformering. Nedenfor er det beskrevet to påvisningssystemer basert på DNA oppformering etter dannelse av enkle eller sammensatte doble D-løkker. ;(i)En oppformerings/påvisningsmetode ifølge den foreliggende oppfinnelse anvender sammensatte dobbel D-løkke strukturer til å befordre oppformering uten behov for termisk denaturering. Eksperimenter gjennomført til støtte for den foreliggende oppfinnelse har vist at anvendelse av to par komplementære DNA primere, som er homologe med forskjellige regioner av det dobbelttrådete mål, i hybridiseringsreaksjonene ifølge den foreliggende oppfinnelse, fører til dannelse av to doble D-løkker i mål DNA. Disse doble D-løkker flankerer og definerer en bestemt region av DNA på et naturlig dupleks mål (fig. 12A): DL801/2 og DL803/4 (tabell 1) er eksempler på prober/primere som kan delta i denne reaksjon. ;Den resulterende DNA målstruktur kan gjenkjennes av forskjellige DNA polymeraser som substrat for DNA syntese. Et eksempel på en slik oppformeringsreaksjon er gitt i eksempel 8. Substratet for oppformeringsreaksjonen beskrevet i eksempel 8 er lambda DNA genomet. Primerne definerer en målregion på ca. 500 bp. Typisk vil oppformeringsreaksjonene inneholde DNA polymerase (f.eks. Klenow fragmentet), RecA protein belagte primere, ATPyS (eller rATP (alene eller i nærvær av et regenereringssystem), dATP, GTPyS, og blandinger av ATPyS og rATP eller ATPyS og ADP), målsubstratet, nødvendige kofaktorer og alle fire dNTPer (innbefattet modifiserte og merkede dNTPer). Disse reaksjoner kan også inneholde DNA helikase, topoisomerase eller andre lignende DNA utkvei-lingsmidler og/eller andre DNA polymeraser. ;Disse reaksjonsbetingelser favoriserer utvidelse av primerne i sine 3' ender med påfølgende primerforlengelse i 5' til 3' retningen. 3' endeutvidelsen av to eller flere av de fire DNA primere i strukturen ved polymerase definerer regionene av DNA mål oppformering mellom DNA primere (se fig. 13). DNA polymerase utvidelse av de andre to primere kan også foregå i deres 3'-ender, dersom disse ikke er kjemisk eller fysisk blokkert til å begrense DNA oppformering til en definert region (eksempel 8). ;DNA polymeraser som katalyserer 3'-utvidelse mellom primerpar kan fortrenge primere på den samme tråd, eller alternativt kan nye syntefiserte produkter ligeres til primeren med DNA ligase, innbefattet termoresistente eller termosensitive DNA ligaser, (Epicentre Technologies, Madison, WI). Replikasjon kan også befordres ved tilsetning av egnet DNA helikase, topoisomerase, enkelttrådbindende proteiner (SSB) gen 32 (eller andre lignende) proteiner, eller RecBCD-innkodede enzymer eller andre proteiner, hvorav noen har assosiert helikase aktiviteter. Eventuelle primere som er korrekt posisjonert med RecA protein kan anvendes for replikasjonsinitiering. ;Prober som anvendes i den todobbelte D-løkke RecA protein katalyserte DNA oppformering er typisk ca. 60 til 80 bp i størrelse. Likeså kan det anvendes større eller mindre prober, men det kan være nødvendig å modifisere reaksjonsbetingelsene, f.eks. inklusjon av stabiliserende peptider (f.eks. SSB eller gen 32 protein), medikamenter, antistoffer, polyaminer eller tverrbindingsreagenser. ;Sammensatte primere av forskjellige størrelser kan også anvendes. Primere kan også være homologe med mål DNA duplekset langs hele sin lengde, eller de kan inneholde ende- eller interne regioner med delvis ikke-homologi, som f.eks. heterologe haler (se ovenfor). Det eneste krav til disse primere er at de baser som anvendes for 3'-utvidelsen av det ønskede oppformeringsprodukt, er tilgjengelig til å prime eller påvirke DNA syntesen. Som beskrevet ovenfor kan primere også inneholde modifiserte fosfat hovedkjeder eller baser som f.eks. biotin eller digoksigenin eller tilknyttede funksjoner som f.eks. DNA modifiserende enzymer og kjemiske agenser. ;Reaksjon i nærvær av overskudd av RecA proteinbelagte primere tillater dannelse av nye sammensatte eller doble D-løkker på det nylig replikerte og oppformerte DNA. De RecA proteinbelagte primere tjener til å initiere ytterligere runder av DNA syntese, og på denne måte blir DNA målet oppformert uten behovet for termisk denaturering av mål DNA for å plassere oppformeringsprimerne. ;DNA oppformeringsreaksjoner kan anvende et hvilket som helst antall DNA polymeraser eller polymeraseblandinger, innbefattet følgende: Klenow stort fragment av E. coli DNA polymerase I; Tl; T4; og/eller andre virale eller cellulære DNA polymeraser og deres mutanter, f.eks. dobbel-Klenow mutant proteiner som ikke har noen eksonuklease aktivitet. ;DNA produktene av to-dobbelte D-løkke reaksjoner blir definert ved de anvendte DNA primere. De venstre og høyre primere til de doble D-løkke regioner som skal oppformeres, definerer 5'-endene av de nylig syntetiserte DNA oppformeringsprodukter. Når primerne ikke blir fortrengt kan det nylig syntetiserte DNA produkt ligeres i en RecA katalysert oppformeringsreaksjon som vist i fig. 12B. ;Ved anvendelse av sammensatte primersett er det også mulig å danne DNA oppformeringsprodukter som har kohesive ender. DNA produktene kan så hybridisere gjennom sine overlappende kohesive ender, og lengden av disse assosierte DNAer blir deretter utvidet (Haase et al.). Forlengelse av eksisterende tråder, fortrengningssyntese og RecA katalysert baseparring i de overlappende regioner kan øke utbyttet av store DNA mål. Dette kan være viktig for RecA katalysert DNA oppformering i celler in situ, som under visse betingelser (Haase et al.) kan kreve store DNA produkter eller tilknyttede grupper for retensjon in situ. ;Den doble D-løkke reaksjon, eller sammensatte doble D-løkker, kan dannes stabilt i agarose for in situ oppformeringsreaksjoner. Typisk vil agarosen være av den lavtsmeltende temperaturkvalitet, selv om blandinger av forskjellige typer agarose er mulig, og konsentrasjonen av agarose er ca. 0,4 - 1%. Under disse betingelser gir agarosegelen et restriktivt medium som også tillater retensjon av kortere DNA produkter: Dette er særlig nyttig ved in situ reaksjoner (se nedenfor). ;Den RecA-befordrede DNA oppformeringsreaksjon kan utføres ved 37°C samt ved forhøyede temperaturer som er under den termiske denatureringstemperatur for mål ;DNA dupleks eller primenmål hybrider, f.eks. 50 - 60°C. Anvendelse av forhøyede temperaturer i disse reaksjoner vil utvide repertoaret av enzymer som er tilgjengelige for primerekstensjonen, og kan tillate syntese av lengre områder av DNA. Temperaturen for oppformeringsreaksjonen vil bestemme valget av reaksjonskomponenter: F.eks. blir villtypen av E. coli RecA-protein belagte prober tilsatt til mål DNA ved 37 - 39°C , DNA syntesen gjennomføres deretter ved 50 - 55°C med Thermus aquaticus DNA polymerase, reaksjonstemperaturen nedsettes deretter til 37 - 39°C og RecA-protein belagte prober blir tilsatt på nytt. Alternativt kan temperaturresistente RecA-lignende proteiner ved høye temperaturer erstatte villtype E. coli RecA proteinet (som diskutert i samtidig verserende, sameiede US søknad serie nr. 07/520.321). ;Den to-dobbelte D-løkke reaksjon, eller den sammensatte doble D-løkke reaksjon som anvender RecA protein-katalysert primerplassering for DNA oppformeringsreaksjoner har viktige diagnostiske anvendelser for DNA påvisning og- oppformering i løsningsdiagnostikken eller in situ diagnostikken. ;ii)En andre påvisningsmetode som utnytter den doble D-løkke og DNA oppformering, anvender polymerasetilsetning av merkede eller modifiserte dNTPer for signalforsterkning. Utvidelse av 3'-enden av en primer i en enkelt (trippeltrådet) D-løkkestruktur ved anvendelse av DNA polymerase ble demonstrert av Cheng et al. (1988). Etter dannelse av en enkelt dobbel D-løkke i et mål DNA molekyl, blir DNA polymerase, nødvendige kofaktorer, og alle fire dNTPer tilsatt til reaksjonen. Trådutvidelse finner sted fra 3'-endene av enten en eller begge probetråder av den dobbelttrådete probe (fig. 13A). Alternativt kan 3'-enden av tråden som inneholder innfangningsgruppen blokkeres for å forhindre primerutvidelse. En eller flere av dNTPene er merket for påvisning ved en standard metode (f.eks. biotin, digoksigenin, eller fluoriserende eller radioaktive grupper). Inkorporering av den merkede dNTP ører til forsterkning av påvisningssignalet. ;Denne fremgangsmåte kan videre utnyttes ved anvendelse av sammensatte dobbel D-løkke strukturer for å oppsøke regionen av interesse (som beskrevet ovenfor). 3'-endene av de dobbelttrådete primere som er eksterne til målregionen, kan enten være blokkert (som illustrert i fig. 13B med en stjerne) eller ikke. Denne fremgangsmåte for signalforsterkning kan ytterligere forbedres ved anvendelse av sammensatte runder av RecA-befordret oppformering, som beskrevet ovenfor, i nærvær av en merket gruppe. ;Målpåvisning med signalforsterkning kan også gjennomføres som følger: ;Det dannes en dobbel D-løkke ved målsekvensen ved anvendelse av to probetråder, hvor minst en av trådene inneholder en innfangningsgruppe. Det resulterende dobbel D-løkke kompleks kan deproteiniseres og innfanges ved å bringe innfangningsgruppen i kontakt med et innfangningsmedium. Det innfangede kompleks blir frigjort ved oppvarming: Komplekset kan frigjøres enten som dsDNA eller ssDNA. Om nødvendig, f.eks. dersom komplekset blir frigjort som dsDNA, blir komplekset denaturert og mål DNA frigjort. Til denne blanding tilsettes DNA synteseprimere som er komplementære til en målsekvens. Disse primere inneholder ikke sekvenser som var tilstede i den opprinnelige dobbelttrådete probe. DNA polymerase og dNTPer blir så tilsatt under de hensiktsmessige bufferbetingelser for å syntifisere DNA fra de hybridiserte primere. Denne primerledede templatsyntese kan utføres i nærvær av merkede dNTPer, f.eks. radiomerkede dNTPer, biotinmerkede dNTPer, FITC-merkede dNTPer, eller andre hensiktsmessig merkede DNA forløpere. Inklusjon av merke tillater målpåvisning via de egnede påvisningssystemer, som f.eks. et fluorometer i tilfelle FITC-merkede dNPer. ;E. Anvendelse av doble D-løkke strukturer ved RecA protein befordret in situ hybridisering. ;En annen påvisningsmetode som anvender den doble D-løkke struktur er in situ hybridisering med fikserte celler (eksempel 9): RecA befordret in situ hybridi-seringsmetoder er beskrevet i sameiet PCT Internasjonal Publikasjon nr. ;WO 93/05177 "In situ Hybridization Method", publisert 18. mars 1993. In situ hybridisering av RecA proteinbelagte dupleks prober gir evne til å lokalisere en målsekvens i en isolert, fiksert biologisk struktur eller i en kjerne eller et kjernevolum i forhold til andre målsøkte sekvenser og/eller kjernemembranen, ved anvendelse av et konfokalt laser scanning mikroskop (van Dekken et al.). ;En anvendelse av in situ metoden er beskrevet i eksempel 9D. I denne fremgangsmåte blir HEp-2 kjerner som deler seg, fiksert og probet med RecA/- kromosom-/X alfa satelitt DNA probe komplekset, og merket med FITC-avidin. Mønsteret for probebinding i kjernen som deler seg, blir evaluert ved anvendelse av standard lysfluoressens eller laser scanning mikroskop teknikk. For å lokalisere den bundne probe blir det samme felt undersøkt ved fasekontrast mikroskopi uten å forandre linsens fokus. Ved å legge de resulterende to fotomikrografier oppå hverandre kan man se den relative plassering av kjernemembranen og kjernedelingsplanet med hensyn til de probemerkede kromosomer. ;Dette trekk av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forenklede in situ fremgangsmåter for lokalisering av målsekvenser i en biologisk struktur. Typisk blir fikserte celler eller subcellulære strukturer probet i suspensjon eller på objektglass etterfulgt av strømningscytometrisk eller mikroskopisk analyse. Fremgangsmåten reduserer artefakter ved eliminering av behovet for et varmedenatureringstrinn, og tillater raskere og mer spesifikk påvisning av målsekvenser. Fremgangsmåten kan anvendes like godt på unike målsekvenser som på målsekvenser med lavt og/eller høyt antall kopier. ;I særdeleshet tillater fremgangsmåten påvisning av lavkopisekvenser uten kravet til først å oppformere sekvensene. Siden de fleste genkartleggings- og kromo-somstudier er ventet å involvere spesifikke, unike eller lavkopisekveser, gir den foreliggende in situ fremgangsmåte en viktig fordel for genkartleggingsstudier, samt for diagnostiske anvendelser som omfatter unike eller lavkopiantall av normale, mutante eller patogene sekvenser. Den foreliggende fremgangsmåte tillater også bestemmelse av kromosominnhold ved strømningscytometrisk analyse. ;En generell diagnostisk anvendelse av denne in situ fremgangsmåte er for anvendelse ved kartlegging av en utvalgt gen- eller regulatorsekvens i et kromosom og/eller i en bestemt region av kromosomet. Mål genet kan være et som (a) danner et utvalgt genprodukt, (b) mistenkes for å utføre en kritisk cellekontrollfunksjon, som f.eks. et celle- eller virus onkogen, (c) er relatert til en repeterende sekvens, (d) mistenkes for å inneholde en genetisk defekt som hindrer ekspresjon av et aktivt genprodukt, (e) kan være relatert i kromosomposisjonen til en markørproberegion med kjent kartposisjon, og/eller (f) kan representere en integrert virussekvens. ;Probetrådene for in situ hybridisering kan merkes på flere måter innbefattet direkte merking med fluorescerende grupper som fluoriscein-11-dUTP (BoehringerMannheim). Dessuten kan individuelle probetråder anvendes til å danne et koblet fluorescens-system hvor f.eks. emisjonsenergien av en fluorescerende gruppe, inkorporert i en tråd, emiterer lys ved eksitasjonsenergien for den andre fluoriserende gruppe, inkorporert i den andre probetråd. Et slikt koblet fluor-escenssystem har fordelen ved nærheten til probetrådene i det doble D-løkke kompleks. ;Når DNA probene er rettet mot bestemte cellulære patogener, typisk for påvisning av tilstedeværelsen av et virus- eller bakteriepatogen i en infisert celle, kan de fikserte merkede celler undersøkes ved lys- eller ved fluoressensmikroskopi for å påvise og lokalisere infiserende patogener i celler. Alternativt kan celleinfeksjon, og prosent celler infisert, bestemmes ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) etter in situ hybridisering av RecA protein belagte dupleksprober til kjerner eller celler i suspensjon (Trask et al.). ;F. Anvendelse av dobbel D-løkke strukturer i påvisnigssystemer basert på restriksjonsenzymspalting. ;Dobbel D-løkke strukturene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes til påvisning av tilstedeværelsen av mål DNA i en prøve ved innføring av forandringer i mål/dobbel D-løkke komplekset som, på en påvisbar måte, modifiserer responsen for dette kompleks på restriksjonsenzymspalting. Flere eksempler på slike påvisningssystemer er beskrevet nedenfor. En fremgangsmåte for påvisning som utnytter dobbel D-løkke og restriksjonsenzymspalting er som følger: Det velges en region i mål DNA som den dobbelttrådete probesekvens. Denne probesekvens modifiseres til å inneholde et internt restriksjonssete som ikke er tilstede i mål DNA. Et slikt restriksjonssete kan velges slik at det minimaliserer basepar misstilpasning mellom målet og proben (fig. 14). Den doble D-løkke blir så dannet og kompleksene deproteinisert. Kompleksene blir så innfanget på den faste bærer og spaltet med det restriksjonsenzym for hvilket dette sete er blitt innført i probesekvensen (i fig 14A, PvuII). Alternativt kan kompleksene spaltes med restriksjonsendonukleasen før innfanging (fig. 14B). Siden dette PvuII restriksjonssete ikke blir rekonstituert når proben hybridiseres til målsekvensen, vil restriksjonsenzym et spalte bare renaturerte probe: probekomplekser, ikke probe:mål komplekser. Den faste bærer blir vasket og undersøkt for tilstedeværelsen av påvisningsgruppen. Denne fremgangsmåte tillater reduksjon av eventuelt bakgrunnssignal som kan dannes ved probe renaturering. ;En andre påvisningsfremgangsmåte arbeider etter et lignende prinsipp. I denne fremgangsmåte blir mål DNA demetylert, og det dobbelttrådete probe DNA blir metylert før RecA proteinbeleggingen. Dobbel D-løkke komplekset blir dannet, komplekset innfanget og deproteinisert. Prøven spaltes deretter med f.eks. Dpnl som spalter dets gjenkjenningssete (SEQ ID nr. 2) bare når A-resten på begge tråder er metylert. Siden det metylerte restriksjonssete ikke blir dannet når proben hybridiserer til målsekvensen, vil Dpnl spaltingen foregå bare når probene er renaturert. Den faste bærer blir vasket og undersøkt for tilstedeværelsen av påvisningsgruppen. Som ovenfor vil denne fremgangsmåte også tillate reduksjon av eventuelle bakgrunnssignaler som dannes ved probe renatureringen. ;Metyleringstilstanden for DNA kan også utnyttes ved anvendelse av mål/dobbel D-løkke kompleksene som følger. I denne fremgangsmåte blir enten mål DNA metylert eller den dobbelttrådete probe blir metylert ført RecA proteinbelegging. Dobbel D-løkke komplekset blir dannet, komplekset innfanget og deproteinisert. De innfangede komplekser kan isoleres fra den faste bærer og splittes opp i flere prøver. En prøve blir spaltet med et metylasesensitivt eller metylaseavhengig restriksjonsenzym, og en annen blir spaltet med et metylaseinsensitivt restriksjonsenzym: F.eks. vil Mbol ikke spalte DNA når A-resten er metylert og Sau3 A I spalter det samme restriksjonssete uavhengig av A-restens metyleringstilstand. ;Disse prøver kan så størrelsesfraksjoneres (f.eks. på en agarose- eller akrylamid gel, eller ved HPLC) og båndingsmønstre for prøvene sammenlignes. Denne fremgagsmåte tillater isolering og påfølgende undersøkelse av restriksjonsfragment lengde polymorfisme for et valgt fragment mellom flere prøver fra forskjellige kilder. ;Metylering kan også anvendes til å beskytte et bestemt restriksjonsenzymsete mot spalting (Nelson et al.). Dersom det f.eks. var ønskelig å isolere et Mbol fragment som spenner over en bestemt region, men det internt til regionen eksisterte et Mbol sete, kunne fragmentet isoleres som følger. Det dannes en dobbel D-løkke struktur i det interne restriksjonssete i mål DNA ved anvendelse av metylerte prober. Mål/dobbel D-løkke komplekset blir deproteinisert, spaltet med Mbol og innfanget (fig. 15A). Denne fremgangsmåte kan anvendes til (i) å undersøke restriksjonsenzym polymorfisme i restriksjonssetes nærliggende til det beskyttede sete i fragmenter oppnådd fra forskjellige kilder, eller (ii) å innfange og klone en ønsket sekvens ved anvendelse av et restriksjonsenzym selv om et internt spaltesete er tilstede for dette enzym. Det faktum at deproteiniserte dobbel D-løkke strukturer er mottakelige for restriksjonsenzymspalting er blitt vist ved Plei restriksjonsendonuklease sete-spesifikk spalting av probe:mål komplekser dannet med 500-mere prober og 2,9-kb homologe målfragmenter. ;De dobbelttrådete RecA proteinbelagte prober kan selv anvendes til å beskytte et bestemt restriksjons enzyms ete mot spalting. I dette tilfelle blir komplekset ikke deproteinisert. Mål/dobbel D-løkke komplekset blir spaltet med restriksjonsendonukleasen og innfanget (fig. 15B). Alternativt kan de dobbelttrådete RecA proteinbelagte prober anvendes til å beskytte et modifikasjonssete, f.eks. et metyleringssete, mot modifisering. I dette tilfelle, som for den ovennevnte restriksjonssetebeskyttelse, blir komplekset ikke deproteinisert. Mål/dobbel D-løkke komplekset blir behandlet med modifiseringsreagenset og deretter deproteinisert. Modifikasjonsmålseter innenfor mål/dobbel D-løkke komplekset er beskyttet og mangler modifikasjonen. ;Evnen til å blokkere restriksj onssetespalting kan anvendes ved genomkartlegging. Dersom f.eks. mål DNA definerer en kjent region i genomet, som Pvul setet på ca. 26,3 kb på lambda genomet, blir det kjente sete beskyttet ved en av de metoder som er beskrevet ovenfor. Ubeskyttet og beskyttet lambda genomisk DNA blir spaltet med Pvul. Forandringen i restriksjonsfragment mønstre mellom de to spaltinger gjør det mulig å utlede hvilke fragmenter som er nær til hverandre - basert på forsvinningen