KR100245284B1 - 이중 d-루프 형성의 진단학적 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RecA 단백질에 의해 촉진시켜 탈단백화에 안정한 이중사슬의 탐침: 이중사슬의 선형 타겟 DNA 복합체를 형성시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 안정한 탐침:복합체는 진단학적/DNA 검출계, 시험관내(in Vitro) 및 인 시튜(in-situ) 혼성화 반응계에 사용될 수 있다. 본 발명에 의한 탐침:타겟 복합체는 RecA 단백질에 의해 촉진되는 DNA 증폭 반응에서 진단학적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

이중 D-루프 형성의 진단학적 응용

본 발명은 미합중국 출원 제 07/910,791호(1992. 7. 9. 출원)의 일부 계속 출원이고, 상기의 모출원은 미합중국 출원 제07/755,462호(1991. 9. 4. 출원)의 일부 계속 출원이며, 이의 모출원 역시 미합중국 출원 제07/520,321(1990. 5. 7. 출원)의 일부 계속 출원이다. 상기 출원들은 모두, 현재 특허청에 계속 중이며 본 출원인이 공동으로 소유하고 있다.

[발명의 분야]

본 발명은, 2개의 탐침(probe) 포획/검출계, RecA에 의해 촉진되는 DNA 증폭반응 및 인-시튜(in-situ)혼성화 반응등의 다양한 진단방법에 이용될 수 있는, 안정한 이중 D-루프 구조(RecA에 의해 촉매됨)의 형성방법에 관한 것이다.

[참고문헌]

[발명의 배경]

RecA + 단백질(와일드 타입)은 이. 콜라이(Escherichia coli)에서 발견되는 37,842 달톤의 단백질로서 상동적 DNA 재조합반응에서 중요한 역할을 한다. 이에 관한 생화학적 및 효소학적 정보는 대부분 정제된 RecA + 단백질을 이용한 시험관내(in-vitro) 연구에 의해서 얻어졌다. 많은 시험관내 연구 결과들은, RecA + 단백질이 상동적 DNA 배열들간의 염기 쌍 형성반응에 긴밀히 관여하여, 궁극적으로는 상동적인 재조합이 이루어지도록 한다는 사실을 보여 주였다(Radding; RecA 단백질의 성질에 대한 최신 개관을 위해서는 Cox et al, 또는 Roca et al. 참조). RecA + 단백질이 DNA 진단에 유용하게 응용되는 것은 그러한 염기쌍 형성 반응에 관여하는 성질 때문이다.

RecA + 단백질은 ATP 존재하에 많은 기질들간의 사슬(strand)교환 반응을 촉진시키는데, DNA 탐침으로 사용하는 데에 가장 바람직한 기질은 단일 사슬 또는 이중 사슬의 DNA이다. RecA 단백질로 피복된(coated) 단일 사슬의 DNA 탐침은 초기에, 혼성화되어 있고 부분적으로 결합되어 있는 (단일) D-루프(일정한 경우 세사슬로 이루어진 구조임)라고 불리는 분자체를 포함하는 재조합 중간체를 형성하면서, 이중 사슬("천연적인")의 상동적 타겟 배열부분과 상호 작용한다(Shibata et al., 1979). 그 다음에 곁가지가 이동되고, 원래의 단일사슬 DNA와 이중사슬의 DNA 사이에 완전한 혼성화 분자가 형성되는데, 이는 그들의 상동적 정도에 따라 달라진다.

선형 타겟에 있는 짧은 치환 루프나 세사슬으로 이루어진 D-루프 구조는 통상 단백질이 떨어져나가면 불안정하게 된다. 그러나, RecA 단백질은, ATPγS 및 과량의 RecA 단백질이 존재하는 경우, 9 내지 20bp(또는 그이상) 정도의 길이를 갖는 짧은 올리고 뉴클레오티드와 안정한 복합체를 형성하는 것으로 나타났다(Leahy et al, ). 선형의 이중 사슬을 타겟으로 사용할 경우, RecA가 제거된 후에도 탐침 타겟간(상보적) 결합을 안정하게 유지시키려면

i) 상동적(염기)배열이 적어도 38 내지 56bp는 되어야 하고

ii) 타겟이 되는 상동적 배열이 선형 이중 사슬구조의 말단에 위치해야 하는 것으로 보인다(Hsieh et al, 1990; Gonda et al. ).

리가스 등(Rigas et al)은, 음성적으로 슈퍼코일된(negatively supercoiled)이중사슬의 환상 DNA 플라스미드를 타겟으로 사용할 경우, 단일 사슬의 43-올리고머가 단백질이 분리된 후에도 안정한 단일의 D-루프 복합체를 형성할 수 있다록 보고한 바 있다.

음성적으로 슈퍼코일된 이중 사슬의 환상 DNA 타겟이 사용되면, RecA로 피복된 단일 사슬의 올리고 뉴클레오티드 탐침도 소랄렌 교차결합(psoralen crosslinking)을 RecA 단백질 제거전에 형성함으로써 안정화될 수 있다; 탐침-타겟의 단일 D-루프체는 올리고머가 30-올리고머 이상의 크기이면 회수 가능하다(Cheng et al., 1989). 이중사슬의 선형 DNA를 타겟 DNA로 사용하여, 소랄렌 교차 결합에 의해서 안정화된 단일의 D-루프 탐침-타겟 복합체를 얻기 위해서는 그 탐침이 적어도 80 내지 107-올리고머 크기이어야 한다(Cheng et al., 1988) : 이 반응은 음성적으로 슈퍼 코일된 환상의 타겟 DNA에서 일어나는 반응과 비교시 그 효율이 매우 낮다.

본 발명을 뒷받침하기 위해서 행한 실험들에 의하면 상호간에 상보적 배열을 가진 이중 탐침을 혼성화 반응에 사용함으로써, 탈단백화에 대해서 안정한 탐침:타겟 DNA 복합체를 RecA 단백질에 의해 촉매화되는 반응에서 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 발견으로 RecA 단백질에 의해 촉진형성되는 안정한 탐침:타겟 혼성화 복합체를 다양한 진단방법에 응용할 수 있게 되었다.

[발명의 요약]

본 발명은 제1 및 제2사슬을 가진 선형의 이중사슬 DNA 분석물(이 분석물은 일차 DNA 타겟 배열을 내부에 함유함)을 검출하기 위한 진단방법을 포함한다. 그 방법은, 각각 제1타겟 배열 사슬 또는 제2타겟 배열 사슬에 상보적인 배열을 함유하는 한 세트의 두가지 DNA 탐침을 제공하며, 이들 탐침들은 상호 오버랩되는 상보적 영역을 가진다. 이어 두가지 탐침 사슬들을 RecA 단백질 코팅 반응에 의해서 RecA 단백질로 피복한다. RecA로 피복된 탐침들을 탐침:타겟 복합체를 생성할 수 있는 조건하에서 타겟 배열을 함유하는 선형의 이중사슬 DNA와 결합시킨다. 이 탐침:타겟 복합체는 두가지 탐침의 사슬들과 선형의 (DNA) 분석물의 이중 사슬을 포함하고 있다. 이 탐침:타겟 복합체는 탈단백에 대해서도 안정하다. 그러나 본 발명의 방법에서 이 복합체가 반드시 탈단백되어야 하는 것은 아니다. 그 다음에, 탐침:타겟 복합체에 있는 탐침 DNA의 존재를 검출할 수 있다.

본 발명의 한가지 실시형태에 의하면, RecA 단백질은 이. 콜라이의 와일드 타입 RecA 단백질이다. RecA 단백질은 이. 콜라이의 recA-803 변이 단백이거나 그밖의 다양한 공급원으로부터 얻어지는 RecA양(RecA-like)단백질 일 수 있다.

본 발명에서 RecA 단백질 피복반응은 ATPγS, rATP (단독 및 재생계의 존재하에서), dATP, GTPγS, ATPγS 및 rATP의 혼합물 그리고 ATPγS 및 ADP의 혼합물 등의 다양한 보조 인자들을 사용하여 수행할 수도 있다.

본 발명의 한가지 실시형태에 의하면, 탐침 사슬간의 상보적 오버랩 영역은 78 염기상 이쌍이고 500 염기쌍 이하의 크기이다. 탐침 사슬들은 타겟 사슬엥 상보적이지 않은 말단의 DNA 연장 영역을 포함하고 있을 수 있다. 두개의 사슬이 모두 그러한 말단의 연장 영역을 포함하고 있을 때에는 이 DNA 연장 영역들이 서로 상보적일 수 있다.

본 발명에 의한 검출법을 시행하는 한가지 방법은 탐침:타겟 복합체를 탈단백화하고 전기 영동에 의해서 결합되어 있지 않은 탐침을 탐침:타겟 복합체로 부터 분리하는 것이다. 탐침:타겟 복합체는, 페놀-베이스 방법(Phenol-based method)과 같은 화학적 표준 제단백 방법 뿐만아니라 SDS 또는 프로테인아제 K로 처리하는 방법등을 포함하는 다양한 방법에 의해서 탈단백화 될 수 있다. 또 한편으로 검출법은 포획계를 사용하여 실시할 수 있다. 포획계는 탐침:타겟 복합체를 포획하는데, 여기에서 제1탐침 사슬은 포획기(captrue moiety) 라벨되고 제2탐침 사슬은 검출기(detection moiety)로 라벨된다. 예를 들어 하나의 탐침 사슬은 비오틴(biotin)으로 라벨되고, 다른 한 사슬은 디곡시제닌(digoxigenin)으로 라벨될 수 있다. 그 다음 이 탐침:타겟 복합체를 스트렙트아비딘(또는 아비딘)의 고형 지지판/라벨된 항-디곡시제닌이나 항-디곡시제닌 항체의 고형 지지판/라벨된 스트렙트아비딘(또는 아비딘)을 이용하여 포획/검출한다. 또다른 실시 형태에서는 제1탐침 사슬이 포획기를 포함하고 있고 제2탐침사슬이 검출에 사용될 방사성 라벨을 포함하고 있다.

탐침사슬들은 여러가지 다양한 방법, 예를 들면 탐침에 부착된 비오틴 또는 디곡시제닌 및 스트렙트아비딘(또는 아비딘) 또는 항 디곡시제닌 항체를 각각 사용하여, 포획을 위해 라벨할 수 있다. 탐침사슬들은 검출될수 있도록 방사성, 비오틴, 디곡시제닌 등을 포함하는 여러 기능기들에 의해 라벨될 수도 있다. 방사성 라벨은 예를 들면 방사선 사진이나 신틸레이션 카운팅등에 의해 확인할 수 있다. 비오틴이나 디곡시제닌의 존재는 스트렙트아비딘이나 항-디곡시제닌 항체에 의해서 각각 검출될 수 있다. 그 스트렙트아비딘(또는 아비딘)이나 항-디곡시제닌은 방사성, 효소(예를 들면, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시디아제, 베타-갈락토시다아제 또는 글루코스 옥시다아제) 또는 플로로크롬(예를 들면, 형광, R-피코에리트린 또는 로다민)으로 라벨되어 있다. 탐침:타겟 복합체내에 있는 탐침 사슬들은 DNA 폴리미라아제에 의해 촉진되는, 각 탐침 사슬의 3'-말단으로부터의 프리머(primer) 연장반응에 의해서도 검출할 수 있다. 상기 프리머 연장반응은 4가지 dNTPs가 모두 존재하는 가운데 수행되며, 하나 이상의 dNTP가 검출가능한 기능기를 포함하고 있다.

본 발명의 방법은 나아가 두개의 DNA로 구성된 2차 탐침 세트를 제공한다. 그 두개의 DNA 탐침들은 이중 사슬의 이차 타겟 배열에 상보적인 제1사슬 및 제2사슬을 가지고 있는데, 그 제1사슬은 이차 타겟중의 한 사슬에 상보적인 배열을 함유하고 있으며 제2사슬은 동 타겟중의 다른 한사슬에 상보적인 배열을 함유하고 있다. 또한

i) 이들 탐침은 이들 상호간에 상보적으로 오버랩되는 영역을 가지고 있으며

ii) 이차 탐침 세트는 일차 탐침세트와 혼성화되지 않는다.

상기의 두가지 탐침세트는 RecA 단백질 피복반응에 의해서 RecA 단백질에 의해 피복될 수 있다. RecA로 피복된 탐침세트들은, 두개의 타겟 배열을 가진 선형의 이중사슬 DNA와 결합될 수 있다. 이 결합반응은 4개의 탐침 사슬이 모두 포함되어 있는 탐침:타겟 복합체를 형성하는 조건하에서 행해진다. 그 결과 얻어진 탐침:타겟 복합체는 탈단백에 대해서 안정하다. 이어 탐침:타겟 복합체내에 있는 탐침 DNA의 존재를 검출한다.

두개의 탐침 세트가 관여하는 방법은, 전술한 바와 같이 하나의 탐침 세트에 의한 방법이 다방면으로 이용되는 것처럼 다양하게 이용될 수 있다. 예를 들면, 일차 탐침 세트는 포획기로 라벨되고, 이차 탐침세트는 검출기로 라벨될 수 있다.

두개의 탐침세트가 관여하는, 이중사슬의 탐침; 이중사슬의 타겟 복합체는 RecA 단백질에 의해 촉진되는 DNA 증폭방법에도 사용될 수 있다. 예를 들어 두개의 탐침 세트는 ATPγS[또는 rATP(적절한 ATP 재생계가 존재할 수도 있고 존재하지 않아도 무방), dATP 그리고 ATPγS 및 ADP의 혼합물]의 존재하에서 이중사슬의 타겟 배열에 혼성화되고, 4개의 dNTPs, RecA 단백질 및 DNA 폴리머라아제를 포함하고 있는 반응혼합물내에서 반응한다. 이 반응은, 두개의 타겟 사슬이 열에 의해 해리(thermal dissociation)되는 온도 보다 낮은 온도에서 수행하며, 타겟 배열이 원하는 정도로 증폭될 때까지 계속한다. i) DNA 폴리머라아제 및 ii) RecA 단백질로 피복된 탐침들을 상기 증폭 반응 중간에 반복하여 첨가할 수 있다. 본 발명에 적용될 수 있는 증폭반응법들은 현재 동시 계속중인 미합중국 출원 제 071 520,321호(1990. 5. 7. 출원)에 개시되어 있다. 각 탐침 세트에서 한 사슬의 3'-말단은 두개의 프리머 세트에 의해서 결정되는 영역의 내부가 될 것이다 : 이들 말단은 증폭반응에 필요하다. 그러나 두개의 프리머 세트에 의해 결정되는 영역의 외부에 있는, 각 프리머 쌍의 반대편 3'-말단은 이들 말단으로부터 연장된 물질이 생기지 않도록 차단될 수 있다. 이 증폭방법은 검출 방법으로도 사용될 수 있는데, 이때 탐침:타겟 복합체내의 탐침은 각 탐침 사슬의 3'-말단으로부터 DNA 폴리머라아제에 의해 프리머를 연장시킴으로써 검출할 수 있다. 상기 프리머 연장 반응은 4개의 dNTP가 모두 존재하는 가운데 수행되며, 하나 이상의 dNTP가 검출 가능한 기능기를 포함하고 있다.

두 사슬의 탐침; 이중사슬의 타겟 복합체는, 타겟이 되는 어떤 제한 부위의 절단을 봉쇄하기 위해서도 사용될 수 있다. 절단에 대한 봉쇄는

i) 탐침:타겟 복합체를 형성시킨 후 복합체의 탈단백화 이전에 제한 효소로 처리하는 방법;

ii) 선택된 효소의 메틸기에 대한 민감도를 고려하여, 메틸화되어 있거나 혹은 되어 있지 않은 탐침을 사용하는 방법; 및

iii) 탐침의 각 사슬에 비상보적인 배열을 도입시켜, 타겟부위에 혼성화되도록 함으로써 제한 부위을 없애도록 하는 방법 등을 포함한 여러가지 방법에 의해서 행할 수 있다.

이중사슬의 탐침; 이중 사슬의 타겟 복합체는, 타겟이 되는 이중 사슬의 DNA에 부위 특이적인 절단이 생기도록 하는데에도 사용될 수 있다. 상기 이중사슬 탐침은 타겟이 되는 이중사슬의 각 사슬을 절단할 수 있는 기능기들에 의해 변형될 수 있다. 절단하는 기능기의 성질에 따라 탈단백화전에 또는 후에 탐침을 변형시킬 수 있다. 그러한 기능기들의 예로는 철 Fe Ⅱ(철/EDTA에 의해 촉진되는 절단에 사용), 비특이적 포스포디에스터라아제 및 제한 엔도 뉴클레아제들 들 수 있다. 어떤 경우이든지 간에 이중사슬의 올리고 뉴클레오티드 탐침에 의해 정해지는 타겟 배열에 절단의 특이성이 부여된다.

제한 부위의 보호법 및 부위 특이적 절단법 모두가, 제한된 단편길이의 다형분석에 유용하다.

본 발명 또다른 실시형태는, 제1사슬 및 제2사슬을 가지고 있고 그 내부에 일차 DNA 타겟 배열을 함유하고 있는 선형의 이중사슬 DNA 분석물이 핵산 분자들과 섞여 있을 때, 그것을 분리해내는 방법을 포함한다. 이 방법에서는 제1 및 제2탐침 사슬로 구성된 한 세트의 두가지 DNA 탐침이 사용되며, 제1 및 제2탐침 사슬들은

(i) 타겟이 되는 제1 및 제2사슬의 배열에 상보적인 배열을 포함하고 있으며,

(ii) 이 상보적인 배열들은 탐침사슬간에 상보적으로 오버랩되는 영역을 포함하고 있다.

이 탐침들은 그다음 RecA 단백질로 피복된다. 피복된 탐침들은 타겟이 되는 배열을 포함하고 있는 선형의 이중사슬 DNA와 결합하여, 그 탐침 사슬들 및 두개의 타겟 사슬들을 포함하고 있는 탐침:타겟 복합체를 형성한다 : 그 결과 얻어진 탐침:타겟 복합체는 제단백에 대해 안정하다. 그 탐침:타겟 복합체는 핵산 분자들의 혼합물로부터 분리된다. 그러면 타겟 배열을 포함하고 있는 이중 사슬의 DNA 분석물이 분리되는 것이다.

이 방법에서는 예컨대, 스트렙트아비딘이나 이비딘에 의해 포획되는 비오틴기를 함유하고 있는 탐침을 이용하여, 핵산 혼합물로부터 상기 복합체를 분리할 수 있다. 스트렙트아비딘이나 아비딘은 고형 지지대(예를 들면, 상자성 비드들; Paramagnetic beads)에 결합되어 있을 수 있다.

상기 방법은, i) 복합체로부터 타겟 배열을 포함하고 있는 이중 사슬의 DNA 분석물을 분리해내기에 충분하면서, ii) 타겟 배열을 포함하는 이중사슬 DNA 분석물의 융점 미만인 온도에서, 분리된 탐침:타겟 복합체를 열변성시키는 단계를 더욱 포함한다. 이로써 온전한 이중사슬 분자체가 얻어진다. 원할 경우, 이 이중사슬을 단일사슬로 변성시킬 수 있다. 다른 한편으로 복합체는, i) 복합체로부터 타겟 배열을 포함하는 이중사슬의 DNA 분석물을 분리해 내기에 충분하면서 ii) 타겟 배열을 포함하고 있는 이중사슬 DNA 분석물의 융점 이상인 온도에서, 열변성될 수 있다. 그 결과, 포획된 이중사슬체로 부터 유리되는 단일사슬의 DNA 분자들이 분리된다.

본 발명의 또다른 실시형태는, 핵산 분자의 혼합물내에서 선형의 이중 사슬 DNA 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 전술한 바와 같이 선형의 이중사슬 DNA 분석물을 분리해내고 그 이중 사슬 DNA 분석물로부터 유래하는 단일 사슬의 DNA 분자들을 얻어내는 단계를 포함한다 : 이것은 통상 이중 사슬의 융점보다 높은 온도에성 그 이중사슬을 가열하는 방법(열변성; heat denaturation)에 의해서 수행된다. 타겟이 되는 단일 사슬의 DNA 분석물에, 타겟 배열에 상보적이되 원래의 두 DNA 탐침중 어느 하나에 존재하던 배열이 아닌 것을 포함하는 DNA 합성 프리머를 적어도 하나 첨가한다. DNA 분석물은, DNA 폴리머라아제에 의해 촉진되어 프리머의 3'-말단으로부터 일어나는 프리머 연장 반응에 의해서 검출될 수 있다. 여기서 프리머 연장반응은 4가지의 모든 dNTP가 존재하고 적어도 하나의 dNTP는 검출가능한 기능기를 포함하고 있는 조건하에서 일어난다.

본 발명에 따른 이중사슬의 탐침; 이중 사슬의 타겟 복합체는 진단학적인 인-시튜(in-situ) 검출기법에도 이용될 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 표 1에 기재된 탐침 및 프리머와 람다 게놈과의 관계를 나타낸다.

제2도는 람다 게놈의 500bp 영역의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다: 이 배열은 SEQ ID NO : 1으로도 표시된다.

제3도는 RecA 단백질이 DNA 탐침에 결합되는 것을 보여주기 위하여, DNA 밴드-이동 겔 전기영동 검정시의 방사선 사진을 나타낸 것이다.

제4a도는 500-올리고머 및 280-올리고머 탐침을 이용한 제단백 혼성화 반응의 구성 성분들이 분리·해상되어 있는 겔을, 에티디움 브로마이드로 염색하여 나타낸것이다.

제4b도는 제4a도에 나타낸 겔의 방사선 사진을 나타낸다.

제5a도는 280-올리고머, 121-올리고머 및 79-올리고머 탐침들을 이용한 제단백 혼성화 반응의 구성 성분들이 분리·해상되어 있는 겔을, 에티디움 브로마이드로 염색하여 나타낸 것이다.

제5b도는 제5a도에 나타낸 겔의 방사선 사진을 나타낸다.

제6a도는 서로 다르게 라벨된 21-올리고머의 DNA 탐침을 이용한 제단백 혼성화반응의 구성 성분들이 분리·해상되어 있는 겔을, 에티디움 브로마이드로 염색하여 나타낸 것이다.

제6b도는 제6a도에 나타낸 겔의 방사선 사진을 나타낸다. 제6b도는 안정하고, 탈단백되어 있으며, RecA 단백질에 의해 촉매되는 혼성화 복합체를 생성하는데 필요한 두개의 DNA 탐침 사슬들을 예시하고 있다.

제7도는 안정한, 이중 사슬의 탐침; 이중사슬의 선형 타겟 DNA의 복합체의 한가지 모델을 예시한 것이다.

제8도는 안정한 이중사슬의 탐침; 이중사슬의 선형 타겟 DNA의 복합체가 분리되는 겔을 나타낸 것인데, 여기에서 탐침의 이중사슬은 각각 서로 다르게 라벨되어 있다.

제9도는 다양한 이중사슬의 탐침; 이중사슬의 선형 타겟 DNA의 복합체를 예시한 것이다.

제10a, 10b 및 10c도는 하나의 이중사슬 탐침; 이중사슬을 선형 타겟 DNA의 복합체에 기초를 둔 몇가지 검출계를 예시한 것이다.

제11a 및 11b도는 여러개의 이중사슬 탐침; 이중사슬의 선형 타겟 DNA의 복합체에 기초를 둔 몇가지 검출계를 예시한 것이다.

제12도는 이중 사슬의 D-루프 프리머가 RecA 단백질에 의해 촉매되어 천연의 타겟 DNA상에 위치하게 되는 것을 나타내고(제12a도), 또한 DNA 폴리머라아제에 의한 DNA의 증폭 및 DNA 리가아제에 의해 뒤이어 일어나는 결찰 과정을 나타낸다(제12b도).

제13도는 하나의 이중 사슬 D-루프 탐침(제13a도) 또는 여러개의 이중사슬 D-루프 탐침(제13b도)을 이용한, DNA 폴리머라아제에 의해 매개되는 신호 증폭 반응을 나타낸다. 제13도에서 X 및 X'는 같은 것일 수도 있고 다른 것일 수도 있다; 예를 들어 X는 방사성으로 라벨될 수 있고 X'는 디곡시제닌기를 수반할 수 있다.