av bånd og størrelsen av de nye bånd i prøven som inneholder blokkerte restriksj onsseter. ;Restriksjonsenzymer og deres respons på metyleringstilstander er vanlig tilgjengelige, og betingelser for deres anvendelse er vel kjent i teknologien (Ausubel et al.; Maniatis et al.). ;G. Anvendelse av doble D-løkker til å fremkalle setespesifikk ;spalting i DNA. ;Oligonukleotider er blitt anvendt til å lede skjæremidler til spesifikke enkelttrådete og dobbelttrådete nukleinsyreseter (Corey et al.; Dreyer, G.B. et al.; Moser, et al.), en fordel ved oligonukleotidrettet spalting er at forskeren ikke lenger er avhengig av eksisterende spaltingsfunksjoner: En hvilken som helst ønsket DNA spaltingsfunksjon kan være skreddersydd. De RecA proteinbelagte dobbelttrådete prober ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes til å danne setespesifikk spalting på flere måter. F.eks. blir det valgt en spesifikk målsekvens, og en dobbelttrådet DNA probe tilsvarende den valgte sekvens blir dannet. En EDTA gruppe blir knyttet til en eller begge tråder i oligonukleotid- proben. En fremgangsmåte for binding av EDTA til et oligodeoksynukleotid via C-5 i tymidin er beskrevet av Dreyer et al. Proben kan deretter RecA proteinbelegges og dobbel D-løkke komplekset dannes med mål DNA. Spalting foregår i nærvær av oksygen etter tilsetting av Fe(II) og et reduksjonsmiddel (vanligvis DTT) til EDTA probe:mål hybridene. ;Alternativt kan kuttingen gjennomføres ved anvendelse av peptidfragmenter avledet fra DNA-bindende/spaltede proteiner (Sluka, J.P. et al.) som er bundet til oligonukleotidprobene. Videre vil restriksjonsendonukleaser som har hyppige kutteseter eller relativt ikke-spesifikke fosfodiesteraser, slik som stafilokokk-nuklease, kunne bindes til et oligonukleotid under dannelse av et hybrid katalytisk middel som har øket sekvensspesifisetet (Cory et al.). ;Oligonukleotider blir bundet til fosfodiesterasen eller et annet spaltemiddel enten før RecA-proteinbeleggingen eller etter dobbel D-løkke kompleksdannelsen og deproteiniseringen. Etter sammenvinningen av fosfodiesterasen, nukleasen eller peptidet med dobbel D-løkke komplekset, blir reaksjonsbetingelsene modifisert for å tillate hydrolyse av begge mål-DNA-tråder på en setespesifikk måte. Avhengig av aktiviteten av det katalytiske middel blir enten en eller begge tråder i den dobbelttrådete probe modifisert til å inneholde midlet. ;H. Anvendelse av dobbel D-løkke ved anrikning av DNA. ;Dobbel D-løkke hybridiseringskomplekset ifølge den foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for separasjon og anrikning av utvalgte mål-DNA-sekvenser. F.eks. kan det dannes en dobbelttrådet probe inneholdende en innfangingsgruppe i en eller begge av probetrådene. Dobbel D-løkke komplekset blir dannet mellom den dobbelttrådete probe og mål-DNA som inneholdes i en blanding av DNA. Dobbel D-løkke kompleksene som inneholder proben og målsekvensen blir deretter adskilt fra reaksjonsblandingen ved anvendelse av innfangingsgruppen, ved f.eks. binding til en fast bærer. Komplekset kan deretter dissosieres ved oppvarming for å frigjøre målduplekset fra bæreren, og om nødvendig kan det frigjorte DNA renatureres under nydanning av de opprinnelige mål dupleks DNA. Alternativt kan hele dobbel D-løkke komplekset ganske enkelt avgis fra den faste bærer. ;For å teste hvorvidt det målsøkte dupleks DNA kunne frigjøres fra hybridene ganske enkelt ved oppvarming, undersøkte man den termiske stabilitet av deproteiniserte dobbel D-løkke hybrider dannet med P-endemerket 500-mer prober og det 10,1 kb Apal målfragment: hybridene var fullstendig stabile ved 75°C i 1XTBE buffer. Ca. halvparten av DNA-probetrådene ble frigjort ved 80°C. I alt vesentlig alle DNA-probetrådene ble frigjort fra målet ved 85°C. Denne smelteprofil er i likhet med den for dupleks probe: mål hybrider dannet ved oppvarming og deretter langsom avkjøling av reaktantblandingen i fravær av RecA-protein. Hybridsmelteprofilen var ca. 10°C lavere enn den for dupleks 500-mer probe, selvsammenføyet, under identiske ionebetingelser. ;Hybridiseringsreaksjonen er potensielt anvendbar for målsøking av kromosomale eller genfragmenter identifisert bare ved sekvensmerkede seter (STSer (Olson & al.) av følgende grunner: (i) den RecA medierte hybridiseringsreaksjon krever ikke denaturering av dupleks DNA-målet for hybriddannelse, og (ii) målene blir frigjort fra isolerte hybrider i oppvarming til en temperatur som dissosierer proben fra probe:mål komplekset men som ikke denaturerer den dupleksmålholdige analytt, f.eks. et kromosomalt eller genholdig fragment. Mål-DNA-analytten kan deretter gjenvinnes i dupleksform. ;Videre vil omhyggelig kontroll av hybridsmeltetemperaturen tillate en seleksjon mot de hybrider som kan ha bare delvis homologi med proben. Stringent valg av smeltetemperatur kan være viktig når det anvendes prober med komplekse blandinger av mål-DNA. En fordel ved gjenvinning av dupleks mål-DNA sammenlignet med enkelttrådet denaturert mål-DNA er at dupleks DNA har tendens til å være mer resistent mot skjærkrefter enn fullstendig denaturert enkelttrådet DNA. Gjenvinning av dupleksmål-DNA, ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, ville tillate anrikning og isolering av bestemte dupleks gen- eller genomsegmenter, innbefattet store kromosomfragmenter, som deretter kan anvendes for ytterligere manipulering og/eller analyse. ;Mål-DNA-duplekser som oppnås ved denne fremgangsmåte, kan anvendes ved DNA-oppformeirngsreaksjoner (Mullis; Mullis et al.) eller i standard klonings-teknikker (Ausubel et al.; Maniatis et al.). ;I. Homogen diagnostisk assay ;En protokoll for en homogen diagnostisk assay som kan påvise et spesifikt naturlig mål-DNA-dupleks er blitt testet. Denne assay involverer dobbelttrådet målinnfanging ved anvendelse av dobbel D-løkke hybrider etterfulgt av DNA-signalamplifikasjon, som kort beskrevet nedenfor. ;(i) Innfanging av dobbelttrådete DNA-mål. ;Det kan utarbeides en teknikk for anvendelse av dobbel D-løkke hybrider for spesifikk innfanging av et stort dobbelttrådet DNA slik som lambda DNA-genom (-50 kb). Reaksjonen kan også anvendes for innfanging av mindre dupleks DNA-mål. Teknikken anvender RecA-belagte enkelt-trådete prober merket med en innfangingsgruppe som f.eks. biotin, med en gjennomsnittlig størrelse på fortrinnsvis 300-500 baser. Det blir foretrukket at alle DNA-prober er homologe med sekvenser innenfor en region på fortrinnsvis ca. 1000 baser av det duplekse DNA-mål. De biotinylerte prober fremstilles ved nick-translatering av et fortrinnsvis ca. 1000 bp DNA-dupleksfragment i fravær av bio-14-dATP. Varmedenaturert probe DNA belegges med RecA-protein og omsettes deretter med dupleks mål-DNA. Etter probe:mål hybriddannelse kan hybridiseringsreaksjonen stanses, f.eks. med 20 mM EDTA og behandles med 0,5 M salt, og hybrider kan innfanges på vaskede magnetiske Dynabeads<®> M-280 Streptavidin (Dynal). Etter innfanging blir kulene vasket tre ganger i buffer inneholdende 1 M salt. Det er sannsynlig at de høye saltbetingelser i alle fall delvis fjernet en andel av det bundne RecA-protein. Mål-DNA-innfanging kan måles ved anvendelse av <32>P-merket lambda DNA og ved direkte telling av den radioaktivitet som holder seg bundet til kulene etter vaskingen. Resultatene av innfangingsreaksjonen ved anvendelse av et stort lambda DNA-genom (-50 kb) er vist i tabell 3. Spesifiseteten av reaksjonen for innfanging av biotinylert probe som ble hybridisert med dobbeltrådet mål ble verifisert ved å inkludere tre kontrollreaksjoner (tabell 3, reaksjonene 2-4). Disse reaksjoner viste at: (1) RecA-belagt biotinylert probe var nødvendig for innfanging av spesifikk mål-DNA (reaksjon 1) siden det ikke ble oppnådd noe signifikant signal i en reaksjon uten RecA (reaksjon 2), (2) RecA-inklusjon i reaksjonen var ikke årsaken til målinnfanging fordi det foregikk bare bakgrunnsnivå DNA-innfanging i nærvær av ikke-biotinylert ikke-homolog DNA-probe belagt med RecA (reaksjon 3), og (3) den gjennomsnittlige bakgrunns, ikke-spesifikke, mål-DNA-innfanging var ca. 3,5 % (reaksjonene 2-4). ;(ii) Signalamplifikasjon fra innfanget DNA. ;En prototyp-protokoll for påvisning av kuleinnfanget mål-DNA er kort beskrevet nedenfor. For dette trinn blir innfanget mål frigjort fra kulene ved oppvarming i en reaksjonsblanding inneholdende dNTP forløpere, hvorav en eller flere er merket (f.eks. bio-14-dATP, eller dNTP med et direkte påvisbart merke, som f.eks. FITC-11-dUTP osv.) og en ss DNA primer (eller primere) som ikke er homologe med de opprinnelige innfangingsprobesekvenser, men homologe bare med målsekvenser, blir tilsatt og får sammenføying til enkelttråder av mål-DNA. Etter sammenføying avkjøles reaksjonen og et DNA polymeraseenzym, fortrinnsvis DNA polymerase T7 (Sequenase<®>, versjon 2,0, USB) og passende buffer blir tilsatt for å tillate DNA-syntese med primerutvidelse. Alternativt kunne det også anvendes en høytemperaturpolymerase og reaksjonen inkuberes ved en temperatur som tillater prosessiv DNA-syntese. Under primerutvidelse blir merkede DNA-forløpere inkorporert i de nylig syntetiserte DNA-tråder. Fordi DNA-primerne ikke er homologe med de tidligere anvendte RecA belagte prober, vil merkeinkorporering spesifikt angi tilstedeværelsen av det korrekte innfangede mål. Anvendelse av en innfangingsgruppe enten direkte forbundet med primerne, som f.eks. poly(A) eller som er i stand til å bli tilsatt senere, tillater påfølgende innfanging av det forsterkede målsignal på oligo(dT) knyttet til magnetiske kuler, cellulose osv. Innfangingen etterfølges av fjerning av ikke-inkorporert forløpermerking fra det oppformerte DNA, og om nødvendig anvendes et blokkeringsmiddel, slik som f.eks. I-blokk (Southern-Light™, Tropix) til å blokkere den ikke-spesifikke binding av påvisningsgruppen (f.eks. AVIDx-AP, Tropix) til innfangingsmatriksen. Etter blokkering tilsettes substrat for å tillate spesifikk signalpåvisning fra det oppformerte mål-DNA, og signalet påvises ved et hvilket som helst egnet middel. En skjematisk skisse av en homogen diagnostisk dobbel D-løkke assay er vist som følger. Selv om det er presentert en spesifikk merking, innfanging og påvisningsplan, er det mange måter som en slik assay kunne praktiseres på. ;En skjematisk skisse av en homogen diagnostisk assay for dupleks DNA-mål med dobbel D-løkke hybrider er vist som følger: ;Følgende eksempler illustrerer. den foreliggeade oppfinnelse. ;Materialer og metoder ;Restriksjonsenzymer ble levert fra Boehringer Mannheim (Indianapolis IN) eller New England Biolabs (Beverly MA) og ble anvendt ifølge fabrikantens anvisninger. ;Generelt var oligonukleotider radiomerket med [y-<32>P]ATP og T4 polyonukleotid kinase. Merkereaksjonene ble utført i bufferne og ved fremgangsmåtene anbefalt av produsentene (New England Biolabs, Beverly MA; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg MD; eller Boehringer/Mannheim, ;Indianapolis IN). Oligonukleotider ble separert fra buffer og ikke-inkorporerte trifosfater ved anvendelse av Nensorb 20 pre-dannede kolonner (NEN-DuPont, Boston, MA) ifølge produsentens instruksjoner, og deretter dialysert mot dd H20 om nødvendig. ;Eksempel 1 ;Fremstillin<g> av RecA- belagte prober ;En serie av dobbelt- og enkelt-trådete DNA-prober og primere er blitt dannet. Posisjonene av disse prober og primere i forhold til en tilgrensende 500 basepar region av lambda fag genomet er vist i figur 1: nukleotidsekvensen for denne region av lambda genomet er presentert i figur 2. Baseposisjonene for 5'-og 3'- endene av hver probe og primer, relativt til lambda virusgenomet, er oppført i tabell 1. Primerne PCR01 og PCR02 tilsvarer primerne levert i "GENEAMP" DNA Amplification Reagent Kit (Perkin Eimer Cetus, Norwalk CT). ;Enkelttrådete primere (PCR01, PCR02 og PCR03A) og enklettrådete prober (DL80-1 tom. 4, biotin 121, 121-<32>p, og biotin-79) ble syntetisert kjemisk ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige fosforamidittforløpere på en Applied Biosystems 380B DNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City CA). ;DNA-molekyler ble biotynilert ved reaksjon med en biotinfosforamiditt i den siste 5' base (New England Nuclear-DuPont, Boston, MA) før deblokkering. Alle kjemisk syntetiserte DNA-molekyler ble deblokkeret ifølge produsentens spesifikasjoner. ;Korte DNA-prober (25-merer) ble anvendt uten ytterligere rensing. Enkelt-trådete 80-merer og 121-merer DNA-prober ble renset ved polyakrylamidgelelektroforese ved anvendelse av henholdsvis 8%,, og 5% eller 8% polyakrylamidgeler. DNA-produkter i full størrelse ble oppnådd ved utskjæring av DNA-bånd fra gelene som svarte til DNA-molekylet med den korrekte størrelse. DNA-molekylene ble gjenvunnet fra gelbiter ved elektroeluering ved anvendelse av "ELUTRAP"-systemet (Schleicher and Schuell, Keene, NH). Både prober og primeren ble konsentrert ved standard etanolutfelling (Maniatis et al.). Probe- og primer DNA-konsentrasjoner ble bestemt basert på UV-absorbans ved 260 nm av det fortynnede ;DNA. ;Dobbelttrådete 500 og 280 bp regioner av lambdagenomer (figur 1) ble syntetisert ved anvendelsen av henholdsvis primerne PCR01 og PCR02, eller PCR03A og PCR02, Taqpolymerase og standard DNA-oppformeringsreaksjonsbetingelser (Perkin Eimer Cetus; Mullis; Mullis et al.). Oppformeringsproduktene ble atskilt fra DNA-primerne ved elektroforese gjennom 0,7% agarose (Sigma Type II, Sigma, St. Louis MO) gel (500-mer) eller en 4% ("NUSIEVE" (FMC BioProducts, Rockland, ME) agarose gel (280-mer). DNA-molekylene i båndene tilsvarende oppformeringsproduktene ble elektroeluert, konsentrert, og deres aktuelle konsentrasjoner bestemt som beskrevet ovenfor. ;Dobbeltetrådete 121- og 159-mere prober ble oppnådd ved restriksjonsspalting av renset 280-mer ved anvendelse av enzymet Alul (New England Biolabs, Beverly MA). DNA-probene ble isolert ved gelelektroforese, elektroeluert og konsentrert som ovenfor. ;Dobbelttrådet 79-mer proben ble oppnådd ved restriksjonsspalting av den rensede 500-mer ved anvendelse av enzymet Hpall. Spalteproduktene ble atskilt og renset fra ikke-skåret DNA ved elektroforese ved anvendelse av enten 3% eller 4% "NUSIEVE" geler (FMC Bioproducts) eller 1% agarosegeler. Spesifikke DNA-fragmenter ble gjenvunnet fra gelene som beskrevet ovenfor. ;Enkeltrådete eller dobbelttrådete DNA-molekyler ble 5'-ende-merket (Maniatis et al.) med [y"32P] ATP og T4 polynukleotidkinase (Promega, Madison WI). Om nødvendig ble DNA-molekylene defosforylert med alkalisk fosfatase (Boehringer Mannheim, Indianapolis IN) før merking med T4 polynukleotidkinase. Ikke-innkorporert merking ble gjenvunnet ved anvendelse av "NENSORB 20" nukleinsyrerensekolonner (NEN-DuPont). De merkede DNA-molekyler kunne renses ytterligere ved dialyse mot sterilt dobbelt-destillert vann etterfulgt av konsentrering ved frysetørking. 31P-merket 121-, 159- eller 79-mer ble også oppnådd ved hensynsmessig restriksjonsenzymspalting av P ende-merket 280-mer eller 500-mer. ;Eksempel 2 ;Rensin<g> av villtype RecA og mutant RecA 803 proteinene ;RecA og RecA-803 proteiner ble isolert fra de overproduserende stammer i JC12772 og JC15369 (levert fra A.J. Clark og M. Madiraju). Disse stammer inneholder RecA og RecA-803-kodesekvensene på plasmider som er tilstede i høyt kopiantall pr. celle. Analyse av totalt protein fra JC12772 og JC15369-celleekstrakter ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese, under denaturerende betingelser, viste at det 38.000-dalton RecaA eller RecaA-803-protein er hoved-proteinet som fremstilles i disse stammer. ;RecA og RecA-803-proteiner ble renset ved modifikasjon av etablerte fremgangsmåter (Shibata et al., 1981; Griffith et al., 1985) ved anvendelse av hurtig proteinvæskekromatorafi (FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography) ved anvendelse av en hydroksylapatittkolonne levert som et pulver (BioRad) etterfulgt av anionbytterkolonne ("MONO Q", Pharmacia). ;Proteinrensing ble overvåket som følger: ;(i) identifikasjon av 38 000-dalton RecA-proteinet ved SDS-PAGE (PHAST-GEL" system, Pharmacia, Piscataway NJ); (ii) assay av den RecA-ssDNA-avhengige ATPaseaktivitet ved anvendelse av [y~ <32>P]ATP og enkeltetrådet DNA (Shibata et al., 1981). Produktene fra reaksjonen ble atskilt ved anvendelse av PEI-cellulose tynnskiktkromatografi (EM Science, NJ): PEI-platene ble fremkalt i et løsningsmiddel av 0,5 Molar LiCl og 0,25 Molar maursyre. Produktene ble påvist ved autoradiografi. (iii) assay av DNase-aktivitet. DNase-aktiviteten ble overvåket ved inkubering av RecA-proteinprøvene med en blanding av phiX174 liniærisert og super-kveilet sirkulær dobbelttrådet RF, og sirkulære enkelttrådete DNAer i RecA-trådoverføringsbuffer (Cheng et al., 1988) i 1 time ved 37°C. DNA-nicking og spalting ble overvåket etter deproteinisering ved visualisering av DNA-ene med etidiumbromid etter agarosegelelektroforese og sammenligning av mengden av hver DNA-type i de RecA-inkuberte prøver med dem som ble inkubert i buffer uten RecA. Bare RecA-proteinprøver som viste ingen påvisbar DNaseaktivitet ble anvendt. (iv) assay av D-løkkeaktivitet med 500-mer oligonuklotidproben ved anvendelse av en fremgangsmåte modifisert fra Cheng et al. (1988). ;Sølvfargede SDS-polyakrylamidgelprofiler av de endelige "MONO-Q"-rensede RecA og RecA-803-proteiner viste et enkelt 38 000-daltonbånd fra hvert preparat som var i alt vesentlig for andre cellulære polypeptider. ;Eksempel 3 ;RecA- proteinbelleggingsreaksion ;RecA-proteinb el egging av prober ble vanligvis utført i en standard IX RecA-beleggingsreaksjonsbuffer (10X RecA-reaksjonsbuffer: 100 mM Tris-acetat (pH 7,5 ved 37°C), 20 mM magnesiumacetat, 500mM natriumacetat, 10 mM DTT og 50% glycerol (Cheng et al. 1988). Alle probene, enten de var dobbelttrådete eller enkelttrådete, ble denaturert før anvendelse ved oppvarming til 95-100°C i fem minutter, plassert på is i ett minutt, og i en Tomisentrifuge underkastet sentrifugering (10000 rpm) ved 0°C i ca. 20 sekunder. Denaturerte prober ble tilsatt umiddelbart til RecA-beleggingsreaksjonbuffer ved romtemperatur blandet med ATPyS og fortynningsmiddel (dobbeltdestillert H2O) etter behov. ;Denne reaksjonsblanding inneholdt typisk følgende komponenter: (i) 2,4 mM ATPyS; og (ii) mellom 10 og 40 ng dobbelttrådet probe. Til denne blanding ble raskt tilsatt og innblandet enten (i) en ul RecA-protein, vanligvis ved 5,2 mg/ml (kjøpt fra Pharmacia eller renset som beskrevet ovenfor), eller (ii) et ekvivalent volum av RecA-lagringsbuffer (20 nM trisHCl pH 7,5, 0,1 nM EDTA, 1,0 mM DTT, og 50% glycerol). Det endelige reaksjonsvolum for RecA-belegging av proben var vanligvis ca. 10 ul. RecA-belegging av proben ble initiert ved inkubering av probe-RecA-blandinger ved 37°C i 10 min. ;ReeA-proteinkonsentrasjoner i beleggingsreaksjoner varierte avhengig av probe-størrelse og mengden av tilsatt probe: Ree A-proteinkonsentrasj onen var typisk i området fra 6,8 til 51 uM. Når enkelttrådete DNA-prober ble belagt med RecA, uavhengig av deres komplementære probetråder, ble konsentrasjonene av ATPyS og RecA-protein begge redusert til halvparten av de konsentrasjoner som anvendt med dobbelttrådete prober: dvs. at recA-protein og ATPyS-konsentrasjonsforholdet ble holdt konstant for en gitt konsentrasjon av enkeltprobe-tråder. ;Figur 3 viser et autoradiogram som illustrerer RecA-proteinbinding til 121-mer og 159-mere DNA-prober som målt ved DNA-båndskift assay. Varmedenaturerte <32>P-merkede dobbelttrådete 121-mer og 159-mere DNA-prober ble omsatt med RecA-protein som beskrevet ovenfor. De endelige RecA-DNA-reaksjonsblandinger inneholdt 2,4 mM ATPyS. RecA-protein eller RecA-lagringsbuffer ble tilsatt til hver av fire reaksjoner inneholdende 0,01 ug av enten denaturert 121 eller 159-mere ;DNA-prober'. Den endelige konsentrasjon av RecA i hver reaksjon var 0, 0,137, 1,37 eller 13,7 uM i henholdsvis sporene 1 og 5, 2 og 6, 3 og 7 eller 4 og 8 (figur 3). Alle RecA/DNA-probebeleggingsreaksjoner ble gjennomført