제14도는 타겟과 복합체를 형성하지 않은 이중 사슬 탐침을 제한 엔도 뉴클레아제로 절단하는 과정을 포함하는 검출계를 예시하는데, 여기서 그 결과 산물의 포획은 제한 효소에 의한 분해 전에(제14b도) 또는 후에(제14a도) 수행할 수 있다.

제15도는 메틸화 또는 RecA 단백질에 의해서 제한 부위를 보호하는 과정을 예시한 것이다. 메틸화에 의해 보호화 할 경우에는 제한 효소로 자르기전에 이중의 D-루프 복합체를 탈단백화 하고(제15a도), RecA 단백질에 의해 보호화 할 경우에는 제한 효소로 자른후에 이중의 D-루프 복합체를 탈단백화 한다(제15b도).

제16도는 열변성된 280-올리고머의 탐침 및 그밖의 다른 보조요소를 사용한 RecA 매개 이중 D-루프 혼성화 반응의 탈단백된 구성성분들이, 전기 영동에 의해 분리·해상되어 있는 아가로스 겔을 에티디움 브로마이드에 의해 염색하여 나타낸 것이다.

제17도는 제16도에 나타낸 겔을 건조시킨 후 방사선 사진 촬영하여 나타낸 것이다.

제18도는 열변성된 500-올리고머의 탐침 및 보조인자로서 ATPγS 및 APTγS/rATP 혼합물을 사용한, RecA 매개 이중 사슬의 D-루프 혼성화 반응의 탈단백된 구성 성분들이 전기 영등에 의해 분리, 해상되어 있는 아가로스 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하여 나타낸 것이다.

제19도는 제18도에 나타낸 겔을 건조시킨 후 방사선 사진 촬영하여 나타낸 것이다.

[발명의 상세한 설명]

I. 탈단백화에 대해 안정하고 RecA에 의해 촉진되는 탐침:타겟 혼성화 복합체의 제조

A. DNA 탐침 및 프리머

본 발명을 뒷받침하기 위해 행한 실험에 의하면, 짧은 이중사슬의 DNA 분자나 상보적인 단일 사슬의 분자들이 타겟이 되는 선형의 DNA 분자들과 내부 영역에서 혼성화 복합체를 형성하며, 이 복합체들은 탈단백에 안정한 것으로 나타났다. 이들 안정한 혼성화 복합체의 예로성, 다양한 길이의 이중사슬 및 상보적인 단일 사슬의 DNA 분자들을 탐침 및 프리머(실시예 1, 표 1)로 사용하기 위해서 제조하였다.

이들 DNA 분자들은 람다파지 게놈의 500bp 영역의 다양한 부분과 상동성을 가지게끔 선택되었다. 표 1에 기재된 탐침 및 프리머와 람다 게놈과의 상관 관계는 제1도에 도시되어 있다. 500bp 람다 게놈 영역의 뉴클레오티드 배열은 제2도에 나타나 있다.

B. RecA 단백질의 준비 및 탐침의 피복

본 발명에서 RecA 단백질은, RecA와 유사하고 본질적으로 모든 혹은 대부분의 기능을 가지고 있으며, 특히 i) DNA 폴리머라아제에 의한 연장 반응이 일어날 수 있도록 상동성이 있는 타겟 부위에 프리머를 적절히 위치시킬 수 있고; ii) DNA 합성에 적합하도록 DNA의 토폴로지(topology)를 정비할 수 있으며; iii) RecA 단백질/DNA 프리머의 복합체에서처럼 그의 복합체가 효율적으로 상보적 배열을 찾아 결합하도록 해주는 기능을 가진 재조합 단백질군을 모두 의미한다. 이. 콜라이(E. coli)로 부터 얻어지는 RecA 단백질의 특성이 가장 잘 연구되어 있다; 와일드 타입 단백질 외에도 RecA와 유사한 많은 단백질 변이주가 동정되어 있었다(예를 들면, recA-803), Madiraju, et al. ). 나아가, 많은 생물체들이 RecA와 유사한 사슬전이 단백질들을 가지고 있다(e.g., Fugisawa, H., et al. ; Hsieh, P., et al., 1986; Hsieh, P., et al., 1989; Fishel, R.A., et al. ; Cassuto, E., et al. ; Ganea, D., et al. ; Moore, S.P., et al. ; Keene, K., et al. ; Kimeic, E.B., 1984; Kimeic, E.B., 1986; Kolodner, R., et al, ; Sugino, A. et al. ; Halbrook, J., et al. ; Eisen, A., et al. ; McCarthy, J., et al., Lowehnaupt, K., et al. ).

통상 RecA 단백질을 과량 생산하는 세균 균주로부터 동 단백질을 얻는다: 실시예 2에는 그러한 균주로부터 와일드 타입 이. 콜라이드 RecA 단백질 및 recA-803번이 단백질을 정제하는 방법이 기술되어 있다. RecA 단백질은 예컨대 파마시아(Pharmacia; Piscataway NJ)로부터 구입하여 사용할 수도 있다.

DNA 탐침을 RecA 단백질 및 ATPγS로 피복하기 위해서 사용되는 조건은 실시예 3에 기술되어 있다. 한편으로 탐침들을 GTPγS, rATP(단독으로 또는 rATP 재생 시스템의 존재하에(Boerhinger Manheim)), dATP, ATPγS 및 rATP의 혼합물 또는 ATPγS 및 ADP의 혼합물을 사용하여 피복할 수도 있다. RecA 단백질 피복반응에 ATPγS, rATP, dATP 및 GTPγS을 보조인자들로 사용하는 방법이 실시예 10에 기재되어 있다. 이들 보조인자들을 사용하여 이중의 D-루프 복합체를 형성시킨 결과를 제16도 및 제17도에 나타내었다. 제17도는 ATPγS, rATP, dATP 및 GTPγS 각각이 존재할 경우 탈단백에 대해서 안정한 D-루프 혼성화 복합체가 생성되었음을 보여준다. 나아가, 실시예 11은 RecA 단백질로의 피복 반응에 보조 인자들로서 ATPγS/rATP를 사용한 예를 기술하고 있다. 그 결과를 제18도 및 제19도에 나타내었고 이는 동 혼합물이 존재할 경우 탈단백에 대해서 안정한 D-루프 혼성화 복합체가 생성되었음을 보여준다. ATPγS/rATP 외, 다른 보조인자들의 혼합물도 본 RecA 단백질 피복 반응에 사용될 수 있다.

탐침이 RecA 단백질로 잘 피복되었는지 여부는 여러가지 방법에 의해서 평가 할 수 있다. 먼저, DNA로의 단백질 결합은 밴드-이동 겔 검정법을 이용하여 시험해 볼수 있다(McEntee et al. ). 실시예 3은, DNA 밴드-이동 겔 검정법을 사용하여 DNA 탐침으로의 RecA 단백질 결합을 보이는 방법을 기술하고 있다. 라벨된 탐침들은 ATPγS의 존재하에 RecA 단백질로 피복되고, 피복 반응의 산물은 아가로스 겔에서의 전기 영동에 의해 분리된다.: 제3도는 그 결과 겔상에 존재하는 DNA의 방사선 사진을 보여준다. 제3도에 나타낸 결과는, 변성된 이중사슬의 탐침 DNAs과 RecA 단백질을 배양(incubation)함으로써, 변성된 이중 사슬의 탐침으로부터 유도된 단일 사슬의 DNA 탐침을 RecA 단백질로 효율적으로 피복하였음을 보여준다. 탐침내의 뉴클레오티들에 대한 RecA 단백질 단량체들의 비율을, 121-올리고머인 경우 0, 1:27, 1:2.7 및 3.7:1(각각, 1 내지 4레인)로, 159-올리고머인 경우 0, 1:22, 1:2.2 및 4.5:1 (각각 5 내지 8레인)로 증가시켜 감에 따라, DNA 탐침에 대한 RecA의 결합으로 인하여, 전기 영동에서 DNA 탐침의 이동도가 감소(이동속도 느려짐)된다. 2, 3 및 6, 7 레인에서 DNA 탐침의 속도가 약간만 느려지는 것은, 탐침 DNA가 RecA 단백질로 포화되지 않았다는 사실을 반영한 것이다. 예상했던 대로(Leahy et al), RecA로 짧은 DNA 탐침들을 효율적으로 피복하기 위해서는, DNA 뉴클레오티드에 비해 과량의 RecA 단량체가 필요하다.

DNA에 대한 단백질 결합을 평가하는 두번째 방법은 니트로 셀룰로오스 필터 바인딩 검정법을 사용하는 것이다(Leahy et al. ; Woodbury et al). 니트로 셀룰로 오스 필터 바인딩 방법은 특히, 라벨된 DNA를 사용하여 단백질: DNA 복합체의 해리 속도를 결정하는데에 유용하다. 이 필터 바인딩 검정법에서는 비결합 상태의 DNA가 필터를 그냥 통과해 나가고 DNA; 단백질 복합체만 필터상에 고정되게 된다. 이 검정방법에서는 비결합의 탐침과 DNA; 단백질 복합체의 분리가 신속하기 때문에 정량적으로 해리속도를 결정할 수 있다.

상기 필터 결합 검정법을 실시하기 위해서는 통상, 니트로 셀룰로오스 디스크(Schleicher and Schuell, BA 85 필터 또는 HAW POO25 니트로 셀룰로오스 필터)를 완충용액에 침지시켜 전처리한 후 진공 필터 장비상에 위치시킨다. DNA: 단백질 결합 반응물은, 복합체의 해리없이 구성성분들의 농도를 감송시키기 위해서 종종 회석시켜 사용한다. 이 반응물들을 진공이 걸려 있는 상태에서 상기 디스크를 통과 시킨다. 염이 적은 조건하에서, DNA; 단백질 복합체는 필터에 결합하고 비결합 상태의 DNA는 그냥 통과한다. 디스크는 신틸레이션 카운팅 유동액(scintillation counting fluid)상에 놓고(New England Nuclear, National Diagnostics, Inc. ), 신틸레이션 카운터를 이용하여 cpm을 측정한다.

C. 타겟 DNA

RecA에 의해 촉진되는, 상동성이 있는 선형의 이중 사슬 타겟 DNA의 안쪽 부분과 탐침과의 혼성화 반응의 특이성을 연구하기 위해서, 다음과 같은 몇가지 모델람다 DNA 타겟 시스템이 사용되었다;

(1) 완전한 람다 게놈의 DNA(48.5kb; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg MD)를 DraI(Promega) 제한 효소에 의해 잘라서 얻어지는, 92 내지 8598 bp 크기의, 14가지 DNA 단편들의 혼합물. 제1도 및 제2도에 의해 정해진 영역에 상동적인 타겟 단편은 8370 bp의 DraI 단편이다. 표 1에 기재된 탐침들에 상동성이 있는 영역(들)은 모두, 그 이중사슬의 타겟 DNA 단편의 3' 말단으로부터 적어도 832 염기내에 존재한다.

(2) 완전한 람다 게놈의 DNA를 ApaI 제한 효소에 의해 절단함으로써 생성되는 두가지 단편(38,412 및 10,090 bp)의 혼합물, 10kb의 정도되는 단편이 제1도 및 제2도에 정해진 영역을 포함하고 있다. 이 상동성이 있는 영역은 이중사슬의 타겟 DNA 단편의 3'-말단으로부터 적어도 2460bp에 존재한다.

(3) 람다 DNA를 ApaI로 절단하여, 아가로스 겔 상에서 정제한 후 제단백하여 얻어지는 10 kb의 단편.

(4) DraI 및 BamHI에 의해 람다 DNA를 두번 절단하여 얻어지는 2957 bp의 타겟 DNA 단편, 단편-타겟 상동영역은 그 이중사슬의 타겟 DNA 단편의 3'-말단으로 부터의 832 염기들이다.

(5) 전체 람다 바이러스 DNA도 타겟으로 사용하였다. 이 경우, 탐침:타겟 상동 영역은 전체 람다 게놈의 5'-말단으로부터 있는 적어도 7131 염기가 된다.

D. RecA에 의해 촉진되는 이중사슬 탐침과 타겟 DNA 배열과의 혼성화 복합체 형성반응.

RecA로 피복된 단일 사슬의 DNA 탐침과 타겟 DNA를 혼합하면, RecA로 피복된 DNA 탐침 및 이중사슬의 타겟 DNA 분자들 같의 상동 영역을 찾는 과정이 개시된다. 단일의 탐침 배열인 경우, 일단 RecA:DNA 탐침 필라멘트가 형성되면, 그것이 상보적 탐침 및 타겟 DNA 배열간의 상동 영역 찾기 및 D-루프 형성을 촉진한다. 전통적인 단일 D-루프는, 선형의 이중 사슬의 타겟 DNA와 500 염기 이하의 상동성을 가지는, RecA로 피복된 단일 사슬의 DNA 탐침간에 형성될 수 있다. 이러한 D-루프는, 탐침:타겟 상동위치가 선형 타겟의 내부에 있을 경우 단백질이 제거되면 불안정해 진다.

본 발명을 뒷받침하기 위해서 행한 실험은, 500-올리고머 이하의 탐침들이 선형의 이중사슬 DNA 타겟상의 내부 위치에서, RecA에 의해 촉진되어 탈단백에 안정한 이중의 D-루프 탐침:타겟 복합체를 형성한다는 사실을 입증하였다. 그러나, 그렇게 안정한 구조를 형성하려면 적어도 사용된 두개의 탐침이 상호 오버랩되는 상보적 배열을 가져야 한다. 두개의 탐침은 RecA에 의해 피복된 단일사슬의 DNA 탐침이고, RecA에 의해 촉진되는 탐침:타겟 혼성화 반응에 사용된다.

실시예 4는 RecA 단백질의 매개로 일어나는 이중 D-루프의 형성, 또는 멀티플렉시스(multiplexes)를 기술한 것이다. 500- 및 280-의 올리고머 탐침들을 RecA 단백질로 피복하였다. 타겟 DNA는 전술한 바와 같이 람다 DNA를 DraI으로 잘라 얻은 8369 bp의 DNA 단편이었다. RecA 단백질 대 탐침-뉴클레오티드의 비율은, 500-올리고머인 경우 1.5:1, 280-올리고머인 경우 1.3:1 이었다. 이중사슬의 DNA 탐침 대 상동성이 있는 이중사슬의 DNA 타겟 단편의 비율은, 500-올리고머인 경우 11:1, 280-올리고머인 경우 22:1 이었다. 제4a도는 탈단백된 혼성화 반응의 DNA 구성성분이 분리, 해상되어 있는 DNA 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하여 나타낸 것이다.

제4b도는 제4a도에 나타낸 겔 상의 DNA를 방사성 사진 촬영한 것이다. 제4b도에 나타낸 결과는, 탈단백에 안정한 500-올리고머:타겟 DNA 및 280-올리고머:타겟 DNA의 혼성화 산물들이 형성 되었음을 보여준다. RecA 단백질이 있는 경우와 없는 경우에 각각 실험을 하여 비교해 보면, 상동적인 탐침:타겟 DNA 복합체를 형성하기 위해서는 RecA가 필요하다는 것을 알 수 있다.

실시예 4에서는, pUC 18 이중사슬 환상 DNA를 양성 콘트롤로서 사용하였다. 음성적으로 슈퍼코일된 이중사슬의 환상 DNA 분자가, 제단백에 안정한 짧은 단일 사슬의 탐침과 상호작용, RecA 단백질에 의하여 촉진되어 탐침:타겟 혼성화 산물을 형성하는 것으로 알려져 있다(Rigas et al. ; and Cheng et al., 1988).

상기 실험에서 혼성화 산물의 동일성을 확인하기 위해서, RecA 단백질로 피복된 탐침을, 람다 게놈 DNA를 DraI/BamHI로 이중 절단하여 생긴 타겟 단편과 반응시켰다. 이렇게 이중 절단에 의해 생성된, 상동적인 타겟 단편은 길이 2957 bp 이었고, 탐침:타겟 배열의 상동적인 위치도 전기실험의 경우와 다르지 않았다(즉, 상동적 타겟 단편의 3'-말단으로부터 832 bs). DraI에 의해 절단된 8370 bp의 타겟 람다 DNA 단편을 사용했을 경우와 동일한 조건하에 혼성화 반응을 시켰다.

이렇게 RecA 단백질에 의해 촉진되는 혼성화 반응물을 전기 영동에 의해 분리하고 방사선 사진 분석한 결과 탈단백된 탐침:타겟 DNA 복합체가 2957 bp의 타겟 단편의 위치로 옮겨진 것으로 나타났고, 이는 탐침:타겟 DNA 혼성화 반응이 실제, 특이적으로 상동적 타겟과의 사이에서 일어났음을 확인시켜 주었다.

RecA 단백질에 의해서 촉진되는 탐침:타겟 반응을 비상동적인 선형의 DNA 타겟 분자들이 과량 존재할 경우 실시하였다.

실시예 5는 작은 이중 사슬의 탐침과 선형의 이중 사슬의 타겟 DNA가 탈단백에 안정한 복합체를 형성하는 과정을 기술하였다. 실시예 5에 기재된 혼성화 반응에서는, RecA 단백질 대 탐침 뉴클레오티드의 비율을 1.8:1, 0, 5.7:1, 5.9:1, 2.6:1 및 11.8:1로 변화시켜가면서(제5a도 및 제5b도에서 1 내지 6레인에 각각 해당) 변성된 탐침을 피복하였다. 이중사슬의 탐침 대 이중사슬의 타겟 단면의 비율은 4.8:1(280-올리고머), 3.6:1(121-올리고머) 및 5.2:1(79-올리고머)이었다. 제5a도는, 탈단백된 혼성화 반응의 구성 성분들이 분리 해상되어 있는 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하여 DNA를 보인 것이다.

제5b도는 제5a도에 나타낸 겔의 방사선 사진을 나타낸 것이다. 제5b도의 결과는, 크기에 있어 280 염기의 탐침보다 더 작은 탐침을 사용하여도 탈단백에 안정한 탐침:타겟 혼성화 산물이 형성된다는 것을 보여준다. RecA 단백질을 너무 과량 가하면 DNA 혼성화 반응에서 안정한 산물이 적게 생산되는 것 같다(4, 5 및 6 레인 비교). 본 실험에 사용된 121-올리고머 및 79-올리고머 탐침들은³²P로 말단 라벨된 280-올리고머 및 500-올리고머의 이중사슬 탐침을 효소로 절단하여 얻어진 것이므로, 각 DNA 탐침은 라벨된 5'-사슬 또는 3'-사슬(양자 모두는 아님)을 280-올리고머에서와 같이 포함하고 있다: 상기 분자의 5' 및 3' 말단을 전체 람다 DNA와 관련하여 동정된다. 제5b도의 3 내지 6 레인에서 관찰되는 신호는 5'-탐침이나 3'-탐침사슬이 탐침:타겟 반응에 관여한다는 것을 보여준다; 그러한 관찰은, 양탐침 사슬이 모두, 탈단백에 안정한 탐침:타겟 DNA 혼성화 복합체 형성에 관여한다는 결론과 일치된다.

실시예 4 및 5에 기재된 기본 계획안에 따른 다양한 혼성화 실험은 RecA 단백질에 의해 촉진되는 혼성화 반응이 광범위한 실험조건하에서 일어난다는 것을 확인시켜 주었다. 서로 다른 농도의 타겟 DNA가 사용될 경우 통상 탈단백된 혼성화물의 수율은, 반응계내의 상동성 있는 타겟 DNA의 양에 비례한다. 몇가지 실험조건들은 다음과 같이 요약될 수 있다:

(i) 1 내지 12mM 사이의 농도범위의 ATPγS를, RecA 단백질로 탐침을 피복하는 반응에 사용하였다. 이 범위의 ATPγS 농도에서는 타겟을 첨가한 후 안정한 혼성화 산물이 생성되었다: 바람직한 범위는 약 2.4 내지 8mM 이었다. ATPγS, rATP(단독으로 또는 재생계의 존재하에), dATP, GTPγS 그리고 ATPγS 및 rATP의 혼합물도 탐침 피복반응에 유용하게 사용될 수 있다(실시예 10 및 11). 나아가, 상업적으로 제조된 ATPγS가 반응엥 사용될 경우 제제의 순도는 각 제제에 따라 다르다. 파마시아(Pharmacia)에서 생산되는 ATPγS 는 대략 약 95 내지 97%의 ATPγS를 포함한다. 시그마(Sigma)에서 생산되는 ATPγS는 약 75% 내지 90%의 APTγS를 포함한다: 이를 제제는 통상 약 10 내지 20%의 ADP를 포함하고 있다. 파마시아 및 시그마에서 생산되는 ATPγS를 모두, 시험해 보았다: 이들 제제 모두 RecA 이중 D-루프 반응에서 적절히 기능을 발휘한다. 따라서 ATPγS 및 ADP의 조합물을 RecA에 의해 매개되는 이중 D-루프 혼성화 반응에 사용할 수도 있다. 나아가 DNA 탐침들은, ATPγS 및 rATP의 혼합물, 바람직하게는 각 구성분을 1.4mM 및 1mM 씩 각각 포함하고 있는 혼합물의 존재하에서도 RecA 단백질에 의해 효율적으로 피복된다. 이 실험 결과는, 이중의 D-루프 복합체 형성 반응에 여러가지 다양한 보조 인자들 및 보조인자들의 조합물을 RecA와 함께 사용할 수 있다는 것을 보여준다;

ii) 탐침 및 타겟 DNA를 포함하고 있는 최종반응에서는, 넓은 농도범위(4 내지 25mM)의 Mg⁺⁺아세테이트를 사용할 수 있으며, 그중 6 내지 8mM의 농도범위가 특히 바람직하다;

iii) 탐침 피복 반응에서는 8.4μM 내지 41μM의 RecA 단백질을 사용하였으며, 이 농도범위내에서 유효활성이 나타났다;

iv) 탐침 피복반응에서 RecA 단백질 대 탐침-뉴클레오티드의 비율은 1:3 내지 6:1 사이가 적당했고, 약 2:1 내지 4:1의 비율이 더욱 바람직했다;

v) 마지막으로 (마이크로 몰의) 이중사슬 DNA 탐침 대 이중사슬의 DNA 타겟분자의 비율은 2:1 내지 22:1 사이였고, 이 경우 모두 안정한 탈단백된 탐침:타겟 혼성체를 얻었다;

vi) DNA 혼성화 반응은 유사한 Tris-HCl 반응 완충액(pH 7.5)에서 행할 수도 있다. 그러나, 이러한 Tris계인 경우보다 아세테이트 완충계인 조건에서 탐침을 피복하고 사슬을 전이시키는 것이 더 많은 산물을 얻을 수 있다;

vii) recA-803 변이 단백도 안정한 혼성화 복합체를 형성시키는 활성을 갖는다;

viii) 혼성화 반응은 단일 사슬의 결합(SSB) 단백질 존재하에서도 일어난다(Morrical et al. );

ix) -20℃에서 수일 저장한, RecA 단백질로 피복된 단일-사슬 DNA 탐침(피복·변성된 이중사슬의 탐침들의 혼합물도 포함됨)은, 타겟과 37℃에서 배양한 후 사용하면 혼성화 복합체를 형성한다;

x) 전체 람다 게놈 DNA를 사용하여 혼성화 반응을 일음킬 수도 있다. 탐침:타겟의 혼성화 반응은, 타겟 DNA가 아가로스 플러그나 마이크로비드에 끼워져 있는 상태에서도 수행될 수 있다: 예를 들어 RecA 단백질로 피복된 탐침과 아가로스 플러그에 끼워져 있는 온전한 48.5kb의 λ DNA 타겟을 사용하여 안정한 이중의 D-루프 혼성화물이 형성되었다;

xi) 탐침 사슬간의 상보적 오버랩 영역은 통상 약 79 염기쌍이고 500 염기쌍 보다는 작다. 이 정도의 상보적인 오버랩을 가지는 탐침은 본 발명에 의한 RecA 촉진 혼성화 반응에서, 안정한 산물을 내부 타겟 부위에 형성한다. 선형 분자의 말단에서도 안정한 혼성화 산물이 생길 수 있다는 것이 증명되었다(예를 들면, 80-올리고머의 탐침과 500-올리고머의 이중사슬을 타겟으로 사용할 수 경우(제1도)). 탐침 사슬과 타겟 사슬간의 상보성은 90-100%인 것이 표준이다. 그러나, RecA 단백질은 비특이적인 염기상 상호작용을 포함하고 있는 혼성화 복합체의 생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Cheng et al. 1989). 따라서, 탐침의 크기 및 검출 반응에서 필요한 특이성 정도에 따라, 탐침:타겟의 상보성을 변화(감소)시킬 수도 있다: 통상 각 탐침 사슬 및 타겟-사슬 간의 염기쌍의 대응에는 70% 이상의 상보성이 있다;

xii) 오버랩이 79 염기쌍 이하인 탐침들도 본 발명에 사용할 수 있다: 제단백후 이중 D-루프의 안정성은 이러한 작은 크기의 탐침이 사용될 경우 더 높을 수 있다. 이중의 D-루프 복합체를 더 안정화시키는 방법은 소랄렌 교차 결합(Psoralen Cross-linking)을 이용하는 것이다(Cheng et al., 1988): 그러한 교차 결합은 강한 세척 조건이 사용되는 인시튜(in-situ) 상에서 유용하게 사용된다.

제5b도에 나타낸 결과는 관찰 대상이 탐침:타겟 산물들이 탈단백에 대해 안정하는 것을 보여주는데, DNA 탐침의 두 사슬이 모두 같은 타겟 분자상에 존재하기 때문이다. 그러한 안정한 복합체의 일례를 제7도에 나타내었다. 이러한 구조를 본 명세서에서는, 종래의 단일 D-루프, 또는 세사슬의 치환 루프 또는 삼중 구조(두개의 타겟 사슬 및 특정한 한가지의 사슬에 상보적인 단일 DNA 탐침)와 구별하여, 이중 D-루프 또는 다중 DNA 구조라고 부른다.

실시예 6의 결과는, 두개의 RecA 단백질로 피복된 DNA 탐침 사슬이, 선형 타겟 DNA 분자의 상동적인 내부 DNA 영역에서 탈단백된 안정한 탐침:타겟 혼성화 복합체를 생성시키는데 필요하다는 사실을 확인시켜 주었다. 개개의 121-올리고머 탐침 사슬들은, 각 탐침이 소량의 상보적인(반대편의) DNA 사슬로 오염되지 않도록 하기 위해서, 화학적으로 합성하였다. 두개의 각 상보적 DNA 탐침사슬들의 존재를 구별하기 위해서, 한 사슬은 5'-말단을³²P로 다른 사슬은 5'-말단 비오틴으로, 탐침을 서로 다르게 라벨하였다.

하나의 사슬만을 방사성으로 라벨하였기 때문에 각 이중 D-루프 DNA 혼성화반응에서의³²P 특이적 활성은 같았다: 따라서 모든 실험 결과를 상호 간편하게 비교할 수 있었다. 혼성화 반응은 실시예 6에 기재된 바대로 실시하였다. 제6a도는 탈단백된 혼성화 반응의 DNA 구성 성분이 분리, 해상되어 있는 겔을 에티디움 브로드마이드로 염색하여 나타낸 것이다.

제6b도는 제6a도에 나타낸 겔의 DNA 방사선 사진을 나타낸다. 제6b도에 나타낸 결과는 탈단백된 안정한 탐침:타겟 혼성화 산물을 생성하기 위해서는 두개의 탐침사슬이 필요하다는 것을 보여준다. 또한, 두개의 탐침이 같은 또는 분리된 반응에서 RecA 단백질로 피복될 경우에도 상기 반응이 일어난다. 나아가, DNA 탐침을 순차적으로 가할 경우에, 혼성화 반응에 의하여, 안정한 탈단백된 복합체가 생긴다(5 및 6 레인).³²P 사슬이 먼저 반응 혼합물에 첨가될 경우 더 안정한 혼성화 산물이 생성되는 것 같다. 말단의 비오틴 라벨은, 그 화학적 스페이서(spacer) 팔의 크기 또는 탐침상에서의 위치 때문에 약간 저해성을 가질 수 있다. 그러나 탐침을 혼성화 반응에 가하는 순서에 상관없이, 탈단백된 안정한 상동 복합체를 생성하기 위해서는 두개의 탐침사슬이 필요하다. RecA에 의해 매개되는 상동성 있는 탐침의 타겟팅 반응에는 비오틴이 내부위치에 삽입되어 있는 탐침들을 사용할 수도 있다. 이러한 탐침들은 폴리머 라아제에 의한 체인 반응을 변형시켜 합성할 수 있는데(Mullis; Mullis, et al), 그 반응에서는 통상의 합성 반응에 사용되는 dATP의 약간 퍼센트(예를 들면, 5 내지 25%)가 비오틴-14-d-ATP로 치환된다.

RecA에 의해 촉진되어 짧은 DNA 탐침이 동종의 타겟 배열을 찾아 상동적으로 짝짓는 속도는 부착되어 있는 이종의 DNA 꼬리의 길이와 양성적으로 관련되어 있다(Gonda et al. ). 따라서, 본 발명의 혼성화 반응에 사용된 탐침들은, 탐침 배열이 타겟 배열에 상동적으로 짝짓는 속도를 촉진하기 위해서 이종의 꼬리들, 즉 타겟 DNA에 상동적이지 않는 말단 배열을 함유할 수 있다.

E. 포획/검출 계

동일한 타겟 분자상에³²P- 및 비오틴으로 라벨된 121-올리고머의 양 사슬이 존재한다는 사실은 포획/검출계를 사용하여 더 확실히 알 수 있다(실시예 7). 탈단백된 이중 D-루프 산물은 스트렙트아비딘-마그네틱 비드(streptavidin-magnetic beads)에 의해 포획된다. 비오틴을 함유하는 탐침의 포획계는³²P-라벨된 탐침도 동시에 포획한다. 제8도는 스트렙트아비딘에 의한 비오틴 반기의 포획 이전의, 탐침:타겟 복합체가 분리되어질 겔상의 DNA를 나타낸다. 상기 DNA 복합체는, 그탐침:타겟 복합체의 예상크기에 대응하는 단편의 겔들로 부터 추출하여 분리한다(실시예 7). 추출된 DNA는 이어 스트렙트아비딘에 의해 피복된 상자성 비드에 노출된다. 그 다음 그 비드를 분리하여³²P로 라벨된 DNA 탐침사슬을 검출하기 위해서 신틸레이션 유동액상에 위치시킨다. 이 분석결과를 표 2에 나타내었다. 그 결과는, 두개의 탐침사슬과 RecA 단백질을 사용한 반응인 경우만 기본 신호 이상의 포획 신호를 생기게 한다는 것을 보여준다. 이 실험은 10kb의 타겟 DNA의 위치에 이동한 DNA 타겟 만을 분리하여 사용하므로, 실제로는 각 10kb 타겟 분자상에 이중 D-루프 구조를 가지고 있지 않은 다중 10kb 타겟들 간의 복잡한 재조합 산물이 포획되어 검출되는 것을 배제한다. 나아가, 본 반응에서 생성된 혼성화 분자들은 사용된 분리조건하에서 상당히 안정하여 포획된³²P 신호가 상보적 탐침의 재회합에 의한 인공적인 것이 아니라는 결론을 뒷받침한다.

Ⅱ. 유용성.

제9도는 많은 가능한 이중 D-루프 구조를 보여준다. 제9a도는 타겟 DNA 분자상의 내부 영역에서의 이중 D-루프 형성을 나타낸다. 제9b도는 탐침 DNA 분자가 이종의 DNA로 된 꼬리를 가진다는 것 이외에는 유사한 구조를 가지는 분자들을 나타낸다(Gonda et al). 그러한 꼬리들은

i) 작은 단편으로 RecA가 로딩(loading)되는 것을 촉진하고;

ii) 탐침에 라벨을 포함시키기 위한 연장분자를 제공하며(예를 들면, 디곡시제닌이나 비오틴);

iii) 포획 배열을 제공하고;

iv) 부가적인 리포터 분자(reporter molecule)에 혼성화되기 위한 배열을 제공하기 위해서 사용될 수 있다.

제9c도는 상동적인 말단의 연장 부위(즉, 다른 탐침에는 상보적이지 않으면서 타겟 DNA에 상보적인 영역)과 상보적인 오버랩영역(즉, 상호간에 상보적인 영역)을 가지고 있는 두개의 탐침이 사용된 상황을 보여준다.

제9d도는 이종의 말단 연장영역(즉 타겟 DNA는 물론 다른 탐침에도 상보적이지 않은 영역)과 상보적인 오버랩 영역을 가지고 있는 두개의 탐침이 사용된 상황을 보여준다. 제9f도는 이종의 말단 연장영역이 각 탐침 사슬의 5'-말단 및 3'-말단 양쪽에 모두 존재하는 유사한 상황을 보여준다. 제9g도는 상동적 꼬리가 상호 상보적이나 타겟 DNA에는 상보적이지 않은 상황을 보여준다.

이중 D-루프 구조가 반드시 두개의 탐침으로 구성되어 있을 필요는 없다. 예를 들면, 제9e도는 5개의 분리된 탐침 사슬로부터 생긴 이중 D-루프 구조를 나타낸다: 내부 탐침 사슬들은 하나 이상의 다른 탐침 사슬에 상보적으로 오버랩되는 영역들을 가지고 있다. 상보적으로 오버랩되는 전체 영역은 통상 79 내지 500 염기쌍 정도 이지만, 전술한 바와 같이 더 적을 수도 있다.

제9도에 나타낸 구조들은 탈단백에 안정한 이중의 D-루프 구조를 생성시킬 수 있는 탐침과 타겟 DNA의 몇가지(모두는 아님) 조합을 예시한 것이다. 이중 D-루프 형성 반응에 사용되는 이중-사슬의 탐침들의 공통된 특징의 한가지는 탐침사슬들간에 상보적으로 오버랩되는 영역이 존재한다는 것이다.

RecA 단백질에 의해서 촉진되어 탈단백된 안정한 이중 D-루프 탐침:타겟 복합체가 내부 영역에 생성되면 상동성 있는 선형의 DNA 타겟을 특이적으로 동정할 수 있다. 이러한 이중 D-루프 반응은 혼성화 진단학에 새로운 가능성을 제시한다. 이 검정법은 서로 다르게 라벨된 상보적인 탐침 사슬들이 한가지 반응에서 사용할 수 있고 오직 하나의 작은 타겟 배열만 알아도 된다는 이점이 있다.

포화시킬 정도의 RecA 단백질을 사용하면 상보적인 탐침들의 재회합이 억제된다(Bryant et al. ). 그러한 탐침들의 재회합은 탐침 피복 반응에 보조인자로서 ATPγS를 포함시킴으로써도 감소시킬 수 있다.

전술한 바와 같이, RecA 단밴직로 피복된 탐침과 타겟 DNAs 간에 생성된 본 발명에 의한 복합체는 탈단백화 반응에 대해 안정하다. 그러나, 복합체로부터 RecA 단백질을 제거하는 것이 몇가지 응용예에서는 필요치 않다. 그런 경우 남아있는 단백질 분자들이 응용과정을 방해하지 말아야 한다는 제한 조건이 있다(예를 들어, 하기 F 단락 참고).

A. 타겟 DNAs

본 발명의 방법은 생물체에 의해서 발생되는 감염성 질환을 임상시료에서 진단하는데에 사용될 수 있다. 이러한 생물체들은 원인성 생물의 특이적 DNA 특성을 검출하여 알아낸다. 그러한 생물체에는 다음과 같은 것들이 있다:

박테리아 - 살모넬라(Salmonella), 네이세리아(Neisseria), 클라미디아(Chlamydia), 시겔라(Shigella) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)등; 바이러스 - 허피스 심플렉스 바이러스-1(HSV-1), 허피스 심플렉스 바이러스-2(HSV-2), 아데노 바이러스(adenovirus) 및 모든 이중사슬의 DNA 바이러스 등; 기생충 - 플라스모디움(Plasmodium) 및 기라디아(Giadia) 등 마이코플라즈마 - 마이코프라즈마 뉴모니아(Mycoplasma prieumonia), 엠. 제니탈리움(M. genitalium) 및 뉴모시스티스(Pneumocystis).

진단학적 검정을 위해서, 탐침 배열은 타겟 DNA에 있는 상보적 영역중 기지의 것으로 선택된다. 타겟 DNA는 여러가지 다른 공급원[예컨대, 수용액, 포유동물 조직, 배양세포, 식물조직, 박테리아, 효모, 혈액 및 혈액 구성분(Ausubel et al. ; Maniatis et al. ; Sambrook et al. ; Davis et al. ; Fey; Strickler et al. ; Kongston; Wachsmuth]으로 부터, 표준 방법에 의해서 준비될 수 있다.

일반적으로 본 발명의 검출 방법은 어떤 핵산 샘플에 존재하는 이중 사슬 DNA를 검출하는데 응용될 수 있다. 전염병의 임상적 진단에 응용되는 외에,

i) 배양된 포유동물 세포에 마이코 플라즈마 같은 오염물이 존재하는가 여부를 조사하는 방법(Zlvin et al), ii) 포유 동물 DNA가 특이적 결손, 특이적 변이, 삽입 또는 재배열됨으로써 발생하는 유전학적 질병, 예컨대 α-탈라세미아(α-thalassemia), β-탈라세미아 또는 만성적 골수세포종 등을 진단하는 방법 iii) 이중사슬의 DNA 분자내에 주어진 타겟 배열이 존재하는가 않는가를 구별하기 위한 혼성화 탐침법 등에도 응용될 수 있다.

B. 하나의 이중 D-루프 구조를 진단학적으로 응용하는 방법.

제10도는 이중 사슬 DNA 내에서 상응하는 배열을 분리, 동정하기 위해, 하나의 이중 D-루프 구조를 사용한 몇가지 실시 형태를 보여준다. 하나의 탐침은 포획기로 라벨될 수 있다(예를 들면, 실시예 7에서와 같이 비오틴으로 라벨). 다른 하나의 탐침은, 방사성 라벨, 비오틴, 디곡시제닌 또는 그 밖에 변형된 염기들과 같은 검출기로 라벨된다. 그 탐침을 피복한 후 타겟 배열의 존재여부가 시험될 핵산 샘플에 혼성화시킨다. 혼성화 반응물은 탈단백될 수도 있고 그냥 사용될 수도 있다.

포획기로 라벨된 탐침을 포획된다. 이러한 포획(반응)은, 예컨대, 탐침을 비오틴 반기로 라벨하고 그 반응 혼합물을 고형 지지대에 부착되어 있는 스트렙트아비딘에 노출시킴으로써 수행될 수 있다. 다른 한편으로, 포획기가 디곡시제닌일수 있고, 포획 반응을 고형 지지대에 부착되어 있는 항-디곡시제닌 항체를 사용하여 행할 수도 있다. 부가적인 기능기들은 다음과 같이 간편하게 DNA 분자의 말단에 부착될 수 있다. 올리고 뉴클레이티드 탐침을, 디곡시제닌-11-dUTP(dTTP의 유사체인 2'-데옥시-유리딘-5'-트리포스페이트가 11-원자의 스페이서 팔을 통하여 디곡시제닌에 연결된 것; Boehringer Mannheim, Indianopolis IN) 및 말단 데옥시뉴클레오티드 전이 효소(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)와 배합시킨다. 이 방법을 사용하면, 삽입된 dig-11-dUTP 기능기의 수가 5개 미만(심어지는 1개 또는 2개)이 되는 것으로 나타났다. 다른 한편으로, dig-11-dUTP 기능기는 비오틴을 사용한 경우에서와 같은 방법으로 탐침의 올리고 뉴클레오티드 배열에 삽입되어 질 수 있다.

통상, 다음과 같이 배합된 이중사슬의 탐침을 포획 검출계에 사용할 수 있다:

i) 제1탐침/포획욕, 비오틴이나 디곡시제닌으로 라벨, 제2탐침/검출용, 방사성 라벨;

ii) 제1탐침/포획용, 비오틴으로 라벨;

제2탐침/검출용, 디곡시제닌으로 라벨;

iii) 제1탐침/포획용, 디곡시제닌으로 라벨;

제2탐침/검출용, 비오틴으로 라벨;

포획된 DNA를 분리시키기 위해서 사용할 수 있는 간편한 방법은 실시예 7에 기재된 바와 같이 스트렙트아비딘이 접합되어 있는 초상장성(superparamag etic)의 폴리스티렌비드를 사용하는 것이다. DNA가 포획된 후, 반응 튜브를 자성 선반위에 올려 놓음으로써 비드를 회수할 수 있다.

다른 한편으로, 아비딘으로 피복된 아가로스 비드를 사용할 수 있다. 비오틴이 결합되어 있는 아가로스 비드(부동화된 D-비오틴, Pierce)는 아비딘에 결합된다. 아비딘은 스트렙트아비딘과 같이 비오틴에 대한 4개의 결합부위를 가지고 있다. 이 결합부위중 하나는, 16원자의 스페이서 팔을 통하여 아가로스 비드에 결합되어 있는 비오틴에 아비딘을 결합시키는데에 사용된다: 나머지의 비오틴 결합부위는 다른 결합에서 더 사용될 수 있다. 상기 비드를 혼성화 복합체들과 혼합하여 비오틴으로 라벨되어 있는 DNA를 포획한다(실시예 7). 이상의 비드 포획방법에 대안이 되는 방법들(Harlow et al. )은 다음과 같이 스트렙트아비딘 또는 아비딘이 결합되어 있는 지지대: 저-단백결합 필터 또는 96-웰 접시(96-well plate) 또는 아미노비오틴과 같은 변형된 비오틴을 포함한다(Rigas, B., et al. ).

상기의 비드 사용법중 어느 것을 사용하든지 간에, 비드를 분리하여 포획된 혼성화 복합체의 양을 정량한다. 정량법은 제2탐침 DNA 사슬이 어떻게 제조되었는가에 따라 달라진다. 제2탐침이 방사성 라벨된 것이라면, 신틸레이션 카운터를 이용하여 방사성 정도를 측정한다. 한편으로 포획된 DNA는 광화학적, 형광학적 또는 색채분석 검출계를 이용하여 정량할 수도 있다.

전술한 실험중 다수는 방사성으로 라벨된 올리고-뉴클레오티드를 이용한 것이다: 실시예 7에서는 비오틴으로 라벨된 제1탐침과 방사성으로 라벨된 제2탐침을 조합하여 사용하였다. 올리고 뉴클레오티드를 방사상 라벨하는 기술은 앞서 기술하였다. 표준 방법(예를 들면, 아데노신 [γ-³²P]-5' 89 트리포스페이트 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 올리고뉴클레오티드를 말단 라벨함)을 사용한 경우 통상, ㎍의 DNA 당 10⁸cpm의 비활성을 갖는 것으로 나타난다. 비활성이 이정도 수준이기 때문에, 필름에 노출된 겔 또는 필터의 방사능을 측정하거나 신틸레이션 유동액내에서 시료를 직접 카운팅함으로써 소량의 DNA를 정량할 수 있다.

방사성 라벨 및 화학적 발광을 이용한 방법은 i) 감도가 매우 높아 아-페토몰(sub-femtomole) 정도의 올리고 뉴클레오티드로 정량할 수 있고, ii) 잘 확립되어진 기술을 사용한다. 광화학적 검출의 경우 그 방법의 계획은 다량의 시료의 조사검정(mass-screening assay)에 필요한 조건등을 조절하기 위해서 고안되었다. 방사성 동위원소를 사용하지 않는 DNA 검출법에서는 주로 알칼라인 포스파타아제를 검출가능한 라벨로서 삽입시키는데, 그 효소가 빠르게 기질을 산무라로 전환시키고, 또한 그에 의해 화학적 발광체 또는 색채를 가진 산물을 형성하는 기질을 쉽게 구할 수 있기 때문이다.

화학적 발광에 의한 검출 반응에서는 화학적 발광의 검출계(예를 들면, "Southern Lights", Tropix, Inc에 의해 개발)를 사용하여 비오틴이나 디곡시제닌으로 라벨되어 있는 올리고 뉴클레오티드 탐침을 검출할 수 있다. 이러한 기본적 기술은 비드나 필터상에 또는 용액속에 포획되어 있는 DNA를 검출하는데 응용될 수 있다.

알칼라인 포스파타아제는 포획된 DNA 복합체에 결합되어 있다. 이를 위해서는 ELISA(Harlow et al. ; Pierce, Rockford IL)기법으로부터 유래된 몇가지 방법들을 통상 사용할 수 있다. 예를 들어, 제2사슬의 DNA 탐침은(전술한 바와 같이), 디곡시제닌-11-dUTP (dig-11-dUTP) 및 말단 전이효소로 말단이 라벨될 수 있다. DNA를 포획하여 혼성화 혼합물로부터 제거한 후에, 알칼라인 포스파타아제가 결합된 항-디곡시제닌 항체를 디곡시제닌을 포함하고 있는 올리고뉴클레오티드와 반응시킨다(Boehringer Mannheim, Indiahpolis IN), 항원성이 있는 디곡시제닌기가 항체-효소 결합체에 의해 인지된다.

포획된 DNA 혼성화 산물은 알칼라인 포스파타아제가 결합되어 있는 항-디곡시제 항체를 사용하여 다음과 같이 검출된다. 알칼라인 포스파타아제에 대한 화학발광성 기질중의 하나가 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3'-포스포리리옥시)페닐-1,2-디옥세탄 디소디움 염(AMPPD)이다. AMPPD로부터 포스포릴기를 제거하면 불안정한 화합물이 생성되는데 이것이 분해되면서 지속적으로 천천히 477nm의 빛을 방출한다. 빛의 측정은 매우 민감해서 매우 소량의 DNA(예를 들면, 10²~10³attomoles)도 검출할 수 있다.

알칼리인 포스파타아제계에 의해 색채를 나타내게 되는 기질도 시험하였다. 색채 분석용 기질도 매우 유용하지만, 빛의 방출 시스템을 이용하는 것이 훨씬 감도가 높다.

상기 비오틴 포획계를 대신하여, 비오틴 자리에 디곡시제닌을 사용하여 제1탐침 사슬을 변형시킨 것을 사용할 수 있다: 비오틴은 상기 검출계에서의 디곡시제닌 부위를 변형시키기 위해 사용된다. 이러한 배치상황에서는 항-디곡시제닌 항체가 DNA 혼성화 복합체를 포획하는데 사용되고, 알칼라인 포스파타아제에 결합된 스트레비트아비딘이 포획된 올리고 뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해서 사용된다. 그 밖의 다른 포획계로는 다음과 같은 것을 들 수 있다:

i) DNA 결합 단백 및 동종의 결합 배열을 사용한 계. 여기서 동종의 결합 배열은 제1탐침사슬의 5' 말단 배열에 포함되어 있는 포획기이다(Kemp et al. ):

ii) 혼성화 포획계. 여기에서는 폴리(T)와 같이 타겟 DNA에 비상보적인 배열이 제1탐침사슬의 말단배열로 삽입되어 있고 폴리(A)와 같이 상보적인 핵산이 혼성화에 의해 탐침과 회답되어 있는 핵산을 포획하기 위해 사용되었다. 이들 두가지 모두 고형 지지대와 연결되어 사용될 수 있다.

또 다른 계에서는 하나의 탐침을 막(Saiki et al. )에 고정시키고, 피복한 후, 타겟 및 두번째의 피복된 탐침을 가하고, 탈단백하고 세척하여 검출한다.

제10도는 이중 D-루프 구조를 검출해 내기 위한 몇가지 배열을 예시하고 있다. 제10a도는 하나의 탐침이 비오틴과 같은 포획기로 라벨되어 있고 다른 하나의 탐침 사슬이 디곡시제닌과 같은 검출기로 라벨되어 있는 것을 보여준다. 제10b도는 디곡시제닌과 같은 포획기로 라벨된 제1탐침사슬과, 비오틴과 같은 다중 검출기들로 라벨되어 있는 상동성 연장 꼬리를 가진 제2탐침사슬을 보여준다. 제10c도는 이중사슬의 탐침중 어느 하나 및/또는 양자에 부착되어 있는 이종의 꼬리에 검출기(또는 포획기)를 가하는 것을 예시한 것이다.