i et sluttvolum på 10 ul. RecA-binding ble initiert ved inkubering av alle reaksjonene ved 37°C i 10 min. 5 ul porsjoner av hver reaksjon ble lastet inn på en 2% agarosegel i IX TBE-buffer og underkastet elektroforese ved 9,2 v/cm i 2 timer. En Haelll-spalting av (pX-174 DNA (GIBCO-BRL, Gaithersburg MD) tjente som en dobbeltrådet DNA-størrelsesmarkør (M). Markør-DNA ble 5'-endemerket med <32>P som beskrevet ovenfor. Gelen ble lufttørket på saranfolie i en bioscyclerovn ved 65°C. Den tørkede gel ble deretter eksponert på røntgenstrålefilm. ;Som det kan sees av figur 3 øker retardasjonen av den elektroforetiske mobilitet av DNA-probene med økende RecA-konsentrasjon. ;De samme betingelser som beskrevet ovenfor ble anvendt for RecA-803-protein. ;Eksempel 4 ;Dannelse av RecA- proteinmedierte multiplekser ;Probe-beleggingsreaksjoner ble gjennomført som beskrevet i eksempel 3. Etter at at beleggingsreaksjonene var fullstendige, ble det tilsatt mål-DNA til hver reaksjon. Dette mål-DNA var avledet fra lambdavirusgenomet, og dersom det var restriksj onsenzymspaltet, inneholdt det DNA-fragmenter homologe med probesekvensen og dessuten ikke-homologe DNA-fragmenter. Typisk ble 0,66 -1,5 ug mål DNA tilsatt til hver reaksjon i lX-reaksjonsbuffer. Magnesium-konsentrasjonen av den totale reaksjon ble justert til 12 mM ved tilsetning av en porsjon av 0,2 M magnesiumacetat. Sluttreaksjonsvolumene var vanligvis 20ul etter tilsetningen av mål-DNA. ;Probe-målblandinger ble inkubert ved 37°C for å tillate RecA-katalyserte homologe prober: målreaksjoner. Etter inkubering i 60 minutter ble reaksjonene deproteinisert med proteinase K (10 mg/ml) ved 37°C i 15-20 minutter, etterfulgt av tilsetning av natriumdodecylsulfat (SDS) til en sluttkonsentrasjon på 0,5 - 1,2% (w/v). Porsjoner av hver reaksjon ble fylt i brønner med 0,7 - 1,0% agarosegel etter tilsetning av sporfargestoff (Maniatis et al.). Gelene ble underkastet elektroforese enten ved romtemperatur eller ved 4°C. Gelene ble farget med etidiumbromid og DNA-molekylene visualisert med UV-lys. Gelene ble fotografert ved anvendelse av et rødt filter og polaroid 667 svart og hvitt film. ;Når radiomerkede DNA-prober ble anvendt i reaksjonene, ble prober: målkom-pleksene påvist ved autoradiografi av enten fuktige eller tørkede agarosegeler ved anvendelse av enten DuPonfCRONEX QUANTA III" eller LIGHTENING PLUS" intensiverende skjermer og Kodak "X-OMAT AR5"-film. For signalkvantifisering ble må-lDNA båndene som viser signal på autoradiogrammene skåret ut fra gelene, knust, slemmet opp i scintillasjonscocktail ("AQUASOL-2", DuPont-NEN, Boston MA), og radioaktiviteten tellet i en Packard 2000 CA Tri-Carb væske-scintillasjonsanalysator. ;Dobbelttrådet 280-mere og 500-mere prober (tabell 1) ble omsatt med et dobbelttrådet lineært mål-DNA fragment (8370 bp lambda Dral-spaltefragment som inneholder hver probe-sekvens) som beskrevet ovenfor. Denaturerte probe-DNA-molekyler ble belagt med RecA-protein i nærvær av 2,4 mM ATPyS og 34,2 uM RecA-protein. Denaturerte prober som ikke var belagt med RecA-protein, ble tilsatt til de samme reaksjonsbetingelser minus RecA-proteinet. Etter inkubering i 10 minutter ved 37°C ble det tilsatt 0,66 ug av lambdagenomisk DNA, som var blitt spaltet med restriksjonsenzymet Dral, til hver probeblanding: det genomiske DNA ble slemmet opp i lX-reaksjonsbuffer med justert Mg^-konsentrasjon, som beskrevet ovenfor. Det endelige mikromolare forhold av dobbelttrådet probe til homologt dobbelttrådet målfragment var 10,6:1 for 500-mer og 21:6:1 for 280-mer. Inkubering av probe:målreaksjonene ble utført som beskrevet ovenfor. ;Reaksjonene ble deproteinisert og påsatt på en 0,7% agarosegel. DNA ble underkastet elektroforese for å atskille probe- og mål-DNA-fragmentene. Et fotografi av det etidiumbromidfargede DNA i gelen som inneholder disse reaksjoner, er vist i figur 4A. De tre reaksjoner på venstre side er kontrollreaksjoner som anvender pUC18 dobbelttrådet sirkulært DNA-mål og RecA-belagt enkelttrådet 69-mer proben (disse kontrollsubstrater ble levert av B. Johnston, SRI, Menlo Park, CA). Sentersporet inneholdt 1 kb markør-DNA (GIBCO-BRL). De fire reaksjoner på den høyre side av gelen var lambda Dral-spalte-mål-DNA-ene. ;Denne gel ble tørket og eksponert på røntgenfilm som beskrevet ovenfor. Det resulterende autoradiogram er vist i figur 4B. Både RecA-belagte 500-mere og 280-mere prober hybridiserte spesifikt med det korrekte Dral lambda DNA-spaltemålfragment. Posisjonen av proben: mål DNA-homologien er minst 832 bp fra 3'-enden av det 8370 bp-målfragment. Dette resultat demonstrer dannelsen av de 500-mere og 280-mere RecA-befordrede DNA-hybridiseringsprodukter som er stabile mot deproteinisering. Dannelsen av disse stabile DNA-komplekser krever RecA-protein. ;Eksempel 5 ;Stabil kompleksdannelse mellom små dobbelttrådete prober og lineære dobbelttrådete mål DNA. ;Dette eksempel beskriver anvendelsen av små dobbelttrådete prober til å danne komplekser med lineært dobbelttrådet DNA som er stabile mot deproteinisering. Følgende hybridiseringsreaksjoner ble utført som beskrevet i eksempel 4. Alle RecA-proteinbeleggingsreaksjonsvolumer var 10ul. Hver reaksjon inneholdt 2,4 mM ATPyS og 20,5 uM RecA, dersom intet annet er angitt. Sluttreaksjonene inneholdt 1,3 ug Dral-spaltet lambda-DNA. Følgende reaksjonsbetingelser tilsvarer sporene i figur 5A og 5B: sporene 1 og 2, 280-mer probe henholdsvis med og uten RecA-protein; spor 3, 121-mer probe med RecA-protein; sporene 4-6, 79-mer probe med RecA-protein. Reaksjonene i sporene 5 og 6 inneholdt RecA-proteinkonsentrasjoner på 8,54 og 41 uM under RecA- probebeleggingsreaksjonen. Reaksjonene ble deproteinisert og påsatt på en 0,7% agarosegel. Gelen ble underkaster elektroforose for å atskille probe- og mål-DNA-fragmentene. ;Figur 5A viser et fotografi av etidiumbromid-farget DNA i en agarosegel som viser lambda-Dral-spaltemålfragmentene fra reksjonene ovenfor. Figur 5B viser et autoradiografi av DNA i en agarosegel vist i figur 5A. Pilene angir migrerings-posisjonen av Dral-lambda-målfragmentet som er homologt med de anvendte prober. Resultatene viser at det kan oppnås komplekser som er stabile mot deproteinisering med alle de RecA-belagte DNA-prober: 280<:>mer, 121-mer, og 79-mer. Som evenfor ble de stabile komplekser dannet minst 832 baser fra enden av et lineært dobbelttrådet DNA-mål molekyl. ;Eksempel 6 ;Stabil kom<p>leksdannelse krever en dobbelttrådet probe ;A. Kravet om en dobbelttrådet DNA-probe. ;RecA-belagte DNA-prober ble anvendt for hybridisering med 3,0 ug av lambda Dral-spaltet mål-DNA pr. reaksjon (60 minutter) som beskrevet i eksempel 4. Det ble anvendt to kjemisk-syntetiserte enkelttrådete DNA 121-merer. Trådene var komplementære til hverandre. En tråd ble biotin-merket og den andre <32>P-merket. ;Følgende reaksjonsnumre tilsvarer sporene i figurene 6A og 6B. Reaksjonene 1,2, 5, 6 og 3, 4 inneholdt henholdsvis 2,4 mM eller 4,8 mM ATPyS. Alle reaksjoner anvendte 20 ng av den <32>P-merkede DNA-probetråd og 10,4 ug RecA-protein: hver reaksjon inneholdt den samme P-spesifikke aktivitet. Reaksjonen 3-6 inneholdt også den biotin-merkede tråd. I reaksjonene 3 og 4 ble begge DNA-prober tilsatt til de opprinnelige 10 ul ReeA-reaksjoner på samme tid. For reaksjonene 5 og 6 ble de <32>P- og biotin-merkede prober alle belagt med RecA i separate 10 ul reaksjoner, deretter ble hver halvpart av hver reaksjonsblanding inkubert med mål DNA i 30 minutter før tilsetning av den manglende, komplementære RecA-belagte DNA-probetråd. Den <32>P-merkede DNA-tråd ble tilsatt først til reaksjon 5 og deretter til reaksjon 6. ;Alle reaksjoner ble deproteinisert med proteinase K og SDS før elektroforese. Figur 6A viser et fotografi av etidiumbromidfarget DNA i en agarosegel som viser lambda Dral-spaltemålfragmentene fra reaksjonene ovenfor. Reaksjonensbetingelsene er sammenfattet i figurene 6A og 6B. Autoradiogrammet av den uttørkede gel i figur 6A er vist i figur 6B. ;Det er nødvendig med to DNA-probetråder for fremstilling av stabile deproteinjiserte produkter dannet ved en homolog intern sekvens på lineært mål-DNA (sporene 3, 5, og 6, sammenlign spor 2). RecA-protein er også nødvendig for produktdannelse (sporene 3, 5, og 6, sammenlign spor 4). ;B. En modell av det dobbelttrådete stabile produkt. ;Figur 7 viser en mulig modell for det deproteiniserte dobbelttrådete RecA-katalyserte hybridiseringsprodukt. Figur 7 illustrerer en stabil dobbel-D-løkke multipleks dannet med korte endemerkede DNA-prober og et dobbelttrådet lineært DNA-mål. Den viste modell beskriver hybridisering på det 8370 bp Dral-DNA-lambda-mål, hvor probe:mål homologien begynner minst 832 baser fra den korte ende av målet (3' merket enden med hensyn til hele lambdagenomet). Dral-fragmentet inkluderer lambdabasene 93-8462. De nøyaktige homologiregioner er definert ved tabell 1. En enkelttrådet RecA-proteinbelagt probe gir ikke komplekser som er stabile mot deproteinisering (se figur 6B ovenfor). ;Eksempel 7 ;Probe:mål- innfanging og DNA- påvisning. ;A. Hybridiseringsreaksjoner. ;Komplementære 121-mere DnA-prober (tabell 1) ble indivuduelt kjemisk syntetisert. De komplementære tråder ble merket forskjellig ved anvendelse av {y-<32>P]ATP og biotin (henholdsvis reporter- og innfangingsgruppene). Alle probebe-leggingsreaksjonsblandinger inneholdt 2,4 mM ATPyS, 20 ng enkelttrådet probe, 5,2 ug av RecA-protein (5,2 ug/ul; Pharmacia), eller et tilsvarende volum av RecA lagringsbuffer (uten RecA-protein), pr. 10 ul reaksjon. For eksperimenter som anvender både biotin- og <32>P-merkede prober (reaksjoner 1 og 4), ble 10 ul porsjoner av de analoge biotin- eller <32>P-merkede probebeleggingsreaksjoner blandet sammen (for å gi 20 ul) før disse blandinger ble tilsatt til mål DNA-blandingen. For å holde alle reaksjons volum er konstante skulle reaksjoner med bare en enkelttrådet probe-tråd (reaksjonene 2 og 3) anvende 10 ul probe-blanding, 10 ul probe-reaksjonsbuffer (dvs. ingen andre prober) og 20 ul av mål-DNA-blanding. ;En lambda-mål-DNA-blanding ble fremstilt som følger: IX RecA reaksjonsbuffer, 1 - 10 fortynning av 0,2 M lager Mg acetat, og Apal-spaltet lambda-DNA. 20 ul av mål DNA-blandingen ble tilsatt til hver av de 20 ul probe-reaksjonsblandinger. Disse reaksjoner ble inkubert i 60 minutter ved 37°C. De 40 ul reaksjoner ble deproteinisert, delt i to like porsjoner, de to porsjoner påsatt på nabo-brønner i en 0,7% agarosegel og komponentene fraksjonert ved elektroforese (som beskrevet ovenfor). ;Den opprinnelige spesifikke aktivitet av alle reaksjoner som inneholdt den <32>P-merkede tråd (1, 2 og 4) var identisk. Den etidiumbromidfargede gel med nabo-duplikate spor av hver reaksjon er vist i figur 8. Innholdet av hver reaksjon er sammenfattet i figur 8. ;Den del av hvert spor av gelen som tilsvarer det 10,1 kb lambda-mål DNA (figur 8) ble skåret ut fra gelen. Hvert utskårne fragment ble plassert i et mikrosentrifugerør og raskt frosset ved anvendelse av tørris. Det DNA som var inneholdt i hvert gelfragment ble gjenvunnet ved pressing av den frosne gel mellom foldet parafilm til det ikke lenger ble ekstrudert mere væske. Denne DNA-holdige væsken ble deretter omhyggelig fjernet med en "EPPENDORF"-mikropipette. ;B. Innfangnings/påvisnings assay. ;Tilstedeværelsen av to probe-tråder på det samme mål-molekyl (en biotin-merket og den andre <32>P-merkef) ble påvist ved innfanging av biotin-merket probermål-hybrider på streptavidinbelagte paramagnetiske kuler (Dynal, Oslo, Norge). Produsentens kulelagringsbuffer ble fjernet før anvendelse. Kulene ble vasket i IX RecA-reaksjonsbuffer, i 10X RecA-reaksjonsbuffer, og tilslutt i IX RecA-reaksjonsbuffer. Før DNA-innfanging ble like store porsjoner av vaskede kuler innsatt til individuelle 1,5 ml mikrosentirfugerør, og den endelige vaskebuffer ble fjernet. Væske ble fjernet fra alle kulesuspensjoner ved plassering av mikrosentrifugerørene inneholdende kuleblandingene i et magnetseparasjonsstativ (Promega, Madison WI). ;De ovenfornevnte DNA-holdige reaksjonsprøver ble hver tilsatt piruettmikro-sentrifugerør inneholdende en porsjon av de vaskede paramagnetiske kuler. Prøvene ble blandet og inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. Siden kulene sedimenterer med tiden, ble blandingene rystet flere ganger under inkuberingen for å sikre effektiv biotin:streptavidineksponering. Etter innfangingsreaksjonen, dvs. bindingen av streptavidin til biotin, ble de paramagnetiske kuler i hver reaksjon samlet sammen med en magnet og reaksjons væsken fjernet. ;Hver prøve av kuler ble vasket tre ganger med IX RecA-reaksjonsbuffer. Tilstedeværelsen av <32>P-merket probe-tråd ble bestemt ved tilsetning av væskes-kintillasjonstellende fluor til kulen og telling av radioaktiviteten av det DNA som ble innfanget i hver kulereaksjon. Disse data er gjengitt i tabell 2. ;I tabell 2 ble det beregnet prosentsatser ut i fra de <32>P radiomerkede DNA-tellinger pr. minutt som var tilbake på de Dynalstreptavidin-belagte kuler etter tre vaskinger av hver innfangingsreaksjon med IX acetatreaksjonsbuffer. Intet <32>P-merket DNA ble tilsatt til reaksjon 3, som utelukkende inneholder biotininnfangningsprobe: ingen radioaktive DNA-tellinger var ventet for denne reaksjonen. De "totale forventede tellinger" i tabell 2 ble bestemt som følger. Identiske reaksjoner ble gjennomført som beskrevet ovenfor, og produktene atskilt ved agarosegelelektroforese. Gel-fragmenter svarende til det 10,1 kb mål-DNA ble skåret ut fra gelen, kappet i småbiter og plassert i "AQUASOL". Den mengde av P-merket DNA som er tilstede i prøven, ble bestemt ved væskeskintillasjons-telling. ;Resultatene viser at hybridiseringsproduktet, inneholdende to komplementære men forskjellig merkede prober, kan innfanges ved anvendelsen av streptavidin-interaksjonen med den biotin-merkede probe-tråd og deretter påvises ved et merke i den komplementære probe-tråd. ;Denne kuleinnfanging av stabile probenmål-hybrider understøtter at homologe probe:mål-komplekser katalysert med RecA-protein i virkeligheten inneholdt 2 homologe probetråder på det samme dobbelttrådete mål-molekyl. ;Eksempel 8 ;RecA+- befordret DNA- oppformering uten mål- DNA denaturering Reaksjonsbetingelser for RecA-proteinbefordret DNA-oppformering er beskrevet i samtidig verserende og medeiet serienummer 07/520 321, for "PROCESS FOR NUCLEIC ACID HYBRIDAZATION AND AMPLIFICATION", registrert 7. mai 1990, innkorporert heri ved referanse. ;Dobbelttrådete probe/primer par tilsvarende DL801/2 og DL803/4 (tabell 1) ble denaturert og belagt med RecA-protein som beskrevet ovenfor. For å sikre at forlengelse av DNA-primere foregår i bare den ønskede retning, kan 3' enden av de hensiktsmessige primere termineres med et 2', 3' -dideoksynukleotid. Dideoksynukleoidet mangler 3'-hydroksylgruppen som er tilstede i de konvensjonelle dNTPer. Fraværet av hydroksylgruppen inhiberer utvidelse ved å forhindre dannelsen av en fosfordiester-binding mellom dideoksynuklotidet og det etterfølgende konvensjonelle dNTP. Addisjonen av dideoksynukleotidet til primeren kan oppnås ved anvendelse av enzymet terminaldeoksykleotidtransferase (Pharmacia, Piscataway, NH). ;Probene får deretter reagere med mål-DNA som beskrevet ovenfor. Produktet av reaksjonen ovenfor, bestående av to sett av dobble D-løkker, blir deretter anvendt som substrater i en typisk DNA-oppformeirngsreaksjon. DNA-reaksjonen kan utføres i buffer inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8-12 mM MgCl2, og 50 mM NaCl suplementert med 200-750 uM dNTP og DNA-polymerase (f.eks. eksonnukleasefri, DNA-polymerase I, Klenow, eller T7 DNA-polymerase). Dessuten kan reaksjonen supplementeres med andre enzymer eller proteiner (f.eks. DNA-helikase, topoisomerase, DNA-ligase og enkelttrådet bindende (SSB) protein) som kan lette dannelsen av det spesifikke oppformeringsprodukt. Reaksjonen far foregå så lenge som nødvendig ved 37°C. Etter terminering kan prøver deproteiniseres (SDS) proteinase K og/eller fenolekstraheres ) og analyseres ved gelelektroforese. Etter elektroforeseseparasjonen kan det resulterende oppformerte DNA visualiseres ved enten etidiumbromidfarging av DNA i gelen eller ved DNA-hybridisering med en mål-spesifikk DNA-probe. Alternativt kan oppformerings-DNA-prober biotinyleres, og det nylig syntifiserte DNA innfanges med hensiktsmessige midler, og deretter rapporteres og påvises som tidligere beskrevet. ;DNA-syntesereaksjoner blir initiert ved tilsetning av 1-2 enheter av exonukleasefri ;E. Coli DNA-polymerase I (U.S. Biochemicals) og 750 uM av hvert dNTP. Reaksjonene holdes ved 37°C. ;Etter den opprinnelige tilsetning av polymerase, kan reaksjonene supplementeres med 1 enhet av f.eks. Klenow og/eller ytterligere dNTP, med bestemte mellomrom fordelt over reaksjonens tidsforløp. ;Prøvene behandles med proteinase K før de blir påsatt for elektroforeseseparasjon. Etter elektroforeseseparasjonen kan de resulterende oppformerte DNA-fragmenter visualiseres ved enten etidiumbromidfarging av gelen eller ved hybridisering med en mål-spesifikk probe; ;For hybridiseringsanalyse kan gelen overføres ved standardprotokoller (Maniatis et al.) til hybridiseringsoverføringsmembran (Hybond-N, Amersham). Dette DNA blir UV-tverrbundet (stratolink, stratagen) til membranen. Den UV-behandlede overføringsmembran blir hybridisert med endemerket (Boehringer Mannheim) ;probe PCR03A (tabell 1): PCR03A (nukleotidene 7351 tom. 7390 av det ntaurlige lambdagenom) er en 40-mer tilsvarende en intern DNA-sekvens av den 500 base par lambdatemplat som er målet for oppformeringsreaksjonen ovenfor. Membranen blir underkastet autoradiografi. ;Eksempel 9 ;In situ DNA- påvisning ved anvendelsen av dobbel D- løkke reaksjoner ;A. Fremstilling av probekompleks. ;Biotinylert kromosom X alfa satelitt DNA-probe blir skaffet fra ONCOR (Gaithersburg, MD). Alternativt kan prober biotinyleres ved standard nick-transla-sjonsmetoder eller ved polymerasekjedereaksjon (Weier et al., 1990). ;Den dobbelttrådete probe fortynnet i sterilt ddHaO til den ønskede konsentrasjon før denaturering, blir denaturert i et 0,5 ml mikrosentrifugerør i en 100°C varmeblokk i 5 minutter. Røret blir umiddelbart plassert i et isvannbad i 1-2 minutter etterfulgt av en kort sentrifugering ved 4-6°C i en "TOMY" mikrosentrifuge, og rørene blir returnert til et isvannbad. Ca. 5 minutter før tilsetning av denaturert DNA-probe til hybridiseringsblandingen, blir røret inneholdende proben plassert i is i en fryser ved minus 20°C. Probehybridiseringsblandingen inneholder følgende komponenter i et bredt konsentrasjonsområde og blir blandet sammen i den oppførte rekkefølge: 1 ul av 10X RecA-reaksjonsbuffer [10X RecA-reaksjonsbuffer: 100 mM Trisacetat pH ;7,5 ved 37°C, 20 mM magnesiumacetat, 500 mM natriumacetat, 10 mM DTT og 50% glycerol (Cheng et al., 1988)]; 1,5 ul ATPyS fra 16,6 mM lagerløsning (Pharmacia) [GTPyS, rATP (alene eller i nærvær av et rATP-regeneringssystem), dATP, blandinger av ATPyS og rATP, eller blandinger av ATPyS og ADP, kan også ;anvendes i noen reaksjoner]; 0,75 ul 20 mM magnesiumacetat; 4-60 ng (eller mer i noen reaksjoner) av denaturert probe i sterilt vann; 1,25 ul 0,137 mM lager RecA-protein når innkjøpt fra Pharmacia [når levert fra andre kilder eller fremstilt i laboratorie vil den tilsatte mengde (ul) variere ifølge konsentrasjonen av lagerløsningen. ;Blandingen inkuberes ved 37°C i 10 minutter etterfulgt av tilsetning av 0,5 ul/reaksjon av 200 mM magnesiumacetat. Endelige konsentrasjoner av reaksjonskomponenter er: 4,0 mM til 10 mM trisacetat, 2,0 mM til 15 mM magnesiumacetat, 20,0 mM til 50 mM natriumacetat, 0,4 mM til 1,0 mM DTT, 2% til 5% glycerol, 1 mM til 2,5 mM ATPyS, 0,005 mM til 0,02 mM RecA-protein. ;B. Fremstilling av HEp-2-fikserte cellekjerner. ;HEp-2-celler ble opprinnelig avledet fra mannlig humant larynksepidermoidkarsi-nomvev. HEp-2 er en khromosomploid variabel cellelinje (Chen). ;Cellene blir dyrket i 24 timer etter utsåing i DMEM medium (Whittaker