C. 여러개의 이중 D-루프 구조의 진단학적 응용

포획/검출계에 존재하는 하나의 이중 D-루프 구조 복합체를 이용하는 외에도 여러개의 이중 D-루프 구조도 사용할 수 있다. 탐침 사슬들의 재회합이 탐침을 너무 크게 한다든지 하는 등의 문제를 일으킬 경우, 여러개의 이중 D-루프 구조를 이용하여 기저잡음(background)을 줄여줄 수 있다. 이 방법에서는 둘 이상의 타겟 배열을 알아야 한다.

제11도는 두개의 이중 D-루프 구조에 근거한 검출방법의 몇가지 배치를 예시한 것이다. 제11a도는 제1차 이중사슬 탐침의 두 사슬을 모두 포획기로 라벨하고 제2차 이중사슬 탐침의 두 사슬을 모두 리포터/검출기로 라벨한 예를 보여준다. 제1차 탐침 세트중 한가지 사슬만 혹은 양사슬 모두가 포획기를 포함할 수 있다. 이 계에는 전술한 바와 같은 혼성화 복합체가 포획되지만, 제1차 이중사슬 탐침의 사슬들의 재회합이 그 반응에 기저 잡음(background)가 생기게끔 하는 것은 아니다. 어느 쪽 사슬도 리포터/검출기를 포함하고 있지 않기 때문이다. 혼성화 복합체를 포획한 후 혼성화 복합체내의 2차 이중사슬 탐침의 존재에 의해 검출한다. 전술한 바와 같이 리포터기를 검출한다.

이러한 계의 두번째 실시 형태는, 타겟 복합체내에 여러개의 이중 D-루프 구조형성에 근거한 것으로 제11b도에 도시되어 있다. 이 경우 1차 이중사슬 탐침중의 한 사슬만이 포획기로 라벨되어 있고, 마찬가지로 2차 이중 사슬 탐침의 한 사슬만이 리포터기로 라벨되어 있다.

하나의 이중 D-루프 구조를 검출해 내기 위해서 설명한 바와 같이 이종의 꼬리 및 타겟 DNA에 상동적인 배열을 이중 사슬 탐침에 부가할 수 있다.

D. RecA 단백질에 의해 촉진되는 DNA 증폭반응에 이중 D-루프 구조를 사용하는 방법.

DNA 증폭반응에서 연속적인 증폭을 위해 사슬을 분리하기 위해서는 대부분 열변성에 의존하는 것으로 알려져 있다(Mullis; Mullis et al. ; Scharf et al). 이하, 하나의 또는 여러개의 이중 D-루프 형성에 이어 일어나는 DNA 증폭에 기초한 두가지 검출계를 설명한다.

(i) 본 발명에 의한 증폭/검출법의 한가지는 열변성에 의하지 않고 증폭반응을 촉진하기 위해서 여러개의 이중 D-루프 구조를 이용한다.

본 발명을 뒷받침하기 위해 행한 실험에 의하면 이중 사슬의 타겟내의 서로 다른 영역에 상동적인 두쌍의 상보적 DNA 프리머를 본 발명의 혼성화 반응에 사용하면 타겟 DNA에 두개의 이중 D-루프가 형성되는 것으로 나타났다. 이러한 이중 D-루프는 천연의 이중 사슬 타겟상에서 특정한 DNA 영역을 규정한다(제12a도); 이 반응에 사용되는 탐침/프리머의 예로서 DL 801/2 및 DL803/4(표 1)를 들 수 있다.

그 결과 얻어진 DNA 타겟구조는 DNA 합성을 위한 기질로서 다양한 DNA 폴리머라아제에 의행 인식된다. 그러한 증폭 반응의 한가지예를 실시예 8에 나타내었다. 실시예 8의 증폭반응에 사용된 기질은 람다 DNA 게놈이다. 프리머는 약 500bp 정도의 타겟 영역을 규정한다. 증폭 반응물은 통상, DNA 폴리머라아제(예를 들면, Klenow 단편 (the Klenow fragment)), RecA 단백질로 피복된 프리머, ATPγS[또는 rATP(단독으로 그리고 재생계의 존재하에) dATP, GTPγS 그리고 ATPγS 및 rATP의 혼합물 또는 ATPγS 및 ADP의 혼합물], 타겟 기질, 보조인자 그리고 4종류의 모든 dNTPs(변형 또는 라벨된 dNTP 포함)를 포함하고 있다. 이 반응물은 DNA 헬리카이제, 토포이소머라아제 혹은 이와 유사하게 DNA의 꼬임을 푸는 기능물질 및/또는 다른 DNA 폴리머라아제를 포함하고 있을 수 있다.

이러한 반응 조건에서는 프리머의 3'-말단에서의 연장반응이 일어나 프리머가 5'-에서 3' 방향으로 길어진다. 상기 구조의 4개의 DNA 프리머중 2개 이상에서 폴리머라아제에 의해 3' 말단이 연장되면서 DNA와 프리머간에 타겟 DNA가 증폭되는 영역이 규정된다(제13도). DNA 증폭을 정해진 영역에 제한하기 위해서 나머지 두개의 프리머를 화학적 또는 물리적으로 봉쇄시킨 경우가 아니라면 그 프리머들으이 3'-말단에서도 DNA 폴리머라아제에 의한 증폭이 일어날 수 있다(실시예 8).

DNA 폴리머라아제에 의해 촉진되어 생성되는 프리머 상호간의 3'-연장물이 동사슬상에 존재하는 프리머들을 대체할 수도 있고, 또는 새롭게 합성된 산물이 열저항성 또는 열민감성 DNA 리가아제를 포함하는 DNA 라가아제에 의해 그 프리머에 연결될 수도 있다(Epicentre Technologies, Madison, WI). 적절한 DNA 헬리카아제, 토포이소머라아제, 단일 사슬 결합 단백(SSB), 32 유전자(혹은 다른 유사한) 단백질 또는 Rec BCD가 코드화되어 있는 효소 또는 헬리카아제의 활성과 관련된 다른 단백질 등을 가하여 복제를 촉진시킬 수 있다. RecA 단백질에 의해 바른 위치에 놓여질 수 있는 프리머들은 어느 것이나 복제를 개시시키는데에 사용할 수 있다.

RecA 단백질에 의해 촉진되는, 두개의 이중 D-루프 형성을 통한 DNA 증발반응에 사용되는 탐침은 통상 약 60 내지 80 bp 크기 정도이다. 더 크거나 작은 탐침을 사용할 수도 있지만, 그 경우 안정화 펩티드(예를 들면, SSB 또는 32 유전자 단백질), 약물, 항체, 폴리아민 또는 교차결합 시약 등을 포함시키는 등 반응조건을 재조정하여야 한다.

서로 다른 크기를 가진 여러개의 프리머를 사용할 수도 있다. 프리머들은 전체가 타겟 DNA 이중사슬에 상동적일 수도 있고, 이종의 꼬리를 갖는 경우와 같이 부분적으로 비상동작인 말단- 혹은 내부 영역을 포함하고 있을 수 있다. 이러한 프리머들이 갖추어야 할 유일한 조건은, 원하는 증폭 산물을 얻기 위한 3'-연장 반응에 사용될 염기들이 프라임 DNA 연장반응에 사용될 수 있어야 한다는 것이다. 이미 기술한 바와 같이, 프리머는 비오틴이나 디곡시제닌에 의해 변형된 인산 골격 또는 염기를 포함할 수 있고 DNA 변형 효소나 화학적 시료와 같은 부가적 기능들을 포함하고 있을 수 있다.

RecA 단백질에 의해 피복된 프리머를 과량 사용하면 새롭게 복제 또는 증폭되는 DNA 상에 새로운 다중 또는 이중 D-루프가 생길 수 있다. RecA 단백질로 피복된 프리머들은 또다른 DNA 합성 과정을 개시시키고, 이러한 방법에 의해서, 증폭 프리머를 위치시키기 위해서 타겟 DNA를 열변성시키지 않고, 타겟 DNA를 증폭시킨다.

DNA 증폭반응에는 수많은 DNA 폴리머라아제중의 하나 또는 폴리머라아제의 혼합물을 사용할 수 있으며 예를 들면 다음과 같다:

이. 콜라이 DNA 폴리미라아제 I T7, T4의 클레노우 단편(큰 것); 및/또는 다른 바이러스 또는 세포 DNA 폴리머라아제 및 그들의 변이체(예를 드리면, 엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않는 변이단백(Klenow에 의해 두번 절단)).

두개의 이중 D-루프 반응에 의한 DNA 결과물은 사용된 DNA 프리머들에 의해 정해진다. 증폭되어질 이중 D-루프 영역의 좌, 우측에 있는 프리머들이 새롭게 합성되는 DNA 증폭산물의 5'-말단을 결정한다. RecA에 의해 촉진되는 증폭반응에서 프리머가 치환되지 않을 경우, 새롭게 합성되어진 DNA 산물은 제12b도에 예시되어 있는 것처럼 결찰되어 진다.

여러 개의 프리머 세트를 사용하면 접착력이 있는 말단을 가지는 DNA 증폭 반응 산물을 생성시킬 수 있다. DNA 산물들은 사로 오버랩되는 접착성 말단을 통하여 혼성화되고 이렇게 회합된 DNA들의 길이가 이어서 연장된다(Haase et al. ). 기존 사슬의 연장, 치환 합성 및 RecA에 의해 촉진되어 오버랩되는 영역에서 일어나는 염기쌍 형성은 커다란 DNA 타겟의 수율을 높일 수 있다. 이것은 인-시튜(in-stiu)상에서 RecA에 의해 촉진되는 세포내 DNA 반응에 중요하고, 일정한 조건하(Haase et al. )에서는 다량의 DNA 산물 및 인 시튜 정체(retention in situ)를 위한 부속기들이 필요할 수 있다.

이중 D-루프 또는 다중 D-루프 형성에 의한 인-시튜 증폭반응은 아가로스 내에서 안정하게 행해진다. 아가로스는 통항 저-융점의 변종이 사용되고, 서로 다른 형태의 아가로스 혼합물도 무방하여, 이의 농도는 약 0.4-1%이다. 이러한 조건의 아가로스 겔은 짧은 DNA 산물을 정체시키는 제한적 매질로 작용한다: 이것은 인시튜 반응에서 특히 유용하다(후술).

RecA에 의해 촉진되는 DNA 증폭반응은, 37℃ 뿐만아니라 이보다 높되 타겟 DNA의 이중 사슬이나 프리머:타겟 혼성체가 열변성 되는 온도 보다는 낮은 온도, 예컨대 50°내지 60℃의 온도에서 행해질 수 있다. 반응계의 온도를 높일 경우 프리머 연장반응에 사용될 수 있는 효소의 범위가 넓어지므로 더 긴 DNA 사슬이 합성될 수 있다. 증폭반응의 온도에 따라 반응의 구성성분이 결정된다: 예컨대 와일드 타입 이. 콜라이의 RecA 단백질로 피복된 탐침을 37~39℃에서 타겟 DNA에 가하고, 더머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 폴리머라이제를 사용하여 50~55℃에서 DNA를 합성한 후, 반응계의 온도를 37 내지 39℃로 내려 RecA 단백질로 피복된 탐침을 다시 가한다. 한편으로, 고온에서 저항성이 있는 RecA 유사 단백질로 와일드 타입 이. 콜라이의 RecA 단백질을 대치할 수 있다(본 발명자가 공동으로 소유하고 있으며 출원 계속중인 미합중국 출원 제07/520,321호 참고).

DNA 증폭을 위해서 RecA 단백질에 의해 프리머의 위치 선정이 촉진되는 것을 이용한 이중 이중 D-루프 또는 다중중복 반응은 용액상 진단방법 또는 인-시튜 진단 방법에 중요한 진단학적 응용가치를 가지고 있다.

(ii) 이중 D-루프 및 DNA 증폭을 이용한 두번째의 검출방법은, 라벨된 또는 변형된 dNTP가 폴리머라아제에 의해 첨가되는 것을 이용하여 신호를 증폭시킨다. DNA 폴리머라아제를 사용하여 하나의 D-루프구조(세개의 사슬)에 있는 프리머의 3'-말단을 연장시킬 수 있다는 것은 쳉 등(Cheng et a. (1988))에 의해 입증되었다. 타겟 DNA 분자내에 하나의 이중 D-루프가 형성된 뒤에 DNA 폴리머라아제, 필요한 보조인자 및 4가지의 dNTP를 반응계에 가한다. 사슬 연장 반응은 이중사슬 탐침의 양쪽 사슬에서 모두 또는 한 사슬에서만 일어날 수 있다(제13a도). 다른 한편으로, 포획기를 포함하고 있는 사슬의 3'-말단은 프리머 연장반응이 일어나지 않도록 봉쇄될 수 있다. 하나 이상의 dNTP를 표준방법에 의해서 검출기로 라벨한다(예를 들면, 비오틴, 디곡시제닌 또는 형광성 또는 방사성 기). 라벨된 dNTP가 삽입되면 검출신호가 증폭된다.

이 방법은 목표가 되는 부위를 지향하는 여러개의 이중 D-루프구조를 이용함으로써 더 개량될 수 있다(전술). 타겟 영역의 바깥쪽에 있는 이중사슬의 프리머의 3'-말단은[제13b도에 도시된 바와 같이 아스터리스크(asterisk)에 의해] 봉쇄할 수도 있고 안할 수도 있다. 신호 증폭법은 라벨된 기의 존재하에 RecA에 의해 촉진되는 증폭반응을 전술한 바와 같이 여러차례 반복하여 일으킴으로써 더 강화할 수 있다.

신호 증폭에 의한 타겟 검출은 다음과 같이 행할 수 있다. 두개의 탐침 사슬(적어도 하나는 포획기 포함)을 이용하여 타겟 배열에 하나의 중복-D-루프를 형성시킨다. 그 결과 얻어진 이중-D-루프 복합체를 탈단백화하고 그의 포획기를 포획매질과 접촉시켜 포획한다. 포획된 복합체를 열에 의해 분리시킨다: dsDNA 또는 ssDNA의 형태로 복합체가 분리된다. 필요하면, 예를 들어 복합체가 dsDNA 형태로 분리된 경우 복합체를 열변성시켜 타겟 DNA를 분리해 낸다. 이 혼합물에 타겟 배열에 상보적인 DNA 합성의 프리머를 가한다. 이 프리머들은 원래의 이중사슬의 탐침에 존재했던 배열은 포함하지 않는다. 그다음 적당한 완충 조건하에서 DNA 폴리머라아제 및 dNTP를 가하여 혼성화된 탐침으로 부터 DNA를 합성한다. 프리머에 의해 일어나는 템플릿 형성 반응에는 라벨된 dNTP, 예컨대 방사선 라벨된 dNTPs, 비오틴 라벨된 dNTP, FITC 라벨된 dNTP 또는 그외 적절히 라벨된 DNA 전구체들이 필요하다. 라벨이 포함되어 있기 때문에 적당한 검출계, 예를 들어 FITC로 라벨된 경우에는 형광분석기를 이용하여 타겟을 검출할 수 있다.

E. RecA 단백질에 의해 촉진되는 인-시튜 혼성화 반응에서 이중 D-루프 구조를 이용하는 방법.

이중의 D-루프구조를 이용한 또다른 검출방법은 고정된 세포와 인-시튜 혼성화시키는 것이다(실시예 9): RecA에 의해 촉진되는 인-시튜 혼성화 법은 공유 출원인 PCT 국제공개 제WO93/05177호 "인-시튜 혼성화 방법"에 기재되어 있다(93.3.18. 공개). RecA 단백질로 피복된 이중사슬 DNA를 인-시튜 혼성화함으로써, 동일 촛점의 레이저 조사 현미경(conforcal laser scanning microscope)을 이용하여 하나의 타겟 배열의 상대적인 위치를, 다른 타겟 배열 및/또는 핵막과 관련하여 분리 고정된 생물 구조체안에서 또는 핵 또는 핵 용적내에서 측정할 수 있다(van Dekken et al. ).

인-시튜 방법의 한 가지 응용예를 실시예 9D에 기재하였다. 이 방법에서는 분열된 HEp-2 핵이 고정되고, RecA/염색체-X 알파 세틀라이트(satellite) DNA 탐침 복합체로 조사되며, FITC-아비딘으로 라벨된다. 분열된 핵에서 탐침이 결합되는 양상을 표준 형광학적 기법 또는 레이저 조사 현미경 기법에 의해 평가하였다. 결합된 탐침들의 위치를 측정하기 위해서, 동일한 시야를 위상차 현미경에 의해서 렌즈의 촛점을 변화시키지 않으면서 관찰하였다. 그 결과 얻어진 현미경 사진을 겹쳐 놓음으로써 탐침으로 라벨된 염색체와 관련하여 핵막 및 핵분열 평면의 상대적인 위치를 알수 있다.

본 발명의 이러한 측면에 의해 생물체 내에서 타겟 배열의 위치를 알아내는 간단한 인-시튜 방법이 제공된다. 고정된 세포나 세포형 구조체들은 통상 현탁액 상태 또는 슬라이드 상에서(탐침으로) 조사되며 이어 플로 시토메트릭(flow-Cytometric) 또는 현미경에 의해 분석한다. 이 방법은 열변성 단계가 불필요하므로 인공적 요소를 감소시켜 더 신속히, 특이적으로 타겟 배열을 검출하게끔 해준다. 이 방법은 타겟 배열이 유일한 경우 복제수(copy number)가 적은 경우 및/또는 많은 경우에 똑같이 적용될 수 있다.

특히 이 방법은 복제수가 적은 배열을 먼저 증폭시키는 과정없이 동배열을 검출하게끔 해 준다. 유전자 지도 작성 및 염색체 연구의 대부분이 특이적이거나 유일한 혹은 복제수가 적은 배열과 관련되므로, 본 발명에 의한 인-시튜 방법은 유일하거나 복제수가 적은 정상의, 변이된 또는 병원성의 배열이 관련된 진단방법 뿐만아니라 유전자 지도 연구에 매우 중요하다. 본 발명의 방법에서는 염색체 함량을 플로 시토메트릭 분석법(flow Cytometric analysis)에 의해 측정할 수 있다.

이러한 인-시튜 방법의 진단학적 응용예중 일반적인 것 하나는, 하나의 염색체 및/또는 그 염색체의 특정 영역에서 선택된 유전자나 정규적인 배열의 지도를 작성하는데 사용하는 것이다. 타겟 유전자는 (a) 선택된 유전자 산물을 생산하는 것, (b) 세포 또는 바이러스 발암 유전자 등과 같이 세포 기능조절에 중요한 역할을 한다고 보여지는 것, (c) 반복된 배열과 관련된 것, (d) 활성이 있는 유전자 산물의 생성을 방해하는 유전자적 결함을 가진다고 보여지는 것, (e) 염색체상의 위치에 있어 지도상 위치가 알려져 있는 탐침 표지의 영역과 관련되어 있는 것 및/또는 (f) 통합되어 있는 바이러스 배열을 나타낸다고 보여지는 것이 될 수 있다. 인-시튜 혼성화를 위해서 플로레신-11-dUTP와 같은 형광성기에 의ㅎ아여 직접 레벨하는 방법(Boehringer-Mannheim)을 포함한 여러가지 방법에 의해서 탐침 사슬들을, 라벨할 수 있다. 나아가, 각 탐침 사슬들은 상호 연결되어 있는 형광계를 형성하게끔 사용될 수 있다. 예를 들어 하나의 사슬에 삽입되어 있는 형광성 기에 의해 방출된 에너지가 다른 탐침사슬에 삽입되어 있는 두번째의 형광기에서 흥분된 에너지 상태의 빛을 방출하게 한다. 그렇게 연결된 형광계는 이중 D-루프 복합체내에서 탐침사슬들이 근접해 있는 것을 이용한 것이다.

DNA 탐침으로 특정한 세포 병원균, 특히 감연된 세포내에 바이러스나 세균 병균이 존재하는지 여부를 검출하려 할 경우에는, 고정, 라벨된 세포를 광학 현미경이나 형광 현미경을 사용하여 검정함으로써 세포내에의 감염성 병원균을 검출하고 위치 측정한다. 다른 한편으로 세포 감염 및 감염된 세포의 비율은, 의심되는 핵 또는 세포에, RecA 단백질로 피복된 이중사슬 탐침을 가하여 인-시튜 혼성화 한 후 형광에 의해 활성화되는 세포를 가려냄으로써(Fluorescence activated cell sorting; FACS) 결정할 수 있다(Trask et al. ).

F. 제한 효소에 의한 절단에 기초한 검출계에 이중 D-루프구조를 이용하는 방법.

본 발명에 의한 이중 D-루프 구조는, 제한 효소에 의한 타겟/이중 D-루프 복합체의 절단양상이 검출가능한 방향으로 달라지게끔 동 복합체를 변형시킴으로써 샘플내에 타겟 DNA가 존재하는 것을 검출하는 데에도 사용된다. 이하 이러한 검출계의 몇가지를 설명한다.

이중 D-루프 및 제한 효소에 의한 절단을 이용한 검출 방법중 하나는 다음과 같다. 타겟 DNA 안에 있는 한 영역을 이중사슬의 탐침 배열로 선택한다. 이 탐침 배열을, 타겟 DNA 상에는 존재하지 않는 내부 제한 부위를 포함하도록 변형시킨다. 제한 부위는 타겟 및 탐침간에 염기 쌍 형성이 어긋나는 것을 최소화하도록 선택될 수 있다(제14도). 그 다음 이중 D-루프를 형성시키고 제단백화 한다. 이어 복합체를 고형 지지대상에 포획하여, 탐침 배열에 도입된 제한 부위에 작용하는 제한 효소로 자른다(제14a도에서 Pvu II). 이와 달리, 포획하기 전에 복합체를 제한 엔도 뉴클레아제로 절단할 수 있다(제14b도). 탐침이 타겟 배열에 혼성화된 경우에는 Pvu II 제한 부위가 생기지 않으므로, 이 제한 효소는 탐침:타겟 복합체는 그대로 두고 변화된 탐침:타겟 복합체만을 절단한다. 고형 지지대를 세척한 후 검출기의 존재를 측정한다. 이 방법에 의하면 탐침의 변화에 의한 기저 시그널이 줄어든다.

두번째의 검출법도 유사한 원리에 근거한 것이다. 이 방법에서는 타겟 DNA의 메틸기를 제거하고, 이중사슬의 탐침 DNA는 RecA 단백질로 피복하기 전에 메틸기를 부착시킨다. 그다음 이중 D-루프 복합체를 형성시켜 포획하고 탈단백시킨다. 이어 샘플을 Dpn I 등으로 자르는데, 동 효소는 두개 사슬의 A염기가 모두 메틸화되어 있는 부위(SEQ ID NO:2)만을 인식하여 자른다. 탐침이 타겟 배열에 혼성화되면 그러한 메틸화된 제한 부위가 생기지 않으므로, 성질변화된 탐침에서만 Dpn I에 의한 절단이 생긴다. 고형 지지대를 세척하여 검출기의 존재를 측정한다. 전기 방법과 같이 이 방법 역시 탐침의 성질 변화에 의한 기저 시그널이 적다.

DNA의 메틸화된 상태는 타겟/이중 D-루프 복합체를 사용하여 다음과 같이 이용될 수 있다. 이 방법에서는 타겟 DNA를 메틸화하거나 RecA 단백질로 피복하기 전에 이중사슬의 탐침을 메틸화 한다. 이어 이중 D-루프 복합체를 만들고, 이를 포획하여 탈단백화 한다. 포획된 복합체를 고형지지대으로 부터 분리하여 여러개의 샘플로 나눈다. 하나의 샘플은 메틸라아제에 민감한 제한효소 또는 메틸라아제 의존적인 제한 효소를 자르고, 다른 하나의 샘플은 메틸라아제에 민감하지 않은 제한 효소를 자른다: 예를 들어 Mbo I은 A염기가 메틸화되어 있으면 DNA를 자를 수 없으나, Sau3A I은 A 염기가 메틸화되어 있는가 여부와 무관하게 같은 제한부위를 자른다.