eller Gibco-BRL) supplementert med 10% FBS, natriumpyruvat og en penicillin/streptomycin antibiotikablanding ved 37°C under standard betingelser. Cellene pelletiseres ved lavhastighetssentrifugering, og pelleten slemmes opp igjen i 75 mM KC1 i et 37°C vannbad i mellom 5 og 15 minutter for at den ønskede mengde av kjernes velling skal foregå, etterfulgt av cellefiksering gjennomført ved tilsetning av 3:1 iskald metanol:eddiksyre og sentrifugering ved 6°C. ;En ml fluid blir etterlatt i røret med de pelleterte celler, ytterligere iskald metanol: eddiksyre blir tilsatt, og cellene blir blandet ved forsiktig omrøring av røret, etterfulgt av sentrifugering. Gjentatte tilsetninger av metanol-acetat nedbryter cytoplasma (HEp-2 og andre celletyper kan fikseres på alternative måter, hvorav noen ikke nedbryter cytoplasmaen). ;Preparater av isolerte kjerner blir fiksert ved oppslemming på nytt i 3:1 metanol :eddikksyre ved en konsentrasjon på ca. 2 x 10<6>/ml og blir enten dryppet med pipette i 10 ul porsjoner på rene objektglass som blir lagret ved minus 20°C, eller de oppslemmede kjerner blir laget ved minus 20°C for senere anvendelse. ;C. Hybridiseringsreaksjoner for fikserte preparater. ;10 ul av probe-blanding/reaksjon fra eksempel 9A blir påført på det fikserte preparat på objektglass. Dekkglass blir plassert over hybridiseringsområdene og forseglet med gummisement, og reaksjonene inkuberes i en fuktig beholder i en 37°C CO2 inkubator i mellom 1 og 4 timer. ;Etter inkubering blir gummisementen manuelt fjernet og objektglassene vasket i coplinkrukker 3 ganger i 10 minutter hver i 2X SSC (20X SSC: 3 M NaCl, 0,3 M natriumsitrat, pH 7,0 blir anvendt i alle SSC-holdige preparater i disse assay) i vannbad ved 37°C. Andre vaskebetingelser kan også anvendes. ;Objektglassene plasseres i pre-blokkeringsløsning [4X SSC, 0,1% "TRITON <®> X-100", 5% Carnation fettfri tørrmelk, 2% normal geiteserum (Gibco), 0,02 natriumacid, pH 7,0] i 25 minutter ved romtemperatur (RT), etterfulgt av neddykking i 5 ug pr. ml FITC-avidin DCS, cellesorteirngskvalitet (Vector, A-2011) i pre-blokkeringsløsning i 25 minutter ved romtemperatur. Objektglassene vaskes i rekkefølge i 4X SSC, 4X SSC og 0,1 % "TRITON <®> X-100", og 4X SSC i 10 minutter, hver ved romtemperatur, etterfulgt av kort skylling i dobbelt-destillert vann. Deretter blir objektglassene tørket. ;Anti-blekeløsning blir påført på objektglassene [100 mg p-fenylendiamindihy-droklorid (Sigma Pl519) i 10 ml fosfatbuffret saltoppløsning, justert til pH 8 med 0,5 M karbonat-hydrogenkarbonatbuffer (0,42 g NaHC03 justert til pH 9 med NaOH i 10 ml ddH20) tilsatt til 90 ml glycerol, og 0,22 um filtrert], og dekkglass blir plassert over preparatene. Anti-bleking inneholdende en motfarging slik som propidiumiodid eller DAPI-løsning kan anvendes istedenfor anti-bleking alene. ;Om nødvendig gjennomføres signalforsterkning som følger: objektglassene blir vasket i 5-10 minutter i 4X SSC og 0,1 % "TRITON <®> X-100" ved RT for å fjerne dekkglass og anti-bleking, etterfulgt av inkubering i pre-blokkeirngsløsning i opp til 20 minutter. Objektglassene inkuberes deretter med biotinylert geite anti-avidin antistoff (Vector BA-0300) ved en konsentrasjon på 5 ug pr. ml fortynnet i pre-blokkeringsløsning i 30 minutter ved 37°C. Objektglassene vaskes i rekkefølge i 10 minutter hver i 4X SSC, 4X SSC og 0,1 % "TRITON <®> X-100", 4X SSC ved RT etterfulgt av inkubering i preblokkeirngsløsning i 25 minutter ved RT, deretter neddykket i pre-blokkeirngsløsning med 5 ug pr. ml FITC-avidin i 20 minutter ved RT. Objektglassene blir vasket igjen i 4X SSC-serien, kort skylt i ddH20 og objektglassene påført en anti-bleking eller anti-bleking med motfarging. ;Spesifikke signaler blir påvist ved anvendelse av standard fluorisensmikroskopi-observasjonsteknikk. D. Påvisning av spesifikke chromosomsekvenser i fikserte kjerner og hele celler. ;Hybridiseringsblandingen blir slått sammen i følgende rekkefølge: 1 ul 10X RecA-reaksjonsbuffer, 1,5 ul ATPyS (16,2 mM lagerløsning, Pharmacia), 0,75 ul magnesiumacetat (20 mM lagerløsning), 12 ul (eksempel 8A) inneholdende 20-60 eller mere ng av denaturert probe i ddH20, RecA (0,137 mM lagerløsning, Pharmacia). Blandingen inkuberes i et 37°C vannbad i 10 minutter etterfulgt av tilsetning av 0,5 ul 200 mM magnesiumacetat. ;HEp-2-cellekjerner eller hele celler fremstilt og fiksert som beskrevet ovenfor blir lagret fiksert i metanol:eddikksyre 3:1 (eller andre hensiktsmessige fikser-ingsløsninger) ved minus 20°C ved en konsentrasjon på ca. 2-3 x IO<6> pr. ml. Ca. 0,5 ml av de oppslemmede kjerner, ca. 1-1,5 x IO<6> kjerner, (eller hele celler) blir sentrifugert i en "TOMY"-sentrifuge innstilt på 3-6 i et 0,5 eller 1,5 ml mikro-sentrifugerør. Kjernene eller de hele celler blir slemmet opp igjen, i rekkefølge i 200 ul til 1 ml av 70%, 85% og 100% iskald EtOH. Etter sluttsentrifugeringen og fjerning av 100% EtOH supernatant blir pelleten slemmet opp igjen i 200-500 ul IX RecA-reaksjonsbuffer i et 0,5 ml mikrosentrifugerør, ved romtemperatur, og sentrifugert. ;Den ferdige probeblanding blir blandet med pelleten, og røret plassers i et 37°C vannbad i 1,5-2,5 timer. Inkuberingen blir stanset ved tilsetning av 250 ul av 2X SSC ved 37°C fulgt av sentrifugering. Pelleten slemmes opp igjen i 250 ul av 37°C 2X SSC og inkuberes i 5 minutter ved 37°C. Etter sentrifugering blir pelleten slemmet opp igjen i 500 ul blokkeringsløsning ved romtemperatur i 20 minutter, deretter sentrifugert og slemmet opp igjen i 10 p.g pr. ml FITC-avidin i 100 ul blokkeringsløsning ved romtemperatur i 20 minutter. Røret blir sentrifugert og 250 ul 4X SSC blandet med pelleten, sentrifugert om igjen, og 250 ul 4X SSC med 0,1% "TRITON <®> X-100" blandet med pelleten, og igjen sentrifugert med 250 ul 4X SSC alle med romtemperatur. I noen tilfeller anvendes forskjellige konsentrasjoner av og/eller forskjellige vaskekomponenter. Etter en sluttsentirfugering ble pelleten blandet med ca. 20 ul anti-bleking. De fremstilte kjerner ble montert på et objektglass, og spesifikt signal blir påvist ved anvendelse av standard fluorisensmikroskopiteknikk. ;Eksempel 10 ;RecaA- medierte dobbel- D- løkke- hybirdiseringsreaksioner ved anvendelse av flere forskjellige co- faktorer ;Dette eksempel beskriver dannelsen av dobbel-D-løkke-komplekset ved anvendelse av flere forskjellige kofaktorer for RecA proteinbeleggingsreaksjonene. ;Dobbel-D-løkke reaksjoner blir utført i IX D-løkke-buffer (10X buffer: 100 mM trisacetat (pH 7,5 ved 37°C), 20 mM magnesiumacetat, 500 mM natriumacetat, 10 mM DTT og 50% glycerol (Cheng et al. 1988)) ved anvendelse av 38 ng proben og inneholdende ATPyS (Pharmacia), rATP (Pharmacia), dATP (USB) eller GTPyS (Pharmacia) ved en konsentrasjon på 1,2 mM. Reksjonene ble etablert med eller uten et regeneringssystem og inneholdt 1,2 ug lambda/Apal-mål DNA spalteprodukt (New England Biolabs, Beverly MA). Proben var lambda 280-meren (tabell 1) ende-merket med <32>P (Ausubel, et al.). Lambda-målfragmentet, dvs. det Apal-fragment som inneholder sekvenser homologe med probene, er det mindre 10,1 kb fragment angitt ved en pil i figur 16. Sluttkonsentrasjonen av RecA i alle RecA-holdige reaksjoner var 12,3 uM. Typisk var sluttmagnesiumacetatkonsentrasjonen ca. 12 mM i hver reaksjon (eksempel 4). ;Dobbel-D-løkke-dannelsesfraksjonene ble deproteinisert ved anvendelse av 10 mg/ml proteinase K og 0,5% SDS. De deproteiniserte RecA-medierte dobbel-D-løkke-hybridiseringsreaksjonene, inneholdende varmedenaturert 280-mer proben og de forskjellige co-faktorer beskrevet ovenfor, ble oppløst ved elektroforese og en agarosegel. Gelen var farget med etidiumbromid (Maniatis, et al.) og et fortografi av gelen er vist som figur 16. Gelen ble tørket og eksponert på røntgenfilm. ;Figur 17 er en autoradiografi av den tørkede gel vist i figur 16.1 figur 17 tilsvarer sporene følgende reaksjonsbetingelser. RecA: spor 2, intet RecA; sporene 1, 3-7, +RecA. CO-faktorer: ATPyS, sporene 1 og 2; rATP, sporene 3 og 4; dATP, sporene 5 og 6; GTPyS, spor 7. Sporene 3 og 5 inneholdt også et ATP-regenereringssystem [6 mM kreatinfosfat, 10 U/ml fosfokreatinkinase (Sigma, St. Louis MO) og 100 mg/ml BSA (Promega, Madison WI)]. Alle reaksjonsbetingelser var som beskrevet ovenfor. ;Prøveopprinnelsen er angitt i figurene 16 og 17. Som det kan sees av resultatene gjengitt i figur 17, ble dannet stabile dobbel-D-løkkekomplekser i nærvær av hver co-faktor, som angitt ved de merkede bånd tilsvarende plasseringen av lambda-målfragmentet på 10,1 kb (pil). ;Eksempel 11 ;RecA- medierte dobbel- D- løkke- hvbridiseringsreaksioner inneholdende ATPyS eller blanding av ATPyS og rATP ;Dette eksempel beskriver dannelsen av dobbel-D-løkke-komplekset ved anvendelse av ATPyS og blandinger av ATPyS/rATP som co-faktorer for RecA-proteinb el eggingsreaksj onene. ;Reaksjonsbetingelsene var som beskrevet i eksempel 10. Figur 18 viser fotografiet av en etidiumbromidfarget agarosegel hvorpå komponenter av deproteiniserte ;RecA-medierte dobbel-D-Løkke-hybridiseringsreaksjoner, ved anvendelse av 20 ng varmedenaturerte 500-mere prober (tabell 1), ble oppløst ved elektroforese. Probene var endemerket med <32>P som ovenfor. Gelen ble tørket og eksponert på røntgenfilm. ;Figur 19 viser en autoradiografi av den tørkede gel i figur 18.1 figur 19 tilsvarer ;sporene følgende reaksjonsbetingelser. Sporene 1, 3 og 5 - ATPyS ko-faktor (1,2 mM). Sporene 2, 4 og 6 - en kombinasjon av ATPyS og rATP ko-faktorer (henholdsvis 0,73 mM og 0,5 mM). Sporene 1, 2 og 3, 4 - reaksjoner utført med to forskjellige porsjoner av lambda/Apal mål-DNA-spalteprodukt (New England Biolabs). Reaksjonene i sporene 5 og 6 anvendte et lambda/Dral mål-DNA spalteprodukt. Alle reaksjoner inneholdt 1,5 ug av mål-DNA blanding. RecA- ;konsentrasjoner i alle reaksjoner var 6,85 uM. Alle konsentrasjoner er basert på et sluttvolum på 20 ul. Alle reaksjonsbetingelser var som ovenfor. ;Prøveopprinnelsen er angitt i figurene 18 og 19. Som det kan sees av de resultater som er angitt i figur 19, ble dannet stabile dobbel-D-løkke komplekser i nærvær av hver co-faktor, som angitt ved de merkede bånd tilsvarende lokaliseringen av lambda-målfragmenter på 10,1 kb og 8,4 kb (piler). ;Selv om oppfinnelsen er beskervet med referanse til bestemte metoder og utførelser, vil det bli forstått at forskjellige modefikasjoner og forandringer kan gjøres uten å avvike fra oppfinnelsen. ;Eksempel 12 ;En homogen diagnostisk assay ;A. Merking av lambda DNA-mål. ;For å lette evalueringen av innfangingsreaksjonen ble lambda-DNA (BRL), oppvarmet til 65°C i 5 minutter, endemerket med <32>P-merking ved anvendelse av en Klenow innfyllingsreaksjon. Merkingsreaksjonen inneholdt 10 ul 10X Klenow buffer (50 mM Tris HC1 pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 mM p-merkaptoetanol), 8 ul 1,25 mM dNTP-blanding, 5 ul [a-<32>P]-dCTP, 18,3 ul 0,82 ug/ul lambda DNA , 2 ul 5 U/ul Klenow DNA-polymerase (Pharmacia) og 56,7 ul dd H20. Etter inkubering ved 37°C i 30 minutter ble reaksjonen spunnet gjennom en Sefadex<®> G-50 (Pharmacia) kolonne i en 1 ml sprøyte, merket DNA ble utfelt i etanol i nærvær av 0,3 M NaOAc, slemmet opp igjen i 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA (TE) og deretter etanol utfelt for annen gang. Den tørkede DNA-pellet ble slemmet opp igjen i 45 ul TE-buffer. DNA-konsentrasjonen ble bestemt ved sin absorbens ved 260 nm i et spektrofotometer. ;B. DNA-probesyntese og biotinylering. ;En 1000 bp region av lambdagenomet ble syntifisert ved anvendelse av standard protokoller for termisk cyklisert PCR. Reaksjonen anvendte to kjemisk syntifiserte primere PCR02 og PCR01000 (sekvens: 5' GCGGCACGGAGTGGAGCA-AGCGTGA 3', innbefattet basene 6631 til 6655 på lambdagenomet) alle fire dNTP-forløpere og Taq DNA-polymerase (Promega). Syntifisert 1000-mer DNA ;(innbefattet lambdabasene 6631 til 7630) ble sentrifugert gjennom en sefadex G-50 (Pharmacia) kolonne og DNA gjenvunnet ved etanolutfelling (2X). Det 1000-mere DNA ble slemmet opp igjen i TE-buffer, og dets konsentrasjon ble bestemt ved OD-måling ved 260 nm og verifisert med DNA Distick™ (invitrogen). Renset 1000-mer ble deretter merket med bio-14-dATP (Gibco-BRL) ved anvendelse av BRL, Nick Translation System. Ved forsiktig modifisering av BRL-protokollen og tilsetning av to ganger den anbefalte mengde av enzymblanding og inkubering ved 15-16°C i 1 ;time og 15 minutter, ble det oppnådd DNA-prober med en gjennomsnittlig enkelt-trådstørrelse på 300-500 baser. Nick-translaterte prober ble utfelt i 0,3 M NaOAc i etanol og etter ny oppslemming i TE ble DNA-konsentrasjonen bestemt med DNA Dipstic™ (invitrogen). ;C. RecA-belegging av prober og probe:mål-hybridisering. ;Den enkelttrådete nick-translaterte proben ble belagt med RecA-protein i en reaksjonsblanding inneholdende 1 ul av 10X acetatreaksjonsbuffer (Cheng et al., 1988), 1,5 ul av 3,24 mM ATPyS (Sigma), 0,6 ul av recA (2,76 ug/ul), 4,4 ul sterilt ddH20, og 2 ul varmedenaturert DNA-probe (15ng/ul). DNA-proben ble varmedenaturert ved 100°C i 5 minutter, raskt avkjølt i et isvannbad, sentrifugert ved 4°C i en Tomy-mikrosentrifuge i 20 sekunder for oppsamling av væsken, og deretter ble den korrekte alikvot umiddelbart tilsatt til en blanding inneholdende de andre reaksjonskomponenter. Det totale volum av RecA-beleggingsreak-sjonsblandingen etter probe-tilsetningen var 10 ul. Probe-blandingen ble inkubert ved 37°C i 15 minutter etterfulgt av tilsetning av 10 ul av en lambda mål-DNA blanding inneholdende 4 ul av 10X acetatreaksjonsbuffer, 4 ul av 0,2 M Mg (OAc)2, 4 ul av <32>P-merket hel dupleks lambda DNA (280 ng/ul; tidligere oppvarmet ved 65°C i 5 minutter) og 28 ul av DDH20. Den RecA-medierte hybridiseringsreaksjon ble inkubert ved 37°C i 60 minutter, deretter ble tilsatt 1,3 ul av 300 mM EDTA (pH 8,0) for å gi en sluttkonsentrasjon på ca. 20 mM. Denne ble etterfulgt av tilsetning av 21 ul av 20 mM Tris-acetatbuffer pH 7,5 med 1 M NaCl for å gi en endelig saltkonsentrasjon på 0,5 M. Tre kontrollreaksjoner ble kjørt sammen med RecA-reaksjonen inneholdende lambda-probe. Den første kontrollreaksjon var identisk med ReeA-reaksj onen bortsett fra at den ikke inneholdt RecA-protein og isteden ble tilsatt en tilsvarende mengde av RecA-lagerbuffer. De to andre kontrollreaksjoner var identiske med eksperimentene inneholdende lambda probe, bortsett fira at lambda probene var erstattet med en ekvivalent mengde av ikke-merket, nick-translatert cpX174 DNA RFI DNA (NEBiolabs). Ca. 5 minutter før anvendelse ble 300 ml av Dynabeads<®> (Dynal) vasket tre ganger i 20 mM Tris-acetat pH 7,5, 1 M NaCl. Vaskebufferen ble fjernet ved oppsamling av kulene i et magnetisk separasjonsapparat (Promega) og hver hybridiseringsreaksjon (i 0,5 M NaCl) ble tilsatt til en separat alekvot (100 ul) av vaskede kuler i et mikrosentrifugerør og inkubert med kuler ved romtemperatur i 30 minutter med leilighetsvis forsiktig rysting av rørene for omhyggelig å slemme opp igjen kulene i reaksjonsvæsken. Etter innfanging ble væsken fjernet, og kulene ble vasket 3X med 100 ul 20 mM Tris-acetat pH 7,5, 1 M NaCl. ;Radioaktiviteten på kulene og i vaskingene ble bestemt ved telling i Safety-Solve (RPI Corp.) i en Packard Scintillation counter. Resultatene av disse eksperimenter er vist i tabell 3. ;Forklaring til tabell 3: det ble utført RecA-medierte dobbel-D-løkke reaksjoner ved anvendelse av biotinylerte (nick-translatert med bio-14-dATP) lambda DNA-prober, eller ikke-merkede (nick-translatert med dATP) (pX174 RFI-prober, og <32>P-merkede hele lambda genomiske DNA mål. de enkelttrådete prober oppnådd ved nick-translasjon hadde gjennomsnittlig størrelse på 300-500 baser og lambda DNA probene var alle homologe med en tilgrensende 1000 bp region av lambda virus genomet. RecA-belagte ss prober ble omsatt med lambda mål DNA i 1 time ved 37°C, behandlet med 20 mM EDTA og 0,5 M NaCl, og affmitetsinnfanget på ferskt vaskede streptavidinbelagte magnetiske Dynabeads<®> (Dynal). Ikke-innfanget DNA ble fjernet fra reaksjonsblandingen ved vasking. % av <32>P-merket lambda DNA som var tilbake på kulene etter vaskingen, ble bestemt ved scintillasjonstelling. Reaksjoner uten RecA-protein og/eller med cpl74 DNA-sekvenser som probe, tjente som kontroller (se tekst og metoder for detaljer). Resultatene viser at dobbel-D-løkke hybrider dannet mellom nick-translaterte prober og store dobbelttrådete mål-DNAer kan innfanget spesifikt og påvises med magnetiske kuler. ;D. Signaloppformering ;Med det formål å påvise innfanget mål-DNA når målet ikke er merket og/eller for oppformering av signal for påvisning av et lavt antall målkopier, ble de vaskede Dynabeads<®> med tilknyttet innfanget DNA vasket en gang i IX T7-buffer (10X buffer: 400 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 50 mM/DTT) og deretter slemmet opp igjen i 44 ul oppformeringsreaksjonsblanding inneholdende 31,1 ul ddH20, 0,5 ul hver av 10 mM dCTP, dGTP og dTTP, 9,4 ul 0,53 mM bio-14-dATP (BRL) og 2 ul 0,8 uM av poly(A) primer [sekvens: 5'Ai5ATACG-GCTGAGGTTTTCAACGGC 3': innbefattet baser (uten poly(A)-hale), er nummer 8001 til 8023 på lambda genomet]. Primeren, mål-DNA blandingen ble deretter oppvarmet til 100°C i 5 minutter og avkjølt til -37°C i ca. 10 minutter før følgende ble tilsatt; 5 ul 10X T7 buffer, 0,5 ul 13 U/ul T7 sekvenase<®> versjon 2,0 (USB), og ddH20 til et sluttvolum på 50 ul. Reaksjonen ble deretter inkubert i 1 time ved 37°C før den ble stanset ved tilsetning av 5 ul av 0,3 M EDTA pH 8,0. ;E. Signalpåvisning ;Innkorporering av bio-14-dATP i primersyntetisert DNA ble påvist ved anvendelse av Southern-Light™ (Tropix) kjemoluminescens assay. DNA fra oppformerings reaksjoner med og uten T7-enzym ble fortynnet hensiktsmessig i TE, og 1 ul av DNA blanding ble tilsatt til 4 ul 200 mM NaOH med 12,5 mM EDTA, inkubert ved romtemperatur i 5 -10 minutter, deretter prikket ut på tørr tropilon-45™ nylonmembran på plastomvikling. DNA-flekkene ble lufttørket, den tørkede membran overført på 3 MM CHR (Whatman) kromatografi-papir og 20X SSC ble dryppet ut på 3 MM papiret omkring kantene på nylonmembranen. Når DNA-flekkene ble fuktet, ble DNA tverrbundet til membranen med en Stratagene Stratalinker innstilt på "auto". Etter at nylonmembranen var fullstendig fuktet med 20X SSC, ble det anvendt Southern-Light™ (Tropix) biotinylert DNA-påvisningsfremgangsmåte med AVIDx-AP (alkalisk fosfatase; Tropix) og AMPPD-substrat, ifølge produsentens anbefalte protokoll. Kjemoluminescens ble påvist ved anvendelse av et kameraluminometer (Tropix) og Polaroid 612 film. Sammenligning av resultater fra reaksjonene med og uten T7 sekvinase<®> viste at biotin var blitt inkorprert i DNA og lett lot seg påvise ved anvendelse kjemoluminescens assay. Dersom påvisning anvender en indirekte merkepåvisnings-fremgangsmåte (dvs. biomerke omsatt ved AVIDx-AP for påvisnig, eller en direkte påvisning av inkorporert merkelapp, slik som FITC) og påvisningstrinnet blir utført på kuler [Dynabeads<®>, Dynal; oligo (dT) kuler, Promega], eller på en matriks (slik som oligo(dT) cellulose, Stratagene poly(A) Quick™], må innfangingsmatriksen inkuberes med noe middel for å blokkere den ikke-spesifikke klebing av påvisningsreagensen til matriksen, I-Block reagensblanding (Blocking Buffer: Southern-Light™, Tropix) har vært anvendt for dette formål. Vaskede kuler [eller origo(dT) cellulose], med tilknyttet DNA ble vasket IX i Blocking Buffer og deretter inkubert i BLocking Buffer i 10-30 minutter, før vasking pg tilsetning av AVIDx-AP (Tropix). Overskudd av ikke-bundet AVIDx-AP ble deretter fjernet ved vasking ifølge Tropix-protokollen. Innfangingsmatriksen ble deretter vasket med en buffer som er forenlig med substratpåvisning (Assay Buffer, Tropix kan anvendes for påvisning ved kjemoluminescens; alternativt for påvisning ved fiuoressens, kan det anvendes ATTOFOS-systemet til JBL Scientific, med dets forlikelige buffere). Substrat blir tilsatt, og det DNA-bundete AP blir påvist ved hensiktsmessige midler. *

Claims (59)

1. Diagnostisk fremgangsmåte for påvisning av en lineær dupleks DNA-analytt, som har en første og en andre tråd, inneholdende en første intern DNA målsekvens, karakterisert ved å tilveiebringe et sett av to DNA-prober som har en første og en andre probe-tråd, hvor den første og den andre probe-tråd (i) inneholder komplementære sekvenser til den første og den andre målsekvens-tråd, og (ii) hvor disse komplementære sekvenser også inneholder komplimentær overlapping mellom probe-trådene, å belegge probene med RecA-protein i en RecA-protein beleggingsreaksjon, å kombinere de RecA-belagte prober med det lineære dupleks-DNA, som inneholder målsekvensen, under betingelser som frembringer et probe:mål-kompleks inneholdende probetrådene og begge måltråder, hvor nevnte kompleks er stabilt mot deproteinisering, å påvise tilstedeværelsen av dette probe-DNA i probe:mål-komplekset.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes DNA-prober som fremstilles ved nick-translasjon.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en beleggingsreaksjon som inneholder en ko-faktor valgt fra gruppen bestående av ATpyS, rATP, dATP, og GTPyS.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det anvendes en ko-faktor som er rATP og at nevnte reaksjon utføres i nærvær eller i fravær av et ATP-regenererende system.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en ko-faktor som er en blanding av ATPyS og rATP eller ATPyS og ADP.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det anvendes en ko-faktor som er ATPyS.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det anvendes en ko-faktor som er dATP.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et RecA-protein som er villtype-proteinet av Escherichia coli.