이러한 샘플을 크기별로 분별하여(아가로스나 아크릴아미드 겔상으로 또는 HPLC에 의해서) 샘플의 밴드 패턴을 비교한다. 이 방법에 의해서, 서로 다른 공급원으로부터 얻어진 많은 수의 샘플중에서 선택된 단편을 분리하여 제한 단편길이의 다형분석을 연구할 수 있다.

메틸화는 특정한 제한효소 작용 부위를 그에 의한 절단으로부터 보호하는데에도 사용할 수 있다(Nelson et al. ). 예를 들어, 특정 영역의 단편을 Mbo I에 의해 절단하여 분리하고자 하나 그 영역의 내부에 Mbo I가 작용하는 부분이 포함되어 있을 경우 그러한 단편은 다음과 같이 분리할 수 있다. 메탈화된 탐침을 사용하여 타겟 DNA의 그 내부 제한 부위에 이중 D-루프 구조를 만든다. 타겟/이중 D-루프 복합체를 제단백하고 Mbo I으롤 절단한 후 포획한다(제15a도). 이 방법은 i) 서로 다른 공급원으로부터 얻어지는 단편들상에 있는 보호된 부위에 인접한 제한 부위에(작용하는) 제한효소의 다형을 조사하거나 또는 ii) 사용할 제한 효소에 의해 절단되는 부위가 내부에 존재하는 단편을 포획하여 클론화하는데에 사용될 수 있다. 탈단백된 이중 D-루프구조가 제한 효소에 의한 절단에 민감하다는 사실을, 500-올리고머의 탐침과 2.9-kb의 상동적 타겟 단편 사이에 형성된 탐침:타겟 복합체를 Ple I 제한 엔도 뉴클레이제에 의해서 부위 특이적으로 절단함으로서 입증하였다.

RecA 단백질로 피복된 이중사슬 탐침자체를 제한효소에 의해 특이적으로 절단되는 부위를 보호하기 위해서 사용할 수 있다. 이 경우 복합체는 탈단백화되지 않는다. 이러한 타겟/이중 D-루프 복합체를 제한 엔도 뉴클레아제로 자르고 포획한다(제15b도). RecA 단백질 피복된 이중사슬 탐침은 변형되는 부위(예를 들어 메틸화되는 부위)를 그러한 변형으로부터 보호하는 데에도 사용할 수 있다. 이 경우에도 전기 제한부위 보호의 경우에서와 마찬가지로 복합제를 탈단백화하지 않는다. 타겟/이중 D-루프 복합체를 변형 시약으로 처리한 후에 탈단백화 한다. 타겟/이중 D-루프 복합체 안에 있는 변형 부위는 변형으로부터 보호되어 변형되지 않은 상태로 남는다.

제한 효소 작용 부위를 봉쇄하는 능력은 게놈 지도를 만드는데도 유용하게 쓰인다. 예를 들어, 타켓 DNA가 람다 게놈의 약 26.3kb에 있는 Pvu I 부위처럼 게놈의 기지 영역에 한정되어 있다면, 그 기지의 부위는 전술한 방법중의 한 가지에 의해서 보호된다. 보호된 것 및 보호되지 않은 람다 게놈 DNA를 Pvu I으로 절단한다. 양자의 절단에 의해 생긴 단편의 패턴 변화에 의해, 보호된 제한부위를 포함하고 있는 샘플내에서의 밴드 소실, 새로운 밴드의 크기등에 근거하여 어느 단편이 어느 것 다음에 오는 것인지 알아낼 수 있다.

제한 효소들은 통상 쉽게 구할 수 있고, 메틸화 상태에 대한 반응 및 이들의 사용을 위한 조건들은 본 발명이 속하는 분야에서 잘 알려져 있다(Ausubel et al. : Maniatis et al. ).

G. 부위 특이적 DNA 절단을 하기 위하여 이중 D-루프를 이용하는 방법.

올리고 뉴클레오티드는 절단 시약을 단일사슬 및 이중 사슬 핵산의 특정부위로 인도하는데 사용된다(Corey et al. ; Dreyer, G.B. et al. ; Moser et al. ). 올리고 뉴클레오티드에 의해 절단을 유도하면 실험자가 기존의 절단기능에 의존할 필요 없이 원하는 대로 DNA 절단기능을 조작할 수 있다. 본 발명에 의하면 RecA 단백질로 피복된 이중사슬의 탐침들이 여러가지 방법에 의해 부위 특이적 절단을 일으키는데에 사용된다. 예를 들어, 특이적 타겟 배열을 골라 그 선택된 배열에 대응하는 이중 사슬의 DNA 탐침을 만든다. 이러한 올리고뉴클레오티드 탐침의 한가지 사슬 또는 양사슬에 EDTA기를 부착시킨다. 올리고뉴클레오티드중의 티민의 C-5에 EDTA를 부착시키는 한가지 방법이 드레이어 등(Dreyer et al. )에 의해 소개된바 있다. 이어 탐침을 RecA 단백질로 피복하고, 타겟 DNA와 이중 D-루프 복합체를 형성시킨다. 산호의 존재하에 Fe(II) 및 환원제(통상 DTT)를 EDTA-탐침:타겟 복합체에 첨가하면 절단반응이 일어난다.

이와는 달리, 올리고뉴클레오티드 탐침에 결합되어 있는 DNA 결합/절단 단백질(Sluka, J.P., et al. )로 부터 유래한 펩티드 단편을 이용하여 절단할 수도 있다. 절단 부위가 많은 제한 엔도 뉴클레아제 또는 스타필로코코스의 뉴클레아제와 같은 상대적으로 비특이적인 포스포디에스터라아제를 올리고뉴클레오티드에 부착하여 배열 특이성이 증가된 혼성 분해 시약을 만들 수 있다(Corey et al. ).

올리고뉴클레오티드는, RecA 단백질로 피복되기 전에 또는 이중 D-루프 복합체를 형성 및 탈단백화 후에, 포스포디에스터라아제나 다른 절단 시약에 부착된다. 포스포디에스터라아제, 뉴클레아제 또는 펩티드를 이중 D-루프 복합체와 회합시킨 후에 반응 조건을 조절하여 타겟 DNA의 양 사슬에서 부위 특이적으로 가수분해가 일어나도록 한다. 분해 시약의 활성도에 따라 이중사슬 탐침중 한 사슬만을 혹은 양사슬 모두를 시약을 포함하도록 변형시킬 수 있다.

H. DNA 부유화를 위해서 이중 D-루프를 사용하는 방법.

본 발명에 의한 이중 D-루프 혼성화 복합체는 원하는 타겟 DNA 배열을 분리하여 그 양을 늘리는 데에도 사용될 수 있다. 예를 들면 한 사슬 또는 양 사슬에 포획기를 포함하도록 이중사슬의 탐침을 만든다. 이 이중사슬 탐침과 DNA 혼합물에 섞여 있는 타겟 DNA 사이에 이중 D-루프 복합체를 형성시킨다. 탐침과 타겟 배열을 포함하고 있는 이중 D-루프 복합체를 포획기를 이용하여 예를 들면 고형 지지대에 부착시킴으로써 반응 혼합물로부터 분리해 낸다. 복합체를 가열하여 지지대로 부터 타겟 이중사슬을 분리해 내고, 필요한 경우 분리된 DNA를 원래의 타겟 DNA 이중사슬이 되도록 변형시킨다. 이와 달리 전체 이중 D-루프 복합체를 고형 지지대로부터 분리해 낼 수도 있다.

간단히 가열함으로써 타겟이 되는 이중사슬 DNA가 혼성체로부터 분리될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해서,³²P로 말단 라벨된 500-올리고머의 탐침과 Apa I에 의해 절단된 10.1kb의 타겟 단편 사이에 형성된 이중 D-루프 혼성체를 제단백 한후 열에 대한 안정성을 조사해 보았다: 이 혼성체는 75℃의 1XTBE 완충액에서 완전히 안정했다. 80℃에서 반정도의 DNA 탐침 사슬들이 분리되었고, 85℃에서는 거의 대부분의 탐침 사슬들이 타겟으로부터 분리되었다. 이러한 용융추이는, 열을 가한 후 RecA 단백질이 없는 상태에서 반응 혼합물을 서서히 식형 만든 이중사슬 탐침:타겟의 혼성화 복합체인 경우 얻어진 것과 유사했다. 또한 이 혼성체의 용융추이는, 동일한 이온 조건하에서 서서히 식혀 얻어진 500-올리고머의 이중사슬 DNA에서 얻어진 것보다 약 10℃ 가량 낮았다.

혼성화 반응은 다음과 같은 이유로, 표식된 배열부위(sequence-tagged sites; STSs; Olson, et al. )에 의해서만 확인되는 염색체 또는 유전자 단편을 타겟팅하는데 유용하게 사용할 수 있다:

(i) RecA에 의해 매개되는 혼성화 반응은 혼성체를 형성하기 위해서 타겟이 되는 이중사슬 DNA가 변성될 필요가 없다;

(ii) 타겟은 혼성체를 일정온도로 가열하여 분리하는데, 이 온도에서는 탐침:타겟 복합체로부터 탐침이 해리될 뿐 타겟을 포함하는 분석물질, 즉 염색체 또는 유전자 함유 단편이 변성되지는 않는다. 이어 타겟인 DNA 분석물을 이중사슬 형태로 회수한다.

나아가 혼성체의 융해온도를 세심히 조절하면 부분적으로만 탐침에 상동적인 배열을 가지는 혼성체도 분리하여 선택할 수 있다. 타겟 DNA가 복잡하게 혼합되어 있는 상태에서 탐침을 사용할 경우에는 융점을 매우 신중하게 선택하여야 한다. 이중사슬의 타겟 DNA를 단일사슬의 변성된 타겟 DNA와 분리하여 회수할 수 있는 한가지 이유는, 이중사슬의 DNA가 완전히 변성된 단일 사슬의 DNA 보다 전단력에 대해 더 저항성이 있기 때문이다. 본 발명의 방법에 따라 이중사슬의 타겟 DNA를 회수하여 특정한 이중사슬 유전자 또는 커다란 염색체 단편을 포함하는 게놈 단편을 분리, 부유화 할 수 있고, 이것들을 더 조작하거나 분석할 수 있다.

이 방법에 의하여 얻어진 타겟 DNA 이중사슬은 DNA 증폭 반응에 사용될 수 있고(Mullis; Mullis et al., ) 또는 표준 클로닝 기법에 사용될 수도 있다(Ausubel et al. ; Maniatis et al. ).

I. 상동적인 진단학적 검정

특이한 천연의 타겟 DNA 이중사슬을 검출할 수 있는 상동적 진단 검정법에 사용될 계획안을 시험해 보았다. 이 검정법에는 이중 D-루프 혼성체에 의해 이중사슬의 타겟을 포획하는 과정과 뒤이어 신호를 증폭하는 과정이 관련되며 약술하면 다음과 같다.

(i) 이중 사슬의 타겟 DNA의 포획

람다 DNA 게놈(~50kb)과 같이 크기가 큰 이중사슬의 표준 DNA를 특이적으로 포획하기 위해서, 이중 D-루프 혼성체를 이용한 기법이 사용될 수 있다. 이 반응은 더 작은 DNA 타겟을 포획하는데에도 적용될 수 있다. 이 방법은, RecA로 피복되어 있고 비오틴과 같은 포획기로 라벨되어 있는 단일 사슬의 탐침을 사용하며, 그 크기가 평균 300~500 염기 정도인 것이 바람직하다. 모든 DNA 탐침들은 바람직하게는 타겟이 되는 이중사슬 DNA의 약 1000개의 염기 영역에 상동성이 있는 것이 좋다. 비오틴이 부착된 탐침은 바람직하게는 약 1000bp의 이중사슬 DNA 단편을 bio-14-dATP 존재하에 틈새 이동시켜(nick-translating) 제조한다. 열변성된 탐침 DNA를 RecA 단백질로 피복한 후 이중사슬의 타겟 DNA와 반응시킨다. 탐침:타겟 혼성화 복합체가 생성된 후에 예컨대 20mM의 EDTA를 사용하여 혼성화 반응을 중단시키고, 0.5M의 염으로 처리한 후, 세척된 자성 다이나비드(Dynabeads) M-280 스트렙트아비딘(dynal)을 이용하여 혼성체를 포획한다. 포획후 1M염을 포함하고 있는 완충액으로 비드를 3번 세척한다. 고농도의 염상태에서, 약간 비율의 결합된 RecA 단백질이 적어도 부분적으로 제거되는 것 같다. 포획된 타겟 DNA는³²P-로 라벨된 람다 DNA를 사용하여 세척후에 비드에 남아 있는 방사성 정도를 직접 카운팅함으로써 측정된다. 커다란 람다 DNA 게놈(~50kb)을 사용하여 포획 반응한 결과를 표 3에 나타내었다. 이 반응이 이중사슬의 타겟과 혼성화되어 있고 비오틴으로 라벨되어 있는 탐침을 특이적으로 포획한다는 사실은 세가지의 대조 실험을 같이 함으로써(표 3. 반응 2-4) 증명하였다. 이러한 반응에 의해서 다음을 알 수 있다: (1) RecA를 사용하지 않은 반응(반응 2)에서 유의성 있는 신호가 얻어지지 않는 것으로 보아, 특이적으로 DNA 타겟을 포획하기 위해서는 RecA로 피복되어진 비오틴 라벨의 탐침이 필요하다(반응 1); (2) 비오틴으로 라벨되지 않은 비상동적 DNA 탐침을 RecA로 피복할 경우 기저상태 정도의 DNA 만이 포획되는 것으로 보아(반응 3). RecA가 포함되었기 때문에 타겟이 포획되는 것은 아니다; (3) 평균적 기저 상태, 즉 비특이적인 타겟 DNA의 포획 정도는 약 3.5% 정도이다(반응 2-4).

ii) 포획된 DNA로 부터의 신호 증폭.

비드에 포획된 타겟 DNA를 검출하기 위한 한가지 모델 계획안을 하기에 간단히 설명한다. 이 단계에서는 하나 이상의 라벨된 dNTP 전귀체(예를 들면, bio-14-dATP, 또는 FITC-11-dUTP 등과 같이 직접 검출할 수 있는 라벨이 달린 dNTP)를 포함하고 있는 반응 혼합물 상에서 가열하여, 포획된 타겟을 비드로부터 분리해내고, 원래의 포획 탐침 배열에 상보적이지 않으면서 타겟 배열에만 상보적인 ssDNA 프리머(들)를 가한 후 타겟 DNA의 단일사슬들로 어닐(anneal)되도록 한다. 어닐링 후, 반응물을 식히고 DNA 폴리머라아제 바람직하게는 DNA 폴리머라아제 T7(Sequenase^RVersion 2.0, USB) 및 적절한 완충 용액을 가하여 프리머 연장에 의한 DNA 합성이 일어나게끔 한다. 이와 달리, 고온의 DNA 폴리머라아제를 사용하여 연속적인 DNA 합성이 일어날 수 있는 온도에서 반응물을 배양할 수 있다. 프리머 연장반응 동안, 라벨된 DNA 전구체(들)가 신생의 DNA 사슬(들)내로 삽입된다. DNA 프리머(들)가 기사용된 RecA 피복 탐침(들)에 상보적이지 않기 때문에 올바른 타겟이 포획되어 존재하는 경우에만 라벨이 특이적으로 삽입되어 들어간다. 폴리(A)와 같이 프리머(들)에 직접 회합되는 또는 뒤에 첨가될 수 있는 포획기를 사용하면, 뒤이어 자성 비드 또는 셀룰로오스에 부차가되어 있는 올리고(dT)상에서 증폭되어진 타겟 시그날을 포획할 수 있다. 포획후 삽입되지 않은 전구체 라벨을 증폭된 DNA로 부터 제거하고, 필요한 경우 예컨대 아이-블럭(I-Block, Southern-Light^TM, Tropix)과 같은 치단 시약을, 검출기(예를 들면, AVIDx-AP, Tropix)가 비특이적으로 포획 매트릭스에 결합되는 것을 차단하기 위하여 사용할 수 있다. 차단 후에 기질을 가하여 증폭된 타겟 DNA로 부터의 특이적 시그널을 분석한다. 시그널 분석은 적절한 방법에 의해서 행한다. 진단학적으로 이용되는, 상동중인 이중 D-루프 검정법을 도식화하여 하기에 나타내었다. 특이적인 라벨화, 포획 및 검출법을 표시하긴 했지만, 그러한 검정을 행할 수 있는 방법은 그외에도 셀수 없을 정도로 많다.

이중 D-루프 혼성체를 이용하여 이중사슬의 DNA 타겟을 상동적, 진단학적으로 검정하는 방법을 개략적으로 도식화하면 다음과 같다:

이하 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 설명한다. 그러나 본 발명이 그에 한정되는 것은 아니다.

[시료 및 제법]

제한 효소는 베링거 만하임(Boehringer Mannheim; Indianapolis IN) 또는 뉴잉클랜드 바이오랩(Now England biolabs; Beverly MA)에서 입수하여 제조자의 지시대로 사용하였다.

일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 [γ-³²P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 방사성 라벨하였다. 라벨 반응은 완충 용액에서, 제조자가 권장하는 방법에 의해서 행하였다(New England Biolabs, Beverly MA; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg MD; 또는 Boehringer/Mannheim, Indianapolis IN). 제조자의 지시대로, 미리 만들어져 있는 넨소르브 20(nensorb 20)칼럼을 사용하여 (NEN-Dupont, Boston, MA), 완충용액 및 삽입되지 않는 트리포스페이트로부터 올리고뉴클레오티드를 분리하였고, 필요한 경우에는 뒤이어 ddH²O를 사용하여 투석하였다.

[실시예 1 : RecA로 피복된 탐침의 제조]

이중사슬 및 단일사슬의 탐침과 프리머를 시리즈로 제조하였다. 인접한 람다 파지 게놈의 500 염기쌍 영역에 대해서 상대적인 이들 탐침 및 프리머의 위치를 제1도에 나타내었다: 람다 게놈중 이 영역의 뉴클레오티드 배열은 제2도에 나타내었다. 각 탐침 및 프로브의 5' 및 3' 말단의 염기위치를 람다 바이러스 게놈과 관련시켜 표 1에 나타내었다.

[표 1]

탐침 및 프리머의 DNA 배열을 규정하는 람다 염기들

5' 사슬

^{. .}반대편 사슬

[표 2]

탐침:타겟 혼성체의 비드 포획물은 RecA에 의해 촉진되는 이중 D-루프 반응산물의 두개의 DNA 탐침사슬을 포함하고 있다는 것을 보여준다.

* 시료반응의 설명은 제8도 참고. 각 포획반응물은 1X 아세테이트 반응 완충용액으로 3회 세척한 후에 스트렙트아비딘으로 피복되어 있는 디날(Dynal) 비드상에 남아 있는³²P를 측정하여 퍼센트 값을 구하였다. 분당³²P 카운트의 전체 기대값은 제8도의 것과 동일한 실험계로부터 얻어지는 얇은 겔 슬라이스 내에서 DNA의 신틸레이션 카운팅을 하여 결정하였다. 반응 3에는 방사성 DNA를 첨가하지 않았기 때문에(비오틴 포획 팀침만을 포함하고 있음). 이 반응에 대한 방사성 카운트 기대치도 없었다.

+ DNA내의 방사성³²P 카운트는 기저 DNA를 비드가 비특이적으로 포획하여 생기는 카운트(즉, 비오틴 포획 탐침이 없는 반응 2로부터 생기는 카운트)에 대해 보정한 것이다.

PCR01 및 PCR02의 프리머는 "진엠프"("GENEMAP") DNA 증폭 시약 키트에 공급되는 프리머에 해당된다(Perkin Elmer Cetus, Norwalk CT)

단일사슬의 프리머(PCR01, PCR02 및 PCR03A)와 단일사슬의 탐침(DL80-1 내지 4, 비오틴-121, 121-³²P 및 비오틴-79)은 상업적으로 구입할 수 있는 포승포르아미디트 전구체를 사용하여 DNA 합성기(Applied Biosystems 380B DNA synthesizer; Applied Biosystems. Foster city CA)상에서 화학적으로 합성하였다.

보호기의 제거전에, 5'-말단염기(New England Nuclear-Dupont, Boston, MA)와 비오틴 포스포르아미디트를 반응시켜 DNA 분자를 비오틴으로 라벨하였다. 화학적으로 합성된 모든 DNA는 제조자의 지시에 따라 보호기를 제거하였다.

짧은 DNA 탐침(25-mers)은 더이상 정제하지 않고 사용하였다. 단일사슬의 80-올리고머 및 121-올리고머 DNA 탐침은 각각 8% 및 5% 또는 8%의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해서 정제하였다. 원하는 크기의 DNA 분자에 대응되는 겔로부터 DNA 밴드를 잘라내어 완전한 크기의 DNA 산물을 얻었다. DNA 분자는 "일루트렙"시스템("ELUTRAP" system; Schleicher and Schuell, Keene, NH)을 사용하여 겔 조각으로부터 전기적으로 용출시켜 회수하였다. 탐침과 프리머들은 표준 에탄올 침전법에 의해서 농축하였다(Maniatis et al. ). 탐침 및 프리머의 DNA 농도는 260nm에서 희석된 DNA의 UV 흡광도를 측정하여 결정하였다.

람다 게놈에서(제1도) 이중사슬의 500bp 및 200bp 영역은, 각각 프리머 PCR01 및 PCR02, 또는 PCR03A 및 PCR02를 사용하고 또한 Taq 폴리머라아제 및 표준 DNA 증폭반응 조건(Perkin Elmer Cetus; Mullis, Mullis et al. )을 사용하여 합성하였다. 증폭반응 산물은, 0.7% 아가로스(Sigma Type II, Sigma, St. Louis Mo) 겔(500-mer) 또는 4% "누시브"("NUSIEVE"; FMC BioProducts, Rockland, ME) 아가로스 겔(280-mer)를 통한 전기영동에 의해서 DNA 프리머로부터 분리하였다. 증폭반응산물에 해당되는 밴드내의 DNA 분자를 전기적으로 용출시키고 농축한 후, 전기의 방법대로 그들의 실제 농도를 측정하였다.

이중사슬의 121- 및 159-올리고머 탐침은, 정제된 280-올리고머를 AluI 효소(New England Biolabs, Beverly MA)에 의해 절단하여 얻었다. 이 DNA 탐침을 겔 전기영동에 의해 분리하고 전기용출 시킨 후 전술한 바대로 농축하였다.

이중사슬의 79-올리고머 탐침은 정제된 500-올리고머를 Hpa II 제한효소를 이용하여 절단하여 얻었다. 절단된 산물은, 3% 또는 4% "누시브"("NUSIEVE", FMC Bioproducts) 겔, 또는 1% 아가로스 겔을 사용한 전기 영동에 의해서 절단되지 않은 DNA와 분리하였다. 전술한 바와 같이, 겔로부터 특이적 DNA 단편을 회수하였다.

단일사슬 또는 이중사슬의 DNA 분자는 (γ-³²P)ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Promega, Madison WI)를 이용하여 5'-말단을 라벨하였다(Maniatis et al. ). 필요시, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 라벨하기 전에, 알칼라인 포스파타아제로 DNA 분자를 탈인산화 하였다(Boehringer Mannheim, Indianapolis IN). 삽입되는 않은 라벨은, 핵산 정제 칼럼인 "넨소르브 20"("NENSORB 20"; NEW-Dupont)을 사용하여 제거하였다. 라벨된 DNA 분자들은 이중 증류수에 대해 투석함으로서 더 정제하였고, 냉동 건조하여 농축하였다.³²P로 라벨된 121-, 159- 또는 79-올리고머 역시³²P로 말단 라벨된 280- 또는 500-올리고머를 적절한 제한효소로 잘라 얻었다.