9 Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et RecA-protein som er RecA 803-proteinet av Escherichia coli.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en region av komplimentær overlapping mellom probetrådene som er minst ca. 78 base par og mindre enn ca. 500 base par.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en probetråd som inneholder en endeterminal utvidelse av DNA som ikke er komplimentær til noen av mål-trådene.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at det anvendes probetråder som inneholder en endeterminal DNA utvidelse og at DNA utvidelsene er komplementære til hverandre.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en probetråd som inneholder en radioaktiv gruppe.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte påvisning blir gjennomført ved deproteinisering av probe:mål-komplekset, etterfulgt av elektroforeseseparasjon av probe:mål-komplekset fra den frie proben.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den første probetråd blir merket med en innfangingsgruppe og den andre probetråd blir merket med en påvisningsgruppe.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at det anvendes en innfangingsgruppe som er biotin og at innfangingen av probe:mål-komplekset blir oppnådd ved anvendelse av streptavidin.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at det anvendes streptavidin som er bundet til en fast bærer.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at den andre probetråd inneholder en påvisningsgruppe valgt fra gruppen bestående av en radioaktiv merking og digoksigenin.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at det anvendes en påvisningsgruppe som er digoksygenin og at tilstedeværelsen av digoksigenin blir påvist ved anvendelse av et antidigoksigenin-antistoff inneholdende en raportørgruppe.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for påvisning av restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme, karakterisert ved å beskytte et kjent restriksjonssete ved anvendelse av probermål-komplekset inneholdende begge probetråder og å undersøke fragmenteringsmønstret som skriver seg fra restriksjonsenzymdigenering av mål-DNA.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte beskyttelse blir oppnådd ved spalting med restriksjonsenzymet før deproteinisering av probe:mål komplekset.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte beskyttelse blir oppnådd ved metylering av begge probetråder før belegging av de to probetråder med RecA-protein i RecA-protein beleggingsreaksjonen.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at påvisningsfremgangsmåten dessuten omfatter analyse av restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme, hvor spalting av mål-DNA blir oppnådd ved tilknytning av en gruppe til en eller begge probetråder som er i stand til å spalte mål-DNA under dannelse av probermål-komplekset, og danne reaksjonsbetingelser som tillater spalting av dette mål-DNA ved spaltegruppen.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at det anvendes en spaltegruppe som er et jern Fe(II)-molekyl.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at det anvendes en spaltegruppe valgt gruppen bestående av ikke-spesifikke fosfodiesteraser og restriksjonsendonukleaser.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en påvisningsfremgangsmåte som dessuten omfatter analyse av restriksjonsfragmentlengde polymorfisme, hvor spalting av mål-DNA blir oppnådd ved å danne probe:mål komplekset ved tilknytning av en gruppe som er i stand til å spalte dette mål-DNA til en eller begge probetråder og danne reaksjonsbetingelser som tillater spalting av dette mål-DNA ved spaltegruppen.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte påvisning blir oppnådd ved DNA-polymerasebefordret primerutvidelse fra 3'-endene av en eller begge probetråder, hvori primerutvidelsen blir gjennomført i nærvær av alle fire dNTPer og en eller flere dNTP inneholder en påvisbar gruppe.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved dessuten å tilveiebringe et andre sett av to DNA-prober, som har en første og en andre probetråd komplementære til en andre dupleks-målsekvens, hvor den første probetråd inneholder sekvenser komplementære til en tråd av den andre målsekvens og den andre probetråd inneholder sekvenser komplementære til den andre tråd av den andre målsekvens, hvor (i) disse prober også har en region av komplementær overlapping til hverandre, og (ii) det andre probe-sett ikke hybridiserer til første probe-sett.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at det anvendes DNA-prober som fremstilles ved nick-translasjon.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at det første probe-sett blir merket med en innfangingsgruppe og det andre probesett blir merket med en påvisningsgruppe.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at det anvendes en innfangingsgruppe som er biotin eller digoksigenin.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at det anvendes en påvisningsgruppe valgt fra gruppen bestående av et radioaktivt merke, biotin og digoksygenin.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at nevnte påvisning omfatter anvendelse av et innfangingssystem som fanger inn probermål-komplekset.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33, karakterisert ved at innfangingssystemet involverer biotinylering av et probe-sett og at innfangingen blir oppnådd ved anvendelse av streptavidin.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at det anvendes streptavidin bundet til en fast bærer.