[실시예 2 : 와일드타입 RecA 단백질 및 변이 RecA 803 단백질의 정제]

RecA 및 recA 903 단백은, 이들을 과량 생산하는 JC12772 및 JC15369종 (A.J. Clark 및 M. Madiraju로부터 입수)에서 분리하였다. 이들 종에는 RecA 및 recA-803을 코딩하는 배열을 가진 플라스미드의 단위 세포당 복제수가 많다. 변성 조건하에서, JC12772 및 JC 15369의 세포 추출물 중 총 단백량을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 이용하여 분석한 결과, 380,000-달톤의 RecA 또는 recA-803 단백이 이들 종에서 생성되는 단백의 대부분을 차지하는 것으로 나타났다.

RecA 및 recA-803 단밸질은, 분말상으로 얻어지는 하드록시아파티드 칼럼(BioRad)을 사용하여 속성 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)하는 기존의 절차(Shibata et al., 1981; Griffith et al., 1985)를 변형시켜 사용하고 이어 음이온("MONO Q", Pharmacia)교환 칼럼을 통과시켜 정제하였다.

단백 정제과정에서는 다음을 검사하였다:

(i) SDS-PAGE("PHASTGEL" 시스템 Pharmacia, Piscatway NJ)에 의해 38,000-달톤의 RecA 단백질 동정;

(ii) [γ-³²P]APT 및 단일사슬 DNA를 이용하여 (Shibata et al., 1981), RecA ssDNA-의존적인 ATPase의 활성도 검정. 반응 산물은 PEI 셀룰로오스 박층 크로마토그래피(EM Science, NJ)를 이용하여 분리하였다; PEI 판은 0.5M LiCl 및 0.25M의 포름산 용매를 이용하열 전개시켰다. 반응산물은 방사선에 의해 검출하였다;

(iii) DNase 활성의 검정. DNase의 활성은 RecA 단백질 샘플을 phiX174의 선형 및 슈퍼 코일된 환상의 이중사슬 RF 및 환상의 단일사슬 DNA의 혼합물과 RecA 사슬-전이 완충액내에서(Cheng et al., 1988) 1시간 배양(37℃)함으로써 조사하였다. 탈단백화한 후에, 상기 DNA를 아가로스 겔상에서 전기 영동하고 에디티움 브로마이드로 염색하여, RecA와 배양한 시료에서 각 DNA 형의 양과 RecA 없이 배양한 시료에서의 양을 비교함으로써, DNA의 틈새 형성(Nicking) 및 절단(digestion) 정도를 조사하였다. DNase 활성이 검출되지 않은 RecA 단백질 시료만을 사용하였다;

(iv) 쳉 등(Cheng et al., 1988)의 방법을 변형시킨 방법에 의해서 500-올리고머의 올리고뉴클레오티드 탐침의 D-루프 활성을 검정.

"모노-큐"("MONO-Q")로 최종 정제한 RecA 및 recA 803 단백질을 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 상에서(전기영동 함으로써 얻어진) 프로파일을 은으로 염색하여 보면, 본질적으로 다른 세포내 폴리펩티드가 없는 제제로부터 생길 수 있는 38,000달톤의 단일 밴드만이 나타났다.

[실시예 3 : RecA 단백질로의 피복 반응]

통상, 표준 1X RecA 피복 반응 완충액(10XRecA 반응 완충액; 10mM 트리스 아세테이트(pH 7.5, 37℃), 20mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 소디움 아세테이트, 10mM DTT 및 50% 글리세롤; Cheng et al., 1988)내에서 RecA 단백질로 탐침을 피복한다. 이중사슬이든 단일사슬이든 모든 탐침은 사용전에 95~100℃에서 5분간 가열하여 변성시키고, 얼음에 1분간 방치한 후 0℃에서 약 20초간 토미 원심분리기(Tomy centrifuge)에 의해 원심분리하였다(10,00rpm). 변성된 탐침들은 즉시, ATPγS 및 희석화제(이중 증류된 H₂O)와 혼합되어 있는 실온의 RecA 피복 반응 완충액에 가하였다.

이 반응 혼합물은 통상 다음의 구성분을 포함하고 있다:

(i) 2.4mM ATPγS 및 (ii) 10~40ng 사이의 이중사슬 탐침; 이 혼합액에, (i) 보통 5.2mg/㎖의 RecA 단백질 1㎕(Pharmacia로부터 구입하거나 전기의 방법대로 정제한 것) 또는 (ii) 같은 용적의 RecA 저장 완충액(20mM Tris-HCl pH7.5, 0.1mM EDTA, 1.0mDTT 및 50% 글리세롤)을 재빨리 가하고 혼합하였다. 탐침을 RecA로 피복하기 위한 반응액의 최종 용적은 보통 10㎕ 정도였다. RecA 피복 반응은 탐침 RecA의 혼합물을 37℃에서 10분간 배양함으로써 개시된다.

피복 반응에서 RecA 단백질의 농도는 탐침의 크기 및 첨가된 탐침의 양에 따라 달라진다: RecA 단백질의 농도는 통상 6.8μM 내지 51μM 정도이었다. 단일사슬의 DNA 탐침을 RecA로 피복할 경우, 그에 상보적인 탐침사슬의 존재에 관계없이 이중사슬의 탐침일 경우에 사용되는 농도의 반정도로 ATPγS 및 RecA 단백질 농도를 줄여 사용한다: 즉, 일정한 농도의 각 탐침사슬에 대해서 RecA 단백질과 ATPγS의 농도 비는 일정하게 유지된다.

제3도는 121-올리고머 및 159-올리고머에 RecA 단백질이 결합되어 있는 것을 보여주는 방사선 사진으로, DNA 밴드-이동 검정법에 의해 측정한 것이다. 전술한 바와 같이, 열변성된³²P-라벨의 이중사슬 121-올리고머 및 159-올리고머 DNA 탐침은 RecA 단백질과 반응한다. 최종적인 RecA-DNA 반응 혼합물은 2.4mM의 ATPγS를 포함하고 있었다. RecA 단백질이나 RecA 저장 완충액은, 변성된 121-올리고머 또는 159-올리고머의 DNA 탐침중의 어느 하나를 0.01㎍ 포함하고 있는 4개의 반응계 각각에 첨가하였다. 각 반응계에서 최종 RecA의 농도는 각각 1 및 5 레인에서 0μM, 2 및 6 레인에서 0.137μM, 3 및 7 레인에서 1.37μM, 4 및 8 레인에서 13.7μM이었다(제3도). 모든 경우에서 최종 용적이 10㎕가 되도록 하여 RecA/DNA 탐침 피복반응을 실시하였다. 반응계를 37℃에서 10분간 배양하여 RecA결합을 개시시켰다. 각 반응계에서 5㎕를 취하여 1X TBE 완충액내에 있는 2% 아가론스 겔에 걸고(loading), 9.2V/cm로 2시간동안 전기영동하였다. øX-174 DNA (GIBCO-BRL, Gaithersburg MD)를 HasIII로 절단하여 이중사슬 DNA의 크기기준(sized marker)으로 사용하였다. 이 기준이 도니는 DNA는 전술한 방법에 의해³²P로 5'-말단을 라벨하였다. 겔은 65℃의 비오스사이클러 오븐(Bioscycler oven)내의 사란 랩(saran wrap)상에서 공기 건조시켰다. 건조된 겔을 X-선 필름에 노출시켰다.

제3도에서 알 수 있는 바와 같이, RecA 농도가 증가할수록 전기영동시 DNA 탐침의 이동도가 감소하였다.

recA-803 단백질에 대해서도 이상과 동일한 조건을 사용하여 실험하였다.

[실시예 4 : RecA 단백질을 매개로 한 다중구조의 형성]

실시예 3의 방법에 의해서 탐침을 피복하였다. 피복이 완결된 후 각 반응계에 타겟 DNA를 첨가하였다. 타겟 DNA는 람다 바이러스 게놈으로부터 유래된 것으로 효소에 의해 절단되면 탐침 배열에 상동적인 단편과 비상동적인 단편을 포함하게 된다. 통상 0.66~1.5㎍의 타겟 DNA를 1X 반응 완충액속의 각 반응계에 첨가하였다. 전체반응의 마그네슘 이온 농도는, 0.2M의 마그네슘 아세테이트를 조금씩 나누어 첨가하여 12mM로 조절하였다. 타겟 DNA를 첨가한 후 반응계의 최종 용적은 보통 20㎕이었다.

RecA에 의해 촉진되어 상동적인 탐침:타겟간에 반응을 일으키도록 하기 위해서 탐침 타겟 혼합물을 37℃에서 배양하였다. 60분동안 배양한 후, 프로테인아제K(10mg/㎖)로 15~20분간(37℃) 처리하고, 소디움 도데실 설페이트(SDS)를 최종농도가 0.5~1.2%(w/v)가 되도록 첨가하여 제단백하였다. 추적용 염료(Maniatis et al. )를 첨가한 후 각 반응물의 분액을 0.7~1.0%의 아가로스 겔 웰(Wells)에 부가하였다. 실온 또는 4℃에서 상기 겔을 전기영동하였다. 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하고 UV광에 의해서 DNA 분자를 가시화하열 분석하였다. 적색 필터오아 폴라로이드 677 블랙 및 화이트 필름을 사용하여 겔의 사진을 촬영하였다.

방사성 라벨된 DNA 탐침을 반응에 사용한 경우, 듀퐁 "크로넥스 콴타 III"(Dupont "CRONEX QUANTA III")또는 "라이트닝 플러스"("LIGHTENING PLUS") 증강 스크린 및 코닥 "X-OMAT AR5" 필름을 사용하여 젖어 있는 또는 건조된 겔의 방사선 사진을 촬영하여 탐침:타겟 복합체를 검출하였다. 신호의 정량을 위해서, 오토래디오그램 상에서 신호가 검출되는 타겟 DNA 밴드를 겔로 부터 잘라내고 분쇄한 후 신틸레이션 칵테링(Scintillation cocktail; "AQUASOL-2", Dupont-NEN, Boston MA) 내에 현탁시켰다. 방사선도는 패카드 2000 씨에이 트리-크랩(Packard 2000 CA Tri-Crab) 액체 신틸레이션 분석기를 이용하여 카운트하였다.

이중사슬의 280-올리고머 및 500-올리고머 탐침(표 1)을 전기한 바와 같이, 이중사슬의 선형 타겟 DNA 단편(람다 DNA를 DraI으로 절단하여 얻은 8370bp의 단편으로, 각 탐침 배열을 포함하고 있다)과 반응시켰다. 변성된 탐침의 DNA 분자는 2.4mM APTγS 및 34.2μM RecA 단백질의 존재하에 RecA 단백질로 피복하였다. RecA 단백질로 피복되지 않은 변성된 탐침을, RecA 단백질만 없고 동일한 조건인 반응계에 첨가하였다. 37℃에서 10분동안 배양한 후, DraI 제한효소로 절단된 0.66㎍의 람다 게놈 DNA를 각 탐침 혼합물에 첨가하였다: 게놈 DNA는 전기와 마찬가지로 조절된 농도의 Mg²⁺가 포함되어 있는 1X 반응 완충액에 현탁시켰다. 이중사슬의 탐침 대 상동성 있는 이중사슬의 타겟 단편의 최종적인 마이크로몰 비율은 500-올리고머인 경우 10.6:1, 280-올리고머인 경우 21.6:1이었다. 탐침:타겟 반응물은 전술한 바와 같은 조건으로 배양하였다.

반응물에서 단백질을 제거하고 0.7%의 아가로스 겔에 부가하였당(loading). 탐침과 타겟 DNA 단편을 분리하기 위해서 DNA를 전기 영동시켰다. 이 반응물을 포함하고 있는 겔 상의 DNA를 에티디움 브로마이드로 염색하고 사진 촬영하고 제4a도에 나타내었다. 좌측의 세개의 반응물은, pUC18의 이중사슬 환상 DNA 타겟 및 RecA로 피복된 단일사슬의 69-올리고머 탐침(이 대조 화합물들은 B. Johnston, SRI, MenLo Park, CA에서 입수함)을 사용한 대조 반응물들이다. 중앙 레인에는 1kb의 마커 DNA(maker DNA:GIBCO-BRL)가 포함되어 있다. 겔의 오른쪽편에 있는 4개의 반응물들이 람다 DNA를 DraI로 절단한 타겟 DNA 들이다.

겔을 건조시킨 후 전기한 바와 같이 X-선 필름에 노출시켰다. 그 결과를 제4b도에 나타내었다. RecA로 피복되어 있는 500-올리고머 및 280-올리고머의 탐침들은 모두 DraI으로 절단된 람다 DNA 타겟의 올바른 단편에 특이적으로 혼성화되어 있다. 탐침:타겟 DNA의 상동적 위치는 8370 bp의 타겟 단편의 3'-말단으로부터의 832bp 이상이다. 이 결과는, 500-올리고머 및 280-올리고머의 RecA에 의해 촉진되어, 탈단백에 안정한 DNA 혼성화 산물이 생성된다는 것을 보여준다. 이렇게 안정한 DNA 복합체의 생성에는 RecA 단백질이 필요하다.

[실시예 5 : 작은 이중사슬의 탐침과 선형의 이중사슬 타겟 DNA 사이에서의 안정한 복합체 형성]

본 실시예는 제단백에 안정한, 선형 이중사슬 DNA와의 복합체를 형성시키는데 작은 이중사슬의 탐침을 사용하는 방법을 설명한다.

다음의 혼성화 반응은 전기 실시예 4의 방법대로 실시하였다. RecA 단백질로의 피복반응의 용적은 모두 10㎕였다. 달리 언급이 없는한 각 반응물은 2.4mM의 ATPγS 및 20.5mM의 RecA를 포함하고 있다. 최종 반응물은 DraI으로 절단된 람다 DNA를 1.3㎍ 포함하였다. 제5a도 및 제5b도상의 각 레인의 반응조건은 다음과 같았다: 1레인, RecA 단백질로 피복된 280-올리고머 탐침; 2레인, RecA 단백질로 피복되지 않은 280-올리고머 탐침; 3레인, RecA 단백질로 피복된 121-올리고머의 탐침; 4 내지 6 레인, RecA 단백질로 피복된 79-올리고머 탐침, 5 및 6레인에 있는 반응물들은 탐침 피복 반응시 RecA 단백질을 8.54μM 및 41μM의 농도로 포함하였다. 반응물에서 단백질을 제거하고 0.7%의 아가로스 겔에 부가하였다. 겔을 전기영동하여 탐침 및 타겟 DNA 단편을 분리하였다.

제5a도는 상기 반응물로부터 얻어진 타겟 DNA 단편(람다 DNA를 DraI으로 절단)이 나타나 있는 아가로스 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하여 촬영한 사진을 보여준다. 제5b도는 제5a도에 나타낸 아가로스 겔상의 DNA의 방사선 사진을 보여준다. 화살표는, 사용된 탐침에 상동성 있는, 람다 DNA의 DraI 타겟 단편이 이동한 위치를 표시한 것이다. 이 결과는 RecA로 피복된 DNA 탐침이 280-올리고머, 121-올리고머 및 79-올리고머인 경우 모드 제단백에 안정한 복합체를 형성한다는 것을 보여준다. 전술한 바와 같이 선형의 이중사슬 DNA 타겟분자의 말단으로부터의 적어도 832 염기에 안정한 복합체가 형성되었다.

[실시예 6 : 안정한 복합체 형성에는 이중사슬의 탐침이 필요]

A. 이중사슬의 DNA 탐침이 갖추어야 할 조건

실시예 4에서와 같이 3.0㎍의 람다 DNA의 DraI 절편을 반응별로 사용하여 RecA로 피복된 DNA 탐침과 혼성화시켰다(60분). 화학적으로 합성된 단일사슬의 DNA 121-올리고머 두개를 사용하였다. 그 두개의 사슬은 서로 상보적이었다. 한 사슬은 비오틴으로 라벨하였고 다른 한 사슬은³²P로 라벨하였다.

다음의 반응번호는 제6a도 및 6b도에 있는 각 레인에 대응한다. 반응 1, 2, 5, 6은 2.4mM의 ATPγS를 반응 3, 4는 4.8mM의 ATPγS 각각 포함하였다. 모든 반응에는 20ng의³²P-라벨된 DNA 탐침사슬과 10.4㎍의 RecA 단백질을 사용하였다: 각 반응물은 동일한³²P-특이 활성을 나타낸다. 반응물 3 내지 6은 비오틴으로 라벨된 탐침도 포함하였다. 반응 3 및 4에서는 초기 10㎕ RecA 반응물에, 양 DNA 탐침을 동시에 첨가하였다. 반응 5 및 6에서는³²P- 및 비오틴-라벨된 탐침을 각각 분리된 10㎕의 반응액에서 RecA로 피복하고 그 다음 각 반응 혼합물의 반을 타겟 DNA와 30분간 배양한 후 빠져 있는 상보적인 DNA 탐침사슬(RecA로 피복된 것)을 첨가한다.³²P-라벨된 DNA 사슬은 반응물 5에 먼저 첨가하고 반응물 6에는 두번째에 첨가하였다.

모든 반응물은 전기영동전에 프로데인아제 K 및 SDS로 제단백하였다. 제6a도는 상기 반응물에서 얻어진 람다 DNA의 DraI 단편 타겟들을 나타내고 있는 아가로스겔을 에티디움 브로마이드로 염색하여 사진 촬영한 것이다. 반응 조건들은 제6a 및 6b도에 요약되어 있다. 제6a도의 겔을 공기 건조시켜 방사선 사진 촬영하여 제6b도에 나타내었다.

선형의 타겟 DNA 상의 상동적인 내부 배열에 제단백된 안정한 산물을 형성하기 위해서 두개의 DNA 탐침사슬이 필요하다(3,5 및 6레인을 2 레인과 비교), 그러한 산물을 생성시키기 위해서는 RecA 단백질도 필요하다(3,5 및 6 레인을 4레인과 비교).

B. 안정한 이중사슬 산물의 예

제7도는 제단백된 이중사슬의 RecA에 의해 촉진되는 혼성화 반응의 산물의 한가지 가능한 모델을 나타낸 것이다. 제7도는 말단 라벨된 짧은 DNA 탐침과 이중사슬의 선형 DNA 타겟에 의해 형성된 안정한 이중 D-루프 다중구조체를 예시한 것이다. 상기 모델을 8370bp의 람다 DNA 타겟(DraI 단편)상에서 혼성화된 형태를 묘사한 것으로, 여기서 탐침:타겟 간의 상동영역은 타겟의 짧은 말단(전체 람다 게놈과 관련하여서는 3'-말단)으로부터 적어도 832 염기 떨어진 위치에서 시작된다. 상기 DraI 단편은 람다 DNA의 93 내지 8462 염기서열을 포함하고 있다. 정확한 상동영역은 표 1에 나타내었다. RecA로 피복된 단일사슬의 탐침은 제단백에 안정한 복합체를 형성하지 않았다(상기 제6b도 참고).

[실시예 7 : 탐침:타겟의 포획 및 DNA 검출]

A. 혼성화 반응

상보적인 21-올리고머 DNA 탐침(표 1)을 각각 화학적으로 합성하였다. 상보적인 탐침들은 [γ-³²P]APT 및 비오틴(각각, 리포터 및 포획기)을 사용하여 다르게 라벨하였다. 탐침 피복 반응 혼합물은 모두 10㎕의 반응액당 2.4mM의 ATPγS, 20ng의 단일사슬 탐침 및 5.2㎍의 RecA 단백질(5.2㎍/㎕: Pharmacia) 또는 동일 용적의 RecA 저장 완충액(RecA 단백질 없음)을 포함하였다. 비오틴- 및³²P-라벨된 탐침들을 모두 사용하는 반응계에 대해서는(반응 1 및 4), 유사한 비오틴- 또는³²P-라벨된 탐침 피복 반응물의 10㎕ 분액을, 이 혼합물들을 타겟 DNA 혼합물에 첨가하기 전에, 모아 섞었다(20㎕ 생성). 반응물의 용적을 일정하게 유지시키기 위해서 단일사슬의 탐침만을 사용하는 반응계(반응 2 및 3)에는 10㎕의 탐침 혼합물, 10㎕의 탐침 반응 완충액(즉, 두번째 탐침은 없음) 및 20㎕의 타겟 DNA 혼합물을 사용하였다.

람다 DNA 혼합물은 다음과 같이 제조하였다:

1XRecA 반응 완충액, 0.2M의 저장 Mg 아세테이트의 1 내지 10배 희석액 및 ApaI로 절단된 람다 DNA. 20㎕의 타겟 DNA 혼합물을 20㎕의 탐침 반응 혼합액 각각에 첨가하였다. 이 반응물을 37℃에서 60분간 배양하였다. 40㎕의 반응액에서 단백질을 제거하고 두개의 분액으로 똑같이 나눈 후 두 분액을 0.7% 아가로스 겔내의 인접 웰(wells)에 각각 부가하여 전기영동에 의해 각 구성분을 분리하였다(전술한 방법에 의함).

³²P로 라벨된 사슬을 포함하고 있는 모든 반응계(1, 2 및 4)의 초기 비활성은 서로 같았다. 각 반응의 인접 이중 레인의 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하여 제8도에 나타내었다. 각 반응의 내용물이 제8도에 요약되어 있다.

겔의 각 레인중 10.0kb의 람다 타겟 DNA(제8도)에 해당되는 부분을 겔로부터 잘라냈다. 잘라낸 조각들을 마이크로 원심분리관에 넣고 드라이아이스를 이용하여 급냉하였다. 각 겔조각에 포함되어 있는 DNA 단편은, 냉동된 겔을 겹쳐진 파라 필름 사이에 넣고 더이상 액체가 나오지 않을 때까지 짜내어 회수하였다. 이 DNA를 포함하고 있는 액체는, 에펜도르프("EPPENDORF")마이크로 피펫을 사용하여 주의 깊게 제거하였다.

B. 포획/검출 검정.

동일한 타겟 분자내에 두개의 탐침사슬(하나는 비오틴으로 라벨 다른 하나는³²P-로 라벨)이 존재한다는 것은, 스트렙트아비딘으로 피복되어 있는 상자성 비드(Dynal, Oslo, Norway)상에 비오틴 함유 탐침:타겟 혼성체를 포획하여 검정하였다. 제조자의 비드 저장 완충액은 사용전에 제거하였다. 비드는 1XRecA 반응 완충액, 10XRecA 반응 완충액 및 마지막으로 1XRecA 반응 완충액을 사용하여 세척하였다. DNA를 포획하기 전에, 세척된 비드를 동량으로 분취하여 각 1.5㎖인 마이크로 원심분리관에 가하고 상기 최종 세척 완충액을 제거하였다. 비드 혼합물을 담고 있는 마이크로 원심분리관을 자성 분리 대(magnetic separating rack, Promega, Madison WI)에 두어 비드 현탁액으로 부터 액체를 제거하였다.

상기에서 얻어진 DNA-함유 반응시료를, 세척된 상자성 비드가 일정량 담겨있는 마이크로 원심분리관에 각각 가하였다. 시료를 혼합하고 실온에서 15분간 배양하였다. 시간이 지남에 따라 비드가 가라앉기 때문에, 비오틴:스트렙트 아비딘이 효율적으로 상호 접촉할 수 있도록 배양 기간중에 반응혼합물을 몇번 흔들어 섞어준다. 포획 반응, 즉 비오틴과 스트렙트아비딘의 결합 반응 후에 각각 반응계에 있는 상자성 비드를 자석을 이용해 모든 다음 반응액을 제거하였다.

각 비드 시료는 1XRecA 반응 완충액으로 3번식 세척하였다. 이 비드에 액체 신틸레이션 카운팅 플로어(liquid scintillation counting fluor)를 가하고 각 비드 반응계에 의해 포획된 DNA이 방사선도를 카운팅하여³²P-라벨된 탐침사슬의 존재를 평가하였다. 그 결과 얻어진 데이타를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

탐침 : 타겟 혼성체를 비드에 포획하여 보면 RecA에 의해 촉진되어 생성되는 이중 D-루프 산물이 두개의 DNA 탐침사슬을 포함하고 있음을 알 수 있다.