3 6. Fremgangsmåte ifølge krav 2 8, karakterisert ved at det anvendes to probe-sett som definerer en intern region av mål-DNA og at hvert probe-sett har en tråd inneholdende en 3'-ende internt til regionen og en 3'-ende eksternt til regionen.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at nevnte påvisning blir oppnådd ved DNA polymerasebefordret primerutvidelse fra 3'-endene av hver probetråd, hvori primerutvidelsereaksjonen blir gjennomført i nærvær av alle fire dNTP'er og et eller flere dNTP inneholder en påvisbar gruppe.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert ved at de eksterne 3'-ender av hver probetråd er blokkert slik at primerutvidelsen ikke er mulig fra de eksterne 3'-ender.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 38, karakterisert ved at prim erutvidelsesreaksj onen blir gjennomført under den temperatur som kreves for termisk dissosiasjon av de to måltråder og blir fortsatt inntil det oppnås en ønsket grad av oppformering av mål-sekvensen.

40. Fremgangsmåte ifølge krav 39, karakterisert ved at nevnte reaksjon omfatter ytterligere tilsetning av DNA polymerase.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 39, karakterisert ved at nevnte reaksjon omfatter ytterligere tilsetning av RecA-proteinbelagte prober.

42. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte beleggingsreaksjon inneholder ATPyS.

43. Fremgangsmåte ifølge krav 42, karakterisert ved at nevnte DNA-prober blir fremstilt ved nick-translasjon.

44. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at anvendes en beleggingsreaksjon som inneholder ATP.

45. Fremgangsmåte ifølge krav 44, karakterisert ved at det anvendes DNA-prober fremstilt ved nick-translasjon.

46. Fremgangsmåte for isolering av en lineær dupleks DNA-analytt som har en første og en andre tråd, inneholdende en første intern DNA målsekvens, hvor nevnte duplekse DNA-analytt er tilstede i en blanding av nukleinsyremolekyler, karakterisert ved å tilveiebringe et sett av to DNA-prober som har en første og en andre probe-tråd, hvor den første og den andre probetråd (i) inneholder komplementære sekvenser til den første og den andre målsekvenstråd, og (ii) hvor disse komplementære sekvenser også inneholder komplementær overlapping mellom probetrådene, å belegge probene med RecA-protein i en RecA-protein beleggingsreaksjon, å kombinere de RecA-belagte prober med det lineære dupleks-DNA som inneholder målsekvensen, under betingelser som frembringer et probe:mål kompleks inneholdende probetrådene og begge måltråder, hvor nevnte kompleks er stabilt mot deproteinisering, å skille probe.mål-komplekset fra blandingen av nukleinsyremolekyl, å isolere den duplekse DNA-analytt innerholdende målsekvensen fra probermål komplekset.

47. Fremgangsmåte ifølge krav 46, karakterisert ved at det anvendes DNA-prober fremstilt ved nick-translasjon.

48. Fremgangsmåte ifølge krav 46, karakterisert ved at det anvendes prober som er bundet til en fast bærer.

49. Fremgangsmåte ifølge krav 46, karakterisert ved at det anvendes prober som inneholder minst en biotingruppe.

50. Fremgangsmåte ifølge krav 49, karakterisert ved at nevnte atskillelse blir oppnådd ved anvendelse av streptavidin.

51. Fremgangsmåte ifølge krav 50, karakterisert ved at det anvendes streptavidin som er bundet til en fast bærer.

52. Fremgangsmåte ifølge krav 46, karakterisert ved at nevnte isolering dessuten omfatter varmedenaturering av probe:mål komplekset ved en temperatur (i) tilstrekkelig til å frigjøre dupleks-DNA analytten inneholden målsekvensen fra komplekset, og (ii) under smeltetemperaturen for den duplekse DNA-analytt inneholdende målsekvensen.

53. Fremgangsmåte ifølge krav 52, karakterisert ved at den duplekse DNA-analytt blir denaturert til enkelttrådet DNA.

54. Fremgangsmåte ifølge krav 46, karakterisert ved at nevnte isolering dessuten omfatter varmedenaturering av probe:mål komplekset ved en temperatur (i) tilstrekkelig til å frigjøre den duplekse DNA-analytt inneholdende målsekvensen fra komplekset, og (ii) ved eller over smeltetemperaturen for den duplekse DNA-analytt inneholdende målsekvensen.

55. Fremgangsmåte for påvisning av lineær dupleks DNA-analytt som har en første og en andre tråd, inneholdende en første interne DNA målsekvens, hvor nevnte duplekse DNA-analytt er tilstede i en blanding av nukleinsyremolekyler, karakterisert ved å isolere den lineære duplekse DNA-analytt som beskrevet i krav 46, hvori nevnte isolering dessuten omfatter varmedenaturering av probe:mål-komplekset ved en temperatur (i) tilstrekkelig til å frigjøre den duplekse DNA-analytt inneholdende målsekvensen fra komplekset, og (ii) ved eller over smeltetemperaturen for den duplekse DNA-analytt inneholdende målsekvensen, å tilsette minst en DNA-synteseprimer som er komplementær til målsekvensen og har 5' og 3'-ender, hvor nevnte primer ikke inneholder sekvenser som var tilstede i noen av de to DNA-prober, og hvor påvisningen av DNA-analytten blir oppnådd ved DNA-polymerasebefordret primerutvidelse fra 3'-enden av primeren, hvori primerutvidelsen blir gjennomført i nærvær av alle fire dNTP'er og minst ett dNTP inneholder en påvisbar gruppe.

56. Fremgangsmåte ifølge krav 55, karakterisert ved at det anvendes DNA-prober fremstilt ved nick-translasjon.

57. Fremgangsmåte ifølge krav 55, karakterisert ved at det anvendes en primertråd som inneholder en ende-terminalutvidelse av DNA som ikke er komplementær til noen av mål-trådene.

58. Fremgangsmåte ifølge krav 55, karakterisert ved at det anvendes minst en DNA-syntese primer som inneholder en innfangingsgruppe.

59. Fremgangsmåte ifølge krav 58, karakterisert ved at nevnte påvisning dessuten omfatter dannelse primerutvidelsesprodukter som inneholder innfangingsgruppen og at påvisningsgruppen og nevnte produkter blir isolert ved anvendelse av nevnte innfangingsgruppe.