+ DNA 중의³²P의 방사성 카운트는 주변 DNA를 비특이적으로 비드가 포획하여 생기는 카운트(즉 비오틴 포획 탐침이 없는 반응계 2에서 얻어지는 카운트)값에 대해 보정한 것이다.

표 2에서 퍼센트 값은, 각 반응물을 1X아세테이트 반응 완충액으로 3번 세척한 후 스트렙트아비딘으로 피복된 디날(Dynal)비드상에 남아있는,³²P-로 방사선 라벨된 DNA 카운트로부터 계산하였다. 반응계 3에서³²P 라벨된 DNA를 첨가하지 않아 비오틴 포획 탐침만을 포함하였다: 따라서 이 반응계에서는 방사성 DNA 기대치도 없었다. 표 2의 "전체 카운트의 기대값"은 다음과 같이 결정하였다. 전기한 바와 같은 반응을 시행하여, 반응산물을 아가로스 겔 전기영동하여 분리하였다. 101kb의 타겟 DNA에 대응하는 겔 조각을 잘라내어 잘게 잘라 "아쿠아졸"("AQUASOL")에 넣었다. 시료에 존재하는³²P-라벨된 DNA의 양을 액체 신틸레이션 카운팅에 의해서 결정하였다.

그 결과는, 상보적이면서 서로 다르게 라벨되어 있는 두개의 탐침을 포함하고 있는 혼성화 산물을 비오틴 라벨된 탐침사슬과 스트렙트아비딘과의 상호작용에 의하여 포획하고, 그에 상보적인 탐침사슬내의 라벨에 의해서 검출할 수 있다는 것을 보여주었다.

안정한 탐침:타겟 혼성체가 비드에 포획됨으로써, RecA 단백질에 의해서 촉진되어 형성되는 상동성의 탐침:타겟 복합체가 실제로 동일한 이중사슬의 타겟 분자내에 두개의 상동성 있는 탐침을 포함하고 있다는 사실을 뒷받침하였다.

[실시예 8 : 타겟 DNA의 변성을 수반하지 않는 RecA 촉진 DNA 증폭반응]

RecA에 의해 촉진되는 DNA 증폭반응 조건은 본 발명자가 공동으로 소유하는, "핵산의 혼성화 및 증폭방법"에 관한 출원 제07/520,321호(1990. 5. 7. 출원: 참고 문헌으로 첨부)에 기재되어 있다.

DL 801/2 및 DL 803/4(표 1)에 해당되는 이중사슬의 탐침/프리머 쌍을, 전술한 바와 같이 변성시킨 후 RecA 단백질로 피복하였다. 원하는 방향으로만 DNA 프리머의 연장 반응이 일어나도록 하기 위해서, 적당한 프리머의 3'-말단을 2', 3'-디데옥시뉴클레오티드에 의해 한정시킬 수 있다. 디데옥시뉴클레오티드에는 통상의 dNTPs에 존재하는 3'-히드록시기가 결핍되어 있다. 따라서 디데옥시뉴클레오티드와 이어질 통상의 dNTP 간에, 포스포디에스테르 결합 생성이 방해 받아 연장반응이 억제된다. 효소 말단의 데옥시뉴클레오티드 전이효소(Pharmacia, Piscataway, NH)를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드를 프리머에 부가할 수 있다.

전술한 바와 같이 그 다음에 탐침과 타겟을 반응시킨다. 두 세트의 이중 D-루프로 구성되어 있는 상기 반응의 산물은 이어 증폭 반응의 기질로 사용된다. 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 8-12mM MgCl₂및 50mM NaCl을 포함하고 200~750μM dNTPs 및 DNA 폴리머라아제(예를 들면, 엑소뉴클레아제가 없는, DNA 폴리머라아제 I, 클레노우 또는 T7 DNA 폴리머라아제)가 보충되어 있는 완충액내에서 DNA를 증폭 반응시킨다. 반응계에는 특정한 증폭반응 산물의 형성을 촉진시킬 수 있는 다른 효소나 단백질(예를 들면, ㅇ 헬라카아제, 포토이소머라아제, DNA 리가아제 및 단일 사슬 결합(SSB)단백)이 더 보충될 수 있다. 반응은 37℃에서 필요한 만큼 진행시킨다. 반응이 끝나면, 시료에서 단백질을 제거하고(SDS, 프로테인아제 K 및/또는 추출 페놀) 겔 전기영동에 의해 분석한다. 전기영동에 의한 분리가 끝나면 증폭되어진 결과 DNA를 겔상에서 에티디움 브로마이드로 염색하거나 표적 특이적인 DNA 탐침과 DNA 혼성화하여 가시화한 후 관찰할 수 있다. 다른 한편으로 전술한 방법대로, 증폭 DNA 탐침을 비오틴으로 라벨하고 새롭게 합성된 DNA를 적절한 방법으로 포획한 후 검출할 수 있다.

DNA 합성반응은 에소뉴클레아제가 없는 1 내지 2 단위의 이. 콜라이 DNA 폴리머라아제 I (U.S. Biochemicals) 및 750μM의 각 dNTP를 첨가함으로써 개시된다. 반응계는 37℃로 유지시켰다.

폴리머라아제를 초기에 가한 후에도 반응 경로중 일정한 간격으로 1단위의 클레노우 등 및/또는 부가적 dNTPs를 반응계에 보충할 수 있다.

시료를 프로테인아제 K로 처리한 후 전기영동에 의해 분리시켰다. 전기영동에 의한 분리후에 증폭된 DNA 단편 결과물은, 에티디움 브로마이드에 의한 겔 염색 또는 표적 특이적 탐침과의 혼성화에 의해서 가시화 될 수 있다.

혼성화 분석을 위해서는 표준 계획안(Maniatis et al. )에 의해서 상기 겔을 혼성화 전이 막(Hybond-N, Amersham)위로 옮긴다. DNA는 상기 막에 UV-가교결합(stratolinker, stratagene)되어 있다. UV로 처리되어 있는 전이막은 말단 라벨되어 있는 (Boehringer Mannheim) 탐침 PCR03A(표 1)와 혼성화된다: PCR03A(천연의 람다 DNA의 7351 내지 7390 뉴클레오티드)는 상기 증폭반응의 타겟이 되는 500 염기상의 람다 템플릿의 내부 DNA 배열에 대응하는 40-올리고머이다. 상기 막을 방사선 사진촬영한다.

[실시예 9 : 이중 D-루프 형성 반응을 이용한 인-시튜 DNA 검출]

A. 탐침 복합체의 제조

비오틴으로 라벨된 염색체 X 알파 새틀라이드 DNA 탐침은 온코(ONCOR; Gaithersurg, MD)에서 구입하였다. 혹은, 표준 닉-이동방법(nick-translation) 또는 폴리머라아제 사슬 반응(Weier et al., 1990)에 의해서 탐침을 비오틴으로 라벨할 수 있다.

변성시키기 전에 멸균된 ddH₂O로 이중사슬의 탐침을 원하는 농도로 희석하여, 0.5㎖의 마이크로 원심분리 관내에서 5분간 100℃로 가열하여 변성시켰다. 상기 원심분리관을 재빨리 빙수조(ice water bath)로 옮겨 1~2분간 방치한 후 4~6℃에서 "토미"("Tomy")마이크로 원심분리기를 사용하여 간단히 원심분리하고 다시 빙수조에 넣었다. 변성된 DNA 탐침을 혼성화 혼합물에 첨가하기 전 약 5분동안에는 탐침을 포함하고 있는 관을 -20℃의 냉동기내에 놓아 두었다. 탐침 혼성화 혼합물은 다음의 구성성분을 비교적 넓은 농도 범위로 함유하였고 표시한 순서대로 배합되었다: 1㎕의 10XRecA 반응 완충액[10XRecA 반응 완충액: 100mM의 트리스 아세테이트(pH 7.5/37℃), 20mM의 마그네슘 아세테이트, 500mM의 소디움 아세테이트, 10mM의 DTT 및 50%의 글리세롤(Cheng et al., 1988)]; 1.5㎕ ATPγS(16.2mm의 저장액에서 만듬: Pharmacia)[GTPγS, rATP(단독으로 또는 rATP 재생계의 존재하에), dATP, ATPγS 및 rATP의 혼합물 또는 ATPγS 및 ADP의 혼합물도 몇몇 반응에 사용될 수 있다]; 0.75㎕의 20mM 마스네슘 아세테이트; 멸균수내에 있는 4-60ng(몇몇 반응에서는 그 이상)의 변성된 탐침; 1.25㎕의 0.137mM 저장 RecA 단백질(Pharmacia에서 입수할 경우; 다른 공급원에서 입수한 경우 첨가되는 양(㎕'s)은 저장액의 농도에 따라 달라진다).

상기 혼합물을 37℃에서 10분간 배양한 후, 200mM의 마그네슘 아세테이트를 반응당 0.5㎕씩 첨가하였다. 반응 구성성분의 최종 농도는 다음과 같았다:

4.0 내지 1mM의 트리스 아세테이트, 2.0mM 내지 15mM의 마그네슘 아세테이트, 20.0mM 내지 50mM의 소디움 아세테이트, 0.4mM 내지 1.0mM의 DTT, 2% 내지 5%의 글리세롤, 1mM 내지 2.5mM의 ATPγS, 0.005mM 내지 0.02mM의 RecA 단백질.

B. HEp-2의 고정 세포핵 준비

HEp-2 세포는 인간(남성)의 후두 외피성 암조직에서 유래한 것이다. HEp-2는 염색체 배수가 변화하는 세포주이다(Chen).

상기 세포를 10% FBS, 소디움 피루베이트 및 페니실린/스트렙토마이신 항생제 혼합물이 보강되어 있는 DMEM 배지 (Whittaker or Gibco-BRL)에 접종하고 37℃, 표준조건하에서 24시간 배양하였다. 저속 원심분리하여 세포 펠렛을 얻고 이를 37℃ 수조에 담겨있는 75mM KCl에 5 내지 15분간 재현탁시켜 필요한 양만큼 세포핵이 팽창되도록 한 후 3:1의 냉 메탄올:아세트산을 첨가하고 6℃에서 원심분리하여 세포를 고정시켰다.

상기 원심분리관내에 1㎖의 액체와 펠렛화된 세포를 남기고 냉 메탄올:아세트산을 더 가한 후 상기 관을 가볍게 혼합하여 세포를 혼합하고 이어 원심분리하였다. 메탄올-아세테이트의 첨가를 반복하면 원형질이 줄어든다(HEp-2 및 다른 세포 형태를 다른 방법으로 고정시킬 수 있으나 그들중 몇가지는 원형질을 없애지 못한다).

분리된 핵 제제를 ~2X10⁶/㎖ 농도의 메탄올:아세트산(3:1) 용액에 재현탁시켜 고정하고, 피펫으로 10㎕씩 깨끗한 유리 슬라이드(-20℃로 저장된 것)에 떨어뜨리거나 또는 차후 사용하기 위해서는 현탁된 세포핵을 -20℃에 저장한다.

C. 고정된 제제를 사용한 혼성화 반응

실시예 9A에서 얻어진 반응당 10㎕의 탐침 혼합물을 유리 슬라이드 상에 고정되어 있는 상기 제제에 가한다. 이 혼성화 영역에 유리 커버슬립(coverslip)을 덮고 고무시메트로 봉한후 1~4시간동안 37℃의 CO₂인큐베이터내의 습성 보관기 안에서 반응물을 배양한다. 배양이 끝나면, 상기 고무 시멘트를 손으로 제거하고 상기 슬라이드를 37℃ 수조내에 있는 코플린 병(Coplin jar)에서 10분동안 2XSSC: 3M NaCl, 0.3M 소디움 시트레이트, 본 검정에서 모든 SSC 함유제제는 pH 7.0)로 3번 세척하였다. 다른 세척조건을 사용할 수도 있다.

상기 슬라이드를 실온에서 25분간 사전-블럭 용액[4X SSC, 0.1% "트리톤X-100", 5% 카네이션 탈지 건조우유, 2% 염소 혈청(Gibco), 0.02%의 소디움 아자이드, pH 7.0]내에 방치한 후, 실온에서 사전블럭 용액내에 있는 5㎍/㎖의 FITC-아비딘 DCS, 세포 분류기 그레이드(cell sorter grade; Vector, A-2011)에 침지시켰다. 상기 슬라이드를 실온에서 4X SSC, 4X SSC 및 0.1% 트리톤X-100, 4X SSC를 사용하여 연속적으로 10분씩 세척한 후 이중 증류수로 헹구었다. 이어 슬라이드를 건조시켰다.

항 탈색 용액을 슬라이드에 가하고[10㎖의 포스페이트 완충 식염액내의 100㎎ p-페닐렌디아민 디히드로클로라이드(Sigma P1519), 0.5M의 카보네이트-비카보네이트 완충액(0.42g NaHCO₃/10㎖ ddH₂O, NaOH로 pH 9로 조절)에 의해 pH 8로 조절되고, 90㎖의 글리세롤에 가해진 후 0.22㎛ 필터로 여과됨], 커버 슬립을 상기 제제위에 덮었다. 단독으로 항탈색제를 사용하는 대신에, 프로피디움 요오드 또는 DAPI 용액과 같은 대조 염색물질을 포함하는 항탈색제를 사용할 수 있다.

필요시 다음과 같이 신호를 증폭시킨다: 슬라이드를 실온에서 5~10분간 4X SSC 및 0.1% "트리톤 X-100"으로 세척하여 커버슬립 및 항탈색제를 제거하고, 사전 블럭용액내에서 20분 정도까지 배양한다. 그 다음에 사전블럭용액내에 5㎍/㎖의 농도로 희석되어 있는 비오틴으로 라벨되어 있는 염소의 항-아비딘 항체(Vector BA-0300)와 37℃에서 30분간 배양한다. 실온에서 4X SSC, 4X SSC 및 0.1% "트리톤 X-100", 그리고 4X SSC를 10분씩 각각 연속적으로 사용하여 슬라이드를 세척하고, 실온의 사전블럭 용액에서 20분간 배양하였다. 5㎍/㎖의 FITC-아비딘을 포함하고 있는 사전 블럭 용액에 20분간 침지시켰다(실온). 다시 상기의 4X SSC계열을 사용하여 슬라이드를 세척하고 ddH2O로 헹군 후 슬라이드상에 항탈색제 또는 대조 염색제를 포함하는 항탈색제를 떨어뜨렸다.

표준 형광 현미경 관찰 기법을 이용하여 특정 신호를 검출하였다.

D. 고정된 핵 및 전체세포에서 특이한 염색체 배열의 검출

혼성화 복합체가 다음 순서대로 배합되었다: 1㎕의 10XRecA 반응 완충액, 1.5㎕ ATPγS(16.2mM Stock, Parmacia), 0.75㎕ 마그네슘 아세테이트(20mM Stock), 20 내지 60ng 또는 그이상의 변성된 탐침이 포함되어 있는 ddH₂O 12㎕(실시예 8A), RecA(0.137mM Stock, Parmacia). 상기 혼합물을 37℃ 수조에서 10분간 배양한 후 0.5㎕의 20mM 마그네슘 아세테이트를 가하였다.

상기에서 제조, 고정한 HEP 세포핵 또는 세포전체는 메탄올:아세트산의 3:1 용액(또는 다른 적당한 고정용액)내에 약 2-3X10⁶/㎖의 농도로 -20℃에서 저장, 고정되어 있다. 상기 현탁된 핵의 5㎖, 약 1-1.5X10⁶의 핵(또는 전체 세포)을 "토미"원심분리기를 이용, 0.5 내지 1.5㎖의 마이크로 원심분리관 3 내지 6에 넣어 원심 분리하였다. 핵 또는 전체 세포를 200㎕ 내지 1㎖의 70%, 85% 및 100% 냉 EtOH 내에 계열적으로 재현탁시켰다. 마지막으로 원심분리하여 100% EtOH의 상등액을 제거한 후 얻은 펠렛을 0.5㎖의 마이크로 원심분리관 내에서 200-500㎕의 1XRecA 반응 완충액으로 재현탁(실온)한 후 원심분리하였다.

탐침 혼합물을 상기 펠렛과 혼합하고, 그 관을 37℃ 수조에 1.5~2.5시간 방치하였다. 250㎕의 2X SSC(37℃)를 가해 상기 배양을 중단시키고 원심분리하였다. 얻어진 펠렛을 250㎕의 2X SSC(37℃)로 재현탁시키고 37℃에서 5분간 배양하였다. 원심분리 후에 실온에서 20분간 500㎕의 차단용액에 얻어진 펠렛을 재현탁한 후 원심분리하고 다시 10㎍ FITC 아비딘/100㎕ 차단용액(실온)내에 20분간 현탁시켠ㅆ다. 그 관을 원심분리하고, 얻어진 펠렛과 250㎕의 4X SSC를 혼합하고 다시 원심분리하고, 0.1% "트리톤 X-100"을 포함하고 있는 250㎕의 4X SSC와 펠렛을 혼합한 후 다시 원심분리하였다. 250㎕의 4X SSC는 모두 실온이었다. 일정한 경우 다른 농도 및/또는 세척 구성분을 사용하였다. 마지막으로 원심분리한 후에 펠렛을 약 20㎕의 항탈색제와 혼합하였다. 제조된 핵을 슬라이드 위에 올려 놓고 표준 형광 현미경 기법을 이용하여 특정신호를 검출하였다.

[실시예 10 : 여러가지 보조인자를 사용한, RecA 매개 이중 D-루프 혼성화 반응]

본 실시예는 여러가지 다른 보조인자를 RecA 단백질 피복반응에 사용한 경우의 이중 D-루프 복합체의 형성에 관하여 설명한다.

이중 D-루프 반응은 1.2mM 농도의 ATPγS(Pharmacia), rATP(Pharmacia), dATP(USB) 또는 GTPγS(Pharmacia)를 포함하고 있는 1X D-루프 완충액[10X 완충액: 100mM 트리스 아세테이트(pH 7.5, 37℃), 20mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 소디움 아세테이트, 10mM DTT 및 50% 글리세롤(Cheng et al., 1988)]내에서 38ng의 탐침을 사용하여 실시하였다. 반응계는 재생 시스템을 갖추고 있을수도 있고 갖추고 있지 않을 수도 있으며, 1.2㎍의 λ/ApaI 타겟 DNA 절편(New England Biolabs, Beverly MA)을 포함하였다. 상기 탐침은 람다 280-올리고머(표 1)가³²P로 말단 라벨(Ausubel et al)된 것이다. 람다 타겟 절편, 즉 탐침에 상동적인 배열을 포함하고 있는 ApaI 단편은 제16도에 화살표로 표시되어 있는 작은 10.1kb 단편이다. RecA를 포함하는 반응에서 RecA의 최종농도는 모두 12.3μM이었다. 통상 마그네슘 아세테이트의 최종농도는 각 반응계에서 약 12mM 이었다(실시예 4).

10㎎/㎖의 프로테인아제 K 및 0.5% SDS를 사용하여, 이중 D-루프 형성 반응물에서 단백질을 제거하였다. 열변성된 280-올리고머의 탐침과 상기의 서로 다른 보조인자들을 포함하고 있는, 탈단백된, RecA 매개 이중 D-루프 혼성화 반응물을 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분리, 해상하였다. 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하고(Maniatis, et al. )사진을 찍어 제6도에 나타내었다. 겔을 건조시킨 후 X-선 필름에 노출시켰다.

제17도는 제16도에 나타낸 건조 겐의 방사선 사진이다. 제17도에 있는 각 레인들은 다음의 반응조건에 대응된다.

RecA : 2레인, RecA 없음; 1레인, 3 내지 7레인, RecA 첨가

보조인자 : 1 및 2레인, ATPγS; 3 및 4레인, rATP; 5 및 6레인, dATP; 7레인, GTPγS.

3 및 5레인은 ATP 재생계[6mM 크레아틴 포스페이트, 10U/㎖ 포스포크레아틴키나아제(Sigma, St. Louis MO) 100㎎/㎖ BSA(Promega, Madison WI)]를 포함하고 있었다. 모든 반응조건은 전기와 같았다.

시료의 적용원점은 제16도 및 제17도에 표시되어 있다. 제17도에 나타난 결과에서, 각 보조인자가 존재하는 경우 안정한 이중 D-루프 복합체가 형성되었음을 10.1kb의 람다 타겟 단편의 위치에 대응하는 라벨된 밴드(화살표)에 의해 확인할 수 있다.

[실시예 11 : ATPγS 또는 ATPγS 및 rATP의 혼합물을 포함하고 있는 RecA 매개 이중 D-루프 혼성화 반응물]

본 실시예에서는 ATPγS 및 ATPγS/rATP의 혼합물을 RecA 단백질 피복 반응에 사용한 경우 이중 D-루프 복합체 형성에 관하여 설명한다.

반응조건은 상기 실시예 10에서와 같았다. 제18도는, 20ng의 열변성 500-올리고머 탐침(표 1)을 사용하여 실시한 RecA 매개 이중 D-루프 혼성화 반응의 탈단백된 산물들(구성성분)이 전기영동에 의해 분리, 해상되어 있는 아가로스 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하여 사진 촬영한 것이다. 상기 탐침은 전술한 바와 같이³²P로 라벨하였다. 상기 겔은 건조시켜 X-선 필름에 노출시켰다.

제19도는 제18도의 건조겔의 방사선 사진을 나타낸 것이다. 제19도에서 각 레인의 반응 조건은 다음과 같았다.

1, 3 및 5 레인 - ATPγS 보조인자(1.2mM)

2, 4 및 6 레인 - ATPγS와 rATP(각각 0.73mM 및 0.5mM) 보조인자의 조합물

1, 2 및 3, 4 레인 - 두개의 서로 다른 λ/ApaI 타겟 DNA 절편(New England Biolabs) 포함 구획, 5레인 및 6레인의 반응계에는 λ/DraI 타겟 DNA 절편을 사용하였다. 모든 반응계에는 1.5㎍의 타겟 DNA 혼합물이 포함되어 있었다. 반응계중 RecA의 농도는 6.85μM이었다. 모든 농도는 최종용적인 10㎕에 기초한 것이다. 모든 반응 조건은 전기와 같았다.

시료의 적용원점은 제18도 및 19도에 표시되어 있다. 제19도에 나타난 결과에서 각 보조인자가 존재하는 경우 안정한 이중 D-루프 복합체가 형성되었음을, 10.1kb 및 8.4kb의 람다 타겟 단편의 위치에 대응하는 라벨된 밴드(화살표)에 의해 확인할 수 있었다.

비록 본 발명을 구체적인 방법 및 실시형태와 관련하여 설명하였지만, 본 발명에서 이탈되지 않는 범위내에서 여러가지 변형 및 변화를 유도할 수 있다.

[실시예 12 : 상동성 진단검정]

A. 람다 DNA 타겟의 라벨화

포획 반응의 평가를 용이하게 하기 위해서, 65℃에서 5분간 가열한 람다 DNA(BRL)를 클레나우 필-인(Klenow fill-in) 반응에 의해서³²P로 말단 라벨하였다. 라벨 반응물은 10㎕의 10X 클레나우 완충액(50mM Tris HCl pH 7.5, 5mM MgCl₂, 10mM β-머캅토에탄올), 8㎕의 1.25mM dNTP 혼합물, 5㎕[α-³²P]-dCTP, 18.3㎕의 0.82㎍/㎕ 람다 DNA, 2㎕의 5U/㎕ 클레나우 DNA 폴리머라아제(Pharmacia) 및 56.7㎕의 ddH₂O를 포함하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후 반응물을 1㎕의 주사기내의 세파덱스 G-50(Pharmacia) 칼럼을 통과시키고, 라벨된 DNA를 0.3M NaOAc 존재하에 에탄올 내에 침전시킨 후 20mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.1mM EDTA(TE)에 재현탁하고 다시 에탄올에 침전시켰다. 건조된 DNA 펠렛을 45㎕의 TE 완충액에 현탁시켰다. DNA 농도를, 분광광도계를 사용하여 260nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.

B. DNA 탐침 합성 및 비오틴 라벨화

열에 의해 회전하는 PCR에 대한 표준 계획안을 사용하여 람다 게놈의 1000bp 영역을 합성하였다. 이 반응은 화학적으로 합성된 두개의 프리머, PCR02 및 PCR01000(배열: 5' GCGGCACGGAGTGGAGCAAGCGTGA 3', 람다 게놈상의 6631 내지 6655 염기 포함), 4개의 모든 dNTP 전구체들 및 Taq DNA 폴리머라아제(Promega)를 사용하였다. 합성된 1000-올리고머의 DNA(6631 내지 7630의 람다 염기 포함)를 세파덱스 G-50(Pharmacia) 칼럼을 통해 원심분리하고 에탄올에 의해 침전시켜(2X) DNA를 회수하였다. 10000-올리고머 DNA를 TE 완충액에 재현탁하고, 260nm에서 OD를 측정하여 종도를 결정하였고, DNA 딥스틱(DNA Dipstick^TMInvitrogen)에 의해 검증하였다. 정체된 1000-올리고머를 BRL, 닉 이동(Nick Translation)계를 사용하여 bio-14-d-ATP (Gibco-BRL) 라벨하였다. BRL 계획안을 약간 변형시켜 효소 혼합물을 추전량의 두배를 두번 가하고 1시간 15분 동안 15~16℃에서 배양하여, 단일사슬의 평균 크기가 300-500 염기로 된 DNA 탐침을 얻었다. 닉 이동된 탐침을 0.3M NaOAc/에탄올 용액에 침전시키고 TE에 재현탁시킨 후 DNA 딥스틱^TM(Invitrogen)으로 DNA 농도를 결정하였다.

C. 탐침의 RecA 피복 및 탐침:타겟 혼성화

상기 닉-이동된 단일사슬의 탐침을, 1㎕의 10X 아세테이트 반응완충액(Cheng et al., 1988), 1.5㎕의 3.24 ATPγS(Sigma), 0.6㎕의 recA(2.76㎍/㎕), 4.4㎕의 멸균 ddH₂O 및 2㎕의 열변성된 DNA 탐침(15ng/㎕)을 포함하고 있는 반응혼합물내에서 RecA 단백질로 피복하였다. 상기 DNA 탐침은 100℃에서 5분간 열변성시키고, 냉수조에서 재빨리 냉각시킨 후 토미 원심분리기 내에서(4℃) 20초간 원심분리하여 액체를 취하고 그중 적당한 분획을 나머지의 다른 반응 구성성분이 포함되어 있는 혼합물에 재빨리 첨가한다. 탐침을 첨가한 후 RecA 피복 반응 혼합물의 전체 용적은 10㎕였다. 상기 탐침 혼합물을 37℃에서 15분간 배양한 후, 4㎕의 10X 아세테이트 반응완충액, 4㎕의 0.2M Mg(OAc)₂, 4㎕의³²P 라벨된 전체 이중사슬 람다 DNA(280ng/㎕, 사전에 65℃에서 5분간 가열) 및 28㎕의 ddH₂O를 포함하고 있는 람다 타겟 DNA 혼합물 10㎕를 가한다. 상기 RecA-매개 혼성화 반응물을 37℃에서 60분간 배양한 후 1.3㎕의 300mM EDTA(pH 8.0)를 최종농도가 ~20mM로 되도록 첨가하였다. 이어 1M의 NaCl를 포함하고 있는 20mM의 트리스-아세테이트 완충용액(pH 7.5) 21㎕ 첨가하여 최종 염의 농도가 0.5M이 되도록 하였다. 세개의 대조반응을, 람다 탐침을 포함하고 있는 RecA 반응과 함께 실시하였다. 첫번째 대조반응은 RecA 단백질 대신에 동량의 RecA 저장완충액을 가한 것외에는 RecA 반응과 동일한 조건이었다. 나머지 두개의 대조 반응은 람다 탐침 대신에 라벨되지 않은, 닉-이동에 의한 øX174 DNA RFI DNA(NEBiolabs)을 사용한 것외에는 람다 탐침을 포함하고 있는 실험계와 동일한 조건으로 실시하였다. 사용하기 약 5분전에 300㎖의 디날비드^R(Dynalbeads; Dynal)를 20mM 트리스-아세테이트(pH 7.5), 1M NaCl 용액에서 3번 세척하였다. 비드를 자성 분리대(Promega)에 모아 세척 완충액을 제거한 후, 각 혼성화 반응물(0.5M NaCl중)을 마이크로 원심분리관에 있는 세척된 비드의 분리 분획(100㎕)에 가하여, 비드가 반응액에 고루 현탁되도록 가끔식 관을 가볍게 흔들어 주면서 비드와 함께 실온에서 30분간 배양하였다. 포획이 되면 액체를 제거하고, 100㎕의 20mM 트리스 아세테이트(pH 7.5), 1M NaCl로 3번 세척하였다.

비드상 및 세척액내에서의 방사선 활성을, 패카드 신틸레이션 카운터(Packard Scintillation Counter)내의 세이프티-솔브(Safety-Solve; RPI Corp.)에서 카운팅하여 결정하였다. 이 실험결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

RecA-피복되어 있고 비오틴으로 라벨된 상보적인 람다 DNA 탐침을 사용하여 이중 D-루프 혼성화 반응을 시키면, 자성 비드상에, 이중사슬의 ~50kb 람다 바러스 타겟 DNA를 특이적으로 포획할 수 있다.

a. 비오틴으로 라벨되지 않은, 닉-이동법에 의한 RFI

표 3에 대한 범례: 비오틴으로 라벨된(bio-14-dATP를 사용, 닉 이동) 람다 DNA 탐침 또는 라벨되지 않은(dATP를 사용, 닉 이동된) øX174 RFI 탐침 및³²P 라벨된 전체 람다 게놈 DNA 타겟을 사용하여, RecA-매개 이중 D-루프 반응을 실시하였다. 닉 이동에 의해 얻어진 단일 사슬의 탐침은 평균크기 300-500 염기이었고, 람다 DNA 탐침은 모두 람다 바이러스 게놈의 인점 1000 bp 영역에 대해 상동적이었다. RecA로 피복된 단일사슬 탐침을 37℃에서 1시간 람다 타겟 DNA와 반응시키고, 20mM EDTA 및 0.5M NaCl로 처리한 후, 깨끗이 세척된, 스트렙트아비딘 피복된 자성 디나비드^R(Dynabeads^R; Dynal)상에 친화성 포획하였다. 포획되지 않은 DNA를 세척에 의해서 반응혼합물로부터 제거하였다. 세척후 비드상에 남아 있는³²P 라벨된 람다 DNA의 %는 신틸레이션 카운팅에 의해 결정하였다. RecA 단백질을 사용하지 않은 반응 및/또는 øX174 DNA 배열을 탐침으로 사용한 반응은 대조군이다(상세한 내용은 본문 및 방법 참조). 결과는 닉 이동에 의한 탐침 및 커다란 이중사슬의 타겟 DNA 상에 형성된 이중 D-루프 혼성체를 자성 비드에 의해 특이적으로 포획, 검출할 수 있다는 것을 보여준다.

D. 신호 증폭

타겟이 라벨되지 않은 경우 및/또는 복제수가 적은 타겟을 검출하기 위해 신호를 증폭하고자 하는 경우에는, 포획된 타겟 DNA를, 검출하기 위해서 포획된 DNA가 부착되어 있는 세척된 디날비드^R(Dynalbead^R)를 1X T7 완충액(10X 완충액: 400mM 트리스 HCl pH 7.5, 100mM MgCl₂, 50mM DTT)으로 한번 세척하고, 31.1㎍의 ddH₂O, 10mM의 dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 0.5㎕, 9.4㎕의 0.53mM bio-14-ATP(BRL) 및 2㎕의 0.8μM 폴리(A) 프리머[배열; 5' A15ATACGGCTGAGGTTTTCAACGGC 3'; 포함된 염기(폴리(A) 꼬리 없이)는 람다 게놈상의 8001 내지 8023번 염기]를 포함하고 있는 증폭반응 혼합액 44㎕에 재현탁시켰다. 상기 프리머, 타겟 DNA 혼합물을 5분간 100℃로 가열하고 37℃로 10분간 냉각한 후, 다음을 첨가하여 최종용적을 50㎕로 하였다; 5㎕의 10X T7 완충액, 0.5㎕의 13U/㎕ T7 시퀀아제^R버젼 2.0(USB) 및 ddH2O. 이어 반응물을 37℃에서 1시간 배양한 후 5㎕의 0.3M-EDTA(pH 8.0)를 가하여 반응을 중단시켰다.

E. 신호 검출

프리머에 의해 합성된 DNA에 bio-14-dATP가 삽입되어 있다는 사실은 써든-라이트^TM(Southern-Light^TM; Tropix) 화학발광 검정계에 의해서 검출할수 있다. T7 효소의 존재 및 부재하에서 실시한 증폭반응의 결과 DNA를, TE 로 적절히 희석하여, (그중) 1㎕의 DNA 혼합물을 12.5mM-EDTA를 함유하고 있는 4㎕의 200mM NaOH 용액에 첨가한 후 실온에서 5 내지 10분간 배양하고, 플라스틱 랩상의 건성 트로필론 -45^YM(Tropilon-45^TM) 나일론 막 위에 배양액의 점을 찍었다. DNA 점을 공기 건조시키고, 건조된 막을 3MM CHR(Whatinom) 크로마토 그래피 용지위로 옮겼다. 20XSSC를 상기 나일론의 가장자리 주변에 있는 3MM 용지에 떨어뜨렸다. 상기 DNA 점이 적셔질 때 자동으로 스트라타젠 스트라타링커 세트(Stratagenc Stratalinker set)와 DNA가 막으로 가교 결합된다. 상기 나일론이 20XSSC로 완전히 적셔지면, 제조자가 추천한 계획안에 따라, AVIDx-AP(알칼라인 포스파타아제; Tropix) 및 AMPPD 기질을 사용하여, 써든-라이트^TM의 비오틴으로 라벨된 DNA의 검출절차를 시행하였다. 화학적 발광은 카메라 발광 측정기(Camera Luminometer; Tropix) 및 폴라로이드 612 필름을 사용하여 측정한다. T7 시퀀아제^R를 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의 반응에서 얻은 결과를 비교해 보면, 비오틴이 DNA로 삽입되며 화학적 발광 검정계를 이용하여 용이하게 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다. 검출에 간접적인 라벨 검출과정을 사용하거나(예를 들면, FITC와 같이 삽입되어 있는 라벨을 직접 검출하는 대신에, AVIDx-AP와 반응된 비오틴 라벨을 사용하는 경우) 검출반응이 비드상에서 [Dynabeads^R, Dynal; Oligo(dT) beads, Promega] 또는 매트릭스상에서[예를 들면, oligo(dT) cellulose, Stratagene Poly(A) Quick^TM] 행해지는 경우에는, 검출시약의 비특이적 부착을 방지하기 위해서, 포획 매트릭스를 적당한 시약과 배양시켜야 하는데, 아이-블럭 시약 혼합물(I-Block reagent mix: Blocking Buffer: Southern-Light^TM, Tropix)을 이 목적으로 사용하였다. 세척된 비등[또는 올리고(dT)셀룰로오스]를 부착된 DNA와 함께 차단용 완충액내에서 한번 씻어낸 다음 차단 완충액내에서 10 내지 30분간 배양한 후 세척된 AVIDx-AP(Troppix)를 첨가하였다. 결합되지 않은 과량의 AVIDx-AP는 트로픽스의 계획안에 따라 세척하여 제거하였다. 그다음 포획 매트릭스를 기질 검출에 부합되는 적당한 완충액으로 세척하였다(검출완충액, 트로픽스를 화학적 발광에 의한 검출에 사용할 수 있다: 형광 검출을 할 경우에는 JBL 과학의 아토포스 시스템(ATTOPHOS system)을 적절한 완충액과 함께 사용할 수 있다). 기질을 가하고 적절한 방법에 의해 DNA-결합된 AP를 검출할 수 있다.

Claims (59)

1. 제1 및 제2사슬을 가지고 있고 그 내부에 일차 DNA 타겟 배열을 포함하고 있는, 선형의 이중사슬 DNA 분석물을 검출하기 위한 방법에 있어서 제1 및 제2의 탐침사슬로 된 한 세트의 DNA 탐침중 상기 제1 및 제2탐침사슬이 i) 제1 및 제2타겟 배열 사슬에 상보적인 배열을 포함하고 있고, ii) 이러한 상보적 배열들이 상기 두개의 탐침사슬 사이에 상보적으로 오버랩되는 영역을 또한 포함하고 있는 상태인 DNA 탐침 세트하나를 제공하는 단계와; RecA 단백질 피복 반응에 의해서 상기 탐침들을 RecA 단백질로 피복하는 단계와; RecA로 피복된 상기 탐침들을, 상기 탐침들 및 두개의 타겟 사슬이 포함되어 있고 탈단백화에 안정한 탐침:타겟 복합체가 형성되는 조건하에서, 타겟 배열을 포함하고 있는 선형의 이중사슬 DNA와 결합시키는 단계 및; 상기 탐침:타겟 복합체내에서 탐침 DNA의 존재를 검출하는 단계를 포함하여 이루어지는 선형의 이중사슬 DNA 분석물의 진단학적 검출방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 탐침이 닉-이동법(nick-translation)에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 피복반응에서 ATPγS, rATP, dATP 및 GTPγS로 구성된 그룹에서 선택된 보조인자가 하나 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 보조인자가 rATP이고 상기 피복 반응은 ATP 재생 시스템의 존재 또는 부재하에 실시하는 것임을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 보조인자가 ATPγS 및 rATP의 혼합물 또는 ATPγS 및 ADP의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제3항에 있어서, 상기 보조인자가 ATPγS인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제3항에 있어서, 상기 보조인자가 dATP인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 RecA 단백질이 이. 콜라이의 와일드 타입 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 RecA 단백질이 이. 콜라이의 recA-803 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 탐침사슬 간의 상보적 오버랩 영역이 약 78 염기쌍 이상 500 염기쌍 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 하나의 탐침사슬이 어느쪽의 타겟 배열에도 상보적이지 않은 DNA 연장말단을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 각 탐침사슬이 DNA 연장말단을 하나씩 포함하고 그 연장말단들은 서로 상보적인 것임을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 하나의 탐침사슬이 하나의 방사성기를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 검출반응이 탐침:타겟 복합체로부터 단백질을 제거하고 이어 전기영동에 의해서 결합되지 않은 탐침을 상기 복합체로 부터 분리함으로써 실시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 제1탐참사슬이 포획기로 라벨되고, 상기 제2탐침사슬이 검출기로 라벨되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 폭획기가 비오틴이고 그에 의한 탐침:타겟 복합체의 포획은 스트렙트아비딘을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 스트렙트 아비딘이 고형지지대에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제16항에 있어서, 제2탐침사슬이 방사성 라벨 및 디곡시제닌으로 구성된 그룹에서 선택된 검출기를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 검출기가 디곡시제닌이고 디곡시제닌의 존재는 리포터기를 포함하고 있는 항-디곡시제닌 항체를 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제1항에 있어서, 두개의 탐침사슬을 모두 포함하고 있는 탐침:타겟 복합체를 사용하여 기지의 제한 부위를 보호하는 단계와 타겟 DNA를 제한 효소로 잘라 단편이 생성되는 패턴을 조사하는 단계를 더욱 포함하여 이루어지는 제한 단편의 다형 검출방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 보호가, 탐침:타겟 복합체를 탈단백화 하기 전에 제한효소로 절단함으로써 수행되는 것임을 특징으로 하는 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기의 보호가, RecA 단백질 피복반응에 의해서 RecA 단백질로 두개의 탐침사슬을 피복하기전에 양 탐침사슬을 메틸화함으로써 수행되는 것이미을 특징으로 하는 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 검출방법이, 타겟 DNA를 절단할 수 있는 기능기를 하나 또는 양쪽의 탐침사슬에 부착하고 탐침:타겟 복합체를 형성시켜 상기 절단기에 의해서 타겟 DNA가 잘릴 수 있도록 반응조건을 조절함으로써 수행되는 타겟 DNA의 절단과정을 포함하고 있는 제한단편의 다형분석 과정을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 절단기가 철 FeII 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 절단기가 비특이적 포스포디에스티라아제 및 제한 엔도뉴클레아제로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
26. 제1항에 있어서, 상기 검출방법이, 탐침:타겟 복합체를 형성시키고 타겟 DNA를 절단할 수 있는 기능기를 하나 또는 양쪽의 탐침사슬에 부착하고 그 절단기에 의해서 타겟 DNA가 잘려질 수 있도록 반응조건을 조절함으로써 수행되는 타겟 DNA의 절단과정을 포함하고 있는 제한 단편의 다형분석과정을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제1항에 있어서, 상기 검출방법이 하나 또는 양쪽 탐침사슬의 3'-말단으로 부터 DNA 폴리머라아제에 의해 촉진되는 프리머 연장 반응을 일으킴으로써 수행되고, 상기 프리머 연장반응은 하나 이상이 검출기를 포함하고 있는 4개의 dNTPs가 모두 존재하는 가운데 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제1항에 있어서, 이중사슬의 제2타겟 배열에 상보적인, 제1 및 제2탐침사슬로 구성되며, 그중 제1탐침사슬은 제2타겟 배열의 한 사슬에 상보적인 배열을, 제2탐침사슬은 제2타겟 배열의 나머지 한 사슬에 상보적인 배열을 각각 포함하고 있으며, i) 이들 탐침간에는 서로 오버랩되는 상보적 영역이 하나 있으나, ii) 상기 제1탐침 세트와는 서로 혼성화되지 않는, 제2DNA 탐침 세트를 제공하는 단계를 더욱 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 DNA 탐침이 닉-이동법(nick-translation)에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
30. 제28항에 있어서, 제1탐침세트가 포획기로 라벨되고 제2탐침세트는 검출기로 라벨되는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 포획기가 비오틴이나 디곡시제닌임을 특징으로 하는 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 검출기가 방사성 라벨, 비오틴 및 디곡시제닌으로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
33. 제30항에 있어서, 상기 검출방법이 탐침:타겟 복합체를 포획하는 포획계를 사용하는 단계를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 포획계가 하나의 탐침 세트를 비오틴으로 라벨하는 것과 관련되어 있고 상기 포획은 스트렙트아비딘을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 스트렙트아비딘이 고형 지지대에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제28항에 있어서, 두가지의 탐침세트가 타겟 DNA 중의 내부영역을 하나 규정하고 각 탐침세트는 그 영역 내부에 있는 3'-말단과 외부에 있는 3'-말단을 포함한 하나의 사슬을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 검출방법이 각 탐침사슬의 3'-말단으로 부터 DNA 폴리머라아제에 의해 촉진되는 프리머 연장 반응을 일으킴으로써 수행되고, 상기 프리머 연장반응은 하나 이상의 검출기를 포함하고 있는 4개의 dNTPs가 모두 존재하는 가운데 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 각 탐침사슬의 외부 3'-말단으로 부터 프리머가 연장되지 않도록 동 말단이 보호되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 연장반응이, 두개의 타겟 사슬이 열에 의해 해리 되기 위하여 필요한 온도보다 낮은 온도에서, 원하는 정도로 타겟 배열이 증폭될 때까지 계속 실시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 반응이 DNA 폴리머라아제를 첨가하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 반응이 RecA 단백질-피복된 탐침을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제1항에 있어서, 상기 피복반응이 ATPγS를 더욱 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 DNA 탐침이 닉-이동법(nick-translation)에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
44. 제1항에 있어서, 상기 피복 반응이 ATP를 더욱 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 DNA 탐침이 닉-이동법(nick-translation)에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
46. 제1 및 제2사슬을 가지고 있는 그 내부에 일차 DNA 타겟 배열을 포함하고 있는 선형의 이중사슬 DNA 분석물을 핵산 분자들의 혼합물로부터 분리하기 위한 방법에 있어서, 제1 및 제2의 탐침사슬로 된 한 세트의 DNA 탐침중 상기 제1 및 제2탐침사슬이 i) 제1 및 제2타겟 배열 사슬에 상보적인 배열을 포함하고 있고, ii) 이러한 상보적 배열들이 상기 두개의 탐침사슬 사이에 상보적으로 오버랩되는 영역을 또한 포함하고 있는 상태인 DNA 탐침 세트하나를 제공하는 단계와; RecA 단백질 피복 반응에 의해서 상기 탐침들을 RecA 단백질로 피복하는 단계와; RecA로 피복된 상기 탐침들을, 상기 탐침들 및 두개의 타겟 사슬이 포함되어 있고 탈단백화에 안정한 탐침:타겟 복합체가 형성되는 조건하에서, 타겟 배열을 포함하고 있는 선형의 이중사슬 DNA와 결합시키는 단계 ATPγS를 포함하는 RecA 단백질 피복반응에 의해서 상기 탐침들을 RecA 단백질로 피복하는 단계와; 상기 탐침:타겟 복합체를 핵산 분자들의 혼합물로부터 분리하는 단계 및; 상기 탐침:타겟 복합체로부터 타겟 배열을 포함하고 있는 이중사슬의 DNA 분석물을 분리해 내는 단계를 포함하여 이루어지는 선형의 이중사슬 DNA 분석물의 분리방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 DNA 탐침이 닉-이동법(nick-translation)에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
48. 제46항에 있어서, 상기 탐침들이 고형 지지대에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제46항에 있어서, 상기 탐침들이 적어도 하나의 비오틴 기를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 분리과정이 스트렙트아비딘을 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 스트렙트아비딘이 고형지지대에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제46항에 인ㅆ어서, 상기 탐침:타겟 복합체를 i) 동 복합체로부터 타겟 배열을 포함하는 이중사슬의 DNA 분석물을 분리해 내기 충분하면서 동시에 ii) 타겟 배열을 포함하는 이중사슬의 DNA 분석물의 융점 보다는 낮은 온도에서, 열변성시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제52항에 있어서, 상기 이중사슬의 DNA 분석물이 단일사슬의 DNA로 변성되는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제46항에 있어서, 상기 탐침:타겟 복합체를, i) 동 복합체로부터 타겟 배열을 포함하는 이중사슬의 DNA 분석물을 분리해 내기에 충분하면서 동시에 ii) 타겟 배열을 포함하는 이중사슬의 DNA 분석물의 융점 이상인 온도에서 열변성시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제1 및 제2사슬을 가지고 있는 그 내부의 일차 DNA 타겟 배열을 포함하고 있는 선형의 이중사슬 DNA 분석물을 핵산 분자들의 혼합물 내에서 검출하기 위한 방법에 있어서, i) 탐침:타겟 복합체로부터 타겟 배열을 포함하는 이중사슬의 DNA 분석물을 분리해내기에 충분하면서 동시에 ii) 타겟 배열을 포함하는 이중사슬의 DNA 분석물의 융점 이상인 온도에서, 탐침:타겟 복합체를 열변성시키는 단계를 더욱 포함하여 구성된 제46항의 방법에 따라 선형의 이중사슬 DNA 분석물을 분리해 내는 단계와; 5' 및 3' 말단을 가지고 타겟 배열에 상보적이며 두개의 DNA 탐침에 존재하지 않는 배열만을 포함하는 DNA 합성 프리머를 하나 이상 첨가하는 단계 및; 그중 하나 이상의 검출기를 포함하고 있는 4가지의 dNTP가 모두 존재하는 가운데 DNA 폴리머라아제에 의해 촉진시켜 3'-말단으로부터 상기 프리머를 연장 반응시킴으로써 상기 DNA 분석물을 검출하는 단계를 포함하여 구성되는 선형의 이중사를 DNA 분석물의 검출방법.
56. 제55항에 있어서, 상기 DNA 탐침이 닉-이동법(nick-translation)에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
57. 제55항에 있어서, 상기 프리머 사슬이, 타겟 사슬중 어느쪽에도 상보적이지 않은 DNA 연장 말단을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
58. 제55항에 있어서, 하나 이상의 DNA 합성 프리머가 포획기를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
59. 제58항에 있어서, 포획기와 검출기를 포함하고 있는 프리머 연장반응의 산물을 생성시키는 단계와 그 포획기를 이용하여 프리머 연장반응의 산물을 분리하는 단계를 더욱 포함하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.